JPS6366197A - 新規なペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、新規なペプチド誘導体、並びにこれを基質と
して用いる生理活性物質の測定法に関））−る。

〔発明の背景〕

ペプチド、タンパク質などの、Ｌとしてアミノ酸で構成
されている物質は、生体内に於て、神々の重要な生理的
役割を果している。このノ１−理的機能を発現するにあ
たり、ペプチド結合の特λ的な分解、特異的な修飾、糖
、リン酸基、スルホン基、硫酸基等のペプチドへの特Ｗ
的なイ・１加及び特異的な脱離反応等が生体内で起こる
ことか知られている。例えば、ペプチド＋１ポルモンの
特嬰的加水分解による活性化、タンパク質のリン酸化に
よる活＋′Ｉ調節、ペプチド、タンパク質の生体膜通過
時の特異的切断、タンパク質に対する糖鎖の付加又は脱
離等多くの具体例か知られている。このような反応の解
明は、医学的、生理学的に非常にＩＩ′１′要なことて
あり、このような反応を行う生理活性物質について、こ
れまで種々の研究がなされている。

従来より、ペプチド、タンパク質等に作用する生理活性
物質の活性を測定するにあたり、ペプチド或はタンパク
質を測定基質として用い、これに対して生理活Ｐ（物質
が修飾、脱離、分解等の種々の作用を行った結果を測定
する方法が最も一般的である。

例えば、プロテアーゼやペプチダーゼ活性を測定する場
合、ベブヂト或はアミノ酸に発色基を導入した天上基質
を用いる方法か知られている。この方法は発色基として
、クマリン、ナフチルアミン、ニトロアニリン、馬尿酸
等の誘導体を用い、こわらの発色基とアミノ酸との結合
が加水分解されることにより遊離する発色基の蛍光強ｊ
「、吸光度（吸収曲線）等の変化を測定１−ることによ
り、或は遊離する発色基を更にカップラー智ど１１′色
反応させて生じた色素の吸光度を測定することによりこ
れを測定する方法である。このように、目的とする生理
活Ｐ［物質により面接この結合を加水分解し、測定する
方法は簡便ではあるが、この方法に用いられる基質はペ
プチドと発色」、Ｌどの結合が切断されて初めて発色或
いは蛍光ｆ１をイ１゛する基を生成するため、加水分解
される箇所はアミノ酸と発色基との結合部位でなく−ｒ
はならず、＃、’ｔ　！Ａ！性の高い生理活性物質の測
定法としては適当ではない。また、ペプチドと発色」、
Ｌとを結合させたＪＩし質のペプチド部分を、］・１的
の牛理活ｆ１物′Ｃ′［て加水分解させ、更にエクソペ
プチダーゼ等を）（役さピて発色基を遊離させる方法は
、面接、加水分解物を測定していないため、混入する他
の’ｌ　Ｊ’ｌ！　？＋’、ｆ’ｌ物質の影響か避けら
れない。

また、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ旧ｏｃｈｃｍｉｓ１．ｒｙ
、　Ｑ、　　１２！Ｉｌ〜１２９９　（１９８５）には
、ペプチドを”＋Ｌ’ｔＴに用い、加水分解によって生
したアミノ基にフルオレサミンを作用させ、干した蛍光
を測定する方法が開示されている１、この方法は、感度
の良い方法ではあるか、ノ１成したアミノ基を特定でき
ず、混入する他の生理活＋Ｊ［物質によって他の部分の
ペプチドが加水分解され、その影響が生じるという欠点
を有する。この方法と同様に、新たに生じるアミノ基又
はカルボキシル基を測定する方法は、反応部分を特定て
きないため、大きな誤差を与える恐れかある。

また、上記文献では、反応物を高速液体クロマログラフ
イーて分離定量することにより、加水分解部分の特定と
定量かｉｉＪ能であることか開示されているが、この場
合、ペプチド結合による２２０ｎｍ前後の吸１ｙを測定
しているため、感度が低いという欠点を有している。

更に、ｌｌｉｎｃｈｃｍｉｓｌ、ｒｙ、　１５．１９５
８〜＋９６７　（＋９７６）には特定の官能基の付加或
は脱離を行う作用を４１する酵素の測定方法としてラジ
オアイソトープを用いる方法が開示されている。この方
法は、ピストン、カゼイン等のタンパク質と　・１′１
）てアイソトープ使用ルしたアデノシン　リン酸を用い
Ｔを行もうと云う タンパク質のリン酸化を行う酵素の測定餘腓＋÷もので
ある。このＪｆ法は感度の高い方法ではあるか、タンパ
ク質のどの部分がリン酸化したが牛、Ｙ定できないし、
アイソトープ使用のためＱ、’ｉ殊な機器類を必要とし
、また操作か煩雑であるという欠点を有している。従っ
て、この様な酵素の測定り法として、より特異性か高く
、反応機構の解明がｉｉＴ能で、操作の簡便な方法の開
発が強く望まゎていた。

〔発明の目的〕

本発明は、上記した如き状況に鑑みなさゎた乙ので、ペ
プチド、タンパクγ′［智に（ｉ’　ＩＩ−！ｌ−る〕
１理活性物質の活性を特宍的に、１１つ感度良く、ｆＡ
１便に測定し得る方法を提供することを目的とする１、
〔発明の構成〕 本発明は、アミノ酸が２〜１５個からなるト記構造式［
ＩＩ又は［ＩＩ　］を４１゛するペプチド１清導体、及
びこれをペプチド又はタンパク′Ｃ′［に作用する生理
活性物質の基質として用い、生理活性物質の作用を受け
て生じる生成物を分別測定することによりこれを行うこ
とを特徴とする、生理活性物質の活性測定法の発明であ
る。

Ｒ１−八＋７．−　八２　　　Ｒ７［ＩＩ又はＲ１−＾
’−Ａ’−Ｒ２［Ｉ１］［ 但し、Ａはアミノ酸残基又はアミノ酸が２〜１３個から
なるペプチド残基を表わし、Ａ１はＮ末端のアミノ酸残
基を、八２はＣ末端のアミノ酸残基を夫々表わす。また
、Ｒ１は−ＮＨ−基と結合して蛍光性及び７／又はＵＶ
吸収を有する基となるもの、又は水素原ｒ−若しくはア
ミノ保護基を表わし、＋１’は水酸基、カルボキシ保護
基又は−ＮＨ−Ｙ−８３（但し、Ｒ３は蛍光＋′１及び
／ＵＶ吸収を有する基を表わし、Ｙは炭素数１〜１０の
直鎖状又は分枝状のアルキレン」、シ、又はフェニレン
基を表わす。）を表わす１１世し、Ｒ１か水素原ｒ−若
しくはアミノ保護基の場合は１１’は　−Ｎ　ＩＩ　−
Ｙ　−Ｒ３であることを要し、Ｒ２か水酸」、Ｌ又はカ
ルボキシ保護基の場合はＲ１は−ＮＨ−基と結合して蛍
光性及び／又はＵＶ吸収を有する基となるものであるこ
とを要＝Ｉ−，，］一般式［＋１及び［１１１ニ於ける
］（１としｃ　４Ｊ、例えば２−ピリジルＪＩＬ、３−
ピリジル」、し、４−メチル−７−クマリノ基、フェニ
ルＪ、Ｃ１置換フェニル基等のように−Ｎｌ＋−基と結
合して蛍光＋″１及び７／又はＵＶ吸収を有する基とな
るもの、又は水素原＃しくはアミノ保護基等が挙げらゎ
る。置換）Ｊ、ニル基の置換基としては、例えば、メチ
ルＪ、Ｕ　、エチル基、プロピル基、ブチル基−１７の
低級アルキル基、例えばメトキシ基、エトキシＪ、ｌ：
　、プロポキシ基等の低級アルコキシ基、ヒドロキシＪ
１Ｌ、カルボしては、アミノ酸のアミノＪ、ｔの保護基
としｃ　般に用いられているものはいずれにても良いが
、 例えば、カルボヘンジキシ基、ザクシニル基、炭素数２
〜１８個からなるアルコキシカルボニルＪ、を等の保護
基が挙げられる。

