JPH0566370B2

JPH0566370B2 -

Info

Publication number: JPH0566370B2
Application number: JP59270982A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kawai; Yoshiaki Oshida
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1984-12-24
Filing date: 1984-12-24
Publication date: 1993-09-21
Also published as: EP0186482A3; US4824945A; JPS61151128A; EP0186482A2; CA1276897C

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なコレステロール低下活性RNA
画分及び有効成分としてこのRNA画分を含有す
るコレステロール低下乃至抗動脈硬化剤に関す
る。今日、所謂典型的成人病の１種である動脈硬
化性疾患乃至高脂血症等の治療・予防薬としては
クロフイブレート関連製剤を始めとして幾つかが
提案されているが、薬理効果及び副作用等の点で
これらはかならずしも充分満足し得るものとは云
い難くより効果的な薬剤への希求が一段と高まつ
ている。本発明者らは新規コレステロール低下剤につき
鋭意研究の結果、ストレプトコツカス属に属する
各種微生物からの特定抽出RNA画分が血中コレ
ステロール値を極めて効果的に低下せしめ得るも
のであり且つその起源が所謂腸内細菌であるスト
レプトコツカス属の抽出画分は経口では実質的無
毒性であることを知見し、本発明に到達したもの
である。以下、本発明に於いて使用され得る微生物、
RNA画分の製法、理化学的性質及び薬理作用等
につき詳細に分説する。微生物１種類ストレプトコツカス属に属する各種微生物が
使用され得、就中、ストレプトコツカス・フエ
シウム、ストレプトコツカス・フエカーリス、
ストレプトコツカス・ボービス、ストレプトコ
ツカス・エビウム、ストレプトコツカス・デユ
ランス、ストレプトコツカス・サリヴアリウ
ス、ストレプトコツカス・ミテイス、ストレプ
トコツカス・イクイヌス等を好適なものとして
例示し得る。更に、本発明に於いて特に有用な具体的菌株
例を微工研受託番号（ブタペスト条約寄託）に
より表示すれば下記の通りである。

【表】２菌学的性質菌学的性質の点では、本発明で使用の微生物
は同一分類菌につき公知各文献の示すものと同
一の諸性質を有する。すなわち、本発明微生物の菌学的性質及び培
養条件等に関しては下記諸文献が参照される。 (1) バージイ・マニユアル・オブ・デタミネイ
テイブ・バクテリオロジイ、第８版
（Bergey′ Manual of Determinative
Bacteriology、8th ed.、）490−509（1974） (2) インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・
システミツク・バクテリオロジイ、（Int.J.
Syst.Bact.）16 114（1966） (3) マイクロバイオロジイ・アンド・イミユノ
ロジイ、（Microbiol.Immunol.）25(3)、257
−269（1981） (4) ジヤーナル・オブ・クリニカル・パソロジ
イ、（J.Clin.Pathol.）33 53−57（1980） (5) ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバ
イオロジイ、（J.General Microbiol.、）128
713−720（1982） (6) アプライド・マイクロバイオロジイ、
（Applied Microbiol.、）23(6)1131−1139
（1972）ここで、前出各種菌株につきその主な菌学的
性状を要約して表示すれば次の通りである。

