JPH0544940B2 - - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
本発明は、ペプチド結合を開裂する酵素を検出
しかつ測定するための基質として好適である発色
性化合物に関する。 従来の技術 ペプチド結合を開裂する酵素は、CONH−結
合の加水分解を触媒する能力を有するものであ
る。例えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
のようなトランスペプチダーゼ、例えばロイシン
アリールアミダーゼのようなペプチダーゼ、カテ
プシン、キモトリプシンのようなプロテイナー
ゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンテロキナ
ーゼ、パパイン、トリプシン及び例えば血液凝固
及び繊維素溶解の進行に関与するすべてのプロテ
アーゼが挙げられる。特に、血液凝固又は繊維素
溶解の進行に関与する酵素並びにトリプシン、キ
モトリプシン、ロイシンアリールアミダーゼ及び
γ−グルタミルトランスペプチダーゼは臨床化学
において診断するのに非常に重要である。 例えば血液、血清、血しよう又は尿のような体
液中のこれらの酵素の検出及び測定には、しばし
ばできる限り迅速に正確な結果を得ることが重要
である。そのような検出−及び測定法の適用者の
範囲は広いので、簡単な方法を開示することが必
要である。これらの方法は試料の性状によつて妨
害されてはならない。例えば黄疸試料の着色、脂
肪血症の混濁等が妨害となり得る。 ペプチド結合を開裂する酵素に対する従来公知
の基質は、式： R1−NH−Ｒ （） 〔式中R1は場合により保護されたアミノ基を
有するアミノ酸又はオリゴペプチドの残基を表わ
し、かつＲはアミノ基と一緒に、アミノ酸又はオ
リゴペプチドのカルボキシル末端基とアミド結合
を成立させる検出可能な化合物の基を表わす〕に
より表わされる。そのような基質の酵素的開裂
で、カルボン酸R1−OH（ａ）（アミノ酸又は遊
離カルボキシル官能基を有するオリゴペプチド）
及びアミンＲ−NH2（ｂ）が生じる。 R1としては、最も頻繁には個々のアミノ酸乃
至テトラペプチドが使われる。しかしより大きな
オリゴペプチドも使用することができる。一般的
には、式の基質によつて、測定すべき酵素にア
ミノ酸もしくはアミノ酸配列が提供され、この部
分で天然基質でも開裂しかつこのアミノ酸もしく
はアミノ酸配列は該酵素に対する基質の特異性に
関して主要な要因である。専門書に多数の公知の
アミノ酸もしくはアミノ酸配列が挙げられている
が、診断上特に重要なものとしていくつかの例を
挙げる：γ−グルタミルトランスペプチダーゼの
ようなトランスペプチダーゼに関しては例えばγ
−グルタミル基〔Bergmeyer著、“Methods of
Enzymatic Analysis”、第３版、Vol.、349〜364頁、
Verlag Chemie出版（1983年）〕、ロイシンアミ
ノペプチダーゼのようなペプチダーゼ、例えばロ
イシン基〔“Z.Klin.Chem.u.Klin.Biochem..”、10
巻、192頁（1972年）〕、トリプシンのようなプロ
テイナーゼ、例えばＮ−末端が保護されたテトラ
ペプチドIle−Glu−Gly−Arg〔Bergmeyer著、
“Methods of Enzymatic Analysis”、第３版、
Vol.V、124〜129頁、Verlag Chemie出版（1984
年）〕、トロンビンのような血液凝固の過程で作用
するプロテアーゼに関しては例えばＮ−末端が保
護されたトリペプチドVal−Pro−Arg又はGly−
Pro−Arg等〔“Seminars in Thrombosis and
Hemostasis”、Vol.9、No.３、179〜183頁（1983
年）〕。 アミンＲ−NH2は、一般式の基質に対して
ペプチド結合を開裂する酵素が作用することによ
り遊離する検出可能な化合物である。一般に、一
般式の基質中でアミノ酸又はオリゴペプチドへ
の結合により遊離物質と比較して最大吸光度又は
最大螢光発光度が短い波長範囲に移動する化合物
が該当する。従つて、基質から分離した物質Ｒ−
NH2は光又は発光した螢光を長波長範囲で吸収
する。 全体的に一般式の基質は、酵素加水分解の際
に遊離する検出可能な化合物の種類に応じて３つ
のカテゴリーに分類することができる。 第１のカテゴリーは、開裂後にｐ−ニトロアニ
リン又はその誘導体を供給する基質である。例え
ば、そのような基質は西ドイツ国特許公開第
3244030号明細書及び同第3311287号明細書の目的
である。開裂により生成した検出可能な化合物は
黄色でありかつ有利には405〜420nmで測定され
る。 しかしながらそのような化合物は、試料から由
来する多数の作用要因によつて妨害されるという
欠点を有する。例えば、大きな妨害因子は血清の
固有の色、脂肪血症の混濁、高められたビリルビ
ン値等である。それ故、ｐ−ニトロアニリン−又
はｐ−ニトロアニリン誘導体を分離する基質は限
定的にしか使用し得ない。レミツシヨン測光法に
より測定する乾式化学試験では前記の因子が妨害
して基質を実際上使用することができない。 第２のカテゴリーの基質は螢光発光化合物、例
えば７−アミノ−４−メチル−クマリン、４−ト
リフルオルメチル−７−アミノ−クマリン、４−
メトキシ−β−ナフチルアミン、β−ナフチルア
ミン、５−アミノ−イソフタル酸ジメチルエステ
ルを分離する。ペプチド結合を開裂する酵素に対
する基質から遊離され得る螢光発光化合物はヨー
ロツパ特許公開第0025190号明細書に挙げられて
いる。 それらの使用には、螢光測定に必要な装置故に
問題が多い。それ故、慣用的測定の基質としては
重要ではない。 第３の基質カテゴリーは、酵素の作用下にアミ
ノフエノール、フエニレンジアミン又は他の芳香
族アミンを脱離し、これらが可視光線範囲で十分
に吸収せずかつそれ故色素形成に二次反応を必要
とするようなアミドである。たいていの場合、色
素形成には酸化的カツプリング反応が適用され
る。例えば、そのような検出原理は西ドイツ国特
許公開第3331588号明細書又はヨーロツパ特許公
開第0076042号明細書から公知である。 第３のカテゴリーの基質から脱離する化合物を
酸化二次反応と結合させるという要件はその使用
を複雑にしかつ限定的に可能であるに過ぎない。
酸化により色素を形成する。試料中に含まれるす
べての物質がそのような検出反応を妨害し得る。
とりわけその例としては血しよう又は血清中に含
まれているビリルビンがある。これを、この酸化
的カツプリングの原理により操作するすべての試
験において予備反応において排除しなければなら
ない。更に、酸化剤は、基質開裂反応中での作用
によつても前記の反応を妨害する。例えば、血液
凝固のカスケード機作の進行が酸化剤によつて作
用される。 発明が解決しようとする課題 それ故、開裂反応の際に、最大吸光度が明らか
に420nmを上廻りかつ最大吸収波長が基質の最大
吸収波長と、酵素活性の測定に申し分のないシグ
ナルが得られる程度に異なつている色素を直接形
成する、ペプチド結合開裂酵素、特にトランスペ
プチダーゼ、ペプチダーゼ及びプロテイナーゼに
対する基質について要求が生じた。 本発明の課題は、そのような基質を開示するこ
とであつた。 課題を解決するための手段 この課題は、一般式： 〔式中R1はアミノ基が場合により保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ドの基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は場合により
低級アルキルにより置換されたカルボキサミド基
を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場合
は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わしてよく、 Ｚは正電荷の共役双環式ヘテロ環系を表わし、
かつ Ｘは有機酸又は無機酸のアニオンを表わす〕の
新規化合物により解決される。 本発明による基質のアミノ酸残基又はオリゴペ
プチド基は測定すべき酵素に相応して選択するこ
とができる。その際に、アミノ酸としては炭素原
子２〜15個、殊に２〜10個を有するα−、β−又
はγ−アミノ酸が該当する。キラルのアミノ酸が
該当する場合、それはＤ−又はＬ形でもしくはラ
セミ体として存在していてよい。蛋白質及びペプ
チド抗生物質中に存在する天然産出のアミノ酸は
優れている。しかし例えばピペコリン酸、シクロ
ヘキシルアラニン、フエニルグリシン、α−アミ
ノシクロヘキシルカルボン酸、ヘキサヒドロチロ
シン、ノルロイシン又はエチオニンのような合成
アミノ酸も使用することができる。R1がアミノ
酸残基である一般式の基質を変換する酵素の例
としては、γ−グルタミル基を有する基質を変換
させるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ア
ルギニン基を含有する基質を変換するトリプシ
ン、例えばアラニンのような脂肪族アミノ酸を含
有する基質を加水分解するアミノペプチダーゼ
Ｍ、又はフエニルアラニンを含有する基質を認識
するキモトリプシンが挙げられる。 R1がオリゴペプチド基である場合、それはア
ミノ酸構成要求２〜10個、殊に２〜６個、殊に２
〜４個を含有する。オリゴペプチドのアミノ酸は
天然及び／又は合成に由来してもよくかつ一般式
の化合物中の好適なアミノ酸に関する前記の定
義に相応する。 測定すべき酵素に相応して、一般式の基質中
のR1として使用される好適なアミノ酸残基又は
オリゴペプチド基は文献〔例えば“Seminars in
Thrombosis and Hemostasis”、Vol.9、No.３、
179〜183頁（1983年）、“IUPAC Enzyme
Nomen Clature”、（1984年）、Academic Press
出版、Orlando在、T.E.Barman著、“Enzyme
Handbook”、1969、補遺、1974、Springer−
Verlag出版、Heidelberg在〕から公知である。
これらを本発明による一般式の基質中でも同様
に使用することができる。 一般式の基質中には末端部、及び／又はアミ
ノ酸残基又はオリゴペプチド基R1の場合により
存在する他のアミノ基が遊離して存在していてよ
い。場合によつては保護基により置換されていて
もよい。 例えば、アミノ保護基としてはアシル基、オキ
シカルボニル基、チオカルボニル基、スルホニル
基、スルフエニル基、ビニル基、シクロヘキセニ
ル基、ホスホリル基又はカルバモイル基が挙げら
れる。アシル基、スルホニル基及びオキシカルボ
ニル基が優れている。 アシル基としては、脂肪族又は芳香族のカルボ
ン残の残基、例えばホルミル基、アセチル基、プ
ロピオニル基、イソブチリル基、ベンゾイル基又
はナフトイル基が該当する。殊に、ホルミル基、
アセチル基及びベンゾイル基が優れている。 例えば、優れたオキシカルボニル基は、ベンジ
ルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル
基、エトキシカルボニル基及びｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基である。 スルホニル基は、例えば炭素原子１〜６個を有
する脂肪族スルホン酸の残基、有利にはメタンス
ルホニル基及びエタンスルホニル基、又は例えば
芳香族スルホン酸残基、有利にはベンゼンスルホ
ニル基、トルエンスルホニル基及びナフチルスル
ホニル基である。 一般式を有する化合物のｐ−フエニレンジア
ミン部分の置換基R2及びR3の定義において、低
級アルキル基は炭素原子１〜６個、殊に１〜４個
を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表わ
す。特に優れている基はメチル、エチル、イソプ
ロピル及びイソブチルである。 低級アルコキシ基であるR2及びR3では炭素原
子１〜６個、殊に１〜４個の直鎖状又は分枝鎖状
のアルコキシ基が挙げられる。優れた低級アルコ
キシ基はメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ
ブトキシ及びｔ−ブトキシである。 前記の低級アルコキシ基の定義は、低級アルコ
キシカルボニル基のR2及びR3中の低級アルコキ
シ基にも該当する。 前記の低級アルキル基の定義も同様にカルボキ
サミド基であるR2及びR3の低級アルキル置換基
に該当する。 酸のアニオンX-は有機酸又は鉱酸のアニオン
を表わす。有機又は無機の強度のアニオンが優れ
ている。アセテート−、トリフルオルアセテート
−、オキサレート−、メタンスルホネート−、サ
ルフエート−、クロリド−、ブロミド−及びペル
クロレートイオンが特に優れている。 正電荷の共役双環式ヘテロ環系のＺには多数の
基がある。ヘテロ原子として窒素又は窒素及び硫
黄を有するヘテロ環が優れている。特に、一般式
の本発明による化合物には、一般式： 〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは炭素原子又は窒素原
子を表わし、その際にそれらが橋頭原子ではない
場合には炭素原子は酸素、低級アルキル基、低級
アルコキシ基、アリール基、アラールキル基又は
アリールオキシ基により置換されていてもよく、
かつ窒素原子は低級アルキル基、アラールキル基
又はアリール基により置換されていてもよく、 Ｙは窒素原子又は硫黄原子により遮断されてい
るか又はそのようなヘテロ原子を連鎖の初めか又
は終りに含有していてもよい３〜５員の不飽和炭
化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は場合に
より低級アルキル基、低級アルコキシ基、アラー
ルキル基、アリールオキシ基又はアリール基によ
り置換されており及び／又は窒素原子は場合によ
り低級アルキル基、アラールキル基又はアリール
基により置換されており、２つの隣接する低級ア
ルキル基は場合により炭素原子３〜５個の飽和ア
ルキレン基を形成し、かつ双環中のヘテロ原子の
合計が最高３個であるにより表わされるような系
Ｚが好適である。 式中の点線は、正の過剰電荷が双環系の一定
の原子だけに局在するのではなく、メメリー又は
互変異性により環式共役の分子部分に分散して存
在することを表わす。 橋頭原子としては、双環系の両方の環に属する
原子Ａ及びＢが挙げられる。この原子は本発明に
よる基質の基Ｚ中で他の原子又は基によつて置換
されてはいない。 場合により、橋頭原子ではない基Ｄ及びＥ中の
炭素原子少なくとも１個は酸素により置換されて
いてよく、それ故例えばカルボニル基を形成す
る。 Ｄ及びＥ中の橋頭形成しない炭素原子又は窒素
原子を置換し得る低級アルキル基もしくは低級ア
ルコキシ基は、炭素原子１〜６個、殊に１〜４個
より成るものである。特に優れている基はメチル
基、エチル基、ｎ−プロピル基もしくはメトキシ
基、エトキシ基及びｎ−プロポキシ基である。 Ｄ及びＥ中の炭素原子又は窒素原子を置換し得
るアリール基もしくはアリールオキシ基は、フエ
ニル基、ナフチル基もしくはフエノキシ基及びナ
フトキシ基である。場合により、これらは炭素原
子１〜６個、殊に１〜４個を含有する低級アルキ
ル基又は低級アルコキシ基１個以上により及び／
又は弗素、塩素、臭素又は沃素のようなハロゲン
原子、殊に塩素又は臭素１個以上により置換され
ていてよい。アリール−又はアリールオキシ置換
基としてはフエニル−又はフエノキシ基が特に優
れている。 Ｄ及びＥ中の炭素−及び窒素原子の可能な置換
基としてのアラールキル基は、特にフエニルメチ
ル−及びナフチルメチル基である。フエニルメチ
ル基が特に優れている。 場合により窒素−又は硫黄原子により遮断され
ているかもしくはそのようなヘテロ原子を連鎖の
初めか終りに含有する３〜５員の不飽和炭化水素
連鎖Ｙとは、殊に他方の環系に隣接することによ
り５−又は６員環を形成するような連鎖である。
この隣接する環系は、他の環の二重結合系に共役
していて、それ故ヘテロ環系Ｚの正の過剰電荷が
両方の環系の間でのメンメリー又は互変異性によ
り交換可能である二重結合１個以上を含有する。
双環Ｚの、Ｙを含有する環の特に優れた環系はチ
アゾリウム−及びピリジニウム系である。 不飽和連鎖Ｙの炭素原子又は窒素原子を置換し
得る低級アルキル−、低級アルコキシ−、アリー
ルオキシ−、アラールキル−及びアリール基とし
ては、Ｄ及びＥ中の炭素−及び窒素原子に関して
挙げたのと同じ基が該当する。 Ｙ中で２つの隣接する低級アルキル基が炭素−
及び／又は窒素原子の置換基として存在する場
合、これは炭素原子３〜５個を有する飽和アルキ
レン基を形成し、Ｙに縮合した環を形成すること
も可能である。炭素原子３又は４個からのアルキ
レン基が優れており、これは５−又は６員環を形
成する。このようにして縮合したシクロペンタン
−又はシクロヘキサン環が特に優れている。 Ｚが である一般式の化合物が特に優れており、その
際にR4、R5、R6及びR7は同じか又は異なつてい
てよく、水素、低級アルキル−、低級アルコキシ
−、アラールキル−、アリールオキシ又はアリー
ル基を表わす。 R4〜R7の低級アルキル−、低級アルコキシ−、
アラールキル−、アリールオキシ−及びアリール
基としては一般式のＤ、Ｅ及びＹ中の置換基に
関して挙げたのと同じ基を表わす。 正電荷の共役双環式ヘテロ環系Ｚとして一般式
、、XI、XII、又はの系を有する一般
式の化合物が特に優れている。 一般式の化合物は新規である。 文献からは、芳香族又はヘテロ芳香族ニトロン
化合物とフエノール、アニリン、メチレン塩基も
しくはその前駆物質、相応してメチル置換された
第四窒素ヘテロ環、例えば２−又は４−ピコリン
ヨードメチラート、２−メチル−１−アリールキ
ノリニウム塩、ピラゾロン又はイミダゾロ−（１，
2a）−ピリジン−２−オンとの縮合が公知である
〔Houben−Weyl、10／１巻、1079頁以下；
“Chem.Ber.”、90巻、2792（1957年）；“J.Chem.
Soc.”914（1951年）；F.Hamer著、 “Cyanine and related dyes”、“The
Chemistry of Heterocyclic Compounds”、A.
Weissberger発行、Vol.18、443頁以下；H.
Stamm著、“Methodicum Chimicum”、F.
Zymalkowsky発行、Vol.6、Georg Thieme
Verlag出版、Stuttgart在、1975、33頁；“Bull.
Soc.Chim.Belg.”、58、498（1949年）；“J.Amer.