一般式［１Ｆ及び　［１１］に於けるＲ）としては、水
酸１１Ｌ、カルボキシ保護Ｊ、シ、−Ｎｌｌ−Ｙ−１＋
’て示される」、Ｌが辛げら２する。≠カルボキシ保護
基としては、アミノ酸のカルボキシ基の保護基として一
般に用いられているちのはいずれにても良いか、例えば
、ヘンシルオキシＪ、（、フェネチルオキシ基等のアラ
ルギルオギシ基等が好ましいものとして挙げられる。ま
た、−Ｎｌｌ−Ｙ−Ｒ３で示される基に於けるＲ３とし
ては、例えば、２−ピリジルアミノ基、３−ビリンルア
ミノＪＩ［，７−アミノ−４−メチル−クマリノ」、シ
、アニリノ基、置換アニリノ基等のような蛍光ス′［及
び／ＵＶ吸収を有する基が挙げられる。置換アニリノＪ
ｉ（の置換基としては、例えば１、メチルＪ、ｔ、　、
エチル基、プロピル基、ブチル基等の低級アルキル基、
例えば、メトキシ基、エトキシｊ、ｌ；　、プロポキシ
基等の低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基
、スルホン基、例えば塩素、（素、沃素等のへロケＱが
挙げられる。また、Ｙとしては炭素数１〜ＩＯの直鎖状
又は分枝状のアルキレン」、シ、又はフェニレン基等か
挙げられる。

Ｒ１，Ｒ′は夫々独立して−に記した如き神々の」、Ｌ
なとり得るが、１１か水素原−ｒ−又はアミノ保護基の
場合はＲ２は−Ｎ　ＩＩ　−Ｙ−１１’でなりればなら
ず、また、Ｒ２が水酸基又はカルボキシ保護基の場ｒ＋
　＆：Ｊ：　ｎ　＋は例えば２−ピリジル、ＩＩ（，３
−ピリジルアミノ、４−メチル−７−クマリノ人し、フ
ェニル基又は置換フェニル基等の様に−ＮＨ基と結合し
て蛍光＋１１及び／又はＵＶ吸収を有する」、（となる
ｂのでなけれはならない。

一般式［ＩＩに於けるＡとしては、詐神アミノ酸残基又
はアミノ酸が２〜１：１個からなるペプチド残基が挙げ
られるか、これら、アミノ酸（ペプチドを構成している
アミノ酸を含む３．）の神頼に特に制約はなく、測定対
象に応じて、また、合成のし易さ等を考慮して適宜選択
すれば良い、１一般式［］］及び　［１１］　に於番す
る八ｌはＮ末端のアミノ酸残基であり、八２はＣ末端の
アミノ酸残ＪＲであるが、これらのアミノ酸に関しズも
特に制約はなく、測定対象に応じて適宜選択される６゜
本発明に係るペプチド誘導体は、例えば、２−ピリジル
アミノ基、３−ピリジルアミノ基の如く蛍光性及びＵＶ
吸収を有する基、或はアニリノ」１Ｌの如（ＵＶ吸収な
打する基が、ペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側の少なくと
もいずれかに存在している必要があるが、そのいずれに
存在していても、また、両端に存在していても良い。こ
れらの３％かＮ、；に端側又はＣ末端側のどちらか片方
にのみイｆ在している場合、他の末端はアミノ酸のまま
でも良く、また、試料中に混入するエキソペプチダーゼ
の作用により基質が加水分解を受ける恐れのある場合に
は、修飾を行っても良い。修飾剤としては、試Ｆ１中に
混入するエキソペプチダーゼの作用を低トさせるもので
あれば良く、特に限定されないが、Ｎ末端、Ｃ末端の夫
々については通常前述したような人々の保護基が用いら
れる。また、へ１．八′又は１１’、ＩＩ２のいずれに
も利用できるアミノ酸の性質と保護基としての性質を併
せ持つものとしてβ−アラニン、β−アミノ酪酸、γ−
アミノ酪酸、δ−アミノーｎ−吉草酸等のβ−１γ−９
δ−１・・・・アミノ酸が挙げられる。またＮ−末端か
Ｎ−メチルアミノ酸等の如きＮ−置換アミノ酸の場合に
は、当然のことながら、これを史に修飾する必要はない
。

ペプチド鎖の合成方法は、ステップ法、フラグメント法
或は固相法、液相法等の通常用いられる方法で良く、末
端への導入方法も特に限定されない。

本発明に係るペプチド誘導体は、例えば次の様にして合
成される。

即ち、例えば、Ｎ末端側にピリジルアミノＪ、Ｌを導入
する場合を例にとると、公知文献、ＩＩ　ｕ　Ｉ　Ｉ　
。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ、：１３．　１３９２〜
Ｉ：Ｉ！■　（１！Ｉ　ｌｉ　Ｏ）　　に従い、以下の
操作を行う１．即ち、ホルムアルデヒドと重非硫酸ナト
リウム水溶液を数１−分乃金数時間還流後、２−アミノ
ピリジンを加えて、史に１時間程度還流する。これに青
酸リートす・ｊツムを加え、９０℃近辺で数時間反応後
、反応液をＩＩ’ｊ＾し、枦液をクロロホルム等で油田
し、濃縮１１−ると２−ピリジルアミノアセトニトリル
の結晶か初出する。２−ビリンルアミノアセト二］・リ
ルをｊυ、酸て加水分解し、濃縮すると２−ピリシルク
リシン塩酸塩の結晶が析出する。

次に、例えば、これとグリシンとのペプチド結合反１心
について述へると、Ｎ−２−ピリジルグリシンにジクロ
ルメタン、Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド
及びクリノンエチルエステルを加え、室温で数時間撹拌
後濾過し、炉液を高速液体クロマトグラフィー等で精製
すれば、Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（ｌｌＸｌ：　（Ｐ
ｙｒはピリジル基をｃｒｙはグリシン残基を夫々示す。

）が得られる。

また、Ｃ末端側にピリジルアミノ基を導入する場合につ
いて述へると、例えば、２−クロルピリジンとエチレン
ジアミンを油浴、トで数時間還流し、冷却後、減圧濃縮
し、塩酸を加えると、Ｎ−（２−ピリジル）エタンジア
ミン塩酸塩の結晶が析出するのでこれを惟離する。次い
で、これにジメチルホルムアミド、トリエチルアミン及
びカルボベンゾキシアラニル−Ｐ−ニトロフェニルエス
テルを加え、室温で１０〜３０時間撹拌後枦通し、炉液
な高速液体クロマトグラフィー等で精製すれは、Ｚ−八
Ｉａ−Ｃｌ１２ｅｌｆ、−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ（Ｚはカルボ
ベンゾキシ基を、八ｌａはアラニン残基を、ｌ’ｙｒは
ピリジル」、（を夫々承−４−，＞か得られる。

本発明のペプチド誘導体はこ７１１をｌ、を質と（］て
用いた場合、水に対して溶解度か高く、安定刊にも優れ
ている。

本発明のペプチド誘導体をＪｌ（質どして用いれば、ペ
プチド、タンパク質等に対して修飾、脱離、分解等の神
々の作用を′Ｉｉなう）Ｉ　Ｉ’ｌ！　７＋’＋　＋’
＋物′Ｃ１の活性を特Ｗ的に１１つ感度良＜　１ｌｌ１
１定することかできる。