【表】

【表】３培養方法これらの微生物の培養は上記の通り常法によ
るものであるが、例えばロゴサ（Rogosa）液
体培地（註：エフチミオ・シー・アンド・ハウ
セン・ピー・エー、（1962）、アン・アンチゲニ
ツク・アナリシス・オブ・ラクトバチルス・ア
シドフイルス、ジヤーナル・オブ・インフエク
シヤス・デイズイーズ、（Efthymiou、C.、and
Hausen、P.A.（1962）An antigenic analysis
of Lactobacillus acidophilus.J.Infect.Dis.）
110：258〜267）にて静置培養し、得られた培
養液を遠心分離してその菌体が採集される。（註）ロゴサ液体培地の組成蒸留水１中にトリプチケース 10ｇ酵母エキス５ｇトリプトース３ｇ K₂HPO₄ ３ｇ KH₂PO₄ ３ｇクエン酸三アンモニウム２ｇツイーン80 １ｇグルコース 20ｇシステイン塩酸塩 0.2ｇ＊塩類溶液５ml （PH７、121℃、15分間加熱滅菌）＊塩類溶液蒸留水100mlに MgSO₄・7H₂O 11.5ｇ FeSO₄・7H₂O 0.68ｇ MnSO₄・2H₂O 2.4ｇ RNA画分の製法本発明RNA画分の典型的製法の１例につきそ
の概要を各工程ごとに示せば次の通りである。１菌体採集工程前記各微生物等の菌株を前述のロゴサ液体培
地に接種し、37℃にて５〜15時間静置培養して
所定生菌数濃度の培養液をつくり、得られた培
養液を12000rpmの連続遠心分離に付し菌体を
集め、生理食塩水で２〜３回洗浄して採集菌体
とする。２熱水抽出処理工程前記、採集菌体を精製水に懸濁して得られる
菌液を100℃40分間、115℃、10分間、115℃30
分間（２回）加熱（オートクレーブ）し、菌体
の破壊と熱水抽出とを併せ行なう。各オートク
レーブ処理物は9000rpm10分間遠心分離し、上
清を濃縮し抽出物とする。３核酸画分分画工程 (a) 前記抽出物を精製水に溶解し、約10倍量の
エタノールを加え、遠心分離（12000rpm：
５分間又は9500rpm：10分間）し、エタノー
ル可溶物とエタノール不溶物とに分離する。 (b) 前記エタノール不溶物をDewex^R50W（H⁺
型）（米国ダウ・ケミカル社製）処理し（溶
媒：精製水）未吸着物は塩化セチルピリジニ
ウム溶液（CPC溶液）を加え37℃３時間イ
ンキユベートする。その後、遠心分離
（12000rpm：５分間又は9500rpm：10分間）
し、CPC沈澱物を2M NaClに溶解し、約５
〜６倍量のエタノールを加え遠心分離
（12000rpm：５分間）しエタノール沈澱物を
再びDowex^R50W（米国ダウ・ケミカル社製）
処理し、CPCを除去した分画を得る。４精製処理工程前記画分をDNA分解酵素処理後、フエノー
ル処理により酵素を除去し、透析後、
Sephadex^R Ｇ−75カラム（フアルマシア社
製）で精製し目的活性RNA画分が得られる。尚、増殖菌体等からのRNA画分の製造は、
より一般的にはその理化学的性質（後記）を参
照して沈澱−再溶解抽出、溶剤抽出、透析、カ
ラムクロマトグラフイ、電気泳動、ゲルろ過、
或いはこれらの手段の組合わせなど当該分野で
汎用の多くの分別精製方法により達成され得、
従つて本発明は特定の採取精製方法に何等限定
されるものではない。すなわち、当該薬理活性はRNA画分に認め
られるのであるから、本発明はストレプトコツ
カス属微生物よりRNA画分を採取することよ
り成るコレステロール低下剤の製法にも係わる
ものである。 RNA画分の理化学的性質本発明RNA画分の理化学的性質乃至生理学的
性質を要約して示せば次の通りである。１存在状態、溶解特性及び温度特性 RNA画分を凍結乾燥して得られる粉末標品
は、微褐色〜黄褐色の粉末である。本品は、水及び1N水酸化ナトリウム溶液に
可溶であり、アルコール、エーテル、ベンゼン
等の有機溶媒には不溶である。また、熱を加えていくと、200℃前後におい
て褐変し、220℃に達すると濃褐色に変化する。２分子量 0.2Mピリジン−酢酸緩衝液（PH5.0）を溶媒
としたSephadex^RＧ−75カラム（2.5×47cmフ
アルマシア社製）を用いたゲルろ過法により、
単一ピークを与える。その結果を第１図に示
す。図中、縦軸はフエノール硫酸法での480n
ｍにおける吸光度、横軸はフラクシヨンナンバ
ーである。ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動（ポ
リアクリルアミド濃度10〜20％において0.4M
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
0.2M酢酸ナトリウム、0.02Mエチレンジアミ
ン四酢酸二ナトリウム、0.2％ドデシル硫酸ナ
トリウム（PH7.5）を10倍希釈した泳動用緩衝
液で約400μｇの試料を30ｍＡで６時間通電し、
メチレンブルーにて染色）において、10％ポリ
アクリルアミドゲルではRNA標品（E.coli）
と比較すると標品物より長い泳動距離を示し、
