JPH05993B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なヒダントイナーゼに関する。
更に詳しくは、５−置換ヒダントインを開裂加水
分解してＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸を生成
する活性を有する新規ヒダントイナーゼに関す
る。 〔従来の技術〕 従来、５−置換ヒダントインに作用するヒダン
トイナーゼとしては、各種動物の肝臓や腎臓、豆
科植物や微生物に存在し、ジヒドロウラシルまた
はジヒドロチミンを開裂加水分解して、それぞれ
Ｎ−カルバモイル−β−アラニンまたはＮ−カル
バモイル−β−アミノ−イソ酪酸に変換するとと
もに、５−置換ヒダントイン類にも作用し、立体
特異的に開裂加水分解して、光学活性Ｎ−カルバ
モイル−Ｄ−アミノ酸類に変換する作用をも有す
るジヒドロピリミジナーゼ（EC3.5.2.2）が知ら
れている（特開昭53−136583）。 一方、５−置換ヒダントインからＮ−カルバモ
イル−Ｌ−アミノ酸を生成する酵素としてはＬ−
５−カルボキシメチルヒダントインからＮ−カル
バモイル−Ｌ−アスパラギン酸を生成するカルボ
キシメチルヒダントイナーゼ（EC3.5.2.4）が知
られている（酵素ハンドブツク朝倉書店1982年発
行、p597）。 ５−置換ヒダントインからＬ−アミノ酸を生成
させる方法としては、特公昭42−13850号公報に
は各種微生物の菌体又は培養液、破砕液を用い
て、Ｌ−アミノ酸を生成させる方法、特公昭45−
8633号公報にはＬ−リジンを製造する方法、さら
に特公昭54−2274号公報及び特公昭54−8749号公
報にはフラボバクテリムアミノゲネスを作用させ
て、５−置換ヒダントインからＬ−フエニルアラ
ニン及びＬ−トリプトフアンを製造する方法が開
示されている。本発明者らも、５置換ヒダントイ
ンに、アリスロバクター属DK−200菌株を作用
させて、Ｌ−アミノ酸を製造する方法をすでに提
案した（特願昭59−70906号明細書）。これらの方
法は医薬、化学工業用原料、食品添加物として有
用なＬ−アミノ酸の製造に極めて有効であり、実
用効果が期待される。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、これらのＬ−アミノ酸の製造法
において、５−置換ヒダントインを開裂加水分解
する酵素については、明らかにされていない。こ
のような酵素が入手できれば有用なＬ−アミノ酸
の製造が経済的に行なえ、工業的利用価値は大き
い、そこで、本発明者らは、５−置換ヒダントイ
ンから、相当するＬ−アミノ酸を生成する反応に
関与する微生物酵素について研究を行なつた結
果、アリスロバクター属の菌株が、５−置換ヒダ
ントインを開裂加水分解して、Ｎ−カルバモイル
−Ｌ−アミノ酸に変換する酵素を効率良く多量に
生産することを見い出し、本発明を完成するに到
つた。 〔問題点を解決するための手段〕 即ち本発明は、下記の理化学的性質を有し、且
つ５−置換ヒダントインを開裂加水分解してＮ−
カルバモイル−Ｌ−アミノ酸を生成する活性を有
する新規ヒダントイナーゼである。 基質特異性；５−カルボキシメチルヒダントイ
ンに作用しない。 至適PH；５−置換ヒダントインからの加水分解
反応PH8.0〜9.0 Ｎ−カルバモイル−アミノ酸からの逆反応
PH5.0〜7.0 安定PH範囲；PH5.0〜10.0 作用適温の範囲；30〜40℃ 温度安定性の範囲；35℃までは安定 阻害剤、金属イオンの影響；ｐ−クロロマーキ
ユリベンゾエイト（PCMB）、エチレンジ
アミノテトラ酢酸によつて阻害される。コ
バルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオ
ンによつて活性が促進される、コバルトイ
オンは熱安定性を向上させる。 以下本発明をさらに詳細に説明する。 先ず、本酵素の理化学的性質を以下に記載す
る。 (1) 作用及び基質特異性 本酵素は、５−置換ヒダントインのＬ体及びＤ