即ち、本発明のペプチド誘導体なベプチＩ・、タンパク
質に作用する生理活＋Ｊ１物′Ｃ′〔のＪ＋し？’Ｅと
して用い、生理活性物質の作用を受けて生ずる）１成物
を分別測定することにより、牛理活↑１１物′Ｃ′［の
枯＋＋１を効果的に測定′１−ることかできる。。

ペプチド、タンパク質等に０川する牛埋活Ｐ１物質とし
ては、例えば、ベブヂト結合の加水分解を行うベブチタ
ーゼ類或はプロテア−セスｆ１、ペプチド或はアミノ酸
の転移反応を１１うトランスフェラーゼ類、（例えば、
ペプチド或はタンパク′Ｃ′【中のセリン残基，チロシ
ン残基，トレオニン残基のリン酸化を行うプロティンキ
ナーゼ類）、タンパク質或はペプチドに含まれているリ
ン酸基の脱離を行うフォスファターゼ類、タンパク質或
はペプチド中のアスパラギン残基等に糖鎖を付加する酵
素類、タンパク質或はペプチドに付加している糖鎖に作
用し、糖鎖の減少，増加を促進する酵素類、タンパク質
或はペプチドにスルホン基。

硫酸基，メチル基．アシル基等の修飾又は脱修飾を行う
酵素類等が挙げられる。

このような酵素類の測定に基質として用い得る本発明の
ペプチド誘導体の具体例を挙げると下記の如くなる。

尚、アミノ酸残基及び修飾基に関しては下記の略語を使
用した。

１’ｙｒ：ピリシル基，　Ａｌａ：アラニン残基，　Ａ
ｒｇ：アルキニン残基，　へｓｎ：アスパラギン残基，
　Ａｓｐ：アスパラギン酸残基，（：ｙｓニジスティン
残基。

１：ｙｓ−ＣｙＳ：シスチン残基，　Ｇｌｎ：グルタミ
ン残基。

Ｇｌｕ：グルタミン酸残基，　Ｇｌｙ：クリシン残Ｊ，
Ｌ，，　ｌｌｉｓ：ヒスチジン残基，　Ｉｌｙｌ：ヒト
ロギシリシン残Ｊ，し。

Ｈｙｐ　：ヒポキシプロリン残基，　Ｉｌｃ：イソロｒ
シン残基，　１．ｅｕ：ロイシン残Ｊ，ＬＩＬｙｓ：リ
シン残１，Ｌ；　、　Ｍｌ！　１．　：メチオニン残基
，　Ｐｈｅ：フェニルアラニン残Ｊ，ｌ；　。

Ｐｒｏニブロリン残基，　Ｓｅｒ：セリン残」、１．、
゛１°ｔ＋ｒ：ｈレオニン残基，１“「ｐニトリブトフ
ァン残３，Ｌ−、　’Ｉ’ｙｒ：ヂロシン残基，　Ｖａ
ｔ：バリン残基。

（ｉｔプロテアーゼの測定 エラスターゼの測定 Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ｇｌｙ−［ｉｌｕ−１
．ｙｓ−１．、ｙｓ−１．ｅ訂１．旧Ｉ　！ＬｙｓーＰ
ｈｅーＧｌｕーβー＾１ａ アミノ酸シークエンス中の↓印はエラスターゼによる切
断部位を示す。

即ち、ト記基質にエラスターゼが作用すると↓印の部位
でペプチドが切断され、ピリジルアミノ基を末端に４１
するペプチドか新たに　４Φデｒ１生成する。従って、
これを分別ｄ１１１定コＪ−ればＪ−ラスターセ活性を
測定′１−ることかできるわけである。

（ｉｉ）プロティンキナーゼ類の測定 （ｊ］’ｙｒ−（Ｉｙ（又はＡｌａ）−Ｇｌｕ−＾５ｐ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−八Ｉａ−へＩａ−Ａｒｇ−
へｒｇ−Ｎｌｌ−（Ｃ１ｌ□ｈ−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ■１＋
ｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−５ｃｒ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｖａｌ　−Ｎｌｌ−（にＩ
ｆ２）２−ＮＨ−ＰｙｒにＤ　Ｉ’ｙｒ−Ｇ　ｌ　ｙ　
（又は＾Ｉ　ａ）　−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ−（１１１□ｈ−Ｎｌｌ−Ｐｙ
ｒ（４）ｌ’ｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−ＡｒＨ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−１ｃ＋＋−Ｎ
１１−（Ｃ１１２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　　　。

■ｌ’、ｙｒ−Ｇｌｙ（父はＡｌａ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−５Ｃｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｎ１１−
（ｆ：ｌｌ２）２−Ｎｌｌ−ＰｙｒＯＰｙｒ−Ｇｌｙ（
又はＡ　１ａ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−へｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔ
ｈｒ−へｒｇ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｎｌｌ−（Ｃｌ１２）
２−ＮＨ−Ｐｙｒ（７；ｌｌ’ｙｒ−（ｉｌｙ（又はＡ
ｌａ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｎ−へ５ｌｌ−β−八１ａ （Ｉｆ、）Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａ、１−Ｔｙｒ−１１ｅ−１１ｉＳ−
Ｐｒｏ−Ｎｌｌ−（Ｃｌｌ２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ（９
］’ｙｒ−Ｇｌｙ（）シ、は八Ｉａ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｈ　（Ｇ１１
２）２−ＮｌＩ　Ｐ、ｖｒＱＤＰｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡ
ｌａ）−５ｅｒ−［１１ｙ−；ｅｒ−ｌ’ｌ＋ｃ−１，
ｙｓ−１，ｃｏ−ＮＨ−（Ｃ１１２）２−ＮＨ−Ｐｙｒ ＯＰｙｒ−Ｇｌｙ（又は八ｌａ）　−Ａｒｇ（又は１．
ｙｒ；）−１，ｙｓ−ＳＬ５ｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ
−（Ｃｌ＋２）２−ＮＨ−ＰｙｒＯＮ−へｃｅＬｙｌ−
５ｅｒ−Ｇｌｙ−八ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｎ１１−（（：１１
２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ ＠Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ｔｈｒ−ＡｒＨ−５
ｅｒ−５ｅｒ−＾ｊｇ−八１ａへＰｙｒ−Ｇｌｙ（又は
Ａｌａ）−Ｌｙｓ−１，ｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｓｃｒ−１ｙ
ｓ−八１ＪＩｃ Ｌｙｓ−Ｌｙｓ ＠　Ｎ−Ａｃｅ　Ｌｙ　ｌ−５ｅ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａ
ｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−１，ｙｓ−Ｎｌｌ−（１：１１．）
　２−ＮＨ−Ｐｙｒ ＠Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又は八Ｉａ）　−１、ｙＳ（父は八
ｒ）＜）−１ｉ１ｎ−ｌｌｃ−＊ ５ｅｒ−Ｖａｌ　（又はｌ１ｅ）−八ｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ
−Ｎｌｌ−（［：ｌｌ、）　、−Ｎｌｌ−１’ｙｒ＠Ｐ
ｙｒ−Ｇａｙ（又は八Ｉａ）−八ｒｇ（又は１ｙｓ）−
１ｉｌｕ−Ｉｌｃ−＊ ５ｅｒ−Ｖａｌ−八ｒｇ−Ｎｌｌ−（Ｃ１１２）２−Ｎ
ｌｌ−ＰｙｒＯ ＠Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ａｒｇ−ｌｌｉＳ−
１ｉ１ｙ−５ｃｒ−１、ｙｓ−Ｔｙｒ−１、ｅｕ−ＮＨ
−（Ｃｌ＋２）２−Ｎｌｌ−１’ｙｒ＠　Ｐｙｒ−Ｇ　
Ｉ　ｙ−Ａ　ｒ）Ｈ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−５ｅｒ−Ａ　ｒｇ−ＮＨ−（にｌＩ、）２−Ｎｌ
ｌ−Ｐｙｒ Ｎｌｈ　（１３１２）　２−Ｎ１１−ＰｙｒＯＰｙｒ−
Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ａｒｇ−１，ｅｕ−５ｅｒ−１
１ｅ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｎｌｌ−（Ｃｌｌ。）
２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ０１’ｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）
−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｖａｌ　（又はｌ
　Ｉｅ）　−Ｔｙｒ−１’ｒｏ−Ｎｌｌ−（ＣＨ２）２
−ＮＨ−ＰｙｒＯＰｙｒ−Ｇｌｙ（又は八１ａ）−八ｒ
ｇ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−八ｒｇ
−Ｎ１１−（Ｃ１１２）２−Ｎｌｌ−ＰｙｒＯＰｙｒ−
Ｇｌｙ　（又はＡｌａ）−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−５
ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｎｌｌ−（［；ＩＩ、、）２−
Ｎｌｌ−Ｐｙｒ＠ｌ’ｙｒ−Ｇｌｙ（又は八Ｉａ）−Ｖ
ａｌ−八ｒｇ−ＭｅＬ−５ｃｒ−Ａｌａ−Ａｓｘ−Ｎｌ
ｌ−（１３１２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ＠Ｉ’ｙｒ−Ｇｌ
ｙ（又はＡｌａ）−Ｌｅｕ−八ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｎ１１−（（：１１２）２−Ｎｌｌ−
ＰｙｒＡｒＨ−（Ｐｒｏ）−Ｎｌｌ−（にＩｆ２）２−
ＮＨ−Ｐｙｒ６Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−（Ａｒ
Ｈ）−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−八ｒｇ−（八ｒｇ）−Ｎｌｌ
−（［：Ｎ２）２−Ｎｌｌ−ＰｙｒＯＰｙｒ−Ｇｌｙ（
又は八Ｉａ）−（Ａｒｇ）−＾１ａ−Ｓｃｒ−＾ｒｇ−
（八ｒ＞：）−Ｎ１１−（Ｃ１１２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙ
ｒ（Ａｒｇ）−Ｎ１１−（ＣＩ−１２）２−Ｎｌｌ−Ｐ
ｙｒアミノ酸シークエンス中の＊印はプロプインキナー
ゼによりリン酸基がイ・１加される品持を小す。