12％ポリアクリルアミドゲルではブロムフエノ
ールブルーと同等か、やや長い泳動距離、20％
ポリアクリルアミドゲルではブロムフエノール
ブルーとキシレンシアノールの間にバンドが認
められた。以上の結果より分子量は11000±
9000と決定された。３赤外線吸収スペクトル日本分光工業社製JASCO Ａ−302型赤外分
光光度計によるKBrタブレツト赤外線吸収ス
ペクトルは第２図に示す通りであり、図中、横
状は波数（cm^-1）、縦軸は透過率（％）を示す。４核酸の塩基組成核酸の酸分解物を高速液体クロマトグラフイ
ー（Patisil^R−10scxカラム（ガスクロ工業社
製）、溶媒：0.05Mリン酸−カリウム緩衝液
（PH3.05）、流出速度：１ml／min、検出：
UV260nｍ）にて分析した。その結果、6N
HCl、100℃３時間分解で、Ｕ（ウラシル）：Ｇ
（グアニン）：Ｃ（シトシン）：Ａ（アデニン）比
が１：１：２：１であることが判明した。５生理学的性質哺乳動物に対し経口投与によりその血中コレ
ステロール値低下作用を有する。 RNA画分の薬理作用１薬理効果後記実施例に示す通り本発明RNA画分より
成る抗動脈硬化剤は、血中コレステロール値を
極めて効果的に低下せしめるものであり、した
がつて、この指標と密接な関連を有する動脈硬
化症を始めとし、高脂血症、脳動脈硬化性疾
患、高リポ蛋白血症、黄色腫症、胆石症、肝、
胆道疾患、腎疾患（ネフローゼ症候群）、高血
圧症、糖尿病、心臓病、内分泌疾患、甲状腺機
能低下症、肥満症等の疾患に対しその治療乃至
予防薬として有用なものと云い得る。本発明剤は又は、経口投与、腹腔内投与、静
注等の手段で適用され得、その用量は通常約
1μｇ〜約0.5ｇ／Kg体重（１回）、より好ましく
は経口投与で約0.1mg〜約50mg／Kg体重（１回）
程度であり、その剤型としては生理食塩水等へ
の溶解液剤、注射液剤、凍結乾燥等による粉末
剤、或いは座剤、腸溶剤、舌下錠、顆粒剤、錠
剤、カプセル剤等々、通常の剤型を適当なキヤ
リヤ、増量剤、希釈剤等と共に適宜選択使用し
得る。２急性毒性後記実施例に示す通り、本発明RNA画分の
LD₅₀値は1370mg／Kg体重・マウス（腹腔内投
与）以上であり、経口投与の場合は実質的に無
毒性である。実施例（RNA画分の製造及び精製）ストレプトコツカス・エビウム
（Streptococcus avium）AD2003（FERM BP−
298）菌株をロゴサ液体培地64、37℃にて12時
間、静置培養して得られる湿菌体207ｇに２の
精製水を加えよく撹拌し、オートクレーブにて
100℃（開放）40分間、115℃10分間、115℃、30
分間（２回）熱水抽出を行なつた。各オートクレ
ーブ処理物は遠心分離（9000rpm10分間）により
上清と沈澱とに分離し、上清を濃縮し抽出物
（収率：36.7％）を得た。得られた抽出物を30mlの精製水に溶解し、撹
拌しながら300mlのエタノールを加え遠心分離
（9500rpm10分間）により、上清（エタノール可
溶物）と沈澱（エタノール不溶物）に分離し、沈
澱物は同様の操作をもう一度くり返した。エタノール不溶物を700mlの精製水に溶解し、
イオン交換樹脂Dowex^R50W（H⁺型）（米国ダ
ウ・ケミカル社製）1000mlに加え、よく撹拌後、
傾斜法にて溶媒を除去し、続いて100mlの精製水
にて６回未吸着物の溶出を行なつた。未吸着物の溶出液は濃縮後、1200mlの精製水に
溶解し、10％塩化セチルピリジウム（CPC）溶
液（半井化学薬品〓製）180mlを加え37℃３時間
インキユベートした。その後遠心分離
（9500rpm10分間）にて得られたCPC沈澱物を2M
NaCl90mlに溶解し、540mlのエタノールを撹拌し
ながら加え、遠心分離（12000rpm5分間）にて沈
澱物を得た。この操作を４回くり返し、得られた
沈澱物を1000mlのDowex^R50W（H⁺型）（米国ダ
ウ・ケミカル社製）を用いて前述と同様の操作を
行ない、CPCを除去した画分（収率8.7％）を
得た。得られた画分300mgにベントナイト処理を行
なつたDNA分解酵素（シグマ社製
Deoxyribonuclease ）の溶液（0.1Mトリス
酢酸緩衝液（PH8.0）＋20ｍＭ硫酸マグネシウム＋
25ｍＭ塩化カルシウム１mlにDNA分解酵素１mg
含有）を30ml加え37℃にて24時間インキユベート
した。酵素処理後30mlの水飽和フエノールを加
え、よく撹拌し、遠心分離（12000rpm5分間）し
た後、水相を注意深く分離した。残つたフエノー
ル相には、さらに30mlのフエノール飽和水を加え
同様の操作を行なつた。この操作は３回くり返し
得られた水相は透析後、濃縮し酵素分解物とし
た。酵素分解物はSephadex^R Ｇ−75カラム（フ
アルマシア社製）（溶媒：0.2Mピリジン−酢酸緩
衝液PH5.0）にてゲルろ過を行ない精製し、目的
のRNA画分を得た。（収率2.5％）ここで以上の各工程ごとの収率等を要約して示
せば下記第３表の通りである。