Chem.Soc.”、66、1805（1944年）〕。この縮合は熱
時にかつ例えばピペリジン、水酸化ナトリウム又
は炭酸ナトリウムによる塩基性触媒作用下に進行
する。例えば第四アンモニウム塩を使用する際に
反応は触媒作用を適用せずとも進行し得る。 Houben−Weyl 10／１巻、1081頁以下から、
３，５−ジフエニル−２−ニトロソピロールと
２，４−ジフエニルピロールとの縮合又はニトロ
ソベンゼンと２，４−ジケトピペラジンとの縮合
も公知であり、これは無水酢酸の存在において加
熱下に進行する。しかしこのような激しい反応条
件は、本発明のようにアミノ酸を構造要素として
含有する化合物では適用し得ない。 それ故、一般式の化合物が一般式： 〔式中R1はアミノ基が場合により保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ド基を表わし、かつ 同じか又は異なるR2及びR3は水素、低級アル
キル−、低級アルコキシ−、カルボキシ−、低級
アルコキシカルボニル−又は、場合により低級ア
ルキルにより置換されているカルボキサミド基を
表わすか又はR2とR3が隣接している場合は−CH
＝CH−CH＝CH−基を表わす〕のニトロソ化合
物と一般式： Z′−Ｈ （） 〔式中Z′は荷電されていない双環式ヘテロ環系
を表わす〕の化合物とを穏やかな条件及び酸性触
媒下に反応させ、かつ場合により引続いてアミノ
保護基を完全に又は部分的に除去することにより
得られることは驚異的であつた。 一般式ととの反応は温度−20〜＋50
℃、殊に＋10〜＋25℃で進行する。 酸性触媒としては有機酸又は鉱酸が好適であ
る。非プロトン性及びプロトン性の溶剤も同じよ
うに使用することができる。例えば、優れた非プ
ロトン性溶剤はジメチルホルムアミド又は塩化メ
チレンである。優れたプロトン性溶剤は、例えば
メタノール又はエタノールのようなアルコールで
ある。しかし反応媒体として酢酸を使用すると特
に優れており、この酸は溶剤及び触媒の機能を有
している。 芳香族ニトロソ化合物と一般式の双環式ヘ
テロ環式化合物との前記条件下での反応は従来公
知ではなかつた。特に、これは一般式の化合
物と、Z′が一般式ａ又はｂ：
しかつ測定するための基質として好適である発色
性化合物に関する。 従来の技術 ペプチド結合を開裂する酵素は、CONH−結
合の加水分解を触媒する能力を有するものであ
る。例えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
のようなトランスペプチダーゼ、例えばロイシン
アリールアミダーゼのようなペプチダーゼ、カテ
プシン、キモトリプシンのようなプロテイナー
ゼ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンテロキナ
ーゼ、パパイン、トリプシン及び例えば血液凝固
及び繊維素溶解の進行に関与するすべてのプロテ
アーゼが挙げられる。特に、血液凝固又は繊維素
溶解の進行に関与する酵素並びにトリプシン、キ
モトリプシン、ロイシンアリールアミダーゼ及び
γ−グルタミルトランスペプチダーゼは臨床化学
において診断するのに非常に重要である。 例えば血液、血清、血しよう又は尿のような体
液中のこれらの酵素の検出及び測定には、しばし
ばできる限り迅速に正確な結果を得ることが重要
である。そのような検出−及び測定法の適用者の
範囲は広いので、簡単な方法を開示することが必
要である。これらの方法は試料の性状によつて妨
害されてはならない。例えば黄疸試料の着色、脂
肪血症の混濁等が妨害となり得る。 ペプチド結合を開裂する酵素に対する従来公知
の基質は、式： R1−NH−Ｒ （） 〔式中R1は場合により保護されたアミノ基を
有するアミノ酸又はオリゴペプチドの残基を表わ
し、かつＲはアミノ基と一緒に、アミノ酸又はオ
リゴペプチドのカルボキシル末端基とアミド結合
を成立させる検出可能な化合物の基を表わす〕に
より表わされる。そのような基質の酵素的開裂
で、カルボン酸R1−OH（ａ）（アミノ酸又は遊
離カルボキシル官能基を有するオリゴペプチド）
及びアミンＲ−NH2（ｂ）が生じる。 R1としては、最も頻繁には個々のアミノ酸乃
至テトラペプチドが使われる。しかしより大きな
オリゴペプチドも使用することができる。一般的
には、式の基質によつて、測定すべき酵素にア
ミノ酸もしくはアミノ酸配列が提供され、この部
分で天然基質でも開裂しかつこのアミノ酸もしく
はアミノ酸配列は該酵素に対する基質の特異性に
関して主要な要因である。専門書に多数の公知の
アミノ酸もしくはアミノ酸配列が挙げられている
が、診断上特に重要なものとしていくつかの例を
挙げる：γ−グルタミルトランスペプチダーゼの
ようなトランスペプチダーゼに関しては例えばγ
−グルタミル基〔Bergmeyer著、“Methods of
Enzymatic Analysis”、第３版、Vol.、349〜364頁、
Verlag Chemie出版（1983年）〕、ロイシンアミ
ノペプチダーゼのようなペプチダーゼ、例えばロ
イシン基〔“Z.Klin.Chem.u.Klin.Biochem..”、10
巻、192頁（1972年）〕、トリプシンのようなプロ
テイナーゼ、例えばＮ−末端が保護されたテトラ
ペプチドIle−Glu−Gly−Arg〔Bergmeyer著、
“Methods of Enzymatic Analysis”、第３版、
Vol.V、124〜129頁、Verlag Chemie出版（1984
年）〕、トロンビンのような血液凝固の過程で作用
するプロテアーゼに関しては例えばＮ−末端が保
護されたトリペプチドVal−Pro−Arg又はGly−
Pro−Arg等〔“Seminars in Thrombosis and
Hemostasis”、Vol.9、No.３、179〜183頁（1983
年）〕。 アミンＲ−NH2は、一般式の基質に対して
ペプチド結合を開裂する酵素が作用することによ
り遊離する検出可能な化合物である。一般に、一
般式の基質中でアミノ酸又はオリゴペプチドへ
の結合により遊離物質と比較して最大吸光度又は
最大螢光発光度が短い波長範囲に移動する化合物
が該当する。従つて、基質から分離した物質Ｒ−
NH2は光又は発光した螢光を長波長範囲で吸収
する。 全体的に一般式の基質は、酵素加水分解の際
に遊離する検出可能な化合物の種類に応じて３つ
のカテゴリーに分類することができる。 第１のカテゴリーは、開裂後にｐ−ニトロアニ
リン又はその誘導体を供給する基質である。例え
ば、そのような基質は西ドイツ国特許公開第
3244030号明細書及び同第3311287号明細書の目的
である。開裂により生成した検出可能な化合物は
黄色でありかつ有利には405〜420nmで測定され
る。 しかしながらそのような化合物は、試料から由
来する多数の作用要因によつて妨害されるという
欠点を有する。例えば、大きな妨害因子は血清の
固有の色、脂肪血症の混濁、高められたビリルビ
ン値等である。それ故、ｐ−ニトロアニリン−又
はｐ−ニトロアニリン誘導体を分離する基質は限
定的にしか使用し得ない。レミツシヨン測光法に
より測定する乾式化学試験では前記の因子が妨害
して基質を実際上使用することができない。 第２のカテゴリーの基質は螢光発光化合物、例
えば７−アミノ−４−メチル−クマリン、４−ト
リフルオルメチル−７−アミノ−クマリン、４−
メトキシ−β−ナフチルアミン、β−ナフチルア
ミン、５−アミノ−イソフタル酸ジメチルエステ
ルを分離する。ペプチド結合を開裂する酵素に対
する基質から遊離され得る螢光発光化合物はヨー
ロツパ特許公開第0025190号明細書に挙げられて
いる。 それらの使用には、螢光測定に必要な装置故に
問題が多い。それ故、慣用的測定の基質としては
重要ではない。 第３の基質カテゴリーは、酵素の作用下にアミ
ノフエノール、フエニレンジアミン又は他の芳香
族アミンを脱離し、これらが可視光線範囲で十分
に吸収せずかつそれ故色素形成に二次反応を必要
とするようなアミドである。たいていの場合、色
素形成には酸化的カツプリング反応が適用され
る。例えば、そのような検出原理は西ドイツ国特
許公開第3331588号明細書又はヨーロツパ特許公
開第0076042号明細書から公知である。 第３のカテゴリーの基質から脱離する化合物を
酸化二次反応と結合させるという要件はその使用
を複雑にしかつ限定的に可能であるに過ぎない。
酸化により色素を形成する。試料中に含まれるす
べての物質がそのような検出反応を妨害し得る。
とりわけその例としては血しよう又は血清中に含
まれているビリルビンがある。これを、この酸化
的カツプリングの原理により操作するすべての試
験において予備反応において排除しなければなら
ない。更に、酸化剤は、基質開裂反応中での作用
によつても前記の反応を妨害する。例えば、血液
凝固のカスケード機作の進行が酸化剤によつて作
用される。 発明が解決しようとする課題 それ故、開裂反応の際に、最大吸光度が明らか
に420nmを上廻りかつ最大吸収波長が基質の最大
吸収波長と、酵素活性の測定に申し分のないシグ
ナルが得られる程度に異なつている色素を直接形
成する、ペプチド結合開裂酵素、特にトランスペ
プチダーゼ、ペプチダーゼ及びプロテイナーゼに
対する基質について要求が生じた。 本発明の課題は、そのような基質を開示するこ
とであつた。 課題を解決するための手段 この課題は、一般式： 〔式中R1はアミノ基が場合により保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ドの基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は場合により
低級アルキルにより置換されたカルボキサミド基
を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場合
は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わしてよく、 Ｚは正電荷の共役双環式ヘテロ環系を表わし、
かつ Ｘは有機酸又は無機酸のアニオンを表わす〕の
新規化合物により解決される。 本発明による基質のアミノ酸残基又はオリゴペ
プチド基は測定すべき酵素に相応して選択するこ
とができる。その際に、アミノ酸としては炭素原
子２〜15個、殊に２〜10個を有するα−、β−又
はγ−アミノ酸が該当する。キラルのアミノ酸が
該当する場合、それはＤ−又はＬ形でもしくはラ
セミ体として存在していてよい。蛋白質及びペプ
チド抗生物質中に存在する天然産出のアミノ酸は
優れている。しかし例えばピペコリン酸、シクロ
ヘキシルアラニン、フエニルグリシン、α−アミ
ノシクロヘキシルカルボン酸、ヘキサヒドロチロ
シン、ノルロイシン又はエチオニンのような合成
アミノ酸も使用することができる。R1がアミノ
酸残基である一般式の基質を変換する酵素の例
としては、γ−グルタミル基を有する基質を変換
させるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ア
ルギニン基を含有する基質を変換するトリプシ
ン、例えばアラニンのような脂肪族アミノ酸を含
有する基質を加水分解するアミノペプチダーゼ
Ｍ、又はフエニルアラニンを含有する基質を認識
するキモトリプシンが挙げられる。 R1がオリゴペプチド基である場合、それはア
ミノ酸構成要求２〜10個、殊に２〜６個、殊に２
〜４個を含有する。オリゴペプチドのアミノ酸は
天然及び／又は合成に由来してもよくかつ一般式
の化合物中の好適なアミノ酸に関する前記の定
義に相応する。 測定すべき酵素に相応して、一般式の基質中
のR1として使用される好適なアミノ酸残基又は
オリゴペプチド基は文献〔例えば“Seminars in
Thrombosis and Hemostasis”、Vol.9、No.３、
179〜183頁（1983年）、“IUPAC Enzyme
Nomen Clature”、（1984年）、Academic Press
出版、Orlando在、T.E.Barman著、“Enzyme
Handbook”、1969、補遺、1974、Springer−
Verlag出版、Heidelberg在〕から公知である。
これらを本発明による一般式の基質中でも同様
に使用することができる。 一般式の基質中には末端部、及び／又はアミ
ノ酸残基又はオリゴペプチド基R1の場合により
存在する他のアミノ基が遊離して存在していてよ
い。場合によつては保護基により置換されていて
もよい。 例えば、アミノ保護基としてはアシル基、オキ
シカルボニル基、チオカルボニル基、スルホニル
基、スルフエニル基、ビニル基、シクロヘキセニ
ル基、ホスホリル基又はカルバモイル基が挙げら
れる。アシル基、スルホニル基及びオキシカルボ
ニル基が優れている。 アシル基としては、脂肪族又は芳香族のカルボ
ン残の残基、例えばホルミル基、アセチル基、プ
ロピオニル基、イソブチリル基、ベンゾイル基又
はナフトイル基が該当する。殊に、ホルミル基、
アセチル基及びベンゾイル基が優れている。 例えば、優れたオキシカルボニル基は、ベンジ
ルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル
基、エトキシカルボニル基及びｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル基である。 スルホニル基は、例えば炭素原子１〜６個を有
する脂肪族スルホン酸の残基、有利にはメタンス
ルホニル基及びエタンスルホニル基、又は例えば
芳香族スルホン酸残基、有利にはベンゼンスルホ
ニル基、トルエンスルホニル基及びナフチルスル
ホニル基である。 一般式を有する化合物のｐ−フエニレンジア
ミン部分の置換基R2及びR3の定義において、低
級アルキル基は炭素原子１〜６個、殊に１〜４個
を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を表わ
す。特に優れている基はメチル、エチル、イソプ
ロピル及びイソブチルである。 低級アルコキシ基であるR2及びR3では炭素原
子１〜６個、殊に１〜４個の直鎖状又は分枝鎖状
のアルコキシ基が挙げられる。優れた低級アルコ
キシ基はメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ
ブトキシ及びｔ−ブトキシである。 前記の低級アルコキシ基の定義は、低級アルコ
キシカルボニル基のR2及びR3中の低級アルコキ
シ基にも該当する。 前記の低級アルキル基の定義も同様にカルボキ
サミド基であるR2及びR3の低級アルキル置換基
に該当する。 酸のアニオンX-は有機酸又は鉱酸のアニオン
を表わす。有機又は無機の強度のアニオンが優れ
ている。アセテート−、トリフルオルアセテート
−、オキサレート−、メタンスルホネート−、サ
ルフエート−、クロリド−、ブロミド−及びペル
クロレートイオンが特に優れている。 正電荷の共役双環式ヘテロ環系のＺには多数の
基がある。ヘテロ原子として窒素又は窒素及び硫
黄を有するヘテロ環が優れている。特に、一般式
の本発明による化合物には、一般式： 〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは炭素原子又は窒素原
子を表わし、その際にそれらが橋頭原子ではない
場合には炭素原子は酸素、低級アルキル基、低級
アルコキシ基、アリール基、アラールキル基又は
アリールオキシ基により置換されていてもよく、
かつ窒素原子は低級アルキル基、アラールキル基
又はアリール基により置換されていてもよく、 Ｙは窒素原子又は硫黄原子により遮断されてい
るか又はそのようなヘテロ原子を連鎖の初めか又
は終りに含有していてもよい３〜５員の不飽和炭
化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は場合に
より低級アルキル基、低級アルコキシ基、アラー
ルキル基、アリールオキシ基又はアリール基によ
り置換されており及び／又は窒素原子は場合によ
り低級アルキル基、アラールキル基又はアリール
基により置換されており、２つの隣接する低級ア
ルキル基は場合により炭素原子３〜５個の飽和ア
ルキレン基を形成し、かつ双環中のヘテロ原子の
合計が最高３個であるにより表わされるような系
Ｚが好適である。 式中の点線は、正の過剰電荷が双環系の一定
の原子だけに局在するのではなく、メメリー又は
互変異性により環式共役の分子部分に分散して存
在することを表わす。 橋頭原子としては、双環系の両方の環に属する
原子Ａ及びＢが挙げられる。この原子は本発明に
よる基質の基Ｚ中で他の原子又は基によつて置換
されてはいない。 場合により、橋頭原子ではない基Ｄ及びＥ中の
炭素原子少なくとも１個は酸素により置換されて
いてよく、それ故例えばカルボニル基を形成す
る。 Ｄ及びＥ中の橋頭形成しない炭素原子又は窒素
原子を置換し得る低級アルキル基もしくは低級ア
ルコキシ基は、炭素原子１〜６個、殊に１〜４個
より成るものである。特に優れている基はメチル
基、エチル基、ｎ−プロピル基もしくはメトキシ
基、エトキシ基及びｎ−プロポキシ基である。 Ｄ及びＥ中の炭素原子又は窒素原子を置換し得
るアリール基もしくはアリールオキシ基は、フエ
ニル基、ナフチル基もしくはフエノキシ基及びナ
フトキシ基である。場合により、これらは炭素原
子１〜６個、殊に１〜４個を含有する低級アルキ
ル基又は低級アルコキシ基１個以上により及び／
又は弗素、塩素、臭素又は沃素のようなハロゲン
原子、殊に塩素又は臭素１個以上により置換され
ていてよい。アリール−又はアリールオキシ置換
基としてはフエニル−又はフエノキシ基が特に優
れている。 Ｄ及びＥ中の炭素−及び窒素原子の可能な置換
基としてのアラールキル基は、特にフエニルメチ
ル−及びナフチルメチル基である。フエニルメチ
ル基が特に優れている。 場合により窒素−又は硫黄原子により遮断され
ているかもしくはそのようなヘテロ原子を連鎖の
初めか終りに含有する３〜５員の不飽和炭化水素
連鎖Ｙとは、殊に他方の環系に隣接することによ
り５−又は６員環を形成するような連鎖である。
この隣接する環系は、他の環の二重結合系に共役
していて、それ故ヘテロ環系Ｚの正の過剰電荷が
両方の環系の間でのメンメリー又は互変異性によ
り交換可能である二重結合１個以上を含有する。
双環Ｚの、Ｙを含有する環の特に優れた環系はチ
アゾリウム−及びピリジニウム系である。 不飽和連鎖Ｙの炭素原子又は窒素原子を置換し
得る低級アルキル−、低級アルコキシ−、アリー
ルオキシ−、アラールキル−及びアリール基とし
ては、Ｄ及びＥ中の炭素−及び窒素原子に関して
挙げたのと同じ基が該当する。 Ｙ中で２つの隣接する低級アルキル基が炭素−
及び／又は窒素原子の置換基として存在する場
合、これは炭素原子３〜５個を有する飽和アルキ
レン基を形成し、Ｙに縮合した環を形成すること
も可能である。炭素原子３又は４個からのアルキ
レン基が優れており、これは５−又は６員環を形
成する。このようにして縮合したシクロペンタン
−又はシクロヘキサン環が特に優れている。 Ｚが である一般式の化合物が特に優れており、その
際にR4、R5、R6及びR7は同じか又は異なつてい
てよく、水素、低級アルキル−、低級アルコキシ
−、アラールキル−、アリールオキシ又はアリー
ル基を表わす。 R4〜R7の低級アルキル−、低級アルコキシ−、
アラールキル−、アリールオキシ−及びアリール
基としては一般式のＤ、Ｅ及びＹ中の置換基に
関して挙げたのと同じ基を表わす。 正電荷の共役双環式ヘテロ環系Ｚとして一般式
、、XI、XII、又はの系を有する一般
式の化合物が特に優れている。 一般式の化合物は新規である。 文献からは、芳香族又はヘテロ芳香族ニトロン
化合物とフエノール、アニリン、メチレン塩基も
しくはその前駆物質、相応してメチル置換された
第四窒素ヘテロ環、例えば２−又は４−ピコリン
ヨードメチラート、２−メチル−１−アリールキ
ノリニウム塩、ピラゾロン又はイミダゾロ−（１，
2a）−ピリジン−２−オンとの縮合が公知である
〔Houben−Weyl、10／１巻、1079頁以下；
“Chem.Ber.”、90巻、2792（1957年）；“J.Chem.
Soc.”914（1951年）；F.Hamer著、 “Cyanine and related dyes”、“The
Chemistry of Heterocyclic Compounds”、A.
Weissberger発行、Vol.18、443頁以下；H.
Stamm著、“Methodicum Chimicum”、F.
Zymalkowsky発行、Vol.6、Georg Thieme
Verlag出版、Stuttgart在、1975、33頁；“Bull.
Soc.Chim.Belg.”、58、498（1949年）；“J.Amer.