即ち、十記基質にプロテインキナーセか作用すると＊印
の部位にリン酸基かイ・１加され、」、（質とは異なる
化合物が新たに生成する。従って、この生成物を分別測
定すればプロテインキナーゼ活性を測定することができ
るわけである。。

Ｇ司）オスファターゼ類の測定 （ｉｉ）の基質の＊印の部位にリン酸」、Ｌかイ・１加
したものが全てフォスファターゼ類の３１４７’ｊとな
る、。

フォスファターゼはプロディンキナーゼと全く逆の働き
をする酵素で、タンパク質或はベプチドに含まれている
リン酸基の脱離を行う。従って、この場合はリン酸基の
ついているペプチドが基質で、リン酸Ｊ、（か外れた形
のペプチドが生理活性物質の作用を受けて生ずる生成物
ということになる。

（ｉＶ）レニン又はアンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ
−■）の測定 ■Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又はＡｌａ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−１１ｅ−旧Ｓ−１’　、ｙ　ｒ Ｖａ　ｌ　−Ｔｙｒ−Ｎｌｌ−（ｅｌｌ、　）　２−Ｎ
）ｌ−Ｐｙｒ（ｅｌｌ２）２−Ｎｌｌ−１’ｙｒ アミノ酸シークエン中の↓印は夫々の酵素による切断部
位を、Ｉマず。

即ち、上記基質に夫々の酵素が０川すると↓印の部位で
ペプチドが切断され一柿のペプチドが新たに生成する。

従ってこれらの生成物を分別測定すれば各々の酵素活性
を測定することができる。。

（■各種ホルモン調節酵素の測定 （Ｖ　−１）　Ｐｏ５ｔ−ｐｒｏｌ　ｉｎｅ　ｃｌｅａ
ｖｉｎｇｃｒ＋ｚｙｍ（５の測定■Ｐｙｒ−Ｇｌｙ（又
は八１ａ）−八ｒｇ−Ｐｒｏ−１’ｒｏ！ＧＩｙ−Ｉ’
ｌ＋ｃ！−５ｃｒＮｌｌ−（Ｃｔ１２）２−ＮＨ−Ｐｙ
ｒ　（ブラジキニンの氷解）。

Ｐｙｒ−Ｇ　ｌｙ　（５１＆□Ｉａ）−ＡｒＨ−１’ｒ
占１ｙ−Ｎｌｌ−（１３１２＞ｚ−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　（
Ｌ　−ＨＲＨの氷解）■Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ｆｌｅ−Ｇｉ
ｎ−＾：ｓ−１’ｒｏ！１．ｅｕ−Ｇ　ｌ、ｙ−Ｎｌｌ
−（Ｃ）Ｉ２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　　（オキシトシン
の氷解）（Ｖ−２）ピログルタミン酸ペプチダーゼの測
定■ピログルタミン酸＋Ｇｌｙ−ｌ’ｒｏ−Ｎｌｌ−（
＋：１Ｉ２）２−Ｎｌｌ−Ｐ、ｙｒ■ｅ［１グルタミン
酸十Ｇｌｙ−１，ｙｓ−Ｎｌｌ−（Ｉｌｌ、、）２−Ｎ
ｌｌ−１’ｙｒ↓↓ ■ｅａグルタミン酸−１１ｉｓ−１’ｒｏ−Ｎｌｌ−（
［：１１２）ｚ−Ｎｌｌ−ｌ’ｙｒ■ピログルタミン酸
ｉ　ｕ　１ｓ−Ｔｒｐ−Ｎ１１−　（ｅｌｌ、　）　２
−Ｎｌｌ−ｌ’ｙｒ（Ｖ−３）その他 １’ｂｅ’Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ’Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ−
（ＣＨ山−ＮＨ−Ｐｙｒ　（サブスタンスＰ） （２］’ｙｒ−Ｇ！ｙ（又はＡｌａ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−’ｌ’ｒｐ−Ｎｌ
ｌ−（Ｃｆ（２）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　（カストリン）
■Ｉ’ｙｒ−Ｇｌｙ（叉は八Ｉａ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
八ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−’ｌ’ｒｐ−Ｎｔｌ
−（ｉ；Ｉｆ、、）２−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　（＝＋レジス
トキニン）アミノ酸シークエンス中の↓印は測定対象酵
素による切断部（ｊ／を示し、＃印は測定対象酵素によ
りスルホン酸基が付加される部位を示す。

前者に於ては、切断されて新たに生じるペプチド又はア
ミノ酸を分別測定することにより、また、後者に於ては
スルホン酸基が付加されたペプチドを分別測定すること
により夫々の酵素活性を測定することができる。

本発明の測定法に於ける測定条件としては、反応温風は
特に限定されないが、好ましくは約２０〜４０℃であり
、反応時間は［１的により適宜選択すれば良く、また反
応時のｐＨも、［１的により適宜選択すれば良い。反応
ρ１１をＭｌ持する緩衝剤は特に制約はないが、例えば
、リン酸塩、トリスハイドロキシメチルアミン−塩酸、
グリシン−水酸化ナトリウム、ゲットの緩衝剤、酢酸塩
などが挙げられる。

