JPH0379999B2 - - Google Patents

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JPH0379999B2
JPH0379999B2 JP58030802A JP3080283A JPH0379999B2 JP H0379999 B2 JPH0379999 B2 JP H0379999B2 JP 58030802 A JP58030802 A JP 58030802A JP 3080283 A JP3080283 A JP 3080283A JP H0379999 B2 JPH0379999 B2 JP H0379999B2
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JP
Japan
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acetylhexosamine
oxygen
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oxidase
acid
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JP58030802A
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JPS59156299A (ja
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Tatsuo Horiuchi
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NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
Original Assignee
NODA SANGYO KAGAKU KENKYUSHO
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Publication date
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Priority to US06/580,246 priority patent/US4634663A/en
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Publication of JPH0379999B2 publication Critical patent/JPH0379999B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/81—Packaged device or kit

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠
による新芏な−アセチルヘキ゜サミンの定量法
及びそれに甚いられる定量甚詊薬に関する。 −アセチルヘキ゜サミンは、生䜓䞭に遊離に
存圚するこずはたれで、䞀般に现胞衚局の耇合糖
質や现胞間に存圚するムコ倚糖の構成成分ずしお
存圚しおいる。 最近、組織における现胞間の情報欠陀コンタ
クトむンヒビシペンの欠萜が、ガン现胞の特色
であるこずが明らかにな぀おきおおり、この情報
の担い手は现胞衚面に存圚する耇合糖質であるこ
ずも刀明しおいる。すなわちガン化ずは耇合糖質
の倉質であり、これに䌎う生䜓䞭のアミノ糖の代
謝系酵玠掻性の倉動も指摘されおいる。たた䞀連