Chem.Soc.”、66、1805（1944年）〕。この縮合は熱
時にかつ例えばピペリジン、水酸化ナトリウム又
は炭酸ナトリウムによる塩基性触媒作用下に進行
する。例えば第四アンモニウム塩を使用する際に
反応は触媒作用を適用せずとも進行し得る。 Houben−Weyl 10／１巻、1081頁以下から、
３，５−ジフエニル−２−ニトロソピロールと
２，４−ジフエニルピロールとの縮合又はニトロ
ソベンゼンと２，４−ジケトピペラジンとの縮合
も公知であり、これは無水酢酸の存在において加
熱下に進行する。しかしこのような激しい反応条
件は、本発明のようにアミノ酸を構造要素として
含有する化合物では適用し得ない。 それ故、一般式の化合物が一般式： 〔式中R1はアミノ基が場合により保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ド基を表わし、かつ 同じか又は異なるR2及びR3は水素、低級アル
キル−、低級アルコキシ−、カルボキシ−、低級
アルコキシカルボニル−又は、場合により低級ア
ルキルにより置換されているカルボキサミド基を
表わすか又はR2とR3が隣接している場合は−CH
＝CH−CH＝CH−基を表わす〕のニトロソ化合
物と一般式： Z′−Ｈ （） 〔式中Z′は荷電されていない双環式ヘテロ環系
を表わす〕の化合物とを穏やかな条件及び酸性触
媒下に反応させ、かつ場合により引続いてアミノ
保護基を完全に又は部分的に除去することにより
得られることは驚異的であつた。 一般式ととの反応は温度−20〜＋50
℃、殊に＋10〜＋25℃で進行する。 酸性触媒としては有機酸又は鉱酸が好適であ
る。非プロトン性及びプロトン性の溶剤も同じよ
うに使用することができる。例えば、優れた非プ
ロトン性溶剤はジメチルホルムアミド又は塩化メ
チレンである。優れたプロトン性溶剤は、例えば
メタノール又はエタノールのようなアルコールで
ある。しかし反応媒体として酢酸を使用すると特
に優れており、この酸は溶剤及び触媒の機能を有
している。 芳香族ニトロソ化合物と一般式の双環式ヘ
テロ環式化合物との前記条件下での反応は従来公
知ではなかつた。特に、これは一般式の化合
物と、Z′が一般式ａ又はｂ：
【式】
【式】
〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥはそれぞれ炭素−又は
窒素原子を表わし、その際にそれらが橋頭原子で
はない場合、炭素原子は場合により酸素、低級ア
ルキル−、低級アルコキシ−、アリール−、アラ
ールキル−又はアリールオキシ基により置換され
かつ窒素原子は場合により低級アルキル−、アラ
ールキル−又はアリール基により置換されてお
り、 Ｙは場合により窒素原子又は硫黄原子により遮
断されているか又はそのようなヘテロ原子を連鎖
の初めか又は終りに含有している３〜５員の不飽
和炭化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は場
合により低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
ラールキル基、アリールオキシ基又はアリール基
により置換されており及び／又は窒素原子は場合
により低級アルキル基、アラールキル基又はアリ
ール基により置換されており、２つの隣接する低
級アルキル基は場合により炭素原子３〜５個の飽
和アルキレン基を形成し、かつ双環中のヘテロ原
子の合計は最高３個であり、不飽和連鎖Ｙの二重
結合は５員環の二重結合系に対して共役しており
及び／又はＡ又はＢが窒素原子である場合にはこ
れが両方の環系に対してエナミン構造を形成す
る〕により表わされるような双環式物質との反応
に該当する。 基Z′としては次のものが特に優れており、 その際に式XI、Ν、、、
、が特に優れている。 一般式及びａ／ｂ〜中の基
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｙ及びR1〜R7は一般式〜
に記載したものを表わす。これにはアミノ酸残
基又はオリゴペプチド基R1の可能なアミノ保護
基も包含される。このような保護基並びにそれら
の脱離については例えばHouben−Weyl、15／１
巻に記載されている。 一般式の双環式化合物又はZ′が一般式
ａ及びｂに記載されたものを表わすそのような化
合物は公知であるか又は公知化合物と同様にして
製造することができる。例えば、合成するための
概要は“Heterocyclic Compounds”、A.
Weissberger＆E.C.Taylor Eds.、Vol.30及び
46；“Ady.Heterocyclic Chem.”、Vol.33、185頁
以下（1983年）； “Bull.Chem.Soc.Jap.”、49、1980頁（1976年）
及び“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、1531（1974年）
に挙げられている。 一般式のニトロン化合物は新規である。一
般式を有する本発明による化合物を製造する際
の中間生成物として、該化合物も同様に本発明の
目的である。 この化合物は、一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1は場合によりアミノ基が保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ド基を表わす〕のアミノ酸又はオリゴペプチドを (a) 一般式： 〔式中同じか又は異なるR2及びR3は水素、低
級アルキル−、低級アルコキシ−、カルボキシ
−、低級アルコキシカルボニル−又は、場合によ
り低級アルキルにより置換されたカルボキサミド
基を表わすか又はR2とR3が隣接する場合、−CH
＝CH−CH＝CH−基を表わし、かつ Ｗは保護基により置換されたアミノ基を表わ
す〕のフエニレンジアミン誘導体と反応させ、引
続いて基Ｗのアミノ保護基を脱離しかつこうして
得られた遊離NH2基を含有する化合物を酸化す
るか、又は (b) ａ式のアミノ酸又はオリゴペプチドを一般
式： 〔式中R2及びR3は式に挙げたものを
表わす〕のｐ−ニトロアニリンと反応させ、こう
して得られたニトロ化合物を相応するヒドロキシ
ルアミンに還元し、かつその後酸化することによ
り製造することができる。 (b)法による一般式ａの化合物との化
合物との反応により製造されたニトロ化合物は相
応するアミノ化合物に還元され得ることもあるこ
とは明らかである。これは、(a)法により一般式
ａの化合物と式の化合物とを反応させ、
引続いて保護基を脱離することにより得られた遊
離NH2基を有するフエニレンジアミン誘導体と
同一であり、これと同様にして一般式のニト
ロソ誘導体に酸化することができる。 一般式ａ、並びに式の化合
物中に記載の基R1〜R3は一般式に記載のもの
と同じものを表わす。保護されたアミノ基Ｗのア
ミノ保護基についても同様であり、アミノ酸残基
又はオリゴペプチド基R1の保護基に相当する。
しかし(a)法により製造された分子中のR1及びＷ
中のアミノ保護基は同一であつてはならない。 アミノ酸又はオリゴペプチドと一般式
及びΝにより表わされるアニリン誘導体と
の間の縮合反応は技術水準から公知である。例え
ばHouben−Weyl15／１巻及び15／２巻に詳細に
記載されている。 Ｗからのアミノ保護基の脱離はHouben−
Weyl15／１巻に記載されているように行なう。 (a)法によりＷからのアミノ保護基の脱離後に得
られた遊離アミノ基を有する化合物は公知方法、
例えばHouben−Weyl、10／１巻、1017頁以下に
より酸化し、一般式のニトロソ化合物に変換
することができる。このために酸化剤としてカロ
酸又はペルオキシカルボン酸、例えば過酢酸を使
用すると優れている。 Houben−Weyl、10／１巻、1091頁以下から、
ニトロ化合物をヒドロキシルアミンに還元する方
法が公知である。これは、(b)法により一般式ａ
及びの化合物から製造された縮合生成物
の還元に関しても実施することができる。このよ
うにして製造したヒドロキシルアミン誘導体の酸
化は強い酸化剤を用いて行なうことができる。こ
れには酸化クロム（）又は過沃素酸ナトリウム
が特に優れている。 (b)法により製造したニトロ化合物を(a)法により
製造した遊離NH2基を含有する化合物に変換す
ることも同様に公知方法により、例えば亜ジチオ
ン酸ナトリウムで還元することにより又は例えば
パラジウム／カーボンのような好適な触媒上で水
素化することにより行なうことができる。 一般式の本発明による基質は塩の形で存在す
ると有利である。それ故そのように製造し、かつ
この形で良好な貯蔵安定性により優れている。し
かし塩基を用いて簡単に遊離形、中性形又は荷電
されていない形に変換することができる。 遊離形は式′： 〔式中R1〜R3は一般式と同じものを表わし、
かつＺは正電荷の共役双環式ヘチロ環系Ｚの荷電
していないメソメリーを表わす〕により表わされ
る。 一般式の化合物を合成する際に、相応するペ
プチド結合を開裂する酵素による酵素的加水分解
により、420nmを上廻る波長を吸するフエニレン
ジアミン誘導体を遊離する物質が生成する。一般
に、酵素的に遊離した色素は赤色乃至青色に着色
されている。 ペプチド結合を開裂する酵素を測定するための
従来公知の基質に比べて本発明による化合物は非
常に有利な特性を有する。本発明による化合物は
湿式−及び乾式試験でも使用することのできる水
溶性の安定な化合物である。 酵素的加水分解により遊離したフエニレンジア
ミン誘導体の長波の光吸収に基づき、血清又は混
濁の固有の色による妨害は回避される。 アミド結合の加水分解により遊離した色素の光
吸収の強さの測定は、一般式の本発明による基
の最大吸収波長と酵素開裂後に存在する色素のそ
れとの差（λ−シフト）故に、加水分解反応の追
跡に十分な精度をもつて可能である。 ペプチド結合を開裂する酵素が一般式の化合
物に作用する際に、直接かつそれ以上の二次反応
なしに測光法により測定することのできる物質が
直接形成されるので、他の反応成分、例えば酸化
剤及び酸化的カツプリング反応用のカツプリング
成分の添加による酵素反応の妨害という問題は存
在しない。ペプチド結合を開裂する酵素の測定は
妨害されることなく実施することができる。 本発明の他の目的は、一般式の化合物を相応
するペプチド結合開裂酵素の活性度を検出しかつ
測定するために使用することである。本発明によ
る基質がペプチド結合を開裂する酵素、特にトラ
ンスペプチダーゼ、ペプチダーゼ及びプロテイナ
ーゼの活性度を測定するのに好適であることが明
らかになつた。例えば、トランスペプチダーゼと
しては、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、
ペプチダーゼとしてはロイシンアリールアミダー
ゼ又はアミノペプチダーゼＭもしくはプロテイナ
ーゼとしてはカテプシン、キモトリプシン、コラ
グナーゼ、エラスターゼ、スブチリシン、エンテ
ロキナーゼ、パパイン、トリプシン及び特に血液
凝固及び繊維素溶解の進行に関与するすべてのプ
ロテアーゼを検出かつ測定することができる。殊
に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ロイ
シンアリールアミダーゼ及び血液凝固又は繊維素
溶解に関与する酵素、並びにトリプシン及びキモ
トリプシンの測定に本発明による化合物が特に好
適であることが明らかになつた。 そのような酵素を検出するには、Ｚが一般式
で挙げたものを表わす一般式の化合物を使用す
ると優れている。Ｚは一般式〜のものを表
わすような本発明による化合物を使用すると特に
優れている。これらのうち一般式、、XI、
XII、及びの基が特に好適である。 一定の酵素に対する本発明による基質の特異性
にとつて必要である、一般式の化合物の基R1
におけるアミノ酸又はアミノ酸配列は公知であ
る。測定すべき酵素に相応して選択することがで
きる。 酵素活性を動力学法又は終点法により測光法に
より測定する際に本発明による化合物を使用する
と優れている。その際に、本発明による基質１種
又は数種並びに場合により他の試薬及び助剤を測
定すべき酵素を含有する試料と混合する。一般式
の化合物は相応するペプチド結合開裂酵素の存
在で加水分解されかつ色素形成するフエニレンジ
アミン誘導体を遊離する。これにより惹起された
反応混合物の吸収の変化を測光法により測定す
る。標準溶液との直接的な比較又は標準曲線との
間接的な比較により、試料中の測定すべき酵素の
活性が確定する。 例えば、本発明による基質は、凝固因子の活性
をそれらの酵素活性の測定を介して測定する血液
凝固試験又は反応の開始から一定の酵素活性の発
生までに経過する時間を測定するグローバル試験
（Globaltest）でも適用することができる。例え
ば、後者ではクイツク（Quick）による単相凝固
試験（Einphasengerinnungstest）又は活性化さ
れた部分トロンボプラスチン時間の測定が該当す
る。両方共、生成したトロンビンの開裂による一
定量の色素の発生の速度を尺度として適用する。 本発明の他の目的はペプチド結合開裂酵素を検
出及び測定するための診断剤である。そのような
診断剤は一般式の本発明による基質１種又はそ
れ以上と共に好適な緩衝剤を並びに場合によりそ
のような診断剤に常用の他の好適な添加物、例え
ば湿潤剤、安定剤等を含有する。診断剤は溶液の
形で、凍結乾燥体として、粉末混合物として、試
薬錠剤として又は好適な賦形剤上に施して存在さ
せてよい。 溶液の形の本発明による診断剤が酵素試験に必
要な全試薬を含有すると有利である。溶剤として
は、水又は、水と水溶性有機溶剤、例えばメタノ
ール、エタノール、アセトン又はジメチルホルム
アミドとの混合物が該当する。耐久性のために、
試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分割して、
試験の際に初めて混合すると有利なはずである。 全量がそれぞれ５〜20mg、殊に約10mgの凍結乾
燥体の形の診断剤の製造に当つては、試験に必要
な全試薬を含有する溶液を乾燥させる。 粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤は、試験
成分に常用のガレヌス添加物を添加して造粒する
ことにより製造することができる。この種の添加
物は、例えばマンニツト、ソルビツト又はキシリ
ツトのような糖アルコール、もしくはポリエチレ
ングリコール又はポリビニルピロリドンのような
他の可溶性不活性化合物である。粉末混合物又は
試薬錠剤は一般に最終重量約30〜200mg、殊に50
〜80mgを有する。 診断剤を試験片の形で製造するに当り、吸収性
又は膨潤性のキヤリア、殊に濾紙、セルロース又
は合成繊維フリースを易揮発性溶剤、例えば水、
メタノール、エタノール又はアセトン中の試験片
の製造に常用の必要な試薬の溶液で含浸すること
ができる。これを１含浸工程で行なうことができ
る。しかし含浸を数工程で実施し、その際にそれ
ぞれ診断剤の一部の成分を含有する溶液を使用す
るとしばしば有利である。例えば、第１工程で緩
衝剤及び他の水溶性添加物を含有する水溶液で、
次に第２工程でペプチド結合を開裂する酵素の基
質を含有する溶液で含浸することができる。最終
的な試験紙をそのままで使用するか又は公知方法
で握りを接着するか又は有利に西ドイツ国特許公
開第2118455号明細書によりプラスチツクとフア
インメツシユのネツト材との間に封入することが
できる。 ペプチド結合を開裂する酵素及び特に凝固因子
を測定するための本発明による基質はヨーロツパ
特許公開第0208218号明細書、西ドイツ国特許公
開第3610429号明細書による診断剤又はヨーロツ
パ特許公開第0045476号明細書に記載の本発明に
関連する類似する製剤中でも使用することができ
る。 実施例 次に実施例により本発明による化合物を合成す
るのに適用することのできる多数の方法のうちの
いくつかを、並びに新規な基質をペプチド結合を
開裂する酵素を測定するのに使用することについ
て詳説する。 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル Fp＝融点（℃） γ−Glu＝γ−グルタミン酸 Gly＝グリシン Nle＝ノルロイシン Phe＝フエニルアラニン Pro＝プロリン Tos＝ｐ−トルエンスルホニル Hepes＝４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペ
ラジン−エタンスルホン酸 Tris＝トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン Rf値は珪酸ゲルプレート上の薄層クロマトグ
ラフイにより確定する。 例 １ 2H−１，４−ジヒドロ−４−メチル−２−オ
キソ−３−〔４−（トシルグリシル−Ｌ−プロピ
ル−Ｌ−アルギニル−アミド）−フエニルイミ
ノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−
サルフエートの製造 ａ） 近似式：2KHSO5×K2SO4×KHSO4のト
リペル塩（CaroatR、Degussa社、西ドイツ国
ハナウ在）5.7ｇを水150ml中に溶かしかつこの
溶液を炭酸カリウムの添加によりPH７に調節す
る。この溶液を水210ml中のトシル−グリシル
−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−（４−アミ
ノアニリド）3.94ｇの溶液に滴加し、混合物を
約５分間撹拌しかつ沈殿を濾取する。精製する
ためにこの沈殿を氷酢酸中に溶かす。不溶の褐
色沈殿を濾別しかつ濾液を撹拌下にエーテ中に
滴加する。析出した黄褐色沈殿を濾取する。ト
シル−グリシル−Ｌ−プロピルル−Ｌ−アルギ
ニル−（４−ニトロソアニリド）−1/2サルフエ
ート３ｇ（81％）が得られる。 Rf＝0.65、ｎ−ブタノール／酢酸／水２：１：
１ ｂ） 合成について“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、
1531（1974年）に記載されている相応するエチ
ルエステルと同様に、２，４−ジヒドロ−２−
ヒドロキシ−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン
−３−カルボン酸メチルエステルを製造する。
Fp.270℃（分解）。このメチルエステル6.27ｇ
をジメチルホルムアミド100ml中に懸濁しかつ
沃化メチル2.1mlを加える。撹拌下に鉱油中の
55重量％水素化ナトリウム1.43ｇを少量ずつ加
え、引続いて混合物を室温で２時間撹拌する。
反応混合物を蒸発濃縮しかつ珪酸ゲルでアセト
ン／メタノール（90：10）、メタノール及びメ
タノール／H2O（80：20）を用いてクロマトグ
ラフイ処理する。Fp175℃の4H−２−ヒドロ
キシ−４−メチル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピ
リジン−３−カルボン酸メチルエステル６ｇ
（88％）が得られる。 このエステル0.5ｇを濃HCl30mlと一緒に２
時間還流下に沸騰させる。反応混合物を蒸発濃
縮させ、残渣をメタノール中に溶かし、かつ生
成物をエーテルの添加により析出させる。 Fp220℃の2H−１，４−ジヒドロ−４−メ
チル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン−２−
オン0.3ｇ（84％）が得られる。 ｃ） 例1a）で得られたニトロソ化合物0.684ｇ
を氷酢酸７ml中に溶かしかつ撹拌下にジメチル
ホルムアミド６ml中の例1b）からの2H−１，
４−ジヒドロ−４−メチル−ピロロ−（３，２
−ｂ）−ピリジン−２−オン0.14ｇの溶液を滴
加する。赤色溶液を室温で８時間撹拌し、一晩
冷蔵庫に保存し、濃縮しかつ残渣を珪酸ゲルカ
ラムでｎ−ブタノール／氷酢酸／水（２：１：
１）を用いてクロマトグラフイ処理する。生成
物含有フラクシヨンを合しかつ濃縮する。残渣
をエーテルで浸漬しかつ吸引濾過する。次の構
造の赤色物質0.17ｇが得られる： Rf＝0.18（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水（２：
１：１））、 Fp 167〜170℃ 例 ２ 例１と同様にしてトシル−グリシル−Ｌ−プロ
ピル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロソアニリドと
次表に記載のヘテロ環式化合物との反応により次
の発色性ペプチドヒドロラーゼ基質が得られる。
窒素原子を表わし、その際にそれらが橋頭原子で
はない場合、炭素原子は場合により酸素、低級ア
ルキル−、低級アルコキシ−、アリール−、アラ
ールキル−又はアリールオキシ基により置換され
かつ窒素原子は場合により低級アルキル−、アラ
ールキル−又はアリール基により置換されてお
り、 Ｙは場合により窒素原子又は硫黄原子により遮
断されているか又はそのようなヘテロ原子を連鎖
の初めか又は終りに含有している３〜５員の不飽
和炭化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は場
合により低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
ラールキル基、アリールオキシ基又はアリール基
により置換されており及び／又は窒素原子は場合
により低級アルキル基、アラールキル基又はアリ
ール基により置換されており、２つの隣接する低
級アルキル基は場合により炭素原子３〜５個の飽
和アルキレン基を形成し、かつ双環中のヘテロ原
子の合計は最高３個であり、不飽和連鎖Ｙの二重
結合は５員環の二重結合系に対して共役しており
及び／又はＡ又はＢが窒素原子である場合にはこ
れが両方の環系に対してエナミン構造を形成す
る〕により表わされるような双環式物質との反応
に該当する。 基Z′としては次のものが特に優れており、 その際に式XI、Ν、、、
、が特に優れている。 一般式及びａ／ｂ〜中の基
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｙ及びR1〜R7は一般式〜
に記載したものを表わす。これにはアミノ酸残
基又はオリゴペプチド基R1の可能なアミノ保護
基も包含される。このような保護基並びにそれら
の脱離については例えばHouben−Weyl、15／１
巻に記載されている。 一般式の双環式化合物又はZ′が一般式
ａ及びｂに記載されたものを表わすそのような化
合物は公知であるか又は公知化合物と同様にして
製造することができる。例えば、合成するための
概要は“Heterocyclic Compounds”、A.