生理活性物質の作用による付加脱離反応、加水分解反応
、転移反応などにより生成する物質の分別測定方法とし
ては自体公知の分別測定法が種々あり、特に限定される
ものではないが、例えば、子量が大きく変化する場合に
はゲル濾過クロマトグラフィーにより、イオン性Ｊ、Ｌ
の代価或は脱修飾が起こる場合にはイオン交換クロマト
グラフィーにより、また、８Ｉ＋釦の付加脱離或は）、
ν定のペプチド構造が変化する場合にはアフィニディク
【Ｊマド利用した測定法１１餠妾幸弁≠＃、矢７　ｕ！
７間のうちに結果が得られるため特に有利である。ＩＩ
　Ｐ　Ｌ　Ｃの条件の一例を示せば、逆相クロマトグラ
フィーに於ては、オクタデシルシラン、オクチルシラン
、トリメチルシラン基等の基を導入した化学結合型シリ
カゲルか好ましく用いられる。溶離液としては、アセト
ニ］・リルに酢酸アンそニウム緩衝液、トリフルオロ酢
酸緩衝液等を添加し、ｐＨ２，０〜６．０にしたものか
分離能が良く、イソクラティック、グラジェントのいず
れでも使用できるが、特にこれらに限定されるものでは
ない。流速はカラムサイズ、分離能により自由に選択で
きるが、例えば０，５〜２．０　ｍｊ／ｍｉｎが好まし
い例である。検出は通常、蛍光法かｔＪＶ法で行われる
。例えば、先に述べた合成例に於て、検出に利用するた
めに導入した２−ピリジルアミノ基は、蛍光性及びＵＶ
吸収の両方を４１し、蛍光の場合は、通常、励起光及び
蛍光を夫々　：ｌＯＯ〜：１３０ｎｍ、：１５０〜４１
０ｎｍの波長を用い、ＵＶの場合は、通常３００〜３１
０ｎｍの波長を用いてｄ１ｑ定する。

本発明によれば、ペプチド、タンパク質等に作用する生
理活性物質の活性を、特異的に且つ極めて高い感度で（
数ピコモルの反応生成物が検出て本発明に係る生理活性
物質は、）１体中に存７１するものであるため、その測
定時にはさまざまな物質が共存する可能性が大きい。本
発明に於≠てはターセ或はエステラーゼ等の酵Ｊ８（以
トクノノ害酵素と略称する。）が共存する場合にはその
Ｉに　Ｍを受ける可能性も皆無ではない。本発明に係る
ペプチド誘導体は様々なものが合成１ＩｆＯｆ：である
ことから、ペプチドを構成するアミノ酸の柿類を妨害酵
素による作用を受けにくいものに限定して合成１−れば
この問題を全く回避することができる３、シかしながら
、測定対象によっては、このような条ｆ’１に好適のア
ミノ酸を４１するペプチド誘導体の使用が難かしい場合
も考えられる。このような場合には共存１−る妨害酵素
のインヒビターを測定試薬中に共存させることによって
この問題を解決ずれば良い。この場合選択されるインヒ
ビターは測定対象の酵素活性を阻害しないもので、共存
する妨害酵素にはイ１効に作用するものを適宜選択して
用いれば良い。そのようなインヒビターの具体例として
は、たとえばプロテアーゼに対してはペプスタチン、ホ
スホラミン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチ
ン、エラスタチナール、ジイソプロピルフルオロホスフ
ェイト（ＤＦＰ）、　Ｎ−トシル−１４−フェニルアラ
ニンクロロメチルケトン（ＴＩＩＧＫ）、　Ｎ−α−ｐ
−１シル−１，−リジンクロロメチルケトン（Ｔ１．Ｃ
Ｋ）　、酵素蛋白質に対する抗体、大豆トリプシンイン
ヒビター、カリクレインインヒビター、α２−マクログ
ロブリン等が、ペプチダーゼに対してはベスタチン、ア
マスタチン等が、ホスファターセに対しては、ホルフェ
ニシン等か、エステラーゼに対してはエステラスチン等
が挙げられる。

以トに実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するか、
本発明はこれら実施例により何等限定されるものでない
。

尚、実施例に於てはＦ記に小４−略語を用いた。

Ｐｙｒ：ピリシル基、　Ｇｌｙニゲリシン残Ｊ、ｌｉ　
、へ１Ｊ１：アラニン残基、１、Ｃｕ：ロイシン残Ｊ、
ｔ　、旧１１：グルタミン酸残基、　Ｌｙｓ：リジン残
基、　Ｐｌ＋＋！：フェニルアラニン残基、Ｂｏｃ：ｔ
−ブトキシカルボ＝　ＪＬ／Ｊ、Ｕ　、　１ｌｚｌ　：
ヘンジル基、　（Ｉｆ−Ｚ：塩化カルボベンゾキシ」、
し、旧：（：：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシル力ルホシイ
ミド。

ＤＣＨ＾ニジシクロヘキシルアミン、ＴＲ＾：Ｌ−ブチ
ルアミン。

〔実　施　例） 実施例１．２−ピリジルグリシンの合成３７％のホルム
アルデヒド溶液１１．２ｇをｌｌｊ　１ｌｌｊ硫酸ソー
ダ水溶液１０．８ｇ／　１６ｒｎ１１１，０に加え、３
０分間遠流した。次いで、２−アミノピリジン！１．４
ｇを加え、史に１時間還流した後、これに、：１１酸ソ
ーダ水溶液１０）Ｈ／　５０ｒｎ！１５０を加え、９０
“Ｃで４峙間撹拌反応させた。反応液を濾過し、炉液を
クロロホルム約５０ｍ！て６同抽出し、硫酸すトリウム
で乾燥後、濃縮して結晶を析出さ１！、結晶な枦取して
エーテルで結晶を洗浄した（収量約７．２ｇ）。クロロ
ポルムより再結晶を行い、２−ピリジルアミノアセトニ
トリル５．９ｇ　（収率４４％）を４また。これを１０
０ｍ１の６Ｎ（１α中で３時間還流して加水分解を行い
、濃縮して結晶を析出させた。結晶を枦取し、エタノー
ルで洗浄した後、水より出結晶を行い、本発明化合物合
成時の重要な中間体の一つである２−ピリジルグリシン
塩酸塩７．５　ｇ　（収率！１０．１％）を得た。

’Ｉｆ−ＮＭ１Ｒ１００Ｍｌｌｚ、Ｄ２０）　：　δ４
．３（ｓ、２Ｈ，−ＧＨ２−）＋１ｉ、８〜７．０（ｍ
、　２１１．　ｐｙｒｉｄｉｎｅ　Ｈ）、　７．７〜８
．０ｐｐｍ（ｍ、　２１１．　ｐｙｒｉｄｉｎｅ　ｔｌ
）。

元素分析値［塩酸塩］　　（Ｃ７１１９０□Ｎ２Ｃ１と
して）実測値　（％）　　Ｃ：４４．４Ｄ、　ｌｌ：４
．８３．　Ｎ：］４．７０゜ＣＱ：１８．５６ 計算値（％）　　Ｃ：４４．５８．　Ｈ：４．８］、　
Ｎ：１４．８５゜ＣＱ：１８．８０゜ ＵＶ極大吸収波長二λｍａｘ＝２：１８．３１Ｏｒ＋ｍ
。

励起波長’　”Ｘ、　ｍａｘ”　３１ｆｌ°″１・蛍光
極大波１ｔ：Ｖ−ｍイａｗ＝　３６０ｎ町実施例２．２
−ピリジルＤＬ−アラニンの合成重亜硫酸ナトリウムの
水溶液１ｔ１．５ｇ／　２１１ｍ１＋１２（＋に４４％
アセトアルデヒド溶液１０ｇを加え、１１１．Ｉｒ間間
熱熱還流た後、２−アミノピリジン！１　、４　ｇを加
え、更に２時間加熱連流を続けた。これに１１１酸ソー
ダ水溶液７　ｇ　／　ｌ０ｍ１ＩＩ□Ｏを加え、！Ｉ　
（１ｃで２１１、ν間反応させた後、油層を分取し、冷
却し゛（結晶化した（収量＋＋、６ｇ　）。これを耐酸
エチルでｉｌｔ結晶して、α−（２−ピリジルアミノ）
プロピオニトリル　９ｇ（収率６７％）を１１だ。