体の開裂加水分解をし、それぞれ相当するＮ−カ
ルバモイル−Ｌ−アミノ酸及びＮ−カルバモイル
−Ｄ−アミノ酸に変換する。５−置換ヒダントイ
ンのうち、置換基に芳香環を有する５−ベンジル
ヒダントインや５−インドリルメチルヒダントイ
ン等にとくによく作用する。 しかしながら、５−カルボキシメチルヒダント
イン（DL−アスパラギン酸ヒダントイン）やDL
−グルタミン酸ヒダントイン及びヒダントインに
は作用しない。従つて、公知のカルボキシメチル
ヒダントイナーゼとは異なる新規のヒダントイナ
ーゼである。 またジヒドロウラシルやジヒドロチミンには、
ほとんど作用せず、ジヒドロピリミジナーゼとは
異なる。 (2) 至適PH 至適PHは緩衝液としてアンモニア緩
衝液（0.05Mアンモニア水−塩化アンモニウム
緩衝液、PH8.0〜10.0）を用い、５−ベンジル
ヒダントインを基質とし、温度35℃で30分間反
応させ、生成したＮ−カルバモイル−DL−フ
エニルアラニンを測定した場合、PH8.0−9.0で
ある。また緩衝液として、酢酸緩衝液（0.05M
酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、PH4.0−5.5）と
リン酸緩衝液（0.05Mリン酸−カリウム−リン
酸二ナトリウム緩衝液PH5.5〜8.0）を用い、Ｎ
−カルバモイル−Ｌ−フエニルアラニン又はＮ
−カルバモイル−Ｄ−フエニルアラニンを基質
として、５−ベンジルヒダントイン生成を測定
した場合の至適PH5.0〜7.0である。本酵素は、
Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸及びＮ−カル
バモイル−Ｄ−アミノ酸から５−置換ヒダント
インを生成する反応即ち逆反応作用を有する。 (3) 力価の測定法 ５−ベンジルヒダントイン
2.5mgを含有し、PH8.0に調整した0.02Mトリス
−塩酸バツフアー0.8mlに、10mM塩化コバル
ト0.1ml、酵素液0.1mlを加え、35℃で30分反応
を行わせる。30分後に0.1Nの塩酸１mlを加え
て反応を停止する。本反応を薄層プレートにス
ポツトし、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：
１：１の展開溶媒で展開する。乾燥後、10％ｐ
−ジメチルアミノベンズアルデヒドのアセトン
溶液（1.5N塩酸含有）で発色させ、デンシト
メトリーにより、Ｎ−カルバモイルフエニルア
ラニンの生成量を定量する。毎分1.0μモルのＮ
−カルバモイルフエニルアラニンを生成させる
ヒダントイナーゼの量を１単位とし、試料のヒ
ダントイナーゼ力価を算出する。 (4) 安定PHの範囲 緩衝液として、酢酸緩衝液
（0.05M酢酸−酢酸ナトリウムPH4.0〜5.5）、リ
ン酸緩衝液（0.05Mリン酸−カリウム−リン酸
＝ナトリウム緩衝液PH5.5〜8.0）、アンモニア
緩衝液（0.05Mアンモニア水−塩化アンモニウ
ム緩衝液PH8.0〜10.0）、ホウ酸緩衝液（0.05M
ホウ酸−ホウ酸ナトリウムPH9.5〜11.5）を用
いて、酵素液を各PHで、35℃、30分インキユベ
ート後、残存力価を測定することによつて求め
た安定PH範囲は、5.0〜10.0である。 (5) 作用適温の範囲 PH8.0で10〜30分間作用さ
せた場合、30〜40℃の範囲が最適である。 (6) PH、温度等による失活の条件 PH4.0以下及
びPH11以上で35℃、30分インキユベートする
と、完全に失活する。PH8.0において60℃で20
分間熱処理することにより完全に失活する。 (7) 阻害、活性化及び安定化 ○イ 阻害 阻害剤無添加時の酵素活性値を100とし、それ
ぞれ、塩化ニツケル、塩化銅、ヨード酢酸、
PCMB、エチレンジアミンテトラ酢酸、窒化ナ
トリウム、ヒドロキシルアミン塩酸を添加し、PH
8.0、温度30℃、30分間反応した場合の残存活性
を表に示す。なお、本活性測定においてコバルト
イオンは添加していない。

【表】 表より、明らかな如く、PCMBの他に、エチ