【表】尚、第３表中、RNAはオルシノール法（標品
Yeast RNA）、DNAはジフエニルアミン法（標
品Calf thymus DNA）、糖は抽出物はフエノ
ール硫酸法（標品Glucose）、その他はアンスロ
ン法（標品Glucose）、タンパクはロウリー法
（Lowry法）（標品Bovine serum albumin）で測
定した。抽出物の核酸量はオルシノール値をも
つて表わした。又、収率は凍結乾燥菌体を100％
としたときの各凍結乾燥物の重量％である。他方、前記第１表に掲示の他の菌株を使用した
場合も収率に多少はあるが、本例と全く同じ様に
RNA画分が精製画分として得られることが確認
された。尚、ここで得たRNA画分の理化学的性質等は
前記の通りである。実施例（RNA画分の薬理効果）１コレステロール低下活性（） RNA画分凍結乾燥精製標品各25mg／Kg体重
相当量を精製水１mlに溶解して試料を調製し、
これを通常ラツト（雄18週令、平均体重240
ｇ；各群５匹）、通常及び無菌マウス（雄10週
令、平均体重20.1ｇ；各群５匹）に経口的に連
日投与後、12乃び８週間飼育し、次いでこれら
の下大動脈より動脈血を採集、遠心分離して血
清標品を得、コレスキツト（商品名；関東化学
社製、ツルコウスキー法（Zurkowski法）によ
り血清標品コレステロール値を測定した。結果
を第４表に要約して示す。尚、表中、対照群は試料無投与群であり、数
値は無投与群を対照としたときの低下率（％）
である。又、標準ダイエツトすなわち標準飼料の組成
（重量％）は下記第５表の通りでありこれを自
由摂取とした。（以下、同様）第４表動物種（投与期間）低下率（％）通常ラツト（12週間） 20.3±0.6 通常マウス（８週間） 30.7±1.1 無菌マウス（８週間） 20.0±0.8 第５表ミルクカゼイン 20 大豆油 10 小麦でんぷん 61 ミネラル^(a) ４ビタミン混合物^(b) ２ろ紙粉末（セルロース）３ (a) フイリツプスハート氏塩^*（岩井化学薬品製）リン酸二カリウム 322（ｇ／1000ｇ）炭酸カルシウム 300 食塩 167 硫酸マグネシウム 102 リン酸二カルシウム 75 クエン酸鉄 27.5 硫酸銅 0.3 塩化亜鉛 0.25 硫酸マンガン 5.1 ヨウ化カリウム 0.8 塩化コバルト 0.05 ＊：フイリツプス・ピー・エイチアンド
ハート・イー・ビー、ザ・エフエクト・オ
ブ・オーガニツク・ダイエタリー・コステ
イテユエンツ．アポン・コロニツク・フル
オリン・トキシコシス・イン・ザ・ラツ
ト、ジヤーナル・オブ・バイオロジー・ケ
ミストリイ（Phillips、P.H.and Hart、E.
B.、The effect of、organic dietary
costituents upon chronic fluorine
toxicosis in the rat、J.Biol.Chem）．、
109、657、（1935） (b) パンビタン末^R（武田薬品工業〓製）
20（ｇ／100ｇ）塩化コリン 10 パントテン酸カルシウム 0.15 ピリドキシン塩酸塩 0.006 イノシトール 1.0 小麦でんぷん 68.8 ２コレステロール低下活性（）前記試料1.0mlを通常ラツト（雄18週令、平
均体重238ｇ；各群５匹）、通常及び無菌マウス
（雄10週令、平均体重22ｇ；各群５匹）に12週
間、経口的に連日投与し、前記と同様にして血
清中コレステロール測定を定した。結果を第６
表に示す。尚、表中、“コレステロール負荷”又は“果
糖負荷”は、前記試料に更に１％コレステロー
ルを添加したもの或いは小麦でんぷん果糖にて
全量置換した飼料を使用した場合を示すもので