Weissberger＆E.C.Taylor Eds.、Vol.30及び
46；“Ady.Heterocyclic Chem.”、Vol.33、185頁
以下（1983年）； “Bull.Chem.Soc.Jap.”、49、1980頁（1976年）
及び“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、1531（1974年）
に挙げられている。 一般式のニトロン化合物は新規である。一
般式を有する本発明による化合物を製造する際
の中間生成物として、該化合物も同様に本発明の
目的である。 この化合物は、一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1は場合によりアミノ基が保護基によ
り置換されているアミノ酸残基又はオリゴペプチ
ド基を表わす〕のアミノ酸又はオリゴペプチドを (a) 一般式： 〔式中同じか又は異なるR2及びR3は水素、低
級アルキル−、低級アルコキシ−、カルボキシ
−、低級アルコキシカルボニル−又は、場合によ
り低級アルキルにより置換されたカルボキサミド
基を表わすか又はR2とR3が隣接する場合、−CH
＝CH−CH＝CH−基を表わし、かつ Ｗは保護基により置換されたアミノ基を表わ
す〕のフエニレンジアミン誘導体と反応させ、引
続いて基Ｗのアミノ保護基を脱離しかつこうして
得られた遊離NH2基を含有する化合物を酸化す
るか、又は (b) ａ式のアミノ酸又はオリゴペプチドを一般
式： 〔式中R2及びR3は式に挙げたものを
表わす〕のｐ−ニトロアニリンと反応させ、こう
して得られたニトロ化合物を相応するヒドロキシ
ルアミンに還元し、かつその後酸化することによ
り製造することができる。 (b)法による一般式ａの化合物との化
合物との反応により製造されたニトロ化合物は相
応するアミノ化合物に還元され得ることもあるこ
とは明らかである。これは、(a)法により一般式
ａの化合物と式の化合物とを反応させ、
引続いて保護基を脱離することにより得られた遊
離NH2基を有するフエニレンジアミン誘導体と
同一であり、これと同様にして一般式のニト
ロソ誘導体に酸化することができる。 一般式ａ、並びに式の化合
物中に記載の基R1〜R3は一般式に記載のもの
と同じものを表わす。保護されたアミノ基Ｗのア
ミノ保護基についても同様であり、アミノ酸残基
又はオリゴペプチド基R1の保護基に相当する。
しかし(a)法により製造された分子中のR1及びＷ
中のアミノ保護基は同一であつてはならない。 アミノ酸又はオリゴペプチドと一般式
及びΝにより表わされるアニリン誘導体と
の間の縮合反応は技術水準から公知である。例え
ばHouben−Weyl15／１巻及び15／２巻に詳細に
記載されている。 Ｗからのアミノ保護基の脱離はHouben−
Weyl15／１巻に記載されているように行なう。 (a)法によりＷからのアミノ保護基の脱離後に得
られた遊離アミノ基を有する化合物は公知方法、
例えばHouben−Weyl、10／１巻、1017頁以下に
より酸化し、一般式のニトロソ化合物に変換
することができる。このために酸化剤としてカロ
酸又はペルオキシカルボン酸、例えば過酢酸を使
用すると優れている。 Houben−Weyl、10／１巻、1091頁以下から、
ニトロ化合物をヒドロキシルアミンに還元する方
法が公知である。これは、(b)法により一般式ａ
及びの化合物から製造された縮合生成物
の還元に関しても実施することができる。このよ
うにして製造したヒドロキシルアミン誘導体の酸
化は強い酸化剤を用いて行なうことができる。こ
れには酸化クロム（）又は過沃素酸ナトリウム
が特に優れている。 (b)法により製造したニトロ化合物を(a)法により
製造した遊離NH2基を含有する化合物に変換す
ることも同様に公知方法により、例えば亜ジチオ
ン酸ナトリウムで還元することにより又は例えば
パラジウム／カーボンのような好適な触媒上で水
素化することにより行なうことができる。 一般式の本発明による基質は塩の形で存在す
ると有利である。それ故そのように製造し、かつ
この形で良好な貯蔵安定性により優れている。し
かし塩基を用いて簡単に遊離形、中性形又は荷電
されていない形に変換することができる。 遊離形は式′： 〔式中R1〜R3は一般式と同じものを表わし、
かつＺは正電荷の共役双環式ヘチロ環系Ｚの荷電
していないメソメリーを表わす〕により表わされ
る。 一般式の化合物を合成する際に、相応するペ
プチド結合を開裂する酵素による酵素的加水分解
により、420nmを上廻る波長を吸するフエニレン
ジアミン誘導体を遊離する物質が生成する。一般
に、酵素的に遊離した色素は赤色乃至青色に着色
されている。 ペプチド結合を開裂する酵素を測定するための
従来公知の基質に比べて本発明による化合物は非
常に有利な特性を有する。本発明による化合物は
湿式−及び乾式試験でも使用することのできる水
溶性の安定な化合物である。 酵素的加水分解により遊離したフエニレンジア
ミン誘導体の長波の光吸収に基づき、血清又は混
濁の固有の色による妨害は回避される。 アミド結合の加水分解により遊離した色素の光
吸収の強さの測定は、一般式の本発明による基
の最大吸収波長と酵素開裂後に存在する色素のそ
れとの差（λ−シフト）故に、加水分解反応の追
跡に十分な精度をもつて可能である。 ペプチド結合を開裂する酵素が一般式の化合
物に作用する際に、直接かつそれ以上の二次反応
なしに測光法により測定することのできる物質が
直接形成されるので、他の反応成分、例えば酸化
剤及び酸化的カツプリング反応用のカツプリング
成分の添加による酵素反応の妨害という問題は存
在しない。ペプチド結合を開裂する酵素の測定は
妨害されることなく実施することができる。 本発明の他の目的は、一般式の化合物を相応
するペプチド結合開裂酵素の活性度を検出しかつ
測定するために使用することである。本発明によ
る基質がペプチド結合を開裂する酵素、特にトラ
ンスペプチダーゼ、ペプチダーゼ及びプロテイナ
ーゼの活性度を測定するのに好適であることが明
らかになつた。例えば、トランスペプチダーゼと
しては、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、
ペプチダーゼとしてはロイシンアリールアミダー
ゼ又はアミノペプチダーゼＭもしくはプロテイナ
ーゼとしてはカテプシン、キモトリプシン、コラ
グナーゼ、エラスターゼ、スブチリシン、エンテ
ロキナーゼ、パパイン、トリプシン及び特に血液
凝固及び繊維素溶解の進行に関与するすべてのプ
ロテアーゼを検出かつ測定することができる。殊
に、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ロイ
シンアリールアミダーゼ及び血液凝固又は繊維素
溶解に関与する酵素、並びにトリプシン及びキモ
トリプシンの測定に本発明による化合物が特に好
適であることが明らかになつた。 そのような酵素を検出するには、Ｚが一般式
で挙げたものを表わす一般式の化合物を使用す
ると優れている。Ｚは一般式〜のものを表
わすような本発明による化合物を使用すると特に
優れている。これらのうち一般式、、XI、
XII、及びの基が特に好適である。 一定の酵素に対する本発明による基質の特異性
にとつて必要である、一般式の化合物の基R1
におけるアミノ酸又はアミノ酸配列は公知であ
る。測定すべき酵素に相応して選択することがで
きる。 酵素活性を動力学法又は終点法により測光法に
より測定する際に本発明による化合物を使用する
と優れている。その際に、本発明による基質１種
又は数種並びに場合により他の試薬及び助剤を測
定すべき酵素を含有する試料と混合する。一般式
の化合物は相応するペプチド結合開裂酵素の存
在で加水分解されかつ色素形成するフエニレンジ
アミン誘導体を遊離する。これにより惹起された
反応混合物の吸収の変化を測光法により測定す
る。標準溶液との直接的な比較又は標準曲線との
間接的な比較により、試料中の測定すべき酵素の
活性が確定する。 例えば、本発明による基質は、凝固因子の活性
をそれらの酵素活性の測定を介して測定する血液
凝固試験又は反応の開始から一定の酵素活性の発
生までに経過する時間を測定するグローバル試験
（Globaltest）でも適用することができる。例え
ば、後者ではクイツク（Quick）による単相凝固
試験（Einphasengerinnungstest）又は活性化さ
れた部分トロンボプラスチン時間の測定が該当す
る。両方共、生成したトロンビンの開裂による一
定量の色素の発生の速度を尺度として適用する。 本発明の他の目的はペプチド結合開裂酵素を検
出及び測定するための診断剤である。そのような
診断剤は一般式の本発明による基質１種又はそ
れ以上と共に好適な緩衝剤を並びに場合によりそ
のような診断剤に常用の他の好適な添加物、例え
ば湿潤剤、安定剤等を含有する。診断剤は溶液の
形で、凍結乾燥体として、粉末混合物として、試
薬錠剤として又は好適な賦形剤上に施して存在さ
せてよい。 溶液の形の本発明による診断剤が酵素試験に必
要な全試薬を含有すると有利である。溶剤として
は、水又は、水と水溶性有機溶剤、例えばメタノ
ール、エタノール、アセトン又はジメチルホルム
アミドとの混合物が該当する。耐久性のために、
試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分割して、
試験の際に初めて混合すると有利なはずである。 全量がそれぞれ５〜20mg、殊に約10mgの凍結乾
燥体の形の診断剤の製造に当つては、試験に必要
な全試薬を含有する溶液を乾燥させる。 粉末混合物又は試薬錠剤の形の診断剤は、試験
成分に常用のガレヌス添加物を添加して造粒する
ことにより製造することができる。この種の添加
物は、例えばマンニツト、ソルビツト又はキシリ
ツトのような糖アルコール、もしくはポリエチレ
ングリコール又はポリビニルピロリドンのような
他の可溶性不活性化合物である。粉末混合物又は
試薬錠剤は一般に最終重量約30〜200mg、殊に50
〜80mgを有する。 診断剤を試験片の形で製造するに当り、吸収性
又は膨潤性のキヤリア、殊に濾紙、セルロース又
は合成繊維フリースを易揮発性溶剤、例えば水、
メタノール、エタノール又はアセトン中の試験片
の製造に常用の必要な試薬の溶液で含浸すること
ができる。これを１含浸工程で行なうことができ
る。しかし含浸を数工程で実施し、その際にそれ
ぞれ診断剤の一部の成分を含有する溶液を使用す
るとしばしば有利である。例えば、第１工程で緩
衝剤及び他の水溶性添加物を含有する水溶液で、
次に第２工程でペプチド結合を開裂する酵素の基
質を含有する溶液で含浸することができる。最終
的な試験紙をそのままで使用するか又は公知方法
で握りを接着するか又は有利に西ドイツ国特許公
開第2118455号明細書によりプラスチツクとフア
インメツシユのネツト材との間に封入することが
できる。 ペプチド結合を開裂する酵素及び特に凝固因子
を測定するための本発明による基質はヨーロツパ
特許公開第0208218号明細書、西ドイツ国特許公
開第3610429号明細書による診断剤又はヨーロツ
パ特許公開第0045476号明細書に記載の本発明に
関連する類似する製剤中でも使用することができ
る。 実施例 次に実施例により本発明による化合物を合成す
るのに適用することのできる多数の方法のうちの
いくつかを、並びに新規な基質をペプチド結合を
開裂する酵素を測定するのに使用することについ
て詳説する。 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル Fp＝融点（℃） γ−Glu＝γ−グルタミン酸 Gly＝グリシン Nle＝ノルロイシン Phe＝フエニルアラニン Pro＝プロリン Tos＝ｐ−トルエンスルホニル Hepes＝４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペ
ラジン−エタンスルホン酸 Tris＝トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン Rf値は珪酸ゲルプレート上の薄層クロマトグ
ラフイにより確定する。 例 １ 2H−１，４−ジヒドロ−４−メチル−２−オ
キソ−３−〔４−（トシルグリシル−Ｌ−プロピ
ル−Ｌ−アルギニル−アミド）−フエニルイミ
ノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−
サルフエートの製造 ａ） 近似式：2KHSO5×K2SO4×KHSO4のト
リペル塩（CaroatR、Degussa社、西ドイツ国
ハナウ在）5.7ｇを水150ml中に溶かしかつこの
溶液を炭酸カリウムの添加によりPH７に調節す
る。この溶液を水210ml中のトシル−グリシル
−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−（４−アミ
ノアニリド）3.94ｇの溶液に滴加し、混合物を
約５分間撹拌しかつ沈殿を濾取する。精製する
ためにこの沈殿を氷酢酸中に溶かす。不溶の褐
色沈殿を濾別しかつ濾液を撹拌下にエーテ中に
滴加する。析出した黄褐色沈殿を濾取する。ト
シル−グリシル−Ｌ−プロピルル−Ｌ−アルギ
ニル−（４−ニトロソアニリド）−1/2サルフエ
ート３ｇ（81％）が得られる。 Rf＝0.65、ｎ−ブタノール／酢酸／水２：１：
１ ｂ） 合成について“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、
1531（1974年）に記載されている相応するエチ
ルエステルと同様に、２，４−ジヒドロ−２−
ヒドロキシ−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン
−３−カルボン酸メチルエステルを製造する。
Fp.270℃（分解）。このメチルエステル6.27ｇ
をジメチルホルムアミド100ml中に懸濁しかつ
沃化メチル2.1mlを加える。撹拌下に鉱油中の
55重量％水素化ナトリウム1.43ｇを少量ずつ加
え、引続いて混合物を室温で２時間撹拌する。
反応混合物を蒸発濃縮しかつ珪酸ゲルでアセト
ン／メタノール（90：10）、メタノール及びメ
タノール／H2O（80：20）を用いてクロマトグ
ラフイ処理する。Fp175℃の4H−２−ヒドロ
キシ−４−メチル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピ
リジン−３−カルボン酸メチルエステル６ｇ
（88％）が得られる。 このエステル0.5ｇを濃HCl30mlと一緒に２
時間還流下に沸騰させる。反応混合物を蒸発濃
縮させ、残渣をメタノール中に溶かし、かつ生
成物をエーテルの添加により析出させる。 Fp220℃の2H−１，４−ジヒドロ−４−メ
チル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン−２−
オン0.3ｇ（84％）が得られる。 ｃ） 例1a）で得られたニトロソ化合物0.684ｇ
を氷酢酸７ml中に溶かしかつ撹拌下にジメチル
ホルムアミド６ml中の例1b）からの2H−１，
４−ジヒドロ−４−メチル−ピロロ−（３，２
−ｂ）−ピリジン−２−オン0.14ｇの溶液を滴
加する。赤色溶液を室温で８時間撹拌し、一晩
冷蔵庫に保存し、濃縮しかつ残渣を珪酸ゲルカ
ラムでｎ−ブタノール／氷酢酸／水（２：１：
１）を用いてクロマトグラフイ処理する。生成
物含有フラクシヨンを合しかつ濃縮する。残渣
をエーテルで浸漬しかつ吸引濾過する。次の構
造の赤色物質0.17ｇが得られる： Rf＝0.18（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水（２：
１：１））、 Fp 167〜170℃ 例 ２ 例１と同様にしてトシル−グリシル−Ｌ−プロ
ピル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロソアニリドと
次表に記載のヘテロ環式化合物との反応により次
の発色性ペプチドヒドロラーゼ基質が得られる。
【表】
【表】
例2c）の出発ヘテロ環の製造
２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−ピロロ−
（３，２−ｂ）−ピリジン−カルボン酸エチルエス
テル５ｇをジメチルホルムアミド180ml中に懸濁
させる。沃化メチル10ml、引続いて水素化ナトリ
ウム（55％）４ｇを少量ずつ添加する。反応混合
物を室温で３時間撹拌しかつ蒸発濃縮する。残渣
を水中に溶かす。溶液を塩化メチレンで数回抽出
する。合した有機相を乾燥しかつ蒸発懸濁する。
残渣を少量の熱いアセトン中に溶かしかつ生成物
をエーテルで析出する。Fp145〜147℃の相応す
るＮ，N′−ジメチル化合物3.2ｇが得られ、これ
を濃塩酸110mlと共に24時間還流下に沸騰させる。
反応混合物を濃縮乾固し、水中に溶かしかつこの
溶液をNa2CO3の添加によりアルカリ性に調節す
る。数回塩化メチレンで抽出する。有機相を合し
かつ蒸発濃縮する。Fp144℃の2H−１，４−ジ
ヒドロ−１，４−ジメチル−ピロロ−（３，２−
ｂ）−ピリジン−２−オン1.9ｇ（90％）が得られ
る。 例2d）の出発ヘテロ環の製造 例2c）の出発ヘテロ環の製造と同様にして、
２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−ピロロ−
（２，３−ｃ）−ピリジン−３−カルボン酸エチル
エステルからＮ，N′−ジメチル化合物の2H−
１，６−ジヒドロ−１，６−ジメチル−ピロロ−
（２，３−ｃ）ピリジン−２−オンが得られる。
この粗製生成物を珪酸ゲルで塩化メチレン／メタ
ノール９：１を用いてクロマトグラフイ処理をす
る。黄色の無定形物質が得られる。 Rf＝0.46（塩化メチレン／メタノール９：１） 例2g）の出発ヘテロ環の製造 例2cの出発ヘテロ環の製造と同様にして２，３
−ジヒドロ−５−メチル−２−ヒドロキシ−ピロ
ロ−（３，２−ｂ）ピリジン−３−カルボン酸エ
ステル〔Fp252℃、５−Ｈ−化合物と同様にして
製造した、“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、1521（1974
年）〕からFp195〜200℃のＮ，N′−ジメチル化合
物の2H−１，４−ジヒドロ−１，４，５−トリ
メチル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン−２−
オンが得られる。 例2h）の出発ヘテロ環の製造 例2c）の出発ヘテロ環の製造と同様にして、沃
化ｎ−プロピルによりアルキル化し、引続いてけ
ん化しかつカルボン酸エチルエステルの脱カルボ
キシルすることにより2H−１，４−ジヒドロ−
１，４−ジ−プロピル−ピロロ−（３，２−ｂ）−
ピリジン−２−オンが油状生成物として得られ
る。 Rf＝＝0.4（酢酸エチルエステル／エタノール９：
１） 例2i）の出発ヘテロ環の製造 酪酸アミド10.5ｇ及び五硫化リン5.4ｇをトル
エン８ml中に懸濁させ、かつ初めは冷却下に、そ
の後約75〜80℃でトルエン10ml中の２−ブロムシ
クロヘキサノン21.5ｇの溶液を加える。引続いて
15分間還流下に加熱し、冷却させかつ反応混合物
のPHを2Nカセイソーダで８〜９に調節する。生
成物を酢酸エチルエステルで抽出する。精製する
ために、生成物を蒸留し（沸点77〜84℃／0.1mm
Hg）かつリグロイン／酢酸エチルエステル
（10：１）により珪酸ゲルを介して濾過する。２
−ｎ−プロピル−４，５，６，７−テトラヒドロ
−ベンゾ−１，３−チアゾール（Rf＝0.35、リグ
ロイン／酢酸エチルエステル90：10）3.1ｇが得
られる。この化合物2.7ｇをアセトン25ml中に溶
かし、ブロムアセトン3.06ｇを加えかつ14時間還
流加熱する。アセトンを留去させかつ残渣にエタ
ノール335ml及びナトリウムメチラート8.7ｇを加
える。混合物を１時間還流下に加熱しかつ約50ml
に濃縮する。この溶液を水500ml中に注入しかつ
酢酸エチルエステルで抽出する。粗製生成物をリ
グロイン／酢酸エチルエステル（98：２）を用い
て珪酸ゲルを介してクロマトグラフイ処理する。
次の構造（ｍ／ｅ＝219）の所望のピロロ−〔２，
１−ｂ〕−チアゾール１ｇが得られる： 例2k）の出発ヘテロ環の製造 Ｋ−ｔ−ブチラート（カリウム12.48ｇとｔ−