レンジアミンテトラ酢酸により、本酵素は顕著に
阻害され、金属酵素と考えられる。 ○ロ 活性化 本酵素は、0.1〜10mMのコバルトイオン、マ
ンガンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオ
ン、鉄イオンのような金属イオンの存在下で反応
させると、無添加の場合に比べ、活性が促進され
る。 ○ハ 安定化 本酵素は、0.1〜10mMのコバルトイオンが共
存すると熱安定性が向上し、40℃で１時間、PH８
でインキユベートすると、無添加の酵素の残存活
性は30〜40％となるが、1mMコバルトイオン共
存下では活性低下は見られない。 (8) 精製方法 培養物を遠心分離して湿潤菌体を集菌し、この
菌体を0.02Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0、塩化
マンガン1mM含有）に懸濁し、超音波処理によ
り、菌体を破砕し、遠心分離にて固形分を除き、
粗酵素液を得る。 次いで、その粗酵素液に、３％プロタミン硫酸
水溶液（PH7.0）を加え、生じた沈澱を遠心分離
で除き、次いでこの上清液に硫酸アンモニウムを
0.30飽和になるまで加え、生じた沈澱を遠心分離
で除く。得られた上清液に更に硫酸アンモニウム
を0.60飽和になるまで加え、生じた沈澱を分離し
て、0.02Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0、塩化マ
ンガン1mM含有）に溶解し、この溶液を同緩衝
液で24時間透析する。 以上のようにして得た硫安分画を、上記緩衝液
で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カラム
（MONO Ｑフアマシア製）による液体クロマト
グラフイーにかけ、酵素をカラムに吸着させる。
次いで、塩化ナトリウム濃度を０〜1Mに直線的
に増加させた上記緩衝液を流して、流出液をフラ
クシヨンコレクターで分画し、活性区分を集め
る。 次いでその活性区分を、0.05Mトリス塩酸緩衝
液（0.2M塩化ナトリウム、1mM塩化マンガン含
有）で平衡化したゲルろ過用カラム（G3000SW
×２東洋曹達工業社製）にかけ、同組成の緩衝液
で溶出し、活性区分を集める。この活性区分を再
度、ゲルろ過用カラムにかけて、クロマトグラフ
イーを行い、活性区分を精製標品とする。 (9) 分子量 本酵素の分子量は高速液体クロマトグラフイー
（G3000SW×２東洋曹達工業社製）によるゲルろ
過法で測定した結果、約20万であり、エチレンジ
アミンテトラ酢酸処置して後測定すると、約10万
である。これらの分子量の異なる酵素は、分子量
の異なること以外は、その理化学的性質において
同様である。 (10) 等電点 MONOP（フアマシア製）を用い
た、クロマトフオーカシング法により測定した
結果４〜4.5であつた。 本酵素は、以上の性質から新規ヒダントイナー
ゼと認められ、本酵素の性質を活用すれば、極め
て有用なＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸製造が
可能となる。 次に本酵素を製造するための具体的手段を以下
に述べる。本酵素を製造する方法としては如何な
る方法でも良く、例えば以下の方法が挙げられ
る。 先ず、本酵素を製造するにあたり使用される菌
としては、アリスロバクター属に属し、上記ヒダ
ントイナーゼ生産能を有する菌であれば如何なる
菌でもよく、またこれらの菌の変種もしくは変異
株でも良い。そして、アリマロバクター属に属
し、新規ヒダントイナーゼ生産能を有する菌の具
体例として、例えばアリスロバクター属
（Arthro−bacter SP）DK−200が挙げられる。 上記アリスロバクターDK−200は本発明者ら
が、土壌中より新たに検索して得た菌株で、その
菌学的性質は、以下に示す通りである。 アリスロバクターDK−200の菌学的性質 (a) 形態的顕微鏡的観察 (1)細胞の形及び大きさ：0.3〜0.5μ×0.8〜