あり、数値は無投与群を対照としたときの低下
率（％）である。第６表動物種低下率無菌マウス^(*) 33.1±1.0 通常マウス^(*) 37.2±0.5 通常ラツト^(*) 48.1±1.0 通常ラツト^(**) 39.7±1.1 （＊）コレステロール負荷ダイエツト（＊＊）果糖負荷ダイエツト３コレステロール低下活性（） RNA画分精製標品11.3mg／Kg体重相当量を
精製水0.5mlに溶解した試料を、コレステロー
ル負荷ダイエツトにより作製した高脂血ラツト
（雄８週令、平均体重222ｇ、各群５匹）に連日
経口的に２週間投与し、前記と同様にしてその
血清中コレステロール値を測定した。結果を第７表に示す。表中、対照群は試料無
投与群であり、数値は無投与群を対照としたと
きの低下率（％）である。第７表低下率（％）投与群 41.2 対照群０４用量−反応関係 RNA画分精製標品各0.1mg〜20mgを精製水１
mlに溶解して、試料を調製し、これを通常ラツ
ト（雄６週令、平均体重210ｇ；各群５匹）に
４週間、経口的に連日投与し、前記と同様にし
て血清中コレステロール値を測定した。（対
照：無投与群）結果を第８表に示す。第８表 mg／ラツト低下率（％）対照０ 0.1 7.4±0.6 １ 12.5±1.0 10 43.3±0.9 20 48.2±0.8 ５急性毒性 ICR系マウス（雄６週令、平均体重31.6±0.6
ｇ、各群10匹）を使用し、RNA画分精製標品
１mg、10mg及び100mgの３段階の投与量でその
生理食塩水0.5ml溶解液を腹腔内投与し、14日
間マウスの生死を観察した。ベレンスーケルベル法に従つて算出した
LD₅₀値は1370mg／Kg体重以上であり、経口投
与の場合は実質的に無毒性であつた。尚、対照
は生理食塩水である。６製剤例 RNA画分精製標品25mgを精製でんぷん末
275mgと均一に混合、打錠して経口投与用錠
剤とした。この錠剤は体重50Kgの成人におけ
る死菌体用量約３×10¹⁰個／Kg体重に相当す
る。 RNA画分は炭酸カルシウム、ラクトース
等の賦形剤、でんぷん、アルギン酸塩等の顆
粒形成剤、ステアリン酸、タルク等の滑沢剤
等々と混合、打錠して経口投与用剤形態を取
り得るものであるが、その１日当りの投与量
は通常、0.1mg〜50mg／Kg・体重程度である。本品900mgをシロツプで呈味した精製水30
mlに分散、溶解してシロツプ液剤を調製し
た。

【図面の簡単な説明】

第１乃至２図は本発明実験例説明図である。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a) ゲルろ過法による分子量：11000±9000 (b) 核酸の塩基組成比：ウラシル：グアニン：シトシン：アデニン＝
１：１：２：１ (c) 赤外線吸収スペクトル：添付第２図に示す通
りである (d) 哺乳動物に対しその血中コレステロール低下
作用を有するコレステロール低下活性RNA画
分を有効成分として含有することを特徴とする
コレステロール低下活性RNA画分。２ストレプトコツカス属に属する微生物より得
られることを更に特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の前記RNA画分。３ (a) ゲルろ過法による分子量：11000±9000 (b) 核酸の塩基組成比：ウラシル：グアニン：シトシン：アデニン＝
１：１：２：１ (c) 赤外線吸収スペクトル：添付第２図に示す通
りである (d) 哺乳動物に対しその血中コレステロール低下
作用を有するコレステロール低下活性RNA画
分を有効成分として含有することを特徴とする
コレステロール低下活性剤。