ブタノール600mlとから製造）の懸濁液に約80℃
でマロン酸ジエチルエステル48.5mlを加える。こ
の白色懸濁液にｔ−ブタノール200ml中の２−ク
ロル−６−メトキシ−３−ニトロピリジン30.2ｇ
の熱い溶液を滴加する。反応混合物を17時間還流
加熱する。蒸発乾固し、残渣を水中に懸濁させ、
2N塩酸で中和しかつジエチルエーテルで数回抽
出する。乾燥させたエーテル相を濃縮しかつ残渣
を珪酸ゲルで酢酸エチルエステル／リグロイン
（１：９）を用いて精製し、Fp84〜85℃の２−
（６−メトキシ−３−ニトロ）−ピリジル−マロン
酸ジエチルエステル40.4ｇ（81％）が得られた。 このようにして得られた物質20ｇをエタノー
ル／塩化メチレン（４：１）500ml中に溶かし、
かつパラジウム／溶性炭触媒上で水素化する。触
媒を濾別し、濾液を約250mlに濃縮しかつ氷酢酸
25mlを加える。混合物を還流下に４時間加熱し、
かつ冷蔵庫で一晩放置する。析出した沈殿を濾取
する。母液から約100mlに濃縮しかつジエチルエ
ーテル約500mlを加えることにより更に生成物が
得られる。１，４−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−
５−メトキシ−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン
−３−カルボン酸エチルエステルの収量は合計
10.8ｇ（72％）である。Fp184〜186℃。 例2cの出発ヘテロ環の製造と同様にして前記の
化合物からFp156〜159℃の2H−１，４−ジヒド
ロ−１，４−ジメチル−５−メトキシ−ピロロ−
〔３，２−ｂ〕−ピリジン−２−オンが得られる。 例 ３ 2H−１，４−ジヒドロ−４−ベンジル−２−
オキソ−３−〔４−（Ｎ−メトキシ−カルボニル
−Ｄ−ノルロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ルアミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，
２−ｂ〕−ピリジニウム−サルフエートの製造 Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ−ノルロイシル−
グリシル−Ｌ−アルギニン−４−ニトラニリド−
アセテート0.95ｇをエタノール20ml、水10ml及び
氷酢酸１滴からの混合物中に溶解しかつパラジウ
ム／活性炭上で水素化する。混合物を蒸発濃縮
し、水300ml中に溶かしかつ凍結乾燥する。
Fp108℃のＮ−メトキシカルボニル−Ｄ−ノルロ
イシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−（４−アミ
ノ−アニリド）−アセテート0.89ｇ（100％）が得
られる。 この化合物を例1a）と同様にしてニトロソ化
合物に変換しかつ例1c）と同様にして2H−１，
４−ジヒドロ−４−ベンジル−ピロロ−（３，２
−ｂ）−ピリジン−２−オンと反応させて次の構
造の発色性ペプチドヒドロラーゼ基質に変換す
る： Fp95〜97℃ Rf＝0.08（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5） 例 ４ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｌ−γ−グルタミルア
ミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，２−
ｂ〕−ピリジニウム−ビス−トリフルオルアセ
テートの製造 ａ） Ｌ−γ−Glu−ｐ−ニトラニリドヒドレー
ト2.85ｇをジオキサン25ml中に懸濁しかつ１，
１，３，５−テトラメチルグアニジン1.15ｇ及
び水25mlを加える。これにジオキサン４ml中の
ジ−ｔ−ブチルジカーボネート2.4ｇの溶液を
加えかつ混合物を室温で４時間撹拌する。反応
混合物に水を加えかつエーテルで抽出する。水
相を2N塩酸の添加によりPH３に調節しかつ酢
酸エチルエステルで抽出する。有機相を乾燥さ
せかつ蒸発濃縮する。残渣はリグロインの添加
により結晶になる。BOC−Ｌ−γ−Glu−ｐ−
ニトラニリド3.3ｇが得られ、これはエタノー
ル150ml及び水50mlの混合物中に溶かしてパラ
ジウム／活性炭上で水素化する。触媒の濾別及
び濾液の蒸発濃縮後にBOC−Ｌ−γ−Glu−
（４−アミノアニリド）2.99ｇ（88％）が残る。 ｂ） 例4a）で得られた化合物2.47ｇを2.5％
NaHCO3溶液70ml中に溶かし、かつ撹拌下に
水２ml中のトリペル塩2KHSO5×KHSO4×
K2SO4（CaroatR、Degussa社、西ドイツ国
Hanau在）500mgの溶液を加える。室温で２時
間撹拌した後で、氷酢酸で飽和しかつ酢酸エチ
ルエステルで抽出する。有機相を乾燥しかつ蒸
発濃縮する。BOC−Ｌ−γ−Glu−（４−−ニ
トロソ−アニリド1.95ｇ（76％）が得られる。 Rf＝0.8（アセトン／塩化メチレン／氷酢酸50：
45：５） ｃ） 例4b）で得られたニトロソ化合物1.9ｇを
氷酢酸70ml中に溶解しかつ2H−１，４−ジヒ
ドロ−１，４−ジメチル−ピロロ−（３，２−
ｂ）−ピリジン−２−オン0.8ｇを加える。混合
物を室温で２時間撹拌しかつ生成物をエーテル
の添加により析出させかつ濾取する。粗製生成
物を珪酸ゲルで溶離剤としてメタノール及びメ
タノール／水（90：10）を用いてクロマトグラ
フイ処理を行なうことにより精製する。生成物
含有フラクシヨンを合しかつ蒸発濃縮する。次
の構造の化合物0.74ｇ（25％）が得られる： Rf＝0.15（CH3OH／H2O9：１）。 ｄ） 例4c）で得られた化合物0.64ｇをトリフル
オル酢酸10ml中に溶かしかつこの溶液を30分後
に蒸発乾固させる。残渣をCH3OH／ジエチル
エーテルから再結晶させる。次の構造の化合物
0.7ｇ（100％）が得られる： Fp167℃、Rf＝0.1（ｎ−ブタノール／氷酢酸／
水２：１：１）。 例 ５ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−スクシニル−Ｌ−
フエニルアラニル−アミド）−フエニルイミノ〕
−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−1/2
サルフエートの製造 Ｎ−スクシニル−Ｌ−フエニルアラニン−ｐ−
ニトラニリド10ｇをエタノール300ml及び水100ml
からの混合物中でパラジウム／活性炭上で水素化
する。Fp167〜168℃（分解）のＮ−スクシニル
−Ｌ−フエニルアラニン−（４−アミノ−アニリ
ド）9.2ｇ（99％）が得られる。この化合物を例
4c）と同様にして次の構造の発色性基質に変換す
る： Fp158−162゜（分解）、Rf＝0.2（酢酸エチルエス
テル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5）。 例 ６ １，２−ジメチル−５−エチル−３−〔４−（Ｎ
−スクシニル−Ｌ−フエニルアラニルアミド）
−フエニルイミノ〕−インドリジニウム−1/2サ
ルフエートの製造 例５で得られたニトロソ化合物を例4c）と同様
にして１，２−ジメチル−５−エチルインドリジ
ンと反応させ、その際にニトロソ化合物を1.4倍
の過剰量で使用しかつ反応時間を15分間に限定す
る。次の構造の化合物が得られる： これを珪酸ゲルで溶難剤としてメタノール／
H2O（90：10）を用いてクロマトグラフイ処理す
ることにより精製する。 Fp125〜130℃（分解） Rf＝0.25（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5） 例 ７ １，２−ジメチル−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｌ−アラニルアミド）−２−メ
トキシ−フエニルイミノ〕−インドリジニウム
−アセテートの製造 ａ） ２−メトキシ−４−ニトロアニリン50ｇを
酢酸エチルエステル820ml中に溶解し、かつク
ロルギ酸ベンジルエステル70.45ｇを加える。
混合物を還流下に５時間加熱し、冷却しかつ析
出結晶を濾取する。Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−２−メトキシ−４−ニトロアニリン54.6
ｇ（61％）が得られ、これをテトラヒドロフラ
ン500ml及び水500mlの混合物中に溶かし、かつ
冷却下に亜ジチオン酸ナトリウム210ｇを少量
ずつ加える。完全に還元した後で、混合物を水
500mlで稀釈しかつ酢酸エチルエステルで抽出
する。抽出物を硫酸ナトリウム及びモレキユラ
ーシーブで乾燥しかつ濃縮する。Fp65〜68℃
の４−ベンジルオキシ−カルボニル−アミド−
３−メトキシ−アニリン26.8ｇ（59％）が得ら
れる。 ｂ） BOC−Ｌ−アラニン1.89ｇをテトラヒドロ
フラン40ml中に溶解し、かつＮ−メチルモルホ
リン1.1mlを加える。−15℃でクロルギ酸イソブ
チルエステル1.31mlを滴加する。15分後に−15
℃でテトラヒドロフラン10ml中の例7a）で得
られた化合物2.75ｇの溶液を添加する。混合物
を−15℃で15分間、−10℃で１時間撹拌し、か
つ最後に室温に加温させる。蒸発濃縮した反応
混合物を酢酸エチルエステル中に取りかつ５％
NaHCO3溶液と共に十分に振盪する。有機相
を乾燥させかつ蒸発濃縮する。粗製生成物をエ
タノールから再結晶させる。Fp144〜145℃の
BOC−Ｌ−Ala−（４−ベンジルオキシ−カル
ボキサミド−３−メトキシ−アニリド）2.58ｇ
（58％）が得られる。 ｃ） 例7b）で得られた化合物2.55ｇをジメチル
ホルムアミド70ml中に溶解し、かつパラジウ
ム／活性炭上で水素化する。触媒を濾別しかつ
濾液を蒸発濃縮する。Fp115〜129℃のBOC−
Ｌ−Ala−（４−アミノ−３−メトキシ−アニ
リド）1.72ｇ（97％）が得られる。 ｄ） 例4bと同様にして前記の化合物をニトロ
ソ化合物に酸化し、かつ例4c）と同様にして
１，２−ジメチルインドリジンと反応させ、そ
の際にニトロソ化合物を1.4倍の過剰量で使用
しかつ反応時間を15分間に限定する。次の構造
の化合物が得られる： これを珪酸ゲルで溶離剤として酢酸エチルエ
ステル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5を用いて精製する。 Rf＝0.28（酢酸エチルエステル／アセトン／氷
酢酸／水50：25：12.5：12.5） Rf＝0.58（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：
１：１）。 例 ８ １，２−ジメチル−３−〔４−（Ｌ−アラニルア
ミド）−２−メトキシ−フエニルイミノ〕−イン
ドリジニウム−トリフルオルアセテートの製造 例７の化合物を例4d）と同様にしてトリフル
オル酢酸を用いてBOC基を脱離するために処理
する。次の構造の化合物が得られる： Fp78℃（分解）、Rf＝0.15（ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水２：１：１）。 例 ９ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキシ−Ｌ
−アラニル−Ｌ−アラニルアミド）−２−メチ
ル−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕
−ピリジニウム−アセテート ａ） 例7a）と同様にして２−メチル−４−ニ
トロアニリン50ｇからＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−２−メチル−４−ニトロアニリン81.3
ｇ（88％）を製造し、これを亜ジチオン酸ナト
リウムで還元すると、Fp60〜62℃の４−ベン
ジルオキシカルボニルアミド−３−メチル−ア
ニリン44ｇが得られる。 例7b）と同様にしてジメチルホルムアミド
中のBOC−Ｌ−Ala−Ala2.6ｇを前記のｐ−フ
エニレンジアミン誘導体と反応させる。収量
1.35ｇ（27％）Fp197〜199℃ 得られた生成物をパラジウム／活性炭上で水
素化する。Fp135℃のBOC−Ｌ−Ala−Ala（４
−アミノ−３−メチルアニリド）1.19ｇが得ら
れる。 ｂ） 例9a）で得られた化合物を例4b）と同様
にしてニトロソ化合物に酸化しかつ例4c）によ
り4H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル
−２−オキソ−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジ
ン−２−オンと反応させる。次の構造の化合物
が得られる： Rf＝0.2（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5）。 例 10 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｌ−アラニル−Ｌ−ア
ラニルアミド）−２−メチル−フエニルイミノ〕
−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−ビス
−トリフルオルアセテートの製造 例9b）からの化合物を例4d）と同様にトリフ
ルオル酢酸を用いてBOC基を脱離するために処
理する。次の構造の化合物が得られる： Fp127〜132℃（分解） Rf＝0.10（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 11 ３−〔４−（Ｄ，Ｌ−Ｎ−ベンゾイルアルギニル
アミド）−フエニルイミノ〕−１−メチル−２−
フエニル−イソドリジニウム−サルフエートの
製造 Ｎ−ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニン−４−ニ
トラニリドを例３と同様にしてパラジウム／活性
炭上でアミノ化合物に水素化し、例1a）と同様
にしてニトロソ化合物に酸化する。例4c）に記載
されているようにニトロソ化合物を１−メチル−
２−フエニルインドリジンと反応させ、その際に
ニトロソ化合物を２倍の過剰量で使用しかつ反応
時間を15分間に限定する。次の発色性ペプチドヒ
ドロラーゼ基質が得られる： Rf＝0.38（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 12 １，２−ジフエニル−３−（４−Ｌ−アラニル
アミド）−フエニルイミノ−インドリジニウム
−トリフルオルアセテートの製造 例７と同様にして、BOC−Ｌ−アラニン、Ｎ
−カルボベンゾキシフエニレン−ジアミン及び
１，２−ジフエニル−インドリジンから１，２−
ジフエニル−３−（４−ｔ−ブトキシ−カルボニ
ル−Ｌ−アラニル−アミド）−フエニルイミド−
インドリジニウムアセテートが得られる。例８と
同様にしてBOC基を脱離して、次の構造の化合
物が得られる： Fp114〜116℃（分解） Rf＝0.2（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 13 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔Ｌ−（２−アラニルアミド）
−２−（Ｎ−イソプロピルアミドカルボニル）−
フエニル−イミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−
ピリジニウム−ビス−トリフルオルアセテート
の製造 ａ） ５−アミノ−２−ニトロ安息香酸5.46ｇ及
び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール−ヒド
レート4.6ｇをジメチルホルムアミド30ml中に
溶解し、かつこの溶液に約10〜15℃でジシクロ
ヘキシルカルボジイミド6.18ｇの溶液を加え
る。室温で１時間後に、イソプロピルアミン
2.6mlを軽く冷却しながら添加する。混合物を
室温で２時間撹拌しかつ一晩放置した後で後処
理する。沈殿を濾別し、濾液を濃縮する。残渣
を酢酸エチルエステル中に取りかつ溶液を迅速
に炭酸水素ナトリウム溶液で洗う。酢酸エステ
ル相から析出した沈殿を単離しかつ乾燥させ
る。Fp211℃の２−（Ｎ−イソプロピルアミド
カルボニル）−４−ニトロ−アニリン5.5ｇが得
られる。 ｂ） BOC−Ｌ−アラニン4.4ｇ、ａ）で得られ
た化合物5.2ｇ及びイミダゾール1.77ｇをピリ
ジン117ml中に溶かしかつ−20℃でオキシ塩化
リン3.4mlを加える。その添加後、徐々に室温
に加温させ、ピリジンを留去させ、残渣を炭酸
水素ナトリウム溶液中に取りかつ酢酸エチルエ
ステル抽出する。酢酸エステル抽出物を炭酸水
素ナトリウム溶液及びクエン酸水溶液（５重量
％）で洗い、乾燥しかつ蒸発濃縮する。粗製生
成物を珪酸ゲルで展開剤としてリグロイン／ア
セトン（２：１）を用いてクロマトグラフイ処
理することにより精製する。生成物フラクシヨ
ンをジエチルエーテル／リグロインから再結晶
させる。Fp125〜129℃（分解）のBOC−Ｌ−
アラニル−２−（Ｎ−イソプロピルアミドカル
ボニル）−４−ニトロアニリド3.2ｇが得られ
る。 ｃ） ｂ）で得られた化合物をエタノール／50ml
及び水50ml中でパラジウム／活性炭触媒上で水
素化する。この反応生成物を例4b）と同様に
ニトロソ化合物に酸化しかつ例4c）と同様に
2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン−２−オンと
反応させる。BOC保護基の脱離は例4d）と同
様に行ないかつ次の構造の標題化合物を得る： Rf＝0.1（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） Fp124℃（分解） 例 14 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジスチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキシ−Ｄ
−フエニルアラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アル
ギニル−アミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−
〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−サルフエートの
製造 ａ Ｎ−カルボベンゾキシ−フエニレンジアミン
の合成 例7a）と同様にして、ｐ−ニトラニリン60ｇ
及びクロルギ酸ベンジルエステル204mlからＮ−
ベンジルオキシカルボニル−４−ニトラニリド
（Rf＝0.75、珪酸ゲル、トルエン／ジオキサン／
氷酢酸72：20：８）が全部で109.9ｇ得られ、こ
れをテトラヒドロフラン1090ml中に溶かし、2N
−カセイソーダ1900ml及び亜ジチオン酸ナトリウ
ム436ｇを加える。還元を完結するために、水
1000ml中の亜ジチオン酸ナトリウム100ｇの溶液
を再度添加する。反応混合物を水で稀釈しかつ生
成物を酢酸エチルエステルで抽出する。粗製生成
物を酢酸エステル／リグロイン（２：１）から再
結晶させる。標題化合物57.3ｇが得られる。Rf＝
0.3（珪酸ゲル、トルエン／ジオキサン／氷酢酸
72：20：８） ｂ） BOC−Ｌ−プロピル−（N〓−ニトロアル
ギニル）−４−ベンジルオキシカルボニル−ア
ミドアニリド BOC−Ｌ−Pro−（N〓−ニトロ−Arg）−
OH18ｇ（443ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール−ヒドレート13.15ｇ（85.8ミ
リモル）及びＮ−カルボベンゾキシフエニレン
ジアミン10.9ｇ（45.1ミリモル）をジメチルホ
ルムアミド240ml中に溶かす。溶液を−10℃に
冷却し、かつジメチルホルムアミド70ml中のジ
シクロヘキシルカルボジイミド9.7ｇ（47ミリ
モル）の溶液を滴加する。その後、混合物を１
時間０℃で、引続いて室温で撹拌する。一晩放
置した後で、ジシクロヘキシル尿素から吸引濾
別し、ジメチルホルムアミド溶液を約1/2に濃