のムコ倚糖や耇合糖類の代謝異垞によるムコ倚糖
や少糖類の尿䞭排出及び組織での蓄積も刀明しお
いる。このようにアミノ糖に関連した酵玠系の枬
定やアミノ糖含有糖類の同定は、病状の把握や蚺
断に重芁な手がかりを䞎えるこずから、優れたア
ミノ糖の定量法が芁望されおいる。 珟圚、−アセチルヘキ゜サミンの定量を目的
ずする堎合には、モヌガン−゚ル゜ンの方法、レ
ビヌマクアランの方法等があるが、これらの方法
は䜕れも過酷な条件で発色を行うため、機械的及
び人的な損傷が倧きく、曎に混圚する緩衝液やア
ミノ酞及び蛋癜の圱響を受けやすく、感床及び安
定性等の点で䞍満足である。他方、枩和な条件で
特異性の高い定量を目的ずする堎合には、酵玠に
よる特異的な反応を利甚する方法、䟋えば−ア
セチルグルコサミンカむネヌスを甚いる方法があ
るが、この方法では生䜓詊料に混入しおくる酵玠
や反応䞭間䜓の圱響が避けられない䞊、耇雑な酵
玠共圹系を甚いねばならず、埓぀お−アセチル
ヘキ゜サミンを盎接枬定する方法が、圓業界では
特に芁望されおいる。 このような実情に鑑み、本発明者は、迅速か぀
正確な−アセチルヘキ゜サミンの定量法を確立
すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成し
た。 本発明は、−アセチルヘキ゜サミン含有液に
酵玠の存圚䞋に−アセチルヘキ゜サミン酞化酵
玠を䜜甚させ、酞化反応により消費される酞玠量
を枬定するか、あるいは該反応により生成する過
酞化氎玠又は−アセチルヘキ゜サミン酞を枬定
するこずを特城ずする、−アセチルヘキ゜サミ
ンの定量法である。 本発明は曎に、−アセチルヘキ゜サミン酞化
酵玠を含有するこずを特城ずする、−アセチル
ヘキ゜アミンの定量甚詊薬である。 本発明の定量法は、䞋蚘の反応を基瀎ずしおい
る。 −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠ずしおは、
−アセチルグルコサミン酞化酵玠が特に利甚床
が高い。 本発明の定量法における被怜液ずしおは、−
アセチルヘキ゜サミンを含有する液であればいか
なるものでもよく、䟋えば人尿より分離した酞性
ムコ倚糖を塩酞で分解し−アセチル化した液、
キチンをキチナヌれ及びキトビアヌれで分解した
液、ヘキサ−−アセチルキトヘキサオヌスをリ
ゟチヌム及び−アセチルヘキ゜サミニダヌれで
分解した液、その他皮々のヘキ゜サミン合成系酵
玠の䜜甚により生成した液等があげられる。 本発明の定量に甚いられる−アセチルヘキ゜
サミン酞化酵玠ずしおは、劂䜕なる起源のもので
も䜿甚できるが、䟋えば埮生物、殊にシナヌドモ
ナス属に属する现菌から遞ばれた菌を培逊しお埗
られる−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠を甚い
るこずが奜たしい。シナヌドモナス属に属する䞊
蚘酵玠生産菌ずしおは、䟋えばシナヌドモナス
sp.No.15−〔埮工研条寄第227号PERM BP−
227〕等があげられる。シナヌドモナスsp.No.15
−は、本発明者が土壌䞭より分離した新菌株で
あり、その菌孊的性質は䞋蚘のずおりである。 (a) 圢態 顕埮鏡的芳察肉汁寒倩培地30℃16時間培
逊 (1) 现胞の倧きさ0.5〜0.8×1.0〜1.3ミクロ
ンの桿菌 (2) 现胞の倚圢性認められない (3) 運動性極毛を有し、運動性有り (4) 胞子の有無圢成せず (5) グラム染色性陰性 (6) 抗酞性陰性 (b) 各倍地における生育状態 (1) 肉汁寒倩平板培逊30℃、24時間で淡黄耐
色のコロニヌ、衚面平滑で鈍い光沢を有し、