得られたα−（２−ピリジルアミノ）プロピオニトリル
３ｇを５０Ｆｎｌの６Ｎ１１α中で５時間還流して加水
分解後、濃縮し、析出してくる結晶（ＮＩ１４Ｃｉりを
除いた後、イオン交換樹脂［吸７７／ｆｌｌ口（ＩＷＩ
！Ｘ　！’ｉ０Ｈ”、カラム：　　１．ｌｉｘ１２ｃｍ
］に吸着させた１、水てよく洗浄した後、　０．２Ｍ酢
酸アンモニウム溶液で溶出し、黄色の両分を集めて濃縮
乾固した。耐酸アンモニウムを除くため、これに水を加
え、白瓜濃縮乾固した後濃塩酸を加え、水−エタノール
より結晶化させ、本発明化合物合成時に於ける重要な中
間体の一つである２−ピリジルＯＬ−アラニン塩酸塩の
結晶　約２ｇ（収率６０％）を得た。

’ＩＩ−ＮＭＩＩ（］０００Ｍ１ｌｚ、０２０）　：δ
Ｌ４４．１．５２（ｄ、　３Ｈ。

−［８１，）、　４．０〜４．２（（＋、ＩＩ＋、−（
：Ｈ−）、　６．８〜７．０（ｍ。

２１１、　ｐｙｒｉｄｉｎｅ　ＩＩ）、　　７．７〜８
．０ｐｐｍ　（ｍ、　２Ｈ。

ｐｙｒｉｄｉｎｅ　Ｉｔ）。

元素分析値［塩酸塩］　（ＣａＬ　、０２Ｎ２（Ｊ！と
じて）実測値（％）　　Ｃ＋４７．２９．　Ｈ：５．４
ｆｉ、　Ｎ：Ｉ３．６９゜α：１７．４８ 計算値（％）　　Ｃ：４７．４２．　Ｈ：５．４７．　
Ｎ：１３．８３゜Ｃｆ！：１７．５０゜ ＵＶ極大吸収波長：λ１．１ａｘ−２３８，３１０ｎｍ
。

励起波長’　Ｆ、Ｘ、　ｍａｙ＝　２９０ｎｍ。

蛍光極大波長：　Ｉｌｎ、　−ａＸ＝　３７０ｎｍ。

実施例３．１）メに−ｃ＋ｙ−ｃｒｙ−ｏ計の合成実施
例１で得られた２−ピリジルグリシン塩酸（：ｌＩＣ１
！３を加え、室温で３時間反応させた。反応液は黄色か
ら濃青色に変化した。反応液を枦道後、逆相の高速液体
クロマトクラフィーで、目的どする生成物を分取した（
収率３１１％）、。

１１Ｐ＋、に　［カラム：充填剤＋１Ｄｓ１２０Ｔ（東
洋曹達１−栗■商品名）　、　７　ｘ２５０ｍｍ）、溶
出液：２５％ＣＨ３（：Ｎ−０，０１Ｍ　Ｎ１１４０Ａ
Ｃ（ＰＩＩ５　、６）　、流速：　３　ａ／　／　＋１
ｌｉｎ、１溶出時間：２３ｍ１ｎ （Ｉｌｌ、６１１．−に１１２−）、　５．２５（ｂｒ
ｏａｄ　Ｓ、　Ｉｌｌ、　ｌ’ｙｒ−Ｎ−１ニー）。

６．４〜６．８　（ｍ、２１１．ｐｙｒｉｄｉｎｅ　Ｉ
ｆ）　、　７．４〜７．１ｉｐｐｍ（ｍ、２１１．ｐｙ
ｒｉｄｉｎｅ　Ｉｆ）。

本実施例により、実施例１で４ｊｌら第１だ２−ピリジ
ルグリシンが他のアミノ酸と容易に結合し１！すること
が確認された。

実施例４．　　Ｌｅｕ−Ｎ１１−Ｃ１１２Ｃ１１２−Ｎ
ｌｌ−Ｐｙｒの合成２−クロルピリジン　１２ｇ（Ｉｎ
Ｉｎりとエチレンジアミン　１００ｍ１を混ぜ、５時間
還流し、次に減ハ下、未反応のエチレンジアミンな留去
した。残渣をＩＮ　Ｎａ叶に溶かした後、クロロホルム
で数回抽出し、クロロホルム層を濃縮した。濃塩酸を加
え、塩酸塩とした後、メタノールを加え結晶化し、Ｎ−
（２−ピリジル）−１，２−エタンジアミン・塩酸塩１
１ｇ（収率９１％）を得た。

’Ｉｆ−ＮＭＩＩ（Ｉｌ］ＯＭＨｚ、　Ｃ２０）　：δ
　３．４〜３．５　（ｔ、２１１゜−［：１１２−Ｃｌ
ｌｚ−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ）、　　３．８〜：１．９（ｔ、
、２１１．　ＮＨ２−ＣＨ２−Ｃｌ１２−）、　７．０
〜７．３（ｍ、２Ｎ、ｐｙｒｉｌｉｎｅ　１＋）、　７
．９〜１１．２ｐｐｍ　　（＋ｎ、２１１．ｐｙｒｉｄ
ｉｎｅ　　ＩＩ）。

次に、　Ｂｏｃ−１，ｅｕＯｌｌ　−１１２０２５０ｍ
ｇにベンゼンを加え、エバポレーターで結晶水を除去し
た後、クロロホルム　５ゴに溶かし、　０６６２０６ｍ
ｇを加えて撹拌した。２０分後、これに先に合成したＮ
−（２−ピリジル）エタンジアミンのクロロホルム溶液
２０６＋ｎｇ１５−を加え、−後反応させた。反応液を
濾過し、沈澱を除いた後、溶媒を留去した。残漬をクロ
ロホルムに溶かし、２．５！ｋＮａ２Ｃｏ３水溶液、水
の順に洗浄し、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで脱
水後、濃縮すると、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｎ）Ｉ−ＣＨ２Ｃ
１１２−ＮＨ−Ｐｙｒか１：ｔられた。

これに、アニソール０．ｌ−１ＴＦＡ（トリフルオロ酢
酸）　０．５　ｍｌを冷却下加え、０℃で２時間反応さ
せ、　Ｂｏｃ基をはずした。エーテルを加え、不溶物を
集めてＫＯＨ入りのデシケータ−てよく乾燥させると、
Ｌｅｕ−ＮＨ−Ｃ１１２Ｃ１ｌ□−ＮＨ−Ｉ’ｙｒが１
１られた（収十約７０％）。本化合物も本発明化合物合
成時のｌｉ　’凶な中間体の一つである。

’Ｈ−ＮＭＩ（（］０００Ｍ１ｌｚ、０２０）　：　　
δ１１　、　Ｉｆ　５　　（ｓ　、　ｌｉ　Ｉｔ　。

−Ｃ（ＣＱ）、１．４〜１．６（ｍ、３１１．−Ｃｌ（
：Ｉｈ（：ＩＩぐ）、：１．ａ〜３．６（＋ｎ、４１１
．−Ｎｌｌ−（：１１２−Ｃ１ｌｚ−Ｎｌｌ−Ｐｙｒ　
）、　：１．１１〜４．０（ｔ、１１１．Ｎｉ１２−ｅ
ｌｌ−Ｇｏ−）、　６．７〜７．０　（ｍ、２１１．ｐ
ｙｒｉｄｉｎｅＨ）、　　７．６〜７．９ｐｐｍ　（ｍ
、２１１．ｐｙｒｉ旧ｎｅ　ＩＩ　）、。