縮し、ほぼ同容量の水を加え、かつ混合物を２
回酢酸エチルエステルで抽出する。合つした抽
出物をクエン酸水溶液（５重量％）又は５％硫
酸水素カリウム溶液、水、５％炭酸水素ナトリ
ウム溶液及び水で洗う。酢酸エステル相を蒸発
濃縮し、残渣をアセトン中に溶かしかつしばら
く放置した後で残りのジシクロヘキシル尿素を
吸引濾別する。濾液を蒸発濃縮しかつ残渣を酢
酸エチルエステルから再結晶させる。物質は非
常にゆつくりと結晶する。２〜３日間放置後、
結晶を吸引濾取する。収量19.09ｇ（69％） 精製するために、該物質を珪酸ゲルを介して
CH3OHを用いてクロマトグラフイ処理する。 Rf＝0.8（珪酸ゲル、アセトン／塩化メチレン氷
酢酸50：45：５）。 ｃ） ｃ）で得られた保護ジペプチド24.3ｇをテ
トラヒドロフラン200ml中に溶かしかつ撹拌下
にエーテル性塩酸（約5N）200mlを加える。粘
着性の沈殿が析出し、これは室温で撹拌する
（1.5時間）際に結晶する。沈殿を吸引濾取し、
ジエチルエーテルで十分に洗いかつ真空乾燥箱
中50℃で乾燥させる。 標題化合物22.4ｇ（100％）が得られる。 Rf＝0.55（珪酸ゲル、酢酸エチルエステル／ア
セトン／氷酢酸／水50：25：12.5：12.5） ｄ） BOC−Ｄ−フエニルアラニル−Ｌ−プロ
リル−N〓−ニトロ−Ｌ−アルギニル−（４−ベ
ンジルオキシ−カルボニルアニリド） BOC−Ｄ−フエニルアラニン4.64ｇ及びｃ）
で得られた化合物5.05ｇをジメチルホルムアミ
ド52ml中に溶かしかつ０℃に冷却する。溶液に
Ｎ−メチルモルホリン5.25ml及び塩化メチレン
中のｎ−プロパンホスホン酸アンヒドリドの50
重量％溶液7.7ｇを加える。この混合物を室温
で一晩放置する。反応混合物を蒸発濃縮する。
残渣を酢酸エチルエステル中に取りかつ有機相
を５％炭酸水素ナトリウム溶液、水及び0.5N
塩酸で洗う。有機相を乾燥させかつ蒸発濃縮す
る。油状生成物4.92ｇが得られた。 Rf＝0.45（珪酸ゲル、塩化メチレン／メタノー
ル95：５） ｅ） BOC−Ｄ−フエニルアラニン−Ｌ−プロ
リル−Ｌ−アルギニル−（４−アミノアニリド） ｄ）で得られた化合物9.6ｇをエタノール250
ml、水25ml及び氷酢酸15ml中に溶解しかつパラ
ジウム／活性炭触媒上で約６バールで水素化す
る。触媒濾別及び濾液の蒸発濃縮後に残留する
残渣はジエチルエーテルにより結晶になる。
Fp133〜135℃、Rf＝0.6（酢酸エチルエステ
ル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5）のBOC−Ｄ−フエニルアラニル−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−アルギニル−（４−アミノ−アニ
リド）4.93ｇが得られる。 ｆ） 例1a）と同様にして、前記のｅ）で得ら
れた化合物をニトロソ化合物に酸化しかつ例
1c）と同様に2H−１，４−ジヒドロ−１，４
−ジメチル−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン
−２−オンと反応させる。次の構造の化合物が
得られる： これを珪酸ゲルでｎ−ブタノール／氷酢酸／
水（２：１：１）を用いてクロマトグラフイ処
理することにより精製する。Fp175℃（分解）、 Rf＝0.38（珪酸ゲル、ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水２：１：１） 例 15 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｄ−フエニルアラニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニルアミド）−フ
エニル−イミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピ
リジニウム−サルフエート−トリフルオルアセ
テートの製造 例14からの化合物を例4d）と同様にしてBOC
基を脱離するためにトリフルオル酢酸で処理す
る。次の構造の化合物が得られる： Fp185℃（分解）、Rf＝0.15（ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水２：１：１） 例 16 本発明による化合物の酵素的開裂 いくつかの化合物に基いてペプチド結合を開裂
する酵素の検出を明らかにする。 トロンビン 例1c）からの物質及び例2b）、2c）、2d）、2e）、
2f）、2g）、2h）、2i）、2k）、14及び15からの物質
をそれぞれ0.1モル／ Hepes緩衝液PH7.5中に
溶かしかつトロンビンを加える。 開裂前後の本発明による化合物の最大吸収が明
らかである。 例 No. λnax（nm） λnax（nm） 開裂前 開裂後 1c） 526 544 2a） 515 566 2b） 501 562 2c） 525 558 2d） 342シヨルダー 568 を含む 420 2e） 470 584 2f） 464 588 2g） 528 564 2h） 529 564 2i） 449 540 2k） 530 567 (14) 525 558 (15) 525 558 凝固因子Xa 例３からの物質を0.1モル／ Hepes緩衝液
PH7.5中に溶かしかつ牛からの凝固因子Xaと反応
させた。最大吸収の測定値は開裂前に532nm及び
開裂後に564nmであつた。 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 例4c）からの物質を0.1モル／トリス緩衝液
PH7.5中で50モル／グリシルグリシンと一緒に
溶解し、かつグルタミルトランスペプチダーゼと
反応させた。測定により、最大吸収は開裂前に
525nm及び開裂後に558nmであつた。 キモトリプシン 例５及び６からの物質をそれぞれカルシウムイ
オンの添加下に0.2モル／ トリス−緩衝液PH
8.1、25モル／ NaCl中に溶解しかつキモトリ
プシンと反応させた。開裂前後の最大吸収を測定
した： 例５からの物質：開裂前525nm 開裂後558nm 例６からの物質：開裂前485nmでシヨルダーを
有する366nm 開裂後594nm アミノペプチダーゼＭ 例８、10、12及び13からの物質をそれぞれ0.2
モル／トリス緩衝液PH8.1中に溶かし、かつア
ミノペプチダーゼＭと反応させた。開裂前後の最
大吸収値を測定した。
（３，２−ｂ）−ピリジン−カルボン酸エチルエス
テル５ｇをジメチルホルムアミド180ml中に懸濁
させる。沃化メチル10ml、引続いて水素化ナトリ
ウム（55％）４ｇを少量ずつ添加する。反応混合
物を室温で３時間撹拌しかつ蒸発濃縮する。残渣
を水中に溶かす。溶液を塩化メチレンで数回抽出
する。合した有機相を乾燥しかつ蒸発懸濁する。
残渣を少量の熱いアセトン中に溶かしかつ生成物
をエーテルで析出する。Fp145〜147℃の相応す
るＮ，N′−ジメチル化合物3.2ｇが得られ、これ
を濃塩酸110mlと共に24時間還流下に沸騰させる。
反応混合物を濃縮乾固し、水中に溶かしかつこの
溶液をNa2CO3の添加によりアルカリ性に調節す
る。数回塩化メチレンで抽出する。有機相を合し
かつ蒸発濃縮する。Fp144℃の2H−１，４−ジ
ヒドロ−１，４−ジメチル−ピロロ−（３，２−
ｂ）−ピリジン−２−オン1.9ｇ（90％）が得られ
る。 例2d）の出発ヘテロ環の製造 例2c）の出発ヘテロ環の製造と同様にして、
２，３−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−ピロロ−
（２，３−ｃ）−ピリジン−３−カルボン酸エチル
エステルからＮ，N′−ジメチル化合物の2H−
１，６−ジヒドロ−１，６−ジメチル−ピロロ−
（２，３−ｃ）ピリジン−２−オンが得られる。
この粗製生成物を珪酸ゲルで塩化メチレン／メタ
ノール９：１を用いてクロマトグラフイ処理をす
る。黄色の無定形物質が得られる。 Rf＝0.46（塩化メチレン／メタノール９：１） 例2g）の出発ヘテロ環の製造 例2cの出発ヘテロ環の製造と同様にして２，３
−ジヒドロ−５−メチル−２−ヒドロキシ−ピロ
ロ−（３，２−ｂ）ピリジン−３−カルボン酸エ
ステル〔Fp252℃、５−Ｈ−化合物と同様にして
製造した、“J.Chem.Soc.Perkin Ｉ”、1521（1974
年）〕からFp195〜200℃のＮ，N′−ジメチル化合
物の2H−１，４−ジヒドロ−１，４，５−トリ
メチル−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジン−２−
オンが得られる。 例2h）の出発ヘテロ環の製造 例2c）の出発ヘテロ環の製造と同様にして、沃
化ｎ−プロピルによりアルキル化し、引続いてけ
ん化しかつカルボン酸エチルエステルの脱カルボ
キシルすることにより2H−１，４−ジヒドロ−
１，４−ジ−プロピル−ピロロ−（３，２−ｂ）−
ピリジン−２−オンが油状生成物として得られ
る。 Rf＝＝0.4（酢酸エチルエステル／エタノール９：
１） 例2i）の出発ヘテロ環の製造 酪酸アミド10.5ｇ及び五硫化リン5.4ｇをトル
エン８ml中に懸濁させ、かつ初めは冷却下に、そ
の後約75〜80℃でトルエン10ml中の２−ブロムシ
クロヘキサノン21.5ｇの溶液を加える。引続いて
15分間還流下に加熱し、冷却させかつ反応混合物
のPHを2Nカセイソーダで８〜９に調節する。生
成物を酢酸エチルエステルで抽出する。精製する
ために、生成物を蒸留し（沸点77〜84℃／0.1mm
Hg）かつリグロイン／酢酸エチルエステル
（10：１）により珪酸ゲルを介して濾過する。２
−ｎ−プロピル−４，５，６，７−テトラヒドロ
−ベンゾ−１，３−チアゾール（Rf＝0.35、リグ
ロイン／酢酸エチルエステル90：10）3.1ｇが得
られる。この化合物2.7ｇをアセトン25ml中に溶
かし、ブロムアセトン3.06ｇを加えかつ14時間還
流加熱する。アセトンを留去させかつ残渣にエタ
ノール335ml及びナトリウムメチラート8.7ｇを加
える。混合物を１時間還流下に加熱しかつ約50ml
に濃縮する。この溶液を水500ml中に注入しかつ
酢酸エチルエステルで抽出する。粗製生成物をリ
グロイン／酢酸エチルエステル（98：２）を用い
て珪酸ゲルを介してクロマトグラフイ処理する。
次の構造（ｍ／ｅ＝219）の所望のピロロ−〔２，
１−ｂ〕−チアゾール１ｇが得られる： 例2k）の出発ヘテロ環の製造 Ｋ−ｔ−ブチラート（カリウム12.48ｇとｔ−
ブタノール600mlとから製造）の懸濁液に約80℃
でマロン酸ジエチルエステル48.5mlを加える。こ
の白色懸濁液にｔ−ブタノール200ml中の２−ク
ロル−６−メトキシ−３−ニトロピリジン30.2ｇ
の熱い溶液を滴加する。反応混合物を17時間還流
加熱する。蒸発乾固し、残渣を水中に懸濁させ、
2N塩酸で中和しかつジエチルエーテルで数回抽
出する。乾燥させたエーテル相を濃縮しかつ残渣
を珪酸ゲルで酢酸エチルエステル／リグロイン
（１：９）を用いて精製し、Fp84〜85℃の２−
（６−メトキシ−３−ニトロ）−ピリジル−マロン
酸ジエチルエステル40.4ｇ（81％）が得られた。 このようにして得られた物質20ｇをエタノー
ル／塩化メチレン（４：１）500ml中に溶かし、
かつパラジウム／溶性炭触媒上で水素化する。触
媒を濾別し、濾液を約250mlに濃縮しかつ氷酢酸
25mlを加える。混合物を還流下に４時間加熱し、
かつ冷蔵庫で一晩放置する。析出した沈殿を濾取
する。母液から約100mlに濃縮しかつジエチルエ
ーテル約500mlを加えることにより更に生成物が
得られる。１，４−ジヒドロ−２−ヒドロキシ−
５−メトキシ−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン
−３−カルボン酸エチルエステルの収量は合計
10.8ｇ（72％）である。Fp184〜186℃。 例2cの出発ヘテロ環の製造と同様にして前記の
化合物からFp156〜159℃の2H−１，４−ジヒド
ロ−１，４−ジメチル−５−メトキシ−ピロロ−
〔３，２−ｂ〕−ピリジン−２−オンが得られる。 例 ３ 2H−１，４−ジヒドロ−４−ベンジル−２−
オキソ−３−〔４−（Ｎ−メトキシ−カルボニル
−Ｄ−ノルロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ルアミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，
２−ｂ〕−ピリジニウム−サルフエートの製造 Ｎ−メトキシカルボニル−Ｄ−ノルロイシル−
グリシル−Ｌ−アルギニン−４−ニトラニリド−
アセテート0.95ｇをエタノール20ml、水10ml及び
氷酢酸１滴からの混合物中に溶解しかつパラジウ
ム／活性炭上で水素化する。混合物を蒸発濃縮
し、水300ml中に溶かしかつ凍結乾燥する。
Fp108℃のＮ−メトキシカルボニル−Ｄ−ノルロ
イシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−（４−アミ
ノ−アニリド）−アセテート0.89ｇ（100％）が得
られる。 この化合物を例1a）と同様にしてニトロソ化
合物に変換しかつ例1c）と同様にして2H−１，
４−ジヒドロ−４−ベンジル−ピロロ−（３，２
−ｂ）−ピリジン−２−オンと反応させて次の構
造の発色性ペプチドヒドロラーゼ基質に変換す
る： Fp95〜97℃ Rf＝0.08（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5） 例 ４ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｌ−γ−グルタミルア
ミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，２−
ｂ〕−ピリジニウム−ビス−トリフルオルアセ
テートの製造 ａ） Ｌ−γ−Glu−ｐ−ニトラニリドヒドレー
ト2.85ｇをジオキサン25ml中に懸濁しかつ１，
１，３，５−テトラメチルグアニジン1.15ｇ及
び水25mlを加える。これにジオキサン４ml中の
ジ−ｔ−ブチルジカーボネート2.4ｇの溶液を
加えかつ混合物を室温で４時間撹拌する。反応
混合物に水を加えかつエーテルで抽出する。水
相を2N塩酸の添加によりPH３に調節しかつ酢
酸エチルエステルで抽出する。有機相を乾燥さ
せかつ蒸発濃縮する。残渣はリグロインの添加
により結晶になる。BOC−Ｌ−γ−Glu−ｐ−
ニトラニリド3.3ｇが得られ、これはエタノー
ル150ml及び水50mlの混合物中に溶かしてパラ
ジウム／活性炭上で水素化する。触媒の濾別及
び濾液の蒸発濃縮後にBOC−Ｌ−γ−Glu−
（４−アミノアニリド）2.99ｇ（88％）が残る。 ｂ） 例4a）で得られた化合物2.47ｇを2.5％
NaHCO3溶液70ml中に溶かし、かつ撹拌下に
水２ml中のトリペル塩2KHSO5×KHSO4×
K2SO4（CaroatR、Degussa社、西ドイツ国
Hanau在）500mgの溶液を加える。室温で２時
間撹拌した後で、氷酢酸で飽和しかつ酢酸エチ
ルエステルで抽出する。有機相を乾燥しかつ蒸
発濃縮する。BOC−Ｌ−γ−Glu−（４−−ニ
トロソ−アニリド1.95ｇ（76％）が得られる。 Rf＝0.8（アセトン／塩化メチレン／氷酢酸50：
45：５） ｃ） 例4b）で得られたニトロソ化合物1.9ｇを
氷酢酸70ml中に溶解しかつ2H−１，４−ジヒ
ドロ−１，４−ジメチル−ピロロ−（３，２−
ｂ）−ピリジン−２−オン0.8ｇを加える。混合
物を室温で２時間撹拌しかつ生成物をエーテル
の添加により析出させかつ濾取する。粗製生成
物を珪酸ゲルで溶離剤としてメタノール及びメ
タノール／水（90：10）を用いてクロマトグラ
フイ処理を行なうことにより精製する。生成物
含有フラクシヨンを合しかつ蒸発濃縮する。次
の構造の化合物0.74ｇ（25％）が得られる： Rf＝0.15（CH3OH／H2O9：１）。 ｄ） 例4c）で得られた化合物0.64ｇをトリフル
オル酢酸10ml中に溶かしかつこの溶液を30分後
に蒸発乾固させる。残渣をCH3OH／ジエチル
エーテルから再結晶させる。次の構造の化合物
0.7ｇ（100％）が得られる： Fp167℃、Rf＝0.1（ｎ−ブタノール／氷酢酸／
水２：１：１）。 例 ５ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−スクシニル−Ｌ−
フエニルアラニル−アミド）−フエニルイミノ〕
−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−1/2
サルフエートの製造 Ｎ−スクシニル−Ｌ−フエニルアラニン−ｐ−
ニトラニリド10ｇをエタノール300ml及び水100ml
からの混合物中でパラジウム／活性炭上で水素化
する。Fp167〜168℃（分解）のＮ−スクシニル
−Ｌ−フエニルアラニン−（４−アミノ−アニリ
ド）9.2ｇ（99％）が得られる。この化合物を例
4c）と同様にして次の構造の発色性基質に変換す
る： Fp158−162゜（分解）、Rf＝0.2（酢酸エチルエス
テル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5）。 例 ６ １，２−ジメチル−５−エチル−３−〔４−（Ｎ
−スクシニル−Ｌ−フエニルアラニルアミド）
−フエニルイミノ〕−インドリジニウム−1/2サ
ルフエートの製造 例５で得られたニトロソ化合物を例4c）と同様
にして１，２−ジメチル−５−エチルインドリジ
ンと反応させ、その際にニトロソ化合物を1.4倍
の過剰量で使用しかつ反応時間を15分間に限定す
る。次の構造の化合物が得られる： これを珪酸ゲルで溶難剤としてメタノール／
H2O（90：10）を用いてクロマトグラフイ処理す
ることにより精製する。 Fp125〜130℃（分解） Rf＝0.25（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5） 例 ７ １，２−ジメチル−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｌ−アラニルアミド）−２−メ
トキシ−フエニルイミノ〕−インドリジニウム
−アセテートの製造 ａ） ２−メトキシ−４−ニトロアニリン50ｇを
酢酸エチルエステル820ml中に溶解し、かつク
ロルギ酸ベンジルエステル70.45ｇを加える。
混合物を還流下に５時間加熱し、冷却しかつ析
出結晶を濾取する。Ｎ−ベンジルオキシカルボ
ニル−２−メトキシ−４−ニトロアニリン54.6
ｇ（61％）が得られ、これをテトラヒドロフラ
ン500ml及び水500mlの混合物中に溶かし、かつ
冷却下に亜ジチオン酸ナトリウム210ｇを少量
ずつ加える。完全に還元した後で、混合物を水
500mlで稀釈しかつ酢酸エチルエステルで抽出
する。抽出物を硫酸ナトリウム及びモレキユラ
ーシーブで乾燥しかつ濃縮する。Fp65〜68℃
の４−ベンジルオキシ−カルボニル−アミド−
３−メトキシ−アニリン26.8ｇ（59％）が得ら
れる。 ｂ） BOC−Ｌ−アラニン1.89ｇをテトラヒドロ
フラン40ml中に溶解し、かつＮ−メチルモルホ
リン1.1mlを加える。−15℃でクロルギ酸イソブ
チルエステル1.31mlを滴加する。15分後に−15
℃でテトラヒドロフラン10ml中の例7a）で得
られた化合物2.75ｇの溶液を添加する。混合物
を−15℃で15分間、−10℃で１時間撹拌し、か
つ最後に室温に加温させる。蒸発濃縮した反応
混合物を酢酸エチルエステル中に取りかつ５％
NaHCO3溶液と共に十分に振盪する。有機相
を乾燥させかつ蒸発濃縮する。粗製生成物をエ
タノールから再結晶させる。Fp144〜145℃の
BOC−Ｌ−Ala−（４−ベンジルオキシ−カル
ボキサミド−３−メトキシ−アニリド）2.58ｇ
（58％）が得られる。 ｃ） 例7b）で得られた化合物2.55ｇをジメチル
ホルムアミド70ml中に溶解し、かつパラジウ
ム／活性炭上で水素化する。触媒を濾別しかつ
濾液を蒸発濃縮する。Fp115〜129℃のBOC−
Ｌ−Ala−（４−アミノ−３−メトキシ−アニ
リド）1.72ｇ（97％）が得られる。 ｄ） 例4bと同様にして前記の化合物をニトロ
ソ化合物に酸化し、かつ例4c）と同様にして