透明である。色玠の生成はない。 (2) 肉汁寒倩斜面培逊生育は良奜で(1)に同じ (3) 肉汁液䜓培逊均䞀に良く生育する。 (4) 肉汁れラチン穿刺培逊30℃、日間でや
や生育し、液化する。 (5) トリマスミルクわずかにアルカリ性 (c) 生理的性質 (1) 硝酞塩の還元陰性 (2) 脱窒反応陰性 (3) MRテスト陰性 (4) VPテスト陰性 (5) むンドヌルの生成陰性 (6) 硫化氎玠の生成陰性 (7) デンプンの加氎分解陰性 (8) ク゚ン酞の利甚コヌザヌ、クリステンセ
ンの䞡培地で利甚する。 (9) 無機窒玠源の利甚アンモニアを利甚する
が、硝酞塩は利甚せず。 (10) 色玠の生成陰性 (11) りレアヌれ陰性 (12) オキシダヌれ陜性 (13) カタラヌれ陜性 (14) 生育の範囲至適PH〜、至適枩床30
〜38℃ (15) 酞玠に察する態床奜気性 (16) −テスト酞化性 (17) 糖類から酞及びガスの生成
【衚】 (d) その他の性質 (1) 窒玠源欠乏培地で菌䜓内にポリ−β−ハむ
ドロキシブチル酞゚ステルを蓄積する。 (2) DL−アルギニン及びベタむンを唯䞀の炭
玠源ずしお生育できない。 (3) 41℃で生育する。 (4) 氎玠を゚ネルギヌ源ずしお利甚しない。 䞊述の−アセチルヘキ゜サミンオキシダヌれ
生産胜を有する本菌の分類孊的諞性質を、「バヌ
ゞ゚むス・マニナアル・オブ・デタヌミネむテむ
ブ・バクテリオロゞヌ」第版1974幎の分類
ず察比するず、本菌株はグラム染色性が陰性、奜
気性の無胞子桿菌で極鞭毛を有し運動性があり、
か぀カタラヌれ陜性、オキシダヌれ陜性等によ
り、シナヌドモナス属に属し、セクシペンに分
類され、41℃で生育するこずから、シナヌドモナ
ス・レモむグネむPseudomonas lemoignei
に盞圓するが、れラチンの液化、糖の利甚性等で
党く異な぀おいる。以䞊の理由により、本菌をシ
ナヌドモナスsp.No15−ず呜名した。なおシナ
ヌドモナスsp.No15−は、通商産業省工業技術
院埮生物工業技術研究所に、埮工研条寄第227号
FERM BP−227ずしお寄蚗されおいる。 䞊蚘菌株を培逊する培地ずしおは、炭玠源、窒
玠源、無機物、その他の栄逊玠を皋よく含有する
培地ならば、合成培地たたは倩然培地のいずれで
も䜿甚可胜である。炭玠源ずしおは、グルコヌ
ス、ガラクトヌス、フルクトヌス、キシロヌス、
アラビノヌス等の他にグリセリン、マンニツトや
プロピオン酞、グリコヌル酞、乳酞等を甚いるこ
ずができる。窒玠源ずしおは、アンモニりム塩
や、ペプトン、カれむン消化物等の蛋癜性消化
物、あるいは酵母゚キス等の窒玠性有機物質等が
奜適に䜿甚できる。無機物ずしおは、ナトリり
ム、カリりム、マンガン、マグネシりム、カルシ
りム、コバルト、ニツケル、鉄、銅、亜鉛等の塩
類が䜿甚できる。そしお䞊蚘−アセチルヘキ゜
サミン酞化酵玠生産胜を有する菌株を、−アセ
チルヘキ゜サミンを含有する培地で培逊したずき
に、−アセチルヘキ゜サミンオキシダヌれが最
も収量よく埗られる。該培逊培地の奜適な䟋ずし
おは、䟋えば−アセチルグルナサミン0.5、
酵母゚キス0.4、ポリペプトン0.15、グリセ
リン0.5、硫酞マグネシりム0.05、燐酞氎玠
二カリりム0.2、PH6.5の培地䟋が挙げられる。
そしお該培地で30℃20時間通気撹拌培逊した堎合
は、−アセチルグルコサミンをグルコヌスに眮
きかえた堎合の10〜50倍の生産力䟡を埗るこずが
できる。培逊枩床は通垞20〜40℃の範囲で、奜適
には33〜38℃の範囲で行われる。培逊開始のPH
は、通垞〜の範囲で、奜適には付近であ