5.0μmの桿菌である。 (2)細胞の多形性の有無：多形性が認められる (3)運動の有無：運動性なし（鞭毛は認められな
い。） (4)胞子の有無：なし (5)グラム染色：陰性〜弱陽性だがグラム陽性粒
子を有する (6)抗酸性：陰性 (b) 各培地での生育状態 (1)肉汁寒天平板培養：コロニーの形状は円形
で、隆起は凸状であり、周辺は全縁状であ
り、コロニーの色は淡白色である。 (2)肉汁寒天斜面培養：適度の生育状態で糸状の
生育を示す。光沢がある (3)肉汁液体培養：混濁の程度は均一で、液面で
の生育は特になし。沈澱がある (4)肉汁ゼラチン穿刺培養：液化する。 (5)リトマスミルク培養：中性で液体しない。 (c) 生理的性質 (1)硝酸塩の還元：還元しない。 (2)脱窒反応：陽性 (3)MRテスト：陰性 (4)VPテスト：陰性 (5)インドールの生成：生成しない。 (6)硫化水素の生成：生成しない。 (7)デンプン加水分解：加水分解しない。 (8)クエン酸の利用：両方とも利用しない。 （Kosevの培地及びChristensenの培地使用 (9)無機窒素源の利用：利用する。（硝酸塩及び
アンモニウム塩） (10)色素の生成：生成しない (11)ウレアーゼ：陰性 (12)オキシダーゼ：陰性 (13)カタラーゼ：陽性 (14)酸素に対する態度：好気性 (15)生育の範囲：温度：17.8〜33.2℃ PH：５〜10 (16)Ｏ−Ｆテスト：酸化 (17)糖類からの酸及びガスの生成の有無：

〔実施例〕

以下実施例を挙げて、本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実施例 １ ヒダントイナーゼの製造例 ポリペプトン1.0ｇ、酵母エキス1.0ｇ、グルコ
ース1.0ｇ、塩化ナトリウム1.0ｇ、Ｎ−カルバモ
イルトリプトフアン0.2ｇを水道水に溶解し、こ
のPHを7.5に調整し、全量を200mlとしたもの500
mlの坂口フラスコに100mlずつ２本分注した。こ
の培地を温度120℃で15分間殺菌後、アリスロバ
クターDK−200（微工研菌与第7472号）を接種
し、温度30℃で20時間振盪培養（100s.p.mの往
復）した。 培養終了後培養液200mlを遠心分離して得られ
た菌体を生理食塩水で１回洗浄後、0.02Mトリス
−塩酸緩衝液（PH8.0、塩化マンガン1mM含有）
に懸濁し、液量を20mlにした。この菌体懸濁液を
10mlずつに分け、20K Hzの超音波破砕機で、そ
れぞれ３分間１回処理して、遠心分離し、固形分
を除去し、粗酵素液を得た。その粗酵素液を集め
て、上記トリス−塩酸緩衝液で30mlとした後、３
％プロタミン硫酸水溶液１mlを攪拌しながら加
え、30分間攪拌を続けた。遠心分離によつて沈殿
を除去し、上清液を得た。その上清液に、硫酸ア
ンモニウムを0.30飽和になるまで加え、生じた沈
殿を遠心分離で除く。得られた上清液に更に硫酸
アンモニウムを0.60飽和になるまで加え、遠心分
離により沈殿を得る。この沈殿を、0.02Mトリス
−塩酸緩衝液（PH8.0、塩化マンガン1mM含有）
に溶解し、この溶液を同緩衝液で24時間透析し、
10mlの酵素液を得た。 以上のようにして硫安分画液５mlを、0.02Mト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0、塩化マンガン1mM含
有）で平衡化した蛋白精製用陰イオン交換樹脂カ
ラム（Mono Ｑフアマシア社製）に吸着させる。
次いで、高速液体クロマトグラフイーにより、そ
の緩衝液を用いて充分に洗浄し、食塩濃度を０〜
1.0Mまで連続的に上昇させる方法により溶出を
行ないフラクシヨンコレクターで分画し、活性区
分を得た。本高速液体クロマトグラフイーを２回
行なうことにより、10mlの硫安分画液からの陰イ
オン交換樹脂精製酵素液が得られた。この酵素液
に0.80飽和硫酸アンモニウムを加えて塩析し、濃
縮酵素液を２ml得た。 次いで、0.2M塩化ナトリウム、1mM塩化マン
ガンを含有した0.05Mトリス塩酸緩衝液で平衡化