実施例５．　　Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１，
ｙｓ−Ｌｃ＋＋−１，ｃｏ−１ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
β−Ａｌａの合成 公知文献　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｃｍ、Ｓｏｃ、、　肋、　ｌ
：ｌＩＯ〜１：１１！ｉ（＋９７３）に従い、両相法で
合成した。

クロロメチルポリスチレン樹脂［ジビニルベンゼン２％
、　１００〜２００メツシュ、　ＣＱ　：（１，！ｌ：
１ｍｍｏｌ／）ＨＪ（和光紬薬工業■製）Ｉｇを用い、
常ｔＪ、に従い、坏当量のＢｏｃ−β−アラニンを導入
させた後、１゛１・へテＢｏｃ基を脱離シタ。次に各々
３イｒｔ当ｉｌｌ　ノＩｆ　ｏ　ｌ：　−アミノ酸を次
の順序でＤＧＣ法により導入させた、。

即ち、口ｏｃ−Ｇｌｕ（０Ｂｚｌ）、　Ｂｏｃ−Ｐｈｅ
−ＤＣＨＡ、　Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣＩ！　−Ｚ）　・Ｔ
ＢＡ　、　　１ｌｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ２Ｏ、Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ−Ｈ２Ｏ、Ｂｏｃ−１、ｙｓ　（（１−７，）　−Ｔ
ＢＡ、　　　１ｌｏｃ−Ｌｙｓ　（（Ｊ！−Ｚ）−ＴＢ
Ａ、　　　Ｂｏｃ−Ｇｌｕ。

”ｙｒ−［＋ｌｙであり、このうちＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｄ
ＣＨＡ、　Ｂｏｃ−Ｃ；１０に於ては、カップリング反
応を２回行った。

１１Ｆ処理による、樹脂からのペプチドの切断とＢｚｌ
、１、芥保護基の切断後、トヨパールＨＷ４０（東洋曹
達玉栗■商品名）を用いたゲル濾過により、Ｐｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１，ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−β−Ａｌａを（Ｉｔた。これを
高速液体クロマトグラフィーにより精製した（収率５５
％）。

１１１？処理後の化合物のマススペクトルにより１、）
１算値！３２９と一致した分子量にピークが確認された
。

アミノ酸分析値：　Ｇｌｕ　２．１．　Ｌｅｕ　２．０
．　Ｐｈｅ　１．０゜１、ｙｓ　　：１．０．β−八へ
ａ　　１．２　　。

実施例６．　　Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−１，Ｌ！ｕ−Ｉ、ｙ８−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
β−Ａｌａを基質に用いたエラスターゼの測定 （試液の調整） ■基質液 Ｐｙｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｌｙｓ−１ｙｓ−Ｌ
ｃｕ　−１ｅｕ−１，ｙ　ｓ−Ｉ’　ｈｅ　−Ｇ　ｌ　
ｏ　−β−＾ｌａ　　１．２ｍｇを０．０１Ｍ　トリス
ヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ１１
，０）５０ｍ／に溶解し調製した。

■酵素溶液 エラスターゼ（豚膵臓由来、シグマ７１製）　：ｌ　、
　ｔｉｍｅを０．０１Ｍ　トリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１００μに溶解
し調製した。

（測定方法） 基質液２００μに酵素溶液　５４を加え、：１７℃の恒
温槽中に放置した。

２０分、４０分、６０分、１２０分、　１１１０分後に
この反応液を夫々ＩＯＪずつとり、高速液体クロマトグ
ラフィーで分析した。

（分析条件〉 カラム：充填剤［オクタデシルシリル基結合逆相Ｊ〜す
、０口Ｓ−＋２０Ｔ（東洋曹達工業■）　、　４　ｘ　
１５０＋ｎｍ］溶鑵条件： Ａ液：　０．０５％トリフルオロ酢酸を含む６％アセト
ニトリル水溶液 Ｂ液：　０．０５％トリフルオロ酢酸を含む２４％アセ
トニトリル水溶液 ０分から１５分にかけて、Ａ液とＢ液の直線的グラジェ
ントを、１ｍｊ／ｎ＋ｉｎの流速で行った。

検出：蛍光；励起波長　３１０１ｍ。

蛍光波長　３７０ロｌ。

（測定結果） 第１図に高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す
。第１図［１］はブランクのチャートを示し、第１図目
Ｉ］は反応開始２時間後のチャートを；ｊ’＜４−。

第１図より明らかなように、反応により２つのピークが
生じていることがわかる。これらのピークはアミノ酸分
析の結果より、のはＰ　ｙ　ｒ　−Ｇ　Ｉ　、ｙ　−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅ＋＋、■はＰｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−１ｙｓ−１，ｙｓ−１ｃｕ−１，ｅｕと同定
された。従って、エラスターゼは、この基質に対して２
ケ所で加水分解を行っ゛（いることがわかる。

また、■を定量し、４０ピコモル以ト−に於て、直線的
タイムコースがｉ４Ｉられた。このターｒムコースを第
２図に示す。

実施例７．　　Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−５ｃｒ−Ｓｃ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾５１１−β−Ａｌａの合成 実施例５と四柱にして公知文献　、１．Ａｍ、ｆ、’ｌ
＋ｃｎ＋。

Ｓｏｃ、、　９ｊ、　１３１０〜ｌ３１５（１！ＩＬＩ
）に従イ、　ｌ＋’ｉｌ相ｌノ、で合成した。

即ち、クロロメチルポリスチレン樹脂［ジビニルベンゼ
ン　２％、１００〜２Ｃ）０メツシユ、　Ｃｉ！：０．
９３ｍｍｏｌ／ｇ］　　（和光紬薬］−業■製）Ｉｇを
用い、常法に従い、％当量１［のロＯＣ−β−アラニン
を導入させた後、ＴＥＡてＩＩ　ｏ　ｃ基を脱離した。

次に丼々３４．、＋を当量の１ｌｏｃ−アミノ酸を次の
順序でＤ　１；　（：　法により導入させた。即ち、ｌ
１ｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｌｌｚｌ）　、　ｆｌｏｅ−旧「１
゜＋１ｏｃ−Ｇｌｎ、　　ロｎｃ−５ｃｒ（ＯＢｚｌ）
、　　ロｏｃ−５ｅｒ（ＯＢｚｌ）、　　Ｂｏｃ−Ｇｉ
ｎ　、　Ｐｙｒ−［ｉｌｙであり、このうち、Ｂｏｃ−
Ａｓｐに於ては、カップリング反応を２回行った。ＨＦ
処理による、樹脂からのペプチドの切断とＤｚｌ、　Ｚ
、各保護基の切断後、トヨパール１１Ｗ４０（東洋Ｗ達
工業■商品名）を用いたゲルが過により、Ｐｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾ｓｐ
−β−ＡＪａを得た。これを高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した（収率５１１％）。

アミノ酸分析値：　Ｇｉｎ　３．０．　Ｓｅｒ　１．８
．　Ａｓｐ　１．１゜β−＾ｌａ　１．２゜ 実施例８．　　Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−β−八へａを基質に用い
たプロティンキナーゼ活性の測定 （試液の調製） ■１１衝液 ２７２ｍｇイミタゾール、　＋４２ｆｆ１ｇ塩化マグネ
シウム、　１．１ｇ塩化カリウム、　７６ｒｎｇグリコ
ールエーテルジアミン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、
　１２ｍｇアテノシンリン酸・２Ｎａを水８０ａ／で溶
解し、塩酸を加えてｐＨ７，５としたのち全ｍを　１０
０ａ／として緩衝液とした。