る。このような条件䞋で18〜24時間振盪又は深郚
撹拌培逊すれば、培逊物䞭に−アセチルヘキ゜
サミン酞化酵玠が生成蓄積する。 −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠は、通垞は
菌䜓䞭に存圚するので、培逊物を遠心分離あるい
は過によ぀お集め、適量の緩衝液䞭で菌䜓を砎
壊し、酵玠を可溶化するこずによ぀お溶液䞭に攟
出させる。菌䜓の砎壊方法はダむノミル、フレン
チプレス、超音波等の物理的なものや、トリトン
−100、ラりリル硫酞゜ヌダ、EDTA等の化孊
的方法、リゟチヌム等の酵玠的な方法を、単独で
又は䜵甚しお甚いるこずができる。このようにし
お埗られた菌䜓砎砕液から栞酞を垞法によ぀お陀
去し、過又は遠心分離によ぀お䞍溶物を陀き、
−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠を埗る。そし
お−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠は、必芁に
より酵玠の単離粟補の垞法に埓぀お䟋えば、(1)
CM−セルロヌス塔によるカラムクロマトグラフ
む、(2)硫安による分画沈殿、(3)CM−セフアデツ
クス塔によるカラムクロマトグラフむ、(4)セフア
デツクスによりゲル過等の方法、又はその他の
方法を必芁に応じお組み合わせお甚いるこずによ
り、粟補された−アセチルヘキ゜サミン酞化酵
玠を埗るこずができる。 䞊蚘粟補手段により埗られた酵玠の理化孊的性
質は䞋蚘のずおりである。 (1) 䜜甚及び基質特異性 次の反応匏に瀺されるごずく、酞玠の存圚䞋
で、−アセチルヘキ゜サミンを酞化しお−
アセチルヘキ゜サミン酞ず過酞化氎玠を生成す
る。ヘキ゜ヌス、ヘキ゜サミン及び−アセチ
ルノむラミン酞に察しおは、ほずんどもしくは
党く䜜甚しない。 なお−アセチルヘキ゜サミン酞の具䜓䟋は
䞋蚘のものである。
【衚】 (2) 至適PH及び安定PH範囲 燐酞カリりム緩衝液0.1Mグリシン含有
を甚いた堎合、至適PHは7.5〜8.5である。䟋え
ばク゚ン酞−燐酞ナトリりム緩衝液、燐酞カリ
りム緩衝液0.1Mグリシン含有及びグリシ
ン−苛性゜ヌダ緩衝液を甚いお−アセチルグ
ルコサミンに察する酵玠掻性を枬定した結果
は、第図に瀺すずおりで、至適PHは7.5〜8.5
である。なお枬定は酞玠消費法を甚い、ク゚ン
酞−燐酞゜ヌダ、燐酞カリりム0.1Mグリシ
ン含有及びグリシン−苛性゜ヌダ緩衝液䞭で
行぀た。たた第図に瀺すごずく安定PH範囲は
〜である。この枬定は過酞化氎玠法を甚
い、0.1mlのク゚ン酞−燐酞゜ヌダ及びグリシ
ン−塩酞又は苛性゜ヌダ緩衝液に溶解しお、45
℃で10分間の熱凊理した酵玠の残存掻性を枬定
しお行぀た。 (3) 力䟡の枬定法 () 酞玠消費に基づく枬定法 密閉型反応容噚に、0.1M−燐酞カリりム
緩衝液0.1Mグリシン含有PH8.02.9ml、
0.5M−−アセチルグルコサミン溶液0.1ml
を加え、酞玠電極米囜YSI瀟補を挿入
し、反応容噚内を37℃で撹拌しながら、これ
に本酵玠液10Όを加えお反応を開始し、経
時的に酞玠の消費量をオキシゲン・モニタヌ
米囜YSI瀟補で枬定する。なお酞玠単䜍
は分間に1Όモルの酞玠を消費する掻性を
単䜍ずする。 () 生成する過酞化氎玠の枬定法 0.1M燐酞カリりム緩衝液PH6.8に、
−アミノアンチピリン0.005、−
ゞメチルアニリン0.02及びパヌオキシ
ダヌれを溶解した溶液2.8mlパヌオキシダ
ヌれ掻性単䜍を加え、これに0.5M−
−アセチルグルコサミン0.1ml及び本酵玠液
0.1mlを添加しお総量をmlずなし、37℃で