１，２−ジメチルインドリジンと反応させ、そ
の際にニトロソ化合物を1.4倍の過剰量で使用
しかつ反応時間を15分間に限定する。次の構造
の化合物が得られる： これを珪酸ゲルで溶離剤として酢酸エチルエ
ステル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5を用いて精製する。 Rf＝0.28（酢酸エチルエステル／アセトン／氷
酢酸／水50：25：12.5：12.5） Rf＝0.58（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：
１：１）。 例 ８ １，２−ジメチル−３−〔４−（Ｌ−アラニルア
ミド）−２−メトキシ−フエニルイミノ〕−イン
ドリジニウム−トリフルオルアセテートの製造 例７の化合物を例4d）と同様にしてトリフル
オル酢酸を用いてBOC基を脱離するために処理
する。次の構造の化合物が得られる： Fp78℃（分解）、Rf＝0.15（ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水２：１：１）。 例 ９ 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキシ−Ｌ
−アラニル−Ｌ−アラニルアミド）−２−メチ
ル−フエニルイミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕
−ピリジニウム−アセテート ａ） 例7a）と同様にして２−メチル−４−ニ
トロアニリン50ｇからＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−２−メチル−４−ニトロアニリン81.3
ｇ（88％）を製造し、これを亜ジチオン酸ナト
リウムで還元すると、Fp60〜62℃の４−ベン
ジルオキシカルボニルアミド−３−メチル−ア
ニリン44ｇが得られる。 例7b）と同様にしてジメチルホルムアミド
中のBOC−Ｌ−Ala−Ala2.6ｇを前記のｐ−フ
エニレンジアミン誘導体と反応させる。収量
1.35ｇ（27％）Fp197〜199℃ 得られた生成物をパラジウム／活性炭上で水
素化する。Fp135℃のBOC−Ｌ−Ala−Ala（４
−アミノ−３−メチルアニリド）1.19ｇが得ら
れる。 ｂ） 例9a）で得られた化合物を例4b）と同様
にしてニトロソ化合物に酸化しかつ例4c）によ
り4H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル
−２−オキソ−ピロロ−（３，２−ｂ）−ピリジ
ン−２−オンと反応させる。次の構造の化合物
が得られる： Rf＝0.2（酢酸エチルエステル／アセトン／氷酢
酸／水50：25：12.5：12.5）。 例 10 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｌ−アラニル−Ｌ−ア
ラニルアミド）−２−メチル−フエニルイミノ〕
−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−ビス
−トリフルオルアセテートの製造 例9b）からの化合物を例4d）と同様にトリフ
ルオル酢酸を用いてBOC基を脱離するために処
理する。次の構造の化合物が得られる： Fp127〜132℃（分解） Rf＝0.10（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 11 ３−〔４−（Ｄ，Ｌ−Ｎ−ベンゾイルアルギニル
アミド）−フエニルイミノ〕−１−メチル−２−
フエニル−イソドリジニウム−サルフエートの
製造 Ｎ−ベンゾイル−Ｄ，Ｌ−アルギニン−４−ニ
トラニリドを例３と同様にしてパラジウム／活性
炭上でアミノ化合物に水素化し、例1a）と同様
にしてニトロソ化合物に酸化する。例4c）に記載
されているようにニトロソ化合物を１−メチル−
２−フエニルインドリジンと反応させ、その際に
ニトロソ化合物を２倍の過剰量で使用しかつ反応
時間を15分間に限定する。次の発色性ペプチドヒ
ドロラーゼ基質が得られる： Rf＝0.38（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 12 １，２−ジフエニル−３−（４−Ｌ−アラニル
アミド）−フエニルイミノ−インドリジニウム
−トリフルオルアセテートの製造 例７と同様にして、BOC−Ｌ−アラニン、Ｎ
−カルボベンゾキシフエニレン−ジアミン及び
１，２−ジフエニル−インドリジンから１，２−
ジフエニル−３−（４−ｔ−ブトキシ−カルボニ
ル−Ｌ−アラニル−アミド）−フエニルイミド−
インドリジニウムアセテートが得られる。例８と
同様にしてBOC基を脱離して、次の構造の化合
物が得られる： Fp114〜116℃（分解） Rf＝0.2（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） 例 13 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔Ｌ−（２−アラニルアミド）
−２−（Ｎ−イソプロピルアミドカルボニル）−
フエニル−イミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−
ピリジニウム−ビス−トリフルオルアセテート
の製造 ａ） ５−アミノ−２−ニトロ安息香酸5.46ｇ及
び１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール−ヒド
レート4.6ｇをジメチルホルムアミド30ml中に
溶解し、かつこの溶液に約10〜15℃でジシクロ
ヘキシルカルボジイミド6.18ｇの溶液を加え
る。室温で１時間後に、イソプロピルアミン
2.6mlを軽く冷却しながら添加する。混合物を
室温で２時間撹拌しかつ一晩放置した後で後処
理する。沈殿を濾別し、濾液を濃縮する。残渣
を酢酸エチルエステル中に取りかつ溶液を迅速
に炭酸水素ナトリウム溶液で洗う。酢酸エステ
ル相から析出した沈殿を単離しかつ乾燥させ
る。Fp211℃の２−（Ｎ−イソプロピルアミド
カルボニル）−４−ニトロ−アニリン5.5ｇが得
られる。 ｂ） BOC−Ｌ−アラニン4.4ｇ、ａ）で得られ
た化合物5.2ｇ及びイミダゾール1.77ｇをピリ
ジン117ml中に溶かしかつ−20℃でオキシ塩化
リン3.4mlを加える。その添加後、徐々に室温
に加温させ、ピリジンを留去させ、残渣を炭酸
水素ナトリウム溶液中に取りかつ酢酸エチルエ
ステル抽出する。酢酸エステル抽出物を炭酸水
素ナトリウム溶液及びクエン酸水溶液（５重量
％）で洗い、乾燥しかつ蒸発濃縮する。粗製生
成物を珪酸ゲルで展開剤としてリグロイン／ア
セトン（２：１）を用いてクロマトグラフイ処
理することにより精製する。生成物フラクシヨ
ンをジエチルエーテル／リグロインから再結晶
させる。Fp125〜129℃（分解）のBOC−Ｌ−
アラニル−２−（Ｎ−イソプロピルアミドカル
ボニル）−４−ニトロアニリド3.2ｇが得られ
る。 ｃ） ｂ）で得られた化合物をエタノール／50ml
及び水50ml中でパラジウム／活性炭触媒上で水
素化する。この反応生成物を例4b）と同様に
ニトロソ化合物に酸化しかつ例4c）と同様に
2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン−２−オンと
反応させる。BOC保護基の脱離は例4d）と同
様に行ないかつ次の構造の標題化合物を得る： Rf＝0.1（ｎ−ブタノール／氷酢酸／水２：１：
１） Fp124℃（分解） 例 14 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジスチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｎ−ｔ−ブトキシ−Ｄ
−フエニルアラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アル
ギニル−アミド）−フエニルイミノ〕−ピロロ−
〔３，２−ｂ〕−ピリジニウム−サルフエートの
製造 ａ Ｎ−カルボベンゾキシ−フエニレンジアミン
の合成 例7a）と同様にして、ｐ−ニトラニリン60ｇ
及びクロルギ酸ベンジルエステル204mlからＮ−
ベンジルオキシカルボニル−４−ニトラニリド
（Rf＝0.75、珪酸ゲル、トルエン／ジオキサン／
氷酢酸72：20：８）が全部で109.9ｇ得られ、こ
れをテトラヒドロフラン1090ml中に溶かし、2N
−カセイソーダ1900ml及び亜ジチオン酸ナトリウ
ム436ｇを加える。還元を完結するために、水
1000ml中の亜ジチオン酸ナトリウム100ｇの溶液
を再度添加する。反応混合物を水で稀釈しかつ生
成物を酢酸エチルエステルで抽出する。粗製生成
物を酢酸エステル／リグロイン（２：１）から再
結晶させる。標題化合物57.3ｇが得られる。Rf＝
0.3（珪酸ゲル、トルエン／ジオキサン／氷酢酸
72：20：８） ｂ） BOC−Ｌ−プロピル−（N〓−ニトロアル
ギニル）−４−ベンジルオキシカルボニル−ア
ミドアニリド BOC−Ｌ−Pro−（N〓−ニトロ−Arg）−
OH18ｇ（443ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール−ヒドレート13.15ｇ（85.8ミ
リモル）及びＮ−カルボベンゾキシフエニレン
ジアミン10.9ｇ（45.1ミリモル）をジメチルホ
ルムアミド240ml中に溶かす。溶液を−10℃に
冷却し、かつジメチルホルムアミド70ml中のジ
シクロヘキシルカルボジイミド9.7ｇ（47ミリ
モル）の溶液を滴加する。その後、混合物を１
時間０℃で、引続いて室温で撹拌する。一晩放
置した後で、ジシクロヘキシル尿素から吸引濾
別し、ジメチルホルムアミド溶液を約1/2に濃
縮し、ほぼ同容量の水を加え、かつ混合物を２
回酢酸エチルエステルで抽出する。合つした抽
出物をクエン酸水溶液（５重量％）又は５％硫
酸水素カリウム溶液、水、５％炭酸水素ナトリ
ウム溶液及び水で洗う。酢酸エステル相を蒸発
濃縮し、残渣をアセトン中に溶かしかつしばら
く放置した後で残りのジシクロヘキシル尿素を
吸引濾別する。濾液を蒸発濃縮しかつ残渣を酢
酸エチルエステルから再結晶させる。物質は非
常にゆつくりと結晶する。２〜３日間放置後、
結晶を吸引濾取する。収量19.09ｇ（69％） 精製するために、該物質を珪酸ゲルを介して
CH3OHを用いてクロマトグラフイ処理する。 Rf＝0.8（珪酸ゲル、アセトン／塩化メチレン氷
酢酸50：45：５）。 ｃ） ｃ）で得られた保護ジペプチド24.3ｇをテ
トラヒドロフラン200ml中に溶かしかつ撹拌下
にエーテル性塩酸（約5N）200mlを加える。粘
着性の沈殿が析出し、これは室温で撹拌する
（1.5時間）際に結晶する。沈殿を吸引濾取し、
ジエチルエーテルで十分に洗いかつ真空乾燥箱
中50℃で乾燥させる。 標題化合物22.4ｇ（100％）が得られる。 Rf＝0.55（珪酸ゲル、酢酸エチルエステル／ア
セトン／氷酢酸／水50：25：12.5：12.5） ｄ） BOC−Ｄ−フエニルアラニル−Ｌ−プロ
リル−N〓−ニトロ−Ｌ−アルギニル−（４−ベ
ンジルオキシ−カルボニルアニリド） BOC−Ｄ−フエニルアラニン4.64ｇ及びｃ）
で得られた化合物5.05ｇをジメチルホルムアミ
ド52ml中に溶かしかつ０℃に冷却する。溶液に
Ｎ−メチルモルホリン5.25ml及び塩化メチレン
中のｎ−プロパンホスホン酸アンヒドリドの50
重量％溶液7.7ｇを加える。この混合物を室温
で一晩放置する。反応混合物を蒸発濃縮する。
残渣を酢酸エチルエステル中に取りかつ有機相
を５％炭酸水素ナトリウム溶液、水及び0.5N
塩酸で洗う。有機相を乾燥させかつ蒸発濃縮す
る。油状生成物4.92ｇが得られた。 Rf＝0.45（珪酸ゲル、塩化メチレン／メタノー
ル95：５） ｅ） BOC−Ｄ−フエニルアラニン−Ｌ−プロ
リル−Ｌ−アルギニル−（４−アミノアニリド） ｄ）で得られた化合物9.6ｇをエタノール250
ml、水25ml及び氷酢酸15ml中に溶解しかつパラ
ジウム／活性炭触媒上で約６バールで水素化す
る。触媒濾別及び濾液の蒸発濃縮後に残留する
残渣はジエチルエーテルにより結晶になる。
Fp133〜135℃、Rf＝0.6（酢酸エチルエステ
ル／アセトン／氷酢酸／水50：25：12.5：
12.5）のBOC−Ｄ−フエニルアラニル−Ｌ−プ
ロリル−Ｌ−アルギニル−（４−アミノ−アニ
リド）4.93ｇが得られる。 ｆ） 例1a）と同様にして、前記のｅ）で得ら
れた化合物をニトロソ化合物に酸化しかつ例
1c）と同様に2H−１，４−ジヒドロ−１，４
−ジメチル−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピリジン
−２−オンと反応させる。次の構造の化合物が
得られる： これを珪酸ゲルでｎ−ブタノール／氷酢酸／
水（２：１：１）を用いてクロマトグラフイ処
理することにより精製する。Fp175℃（分解）、 Rf＝0.38（珪酸ゲル、ｎ−ブタノール／氷酢
酸／水２：１：１） 例 15 2H−１，４−ジヒドロ−１，４−ジメチル−
２−オキソ−３−〔４−（Ｄ−フエニルアラニル
−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニルアミド）−フ
エニル−イミノ〕−ピロロ−〔３，２−ｂ〕−ピ
リジニウム−サルフエート−トリフルオルアセ
テートの製造 例14からの化合物を例4d）と同様にしてBOC
基を脱離するためにトリフルオル酢酸で処理す
る。次の構造の化合物が得られる： Fp185℃（分解）、Rf＝0.15（ｎ−ブタノール／
氷酢酸／水２：１：１） 例 16 本発明による化合物の酵素的開裂 いくつかの化合物に基いてペプチド結合を開裂
する酵素の検出を明らかにする。 トロンビン 例1c）からの物質及び例2b）、2c）、2d）、2e）、
2f）、2g）、2h）、2i）、2k）、14及び15からの物質
をそれぞれ0.1モル／ Hepes緩衝液PH7.5中に
溶かしかつトロンビンを加える。 開裂前後の本発明による化合物の最大吸収が明
らかである。 例 No. λnax（nm） λnax（nm） 開裂前 開裂後 1c） 526 544 2a） 515 566 2b） 501 562 2c） 525 558 2d） 342シヨルダー 568 を含む 420 2e） 470 584 2f） 464 588 2g） 528 564 2h） 529 564 2i） 449 540 2k） 530 567 (14) 525 558 (15) 525 558 凝固因子Xa 例３からの物質を0.1モル／ Hepes緩衝液
PH7.5中に溶かしかつ牛からの凝固因子Xaと反応
させた。最大吸収の測定値は開裂前に532nm及び
開裂後に564nmであつた。 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ 例4c）からの物質を0.1モル／トリス緩衝液
PH7.5中で50モル／グリシルグリシンと一緒に
溶解し、かつグルタミルトランスペプチダーゼと
反応させた。測定により、最大吸収は開裂前に
525nm及び開裂後に558nmであつた。 キモトリプシン 例５及び６からの物質をそれぞれカルシウムイ
オンの添加下に0.2モル／ トリス−緩衝液PH
8.1、25モル／ NaCl中に溶解しかつキモトリ
プシンと反応させた。開裂前後の最大吸収を測定
した： 例５からの物質：開裂前525nm 開裂後558nm 例６からの物質：開裂前485nmでシヨルダーを
有する366nm 開裂後594nm アミノペプチダーゼＭ 例８、10、12及び13からの物質をそれぞれ0.2
モル／トリス緩衝液PH8.1中に溶かし、かつア
ミノペプチダーゼＭと反応させた。開裂前後の最
大吸収値を測定した。
【表】
スブチリシン
例9b）からの物質を0.2モル／トリス−緩衝
液PH8.1中に溶かし、かつスブチリシンと反応さ
せた。最大吸収値は開裂前548nm及び開後566nm
であつた。 トリプシン 例11からの物質を200モル／トリス／HClPH
8.1中に溶かし、かつトリプシンと反応させた。
最大吸収値は開裂前418nm（525nmでシヨルダー
を有する）及び開裂後594nmであつた。 例 17 クイツク（Quick）による単一相凝固時間の測
定 試薬の製造 例2c）からの物質58mgを0.1モル／ Hepes
緩衝液PH7.0 100ml中に溶かし、かつトロンボプ
ラスチン（ヨーロツパ特許第0083773号明細書に
より製造）36mlと混合せる。この溶液を35ml−小
びん中に３mlずつ装填しかつ凍結乾燥させる。こ
れを６ミリモル／塩化カルシウムを含有する
0.1モル／ Hepes緩衝液PH7.0 30ml中に溶解す
る。 クイツク時間測定 調温可能なキユベツトホールダー及び接続して
いる記録計を有する光度計で37℃及び波長560nm
で測定を実施する。試薬１mlを37℃に予め調温し
かつ１cm−プラスチツク製キユベツト中に装入す
る。これにクエン酸塩血しよう0.1mlをピペツト
装入し、直ちに混合しかつ同時に記録計を治動さ
せる。吸光度が0.1E増加するまでの時間を測定す
る。 この測定法によりプール血しよう稀釈度との関
係曲線を測定した。結果を次表に記載する。 吸光度が0.1Eだけ変化 試料のクイツク％ するまでの時間（秒） 100％ 45.9 50％ 62.4 33％ 76.7 25％ 91.6 20％ 108.1 12.5％ 156.4 10％ 197.9 本発明方法とU.Becker及びその他共著、
“Haemostasis”、12，１〜２、73（1982年）に記
載の方法とを、例2c）からの物質の代りにTos−
Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリンアセテー
トを指示薬として使用して比較すると抗凝固処理
した患者の血しように関して相関係数0.988で一
致した。 例 18 レミツシヨン測光法によるクイツクの単一相凝
固時間の測定 指示薬ネツト NY75HC型のナイロン織物（Zu¨richer
Beuteltuchfabrik製、スイス国チユーリツヒ在）
をモヴイオール（Mowiol）26／88（Hoechst AG
社、西ドイツ国在）2.5ｇ、例2c）からの物質150
mg及び無水塩化カルシウム110mg、水全量100mlよ
り成る溶液で含浸し、引続いて乾燥箱中50℃で乾
燥する。 トロンボプラスチンネツト NY75HC型のナイロンネツトを下記の組成の
トロンボプラスチン溶液で含浸し、引続いて乾燥
箱中50℃で乾燥する。 トロンボプラスチン溶液は次のように製造す
る： モヴイオール18／88（Hoechst AG社、西ドイ
ツ国在）3.5ｇを、100％血しようでクイツク時間
11.0〜12.6秒を達成するトロンボプラスチン溶液
22mlと一緒に100ミリモル／ Hepes緩衝液PH
7.45 100ml中に溶かす。 第１図に示すように、指示薬ネツトとトロンボ
プラスチンネツトとを幅12mmの帯材に切断しかつ
幅16mmのガラス繊維フリース（ヨーロツパ特許公
開第0208218号明細書及び西ドイツ国特許公開第
3610429号明細書による）と一緒に西ドイツ国特
許公開第3616496号明細書による試験キヤリアに
加工する。 第１図に図示した試験キヤリアは、通常の試験
片の基本的な形状を有している。幅100mmのポリ
スチレンシート１上にヨーロツパ特許公開第
0208218号明細書又は西ドイツ国特許公開第
3610429号明細書によるガラス繊維フリース４を
幅16mmで載せかつ粗いナイロンネツト３で一部を
覆い、かつ一方の端部を接着剤２で固定する。ガ
ラス繊維フリースの自由端部にトロンボプラスチ
ンネツト５及び指示薬ネツト６を重畳して設け、
かつ厚さ200μm幅16mmの透明なポリカーボネート
シート７で覆い、かつ接着剤８で固着する。この
ようにして製造した帯材を幅６mmの試験片に切断
する。 クイツク試験を実施するに当り、血液又は血し
ようをカバーネツト３上に施すと、ガラス繊維層
４を介してトロンボプラスチンネツト５及び指示
薬ネツト６の区域に移行する。完全血液を施した
場合には、ヨーロツパ特許公開第0045476号明細
書に記載されているように血しようの分離が行な
われる。層５及び６に含有される試薬との反応を
開始させるために、これらの層を下向きに押圧す