したゲルろ過用カラム（G3000SW×２、東洋曹
達製）にかけ、高速液体クロマトグラフイーによ
り、同緩衝液で溶出し、活性区分を集めた。この
活性区分を再度、同じゲルろ過用カラムにかけ、
高速液体クロマトグラフイーにより集めた活性区
分を精製酵素液とした。本酵素液の蛋白濃度を、
プロテイン・アツセイ（バイオラツド社製）によ
り測定し、活性を測定したところ、比活性34.2単
位／mgであつた。 本発明のヒダントイナーゼの利用例 本酵素液0.5単位を用い、５−ベンジルヒダン
トイン２mg、0.02Mトリス−塩酸バツフアー（PH
８），1mM塩化コバルトを含む１mlの溶液中、35
℃、15時間反応させた。煮沸により反応を停止し
て後生成したＮ−カルバモイル−フエニルアラニ
ンを薄層クロマトグラフイーにより、ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：１で展開し、ｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒド試薬で発色させ、デ
ンシトメトリーにより定量したところ、2.1mg／
mlのＮ−カルバモイルフエニルアラニンが生成し
ていた。この反応液にＮ−カルバモイル−Ｌ−ア
ミノ酸に特異的に反応してＬ−アミノ酸を生成す
るシユードモナスDK−910微工研菌寄第7473号
（FERM Ｐ−7473）の酵素を0.05Mトリス・塩酸
緩衝液（PH8.0）中、35℃、15時間反応させた。
生成したＬ−フエニルアラニンをラクトバチル
ス、アラビノザスATCC8014を用いるバイオアツ
セイ法により測定したところ、0.83mgのＬ−フエ
ニルアラニンが生成していた（モル収率49.8％対
Ｎ−カルバモイルフエニルアラニン）。 実施例 ２ 本発明ヒダントイナーゼの利用例 実施例１と同様にして得た酵素液を用い、５−
ベンジルヒダントインのかわりに、５−インドリ
ルメチルヒダントインを用いて、実施例１と同様
にして反応させた。生成したＮ−カルバモイル−
トリプトフアンを実施例１と同様にして薄層クロ
マトグラフイーにより定量したところ2.1mg／ml
のＮ−カルバモイルトリプトフアンが生成してい
た。この反応液に実施例１と同様にして、シユー
ドモナスDK−910微工研菌寄第7473号（FERM
Ｐ−7473）の酵素を反応させた。生成したＬ−ト
リプトフアンをバイオアツセイ法により、測定し
たところ、0.86mgのＬ−トリプトフアンが生成し
ていた（モル収率49.6％対Ｎ−カルバモイルトリ
プトフアン）。 〔発明の効果〕 有機合成化学的に製造される５−置換ヒダント
インから、本酵素によつて常温常圧の温和な条件
下で、効率よく、Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アミノ
酸を製造することが可能である。さらに、本酵素
はＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸加水分解酵素
との併用もしくは逐次反応により医薬・食品添加
物等として有用なＬ−アミノ酸の製造に有効であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有し且つ５−置換ヒダ
   ントインを開裂加水分解してＮ−カルバモイル−
   Ｌ−アミノ酸を生成する活性を有する新規ヒダン
   トイナーゼ。 基質特異性；５−カルボキシメチルヒダントイ
   ンに作用しない。 至適PH；５−置換ヒダントインからの加水分解
   反応PH8.0〜9.0 Ｎ−カルバモイル−アミノ酸からの逆反応
   PH5.0〜7.0 安定PH範囲；PH5.0〜10.0 作用適温の範囲；30〜40℃ 温度安定性の範囲；35℃までは安定 阻害剤、金属イオンの影響；ｐ−クロロマーキ
   ユリベンゾエイト、エチレンジアミンテト
   ラ酢酸によつて阻害される、コバルトイオ
   ン、マンガンイオン、亜鉛イオンによつて
   活性が促進される、コバルトイオンは熱安
   定性を向上させる。