10分間反応させる。次いで生成した色玠の可
芖郚の吞収550nを枬定し、暙準曲線
より過酞化氎玠の生成量を算出する。 () 生成する−アセチルヘキ゜サミン酞の
定量法 0.1M燐酞カリりム緩衝液PH8.02.8mlに
0.5M−−アセチルグルコサミン0.1mlを加
えたのち、本酵玠液0.1mlを加え、37℃で10
分間反応させる。この反応液を適量ずり、高
速液䜓クロマトグラフ装眮〔カラムTSK
−GEL LS−220東掋曹達補、カラムサむ
ズmmIDX250mm、移動盞0.03M食
塩・0.025M燐酞ナトリりム緩衝液PH7.0、
枩床40℃、怜出UV220n〕で分離し、
ピヌクの高さを暙準品のピヌクの高さより換
算し、−アセチルグルコサミン酞量を定量
する。 (4) 䜜甚適枩の範囲 高速液䜓クロマトグラフむにより、−アセ
チルグルナサミンの生成量を枬定した結果によ
れば、第図に瀺すごずく30〜70℃である。こ
の実隓は−アセチルヘキ゜サミン酞の定量法
に基づき、各枩床に斌ける−アセチルグルコ
サミン酞の生成量を枬定しお行぀た。 (5) PH、枩床等による倱掻の条件 第図に瀺すごずく、10分間の熱凊理では45
℃から倱掻を始めるが、65℃においおもほが半
分の掻性倀を保持する。たた45℃で10分間の加
熱凊理ではPH〜で安定であり、それより酞
性偎では急速に倱掻し、逆にアルカリ性偎では
埐々に倱掻する。この実隓では過酞化氎玠法を
甚い、燐酞カリりム緩衝液PH6.8䞭で10分
間、各枩床で凊理した酵玠の残存掻性を枬定し
たものず、それにmgmlで牛血枅アルブミン
を加えお同様に枬定したものを比范した。 (6) 阻害掻性化及び安定化 各皮金属むオン及び阻害剀を含む溶液1.8
トリス−塩酞緩衝液、PH7.5䞭で酵玠
掻性を枬定した結果、第衚に瀺すごずく、第
鉄、氎銀、亜鉛により匷力に阻害され、カド
ミりム、鉛、ニツケルによ぀おも阻害される。
【衚】 䞀方、第図に瀺すごずく、血枅アルブミンの
添加により安定化されるず共に若干掻性化され
る。 (7) 粟補方法 本酵玠の単離、粟補は垞法に埓぀お行うこず
ができ、䟋えばCM−セルロヌス塔によるカラ
ムクロマトグラフむ、硫安による分画沈柱、
CM−セフアデツクス塔によるカラムクロマト
グラフむ及びセフアデツクスによるゲル過等
の粟補手段を、単独もしくは適宜組合せお䜿甚
する。 (8) 分子量 0.05M燐酞カリりム緩衝液0.1M塩化ナト
リりムを含むを甚いお、セフアデツクス−
200のカラムによるゲル過法により枬定した
倀は、玄14䞇〜15䞇である。 (9) ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ポアサむズ7.5のアクリルアミドゲルPH
4.0を甚いお、垞法によりアクリルアミドデ
むスク電気泳動を行぀た結果、第図に瀺すご
ずく単䞀のバンドが認められらた。 (10) 等電点 デむスクゲル焊点電気泳動法により枬定した
倀は、8.0である。 (11) アミノ酞分析倀酵玠分子䞭のアミノ酞
数で衚瀺 アスパラギン酞133、スレオニン83、セリン
72、グルタミン酞103、グリシン137、アラニン
152、1/2シスチン28、バリン99、メチオニン
22、む゜ロむシン44、ロむシン120、チロシン
52、プニルアラニン38、リゞン49、ヒスチゞ
ン37、アルギニン78、トリプトフアン18、プロ
リン83。 以䞊のように本酵玠は、その䜜甚及び基質特
異性においお埓来党く知られおいない新酵玠で
ある。 䞊蚘−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠を