ると、試料液体がこれらの層中に浸透し、相応す
る反応が進行する。 この種の凝固試薬で進行する化学反応について
の詳細はヨーロツパ特許公開第0182373号明細書
から明らかである。 第１図による試薬キヤリアを用いて567nmの
LEDを有するレミツシヨン光度計ReflotronR
（Boehringer Mannheim GmbH社、西ドイツ国
在）上で稀釈血しようを用いて検量曲線を作成し
た。このために血しようを牛血清アルブミン10％
を添加した生理食塩液を用いて種々のクイツクパ
ーセントに稀釈した。このようにして前処理した
試料を試料１部に対して生理食塩液６部で稀釈
し、そのうちの32μを滴下側（第１図のカバー
ネツト３）上にピペツト滴下した。 参考曲線の結果は次の表から明らかである： 最終的な稀釈前の レミツシヨンが10％変化試料のクイツク％ するまでの時間（秒） 100％ 38.0 50％ 57.0 33％ 74.5 25％ 93.9 20％ 110.0 12.5％ 163.8
液PH8.1中に溶かし、かつスブチリシンと反応さ
せた。最大吸収値は開裂前548nm及び開後566nm
であつた。 トリプシン 例11からの物質を200モル／トリス／HClPH
8.1中に溶かし、かつトリプシンと反応させた。
最大吸収値は開裂前418nm（525nmでシヨルダー
を有する）及び開裂後594nmであつた。 例 17 クイツク（Quick）による単一相凝固時間の測
定 試薬の製造 例2c）からの物質58mgを0.1モル／ Hepes
緩衝液PH7.0 100ml中に溶かし、かつトロンボプ
ラスチン（ヨーロツパ特許第0083773号明細書に
より製造）36mlと混合せる。この溶液を35ml−小
びん中に３mlずつ装填しかつ凍結乾燥させる。こ
れを６ミリモル／塩化カルシウムを含有する
0.1モル／ Hepes緩衝液PH7.0 30ml中に溶解す
る。 クイツク時間測定 調温可能なキユベツトホールダー及び接続して
いる記録計を有する光度計で37℃及び波長560nm
で測定を実施する。試薬１mlを37℃に予め調温し
かつ１cm−プラスチツク製キユベツト中に装入す
る。これにクエン酸塩血しよう0.1mlをピペツト
装入し、直ちに混合しかつ同時に記録計を治動さ
せる。吸光度が0.1E増加するまでの時間を測定す
る。 この測定法によりプール血しよう稀釈度との関
係曲線を測定した。結果を次表に記載する。 吸光度が0.1Eだけ変化 試料のクイツク％ するまでの時間（秒） 100％ 45.9 50％ 62.4 33％ 76.7 25％ 91.6 20％ 108.1 12.5％ 156.4 10％ 197.9 本発明方法とU.Becker及びその他共著、
“Haemostasis”、12，１〜２、73（1982年）に記
載の方法とを、例2c）からの物質の代りにTos−
Gly−Pro−Arg−ｐ−ニトロアニリンアセテー
トを指示薬として使用して比較すると抗凝固処理
した患者の血しように関して相関係数0.988で一
致した。 例 18 レミツシヨン測光法によるクイツクの単一相凝
固時間の測定 指示薬ネツト NY75HC型のナイロン織物（Zu¨richer
Beuteltuchfabrik製、スイス国チユーリツヒ在）
をモヴイオール（Mowiol）26／88（Hoechst AG
社、西ドイツ国在）2.5ｇ、例2c）からの物質150
mg及び無水塩化カルシウム110mg、水全量100mlよ
り成る溶液で含浸し、引続いて乾燥箱中50℃で乾
燥する。 トロンボプラスチンネツト NY75HC型のナイロンネツトを下記の組成の
トロンボプラスチン溶液で含浸し、引続いて乾燥
箱中50℃で乾燥する。 トロンボプラスチン溶液は次のように製造す
る： モヴイオール18／88（Hoechst AG社、西ドイ
ツ国在）3.5ｇを、100％血しようでクイツク時間
11.0〜12.6秒を達成するトロンボプラスチン溶液
22mlと一緒に100ミリモル／ Hepes緩衝液PH
7.45 100ml中に溶かす。 第１図に示すように、指示薬ネツトとトロンボ
プラスチンネツトとを幅12mmの帯材に切断しかつ
幅16mmのガラス繊維フリース（ヨーロツパ特許公
開第0208218号明細書及び西ドイツ国特許公開第
3610429号明細書による）と一緒に西ドイツ国特
許公開第3616496号明細書による試験キヤリアに
加工する。 第１図に図示した試験キヤリアは、通常の試験
片の基本的な形状を有している。幅100mmのポリ
スチレンシート１上にヨーロツパ特許公開第
0208218号明細書又は西ドイツ国特許公開第
3610429号明細書によるガラス繊維フリース４を
幅16mmで載せかつ粗いナイロンネツト３で一部を
覆い、かつ一方の端部を接着剤２で固定する。ガ
ラス繊維フリースの自由端部にトロンボプラスチ
ンネツト５及び指示薬ネツト６を重畳して設け、
かつ厚さ200μm幅16mmの透明なポリカーボネート
シート７で覆い、かつ接着剤８で固着する。この
ようにして製造した帯材を幅６mmの試験片に切断
する。 クイツク試験を実施するに当り、血液又は血し
ようをカバーネツト３上に施すと、ガラス繊維層
４を介してトロンボプラスチンネツト５及び指示
薬ネツト６の区域に移行する。完全血液を施した
場合には、ヨーロツパ特許公開第0045476号明細
書に記載されているように血しようの分離が行な
われる。層５及び６に含有される試薬との反応を
開始させるために、これらの層を下向きに押圧す
ると、試料液体がこれらの層中に浸透し、相応す
る反応が進行する。 この種の凝固試薬で進行する化学反応について
の詳細はヨーロツパ特許公開第0182373号明細書
から明らかである。 第１図による試薬キヤリアを用いて567nmの
LEDを有するレミツシヨン光度計ReflotronR
（Boehringer Mannheim GmbH社、西ドイツ国
在）上で稀釈血しようを用いて検量曲線を作成し
た。このために血しようを牛血清アルブミン10％
を添加した生理食塩液を用いて種々のクイツクパ
ーセントに稀釈した。このようにして前処理した
試料を試料１部に対して生理食塩液６部で稀釈
し、そのうちの32μを滴下側（第１図のカバー
ネツト３）上にピペツト滴下した。 参考曲線の結果は次の表から明らかである： 最終的な稀釈前の レミツシヨンが10％変化試料のクイツク％ するまでの時間（秒） 100％ 38.0 50％ 57.0 33％ 74.5 25％ 93.9 20％ 110.0 12.5％ 163.8
第１図は本発明による診断剤を含有する試験片
図である。 １……ポリスチレンシート、２，８……接着
剤、３……ナイロンネツト、４……ガラス繊維フ
リース、５……トロンボプラスチンネツト、６…
…指示薬ネツト、７……ポリカーボネートシー
ト。
図である。 １……ポリスチレンシート、２，８……接着
剤、３……ナイロンネツト、４……ガラス繊維フ
リース、５……トロンボプラスチンネツト、６…
…指示薬ネツト、７……ポリカーボネートシー
ト。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式： 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級アル
キルにより置換されていてもよいカルボキサミド
基を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場
合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わし、 Ｚは正電荷の共役双環式ヘテロ環系を表わし、
かつ Ｘは有機酸又は無機酸のアニオンを表わす〕の
発色性化合物。 ２ Ｚが一般式： 〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥは炭素原子又は窒素原
子を表わし、その際にそれらが橋頭原子ではない
場合には炭素原子は酸素、低級アルキル基、低級
アルコキシ基、アリール基、アラールキル基又は
アリールオキシ基により置換されていてもよく、
かつ窒素原子は低級アルキル基、アラールキル基
又はアリール基により置換されていてもよく、 Ｙは窒素原子又は硫黄原子により遮断されてい
るか又はそのようなヘテロ原子を連鎖の初めか又
は終りに含有していてもよい３〜５員の不飽和炭
化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基、アラールキル基、
アリールオキシ基又はアリール基により置換され
ていてもよく及び／又は窒素原子は低級アルキル
基、アラールキル基又はアリール基により置換さ
れていてもよく、２つの隣接する低級アルキル基
は炭素原子３〜５個を有する飽和アルキレン基を
形成してもよく、かつ 双環中のヘテロ原子の合計は最高３である〕の
基を表わす請求項１記載の化合物。 ３ Ｚが を表わし、その際R4〜R7は同じか又は異なつて
いてよく、水素、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、アラールキル基、アリールオキシ基又はア
リール基を表わす請求項２記載の化合物。 ４ 一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わす〕の化合物を一般式： 〔式中同じか又は異なつているR2及びR3は水
素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボ
キシ基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級
アルキルにより置換されていてもよいカルボキサ
ミド基を表わすかもしくはR2とR3が隣接してい
る場合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わし、 Ｗは保護基により置換されているアミノ基を表
わす〕のフエニレンジアミン誘導体と反応させ、
引続いて基Ｗのアミノ保護基を脱離しかつ得られ
た遊離NH2を有する化合物を酸化し、かつこの
ようにして得られた一般式： 〔式中R1〜R3は前記のものを表わす〕のニト
ロソ化合物を酸性触媒下に一般式： Z′−Ｈ （） 〔式中Z′は荷電されていない双環式ヘテロ環式
系を表わす〕の化合物と反応させ、引続いてアミ
ノ保護基を完全に又は部分的に脱離してよいこと
を特徴とする請求項１記載の化合物の製法。 ５ 荷電されていない双環式ヘテロ環系が一般式
ａ又はｂ： 【式】 【式】 〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥはそれぞれ炭素−又は
窒素原子を表わし、その際にそれらが橋頭原子で
はない場合、炭素原子は酸素、低級アルキル−、
低級アルコキシ−、アリール−、アラールキル−
又はアリールオキシ基により置換されていてもよ
くかつ窒素原子は低級アルキル−、アラールキル
−又はアリール基により置換されていてもよく、 Ｙは窒素原子又は硫黄原子により遮断されてい
るか又はそのようなヘテロ原子を連鎖の初めか又
は終りに含有していてもよい３〜５員の不飽和炭
化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基、アラールキル基、
アリールオキシ基又はアリール基により置換され
ていてもよく及び／又は窒素原子は低級アルキル
基、アラールキル基又はアリール基により置換さ
れていてもよく、２つの隣接する低級アルキル基
は炭素原子３〜５個の飽和アルキレン基を形成し
てもよく、かつ双環中のヘテロ原子の合計が最高
３個であり、不飽和連鎖Ｙの二重結合は５員還の
二重結合系に対して共役しており及び／又はＡ又
はＢが窒素原子である場合にはこれが両方の還系
に対してエナミン構造を形成する〕により表わさ
れる請求項４記載の方法。 ６ 一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わす〕の化合物を一般式： 〔式中同じか又は異なつているR2及びR3は水
素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボ
キシ基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級
アルキルにより置換されていてもよいカルボキサ
ミド基を表わすかもしくはR2とR3が隣接してい
る場合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わす〕
のｐ−ニトロアニリン誘導体と反応させ、得られ
たニトロ化合物を相応するヒドロキシルアミンに
還元し、次に酸化し、かつこのようにして得られ
た一般式： 〔式中R1〜R3は前記のものを表わす〕のニト
ロソ化合物を酸性触媒下に一般式： Z′−Ｈ （） 〔式中Z′は荷電されていない双環式ヘテロ環式
系を表わす〕の化合物と反応させ、引続いてアミ
ノ保護基を完全に又は部分的に脱離してよいこと
を特徴とする請求項１記載の化合物の製法。 ７ 荷電されていない双環式ヘテロ環系が一般式
ａ又はｂ： 【式】 【式】 〔式中Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥはそれぞれ炭素−又は
窒素原子を表わし、その際にそれらが橋頭原子で
はない場合、炭素原子は酸素、低級アルキル−、
低級アルコキシ−、アリール−、アラールキル−
又はアリールオキシ基により置換されていてもよ
くかつ窒素原子は低級アルキル−、アラールキル
−又はアリール基により置換されていてもよく、 Ｙは窒素原子又は硫黄原子により遮断されてい
るか又はそのようなヘテロ原子を連鎖の初めか又
は終りに含有していてもよい３〜５員の不飽和炭
化水素連鎖を表わし、その際に炭素原子は低級ア
ルキル基、低級アルコキシ基、アラールキル基、
アリールオキシ基又はアリール基により置換され
ていてもよく及び／又は窒素原子は低級アルキル
基、アラールキル基又はアリール基により置換さ
れていてもよく、２つの隣接する低級アルキル基
は炭素原子３〜５個の飽和アルキレン基を形成し
てもよく、かつ双環中のヘテロ原子の合計が最高
３個であり、不飽和連鎖Ｙの二重結合は５員環の
二重結合系に対して共役しており及び／又はＡ又
はＢが窒素原子である場合にはこれが両方の環系
に対してエナミン構造を形成する〕により表わさ
れる請求項６記載の方法。 ８ 一般式： 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級アル
キルにより置換されていてもよいカルボキサミド
基を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場
合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わす〕の化
合物。 ９ 一般式： 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級アル
キルにより置換されていてもよいカルボキサミド
基を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場
合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わす〕の化
合物を製造する方法において、一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1は前記のものを表わす〕の化合物を
一般式： 〔式中R2及びR3は前記のものを表わし、かつ
Ｗは保護基により置換されたアミノ基を表わす〕
のフエニレンジアミン誘導体と反応させ、引続い
て基Ｗのアミノ保護基を脱離しかつ生成した遊離
NH2基を含有する化合物を酸化することを特徴
とする中間生成物の製法。 １０ 一般式： 〔式中R1はアミノ基が保護基により置換され
ていてもよいアミノ酸残基又はオリゴペプチドの
基を表わし、 同じか又は異なつているR2及びR3は水素、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシ
基、低級アルコキシカルボニル基又は、低級アル
キルにより置換されていてもよいカルボキサミド
基を表わすかもしくはR2とR3が隣接している場
合は−CH＝CH−CH＝CH−基を表わす〕の化
合物を製造する方法において、一般式ａ： R1−OH （ａ） 〔式中R1は前記のものを表わす〕の化合物を
一般式： 〔式中R2及びR3は前記のものを表わす〕のｐ
−ニトロアニリン誘導体と反応させ、生成したニ
トロ化合物を相応するヒドロキシルアミン又はア
ミンに還元し、かつその後酸化することを特徴と
する中間生成物の製法。 １１ 請求項１から３までのいずれか１項記載の
化合物を使用するペプチド結合を開裂する酵素を
測定する方法。 １２ 請求項１から３までのいずれか１項記載の
化合物を使用する血液凝固因子を測定する方法。 １３ 発色性基質１種以上、好適な緩衝物質並び
に場合により他の常用の助剤を含有する、ペプチ
ド結合を開裂する酵素を測定するための診断剤に
おいて、発色性基質として請求項１から３までの
いずれか１項記載の化合物を含有することを特徴
とするペプチド結合を開裂する酵素を測定するた
めの診断剤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3710937.5 | 1987-04-01 | ||
| DE19873710937 DE3710937A1 (de) | 1987-04-01 | 1987-04-01 | Chromogene verbindungen, ihre herstellung und verwendung als enzymsubstrate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63275551A JPS63275551A (ja) | 1988-11-14 |
| JPH0544940B2 true JPH0544940B2 (ja) | 1993-07-07 |
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| JP63078297A Granted JPS63275551A (ja) | 1987-04-01 | 1988-04-01 | 発色性化合物、その製法、該化合物を製造するための中間生成物、該中間生成物の製法、ペプチド結合を開裂する酵素及び血液凝固因子の測定法並びにペプチド結合を開裂する酵素を測定するための診断剤 |
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| DK (1) | DK178588A (ja) |
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| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
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-
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- 1987-04-01 DE DE19873710937 patent/DE3710937A1/de not_active Withdrawn
-
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- 1988-03-24 EP EP88104715A patent/EP0285000B1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1988-03-31 US US07/175,858 patent/US5108890A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1988-04-01 JP JP63078297A patent/JPS63275551A/ja active Granted
- 1988-04-01 KR KR1019880003688A patent/KR880012639A/ko not_active Withdrawn
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