■基質液 Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｉｎ−八５ｌｌ−β　−八１．１２．７ｍｇに水３ｒｒ
Ｌｌを加えて溶解して」、（室液とした。

■試　料 公知文献口、１１．Ｒ，Ｃ，，８９＠（１１、７１ｆｉ
貞、　Ｉ！＋７９４ＬＢｏｌｖｉｎらに従いヒト赤血球
から精製したプロティンキナーゼを上記１１１衝液に適
当ｒＩＩ溶解したものを試料原液とし、それを史に緩衝
液を用いて１／４゜２／４．３／４に希釈し、夫々試料
とした。

（測定方法） 緩衝液２０４に基質液１０４を加えた後、試料を各々Ｉ
ＯＪ加え３０℃で１時間反応後、夫々４μ！ずつとり高
速液体クロマトグラフィーで分析した。

〈分析条件） カラム：充填剤［オクタデシルシリルＪ＋Ｌｉ　１１＋
’ｉ　今逆相型、　ＯＤ　Ｓ　、　Ｓ−５（１，１１村
化学＠Ｉ　）　、　４　Ｘ　ｌ　！’ｉ０ｍ＋ｎｌ、。

溶離条件： 溶離液：１０％アセトニトリルを含む０．０５％トリフ
ルオロ酢酸水溶液。

流速：　１．Ｏｍｌ／ｍ１ｎ０ 検出：蛍光：励起波長　３２０ｎｍ。

蛍光波長　４１０ｎｎＩ。

（測定結果） 第３図に高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す
。第３図［１１はブランクのチャートを示し、第３図［
１１］は、２／４希釈試料を用いた反応液により得られ
た反応開始１時間後のチャートを示す。第３図から明ら
かなように反応により１つのピークのか生じ、リンの定
量により、生じたピークのは基質がリン酸化されたもの
であることかわかった。またこの生じたピークのを測定
し直線的検廿関係が得られた。この検量関係を第４図に
示す。

（発明の効果） 以上述へた如く、本発明は、これまでにない全く新規な
ペプチド誘導体と、これを基質として用いる生理活性物
質の新規な測定法を提供するものであり、本発明によれ
ば、ペプチド、タンパク′Ｃ′［等に作用する生理活性
物質の活性を特異的に１１つ極めて高い感度で（数ピコ
モルの反応〕１．成物か検出できる）、シかも生理法＋
′１物質の反応部イ１γを選択して測定できる点に顕著
な効果を奏するものてあり、斯業に貢献するところ人な
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例６に於ける高速液体クロマトクラフィ
ーの測定結果を示し、第１図［１１はブランクのチャー
トを、第１図［１１］は反応開始２時間後のチャートを
承ず。 第２図は、実施例６に於けるタイムコースな表わし、横
軸の反応時間（時間）に於りるピークの物質の生成量（
ピコモル）を縦軸に対しブロワ！・した点を結んだもの
である。 第３図は、実施例８に於ける！’ｉ＋速液体クロマりグ
ラフィーの測定結果を示し、第３図［１］はブランクの
チャートを、第３図［１１］は２／４希釈試料を用いた
反応液により得られた反応開始１時間後のチャー１・を
示ず。 第４図は、実施例８に於−て得られた検量線を表わし、
横軸の各試料の希釈率について得られたピークの物質の
生成量（ピコモル）を縦軸に沿ってプロットした点を結
んだものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 第２図 反応時間（時間）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸が２〜１５個からなる下記構造式［ I
   ］又は［II］を有するペプチド誘導体。 Ｒ＾１−Ａ＾１−Ａ−Ａ＾２−Ｒ＾２［ I ］又はＲ＾
   １−Ａ＾１−Ａ＾２−Ｒ＾２［II］［但し、Ａはアミノ
   酸残基又はアミノ酸が２〜１３個からなるペプチド残基
   を表わし、Ａ＾１はＮ末端のアミノ酸残基を、Ａ＾２は
   Ｃ末端のアミノ酸残基を夫々表わす。また、Ｒ＾１は−
   ＮＨ−基と結合して蛍光性及び／又はＵＶ吸収を有する
   基となるもの、又は水素原子若しくはアミノ保護基を表
   わし、Ｒ＾２は水酸基、カルボキシ保護基又は−ＮＨ−
   Ｙ−Ｒ＾３（但し、Ｒ＾３は蛍光性及び／又はＵＶ吸収
   を有する基を表わし、Ｙは炭素数１〜１０の直鎖状また
   は分枝状のアルキレン基、又はフェニレン基を表わす。 ）を表わす。但し、Ｒ＾１が水素原子若しくはアミノ保
   護基の場合はＲ＾２は−ＮＨ−Ｙ−Ｒ＾３であることを
   要し、Ｒ＾２が水酸基又はカルボキシ保護基の場合はＲ
   ＾１は−ＮＨ−基と結合して蛍光性及び／又はＵＶ吸収
   を有する基となるものであることを要す。］
2. （２）アミノ酸が２〜１５個からなる下記構造式［ I
   ］又は［II］を有するペプチド誘導体をペプチド又はタ
   ンパク質に作用する生理活性物質の基質として用い、生
   理活性物質の作用を受けて生じる生成物を分別測定する
   ことによりこれを行うことを特徴とする、生理活性物質
   の活性測定法。 Ｒ＾１−Ａ＾１−Ａ−Ａ＾２−Ｒ＾２［ I ］又はＲ＾
   １−Ａ＾１−Ａ＾２−Ｒ＾２［II］［但し、Ａはアミノ
   酸残基又はアミノ酸が２〜１３個からなるペプチド残基
   を表わし、Ａ＾１はＮ末端のアミノ酸残基を、Ａ＾２は
   Ｃ末端のアミノ酸残基を夫々表わす。また、Ｒ＾１は−
   ＮＨ−基と結合して蛍光性及び／又はＵＶ吸収を有する
   基となるもの、又は水素原子若しくはアミノ保護基を表
   わし、Ｒ＾２は水酸基、カルボキシ保護基又は−ＮＨ−
   Ｙ−Ｒ＾３（但し、Ｒ＾３は蛍光性及び／又はＵＶ吸収
   を有する基を表わし、Ｙは炭素数１〜１０の直鎖状また
   は分枝状のアルキレン基、又はフェニレン基を表わす。 ）を表わす。但し、Ｒ＾１が水素原子若しくはアミノ保
   護基の場合はＲ＾２は−ＮＨ−Ｙ−Ｒ＾３であることを
   要し、Ｒ＾２が水酸基又はカルボキシ保護基の場合はＲ
   ＾１は−ＮＨ−基と結合して蛍光性及び／又はＵＶ吸収
   を有する基となるものであることを要す。］
3. （３）生理活性物質の作用を受けて生ずる生成物の分別
   測定に、高速液体クロマトグラフィーを用いる、特許請
   求の範囲第２項に記載の測定法。
4. （４）生理活性物質が、ペプチド結合の加水分解を行う
   ペプチダーゼ類或はプロテアーゼ類、タンパク質、ペプ
   チド或はアミノ酸に転移反応を行うトランスフェラーゼ
   類、タンパク質或はペプチドに含まれているリン酸基の
   脱離を行うフォスファターゼ類、タンパク質或はペプチ
   ド中のアスパラギン残基等に糖鎖を付加する酵素類、タ
   ンパク質は或はペプチドに付加している糖鎖に作用し、
   糖鎖の減少、増加を促進する酵素類、又はタンパク質或
   はペプチドにスルホン基、硫酸基、メチル基、アシル基
   等の修飾又は脱修飾を行う酵素類である、特許請求の範
   囲第２項又は第３項に記載の測定法。