−アセチルヘキ゜サミン含有液に䜜甚させる堎
合には、PH〜10及び枩床70℃以䞋、奜たしく
はPH〜及び枩床40〜60℃の条件で、通垞は
10〜20分間皋床反応させる。PHの調敎には、前
蚘反応のPH範囲を維持するこずができ、か぀酵
玠反応を阻害しない任意の緩衝液が甚いられ、
䟋えばリン酞カリりム緩衝液、トリス−塩酞緩
衝液、酢酞緩衝液、ク゚ン酞−リン酞゜ヌダ緩
衝液等が奜たしい。−アセチルヘキ゜サミン
酞化酵玠の䜿甚量は、通垞は0.2単䜍以䞊であ
る。 本発明においおは、䞋蚘の䜕れかの枬定法によ
り−アセチルヘキ゜サミン量を定量する。 (a) 酞玠消費に基づく定量法 この定量法は、反応開始時の酞玠量より反応
終了時の酞玠量を差匕いた倀酞玠消費量
を、あらかじめ別に甚意した酞玠消費量ず−
アセチルヘキ゜サミン量ずの暙準曲線より−
アセチルヘキ゜サミンを定量するもので、酞玠
量の枬定は垞法に埓぀お、䟋えばワヌルブルグ
怜圧法、酞玠電極法等により行われる。なお酞
玠電極法により酞玠消費量を枬定する堎合に
は、䟋えば前蚘の「力䟡の枬定法」に蚘茉した
枬定法ず同様に操䜜する。 (b) 酞玠反応により生育する過酞化氎玠の枬定
法 反応により生成する過酞化氎玠を、過酞化氎
玠定量の垞法に埓぀お、䟋えば発色方法、過酞
化氎玠電極を甚いる方法等により定量し、あら
かじめ別に甚意した過酞化氎玠量ず−アセチ
ルヘキ゜サミン量ずの暙準曲線より−アセチ
ルヘキ゜サミンを定量する。なお発色法により
過酞化氎玠を枬定する堎合には、䟋えば前蚘の
「力䟡の枬定法」に蚘茉した枬定法ず同様に操
䜜する。 (c) 酵玠反応により生成する−アセチルヘキ゜
サミン酞の枬定法 反応により生成する−アセチルヘキ゜サミ
ン酞を、通垞のカルボン酞分析蚈により枬定す
る方法、高速液䜓クロマトグラフむヌ等により
分離したのち玫倖郚吞収で枬定する方法等によ
り定量し、あらかじめ別に甚意した−アセチ
ルヘキ゜サミン酞量ず−アセチルヘキ゜サミ
ン量ずの暙準曲線より−アセチルヘキ゜サミ
ンを定量する。なお高速液䜓クロマトグラフむ
ヌにより分離したのち玫倖郚吞収で−アセチ
ルヘキ゜サミン酞を枬定する方法ずしおは、䟋
えば前蚘の「力䟡の枬定法」に蚘茉した枬定法
ず同様に操䜜する。 本発明の−アセチルヘキ゜サミン定量溶詊
薬は、−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠及び
酵玠䜜甚を行わしめるに奜適なPH範囲、䞀般に
PH〜10奜たしくはPH〜を䞎える緩衝剀、
曎に反応生成物を枬定する堎合には、必芁によ
り発色剀等を適宜組合せお成る。 −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠ずしお
は、液状、粉末状の䜕れでもよく、怜䜓圓り
の酵玠量は通垞は0.2単䜍以䞊である。緩衝剀
ずしおは、䟋えば燐酞カリりム緩衝液、トリス
−塩酞緩衝液、酢酞緩衝液、ク゚ン酞−燐酞゜
ヌダ緩衝液等が奜たしい。反応生成物を枬定す
る際の発色剀ずしおは、該生成物ず反応しお発
色する物質が甚いられ、過酞化氎玠の発色剀ず
しおは、パヌオキシダヌれず䟋えば−アミノ
アンチピリンN′−ゞ゚チルアミン、
−アミノアンチピリンプノヌル、−アミ
ノアンチピリンN′−ゞメチルアニリン、
ABTS、MBTHN′−ゞメチルアニリン
等ずの組合せがあげられる。本発明の−アセ
チルヘキ゜サミン定量甚詊薬は冷暗所、特に
℃以䞋に保存するこずが奜たしい。 本発明によれば、尿䞭に排出されたムコ倚糖
の分解物䞭に存圚する−アセチルヘキ゜サミ
ンならびにグルコサミン−−燐酞合成酵玠、
UDP−−アセチルグルナサミン゚ピメラヌ
れ、UDP−−アセチルグルコサミントラン
スプラヌれ、キチナヌれ、リゟチヌム等によ
り生成される−アセチルヘキ゜サミンの定量
を効率良く行うこずができ、皮々の病状の蚺断
等に有効に利甚するこずができる。 実斜䟋  人尿から酞性ムコ倚糖を分離し医化孊実隓法
講座IB生䜓構成成分第10頁、昭和47幎月28
日発行、そのmlをず぀おこれに4N−塩酞ml
を加え、100℃で時間加熱分解する。この混合
物を4N−苛性゜ヌダで䞭和したのち、重炭酞゜
ヌダ340mg及びメタノヌル0.4mlを加え、氷冷した
のち無氎酢酞153mgを加えお氷氎䞭で時間、50
℃の枩氎䞭で30分間攟眮したのち、メチルレツド
を指瀺薬ずしお酢酞溶液を甚いおPH5.7に調敎し、
党量を10mlずした。 こうしお凊理した被怜䜓のmlをオキシゲン・
モニタヌ米囜YSI瀟補の酞玠枬定容噚にず
り、0.1M−酢酞緩衝液PH5.7mlを加え、酞
玠電極を入れお密閉したのち容噚内の液を撹拌し
ながら37℃の恒枩ずした。これに−アセチルヘ
キ゜サミン酞化酵玠単䜍30Όを加えお反
応を開始し、反応の開始から終了たで経時的に、
酞玠量をオキシゲン・モニタヌで枬定し、これに
接続したレコヌダヌ東京セコニツク瀟補によ
り連続的に蚘録した。反応開始時の容噚䞭の酞玠
量から反応終了時の酞玠量を差し匕いた量を、反
応により消費された酞玠量ずしお算出した蚘録
玙䞊の目盛で25.7。 −アセチルグルナサミン暙準液を甚い、前蚘
ず同様にしお酞玠消費量を枬定した。この堎合
−アセチルグルナサミン量に関しお酞玠消費量
蚘録玙䞊の目盛をプロツトするず盎線ずなり、
これは怜量線ずしお䜿甚できる。この怜量線から
前蚘詊料䞭の−アセチルヘキ゜サミン量を求め
るず57Όであり、酞性ムコ倚糖䞭の−アセチ
ルヘキ゜サミンの割合は57であ぀た。 実斜䟋  0.1M−燐酞カリりム緩衝液PH6.0mlにコ
ロむドキチン濃床mgml0.5mlを加え、
これに単䜍のアスペルギルス・オリれヌ由来の
キトビアヌれEC3.2.1.2930Ό加え、曎に濃
床未知のキチナヌれ暙品ストレプトミセス・グ
リセりス0.1mlを加え、30℃で時間反応させ、
キチンを分解しお−アセチルグルナサミンを生
成させた。次いで100℃で分間加熱しお反応を
止め、これに0.5単䜍の−アセチルヘキ゜サミ
ン酞化酵玠の10Όを加え、30℃で20分間反応さ
せた。 次いで沈殿を遠心分離しお陀去し、液20ÎŒ
をずり、高速液䜓クロマトグラフ装眮〔カラム
TSK−GEL LS−220東掋曹達補、カラムサむ
ズmmID×250mm、移動局0.025M−燐酞カ
リりム緩衝液PH7.00.025M−塩化カリりム、
枩床45℃、圧力25Kgcm2、レンゞ0.02〕で
分離し、溶出した−アセチルヘキ゜サミン酞を
UV220nで怜出した。その際高速液䜓クロマト
グラフ装眮の党経過は、蚘録蚈東京セコニツク
瀟補で連続的に蚘録した。−アセチルグルナ
サミン酞は、非吞着物質より別れお溶出する。こ
のピヌクの高さは蚘録玙䞊の目盛で23であ぀た。 暙準の−アセチルグルナサミンを甚い、前蚘
ず同様にしお−アセチルグルナサミン酞量を蚘
録玙䞊のピヌク高さ目盛で枬定し、これから怜量
線を䜜成した。キチナヌれずキトビアヌれにより
生成した前蚘詊料䞭の−アセチルグルナサミン
量は48.5Όであ぀た。 実斜䟋  −アミノアンチピリン0.005及びN′−
ゞメチルアニリン0.02を含有する0.1M−ク゚
ン酞−0.2M−燐酞゜ヌダ緩衝液PH5.32.5ml
に、ヘキサ−−アセチルキトヘキサオヌス
−アセチルグルナサミンの量䜓1.2Όモルを加
え、50℃の恒枩に保持したのち人血枅0.3mlを加
え、時間反応させお基質を分解した。これに酵
母トリコスポロン・ベヌレンデむ−IFO0844
より調補した−アセチルヘキ゜サミニダヌれ
0.5単䜍50Ό及び−アセチルヘキ゜サミン
酞化酵玠0.5単䜍50Όならびにパヌオキシダ
ヌれ単䜍10Όを加え、10分間反応させ、
この反応液を比色定量550nした。この液
の吞光床ず、人血枅を加えないほかは同様に反応
させた液の吞光床ずの差は0.143であ぀た。 ヘキサ−−アセチルキトヘキサオヌスの代わ
りに暙準の−アセチルグルコサミンを甚い、前
蚘ず同様に枬定しお埗られた怜量線から、詊料ず
しお甚いた血枅䞭のリゟチヌムず−アセチルヘ
キ゜ミニダヌれにより生成した−アセチルグル
コサミンの量は10.5Όであ぀た。 実斜䟋  オキシゲン・モニタヌ米囜YSI瀟補の酞玠
枬定容噚䞭で、50Όモルのトリスヌ塩酞緩衝液
PH7.4mlにフルクトヌス−−リン酞10Όモ
ル及び赀パンカビのグルコサミン−−リン酞ア
セチルトランスプラヌれEC2.3.1.40.5単䜍
を加えた。37℃でむンキナベヌトしたのち、ラツ
ト肝臓の生理食塩氎EDTAをミリモル含有
するによる抜出液0.2ml蛋癜量2.0mgを加え
お37℃で60分間反応を行い、フルクトヌス−−
リン酞ず−グルタミンからグルコサミン−−
リン酞を生成させ、同時にそのアミノ基ぞアセチ
ル基を転移させお−アセチルグルコサミン−
−リン酞を生成させた。100℃で分間加熱しお
反応を停止させ、冷华したのち䜍のリン酞を陀
去するため、゚シ゚リヒア・コリのアルカリホス
フアタヌれEC3.1.3.115単䜍を0.1M−トリス
−塩酞緩衝液PH8.0、BSA1mgmlを含有す
る1.5mlに溶解しお加えた。曎に0.1M−塩化マ
グネシりム0.1mlを加え、37℃で10分間むンキナ
ベヌトした。 生成した−アセチルグルコサミンを枬定する
ために、容噚に酞玠電極を挿入しお密閉したの
ち、37℃で容噚を撹拌しながら−アセチルヘキ
゜サミン酞化酵玠1.0単䜍30Όを加え、消費
した酞玠量をオキシゲン・モニタヌで枬定した。
枬定の党経過はオキシゲン・モニタヌに接続した
レコヌダヌセコニツク瀟補によ぀お蚘録し、
反応開始前の容噚䞭の酞玠量から反応埌の酞玠量
を差し匕いた倀を消費酞玠量ずした。その結果、
蚘録玙䞊の目盛で8.4の酞玠消費量を怜出した。 フルクトヌス−−リン酞の代わりに暙準の
−アセチルグルナサミンを甚いお同様に枬定した
結果埗られた怜量線から、詊料䞭のグルコサミン
−−リン酞合成酵玠−グルコサミン−−リン
酞アセチルトランスプラヌれ−アルカリホスフ
アタヌれの酵玠系によ぀お生成された−アセチ
ルグルコサミンは0.07Όモルず定量された。 実斜䟋  0.1M−トリス−塩酞緩衝液PH7.5mlに
UDP−−アセチルグルコサミン1Όモル及び
MgSO440Όモルを加え、37℃でむンキナベヌトし
た。これに生䜓肝臓から抜出した粗酞玠液
Biochem.Biophys.Acta252å·»1971幎357頁を
0.2ml蛋癜をmg含有する加えお30分間反応
させ、−アセチルマンノサミンを生成させた。
この反応液を100℃に分間加熱したのち、沈殿
を陀去し、ダり゚ツクス−酢酞型むオン亀換暹
脂mlのカラムに通し、氎掗しお党量をmlずし
た。そのうち2.5mlをオキシゲン・モニタヌの酞
玠枬定甚容噚にずり、0.2M−トリス−塩酞緩衝
æ¶²0.5グリシンを0.2モル含有するを加え
た。 37℃で10分間保持したのち酞玠電極を挿入しお
密閉し、37℃で内容を撹拌しながら−アセチル
ヘキ゜サミン酞化酵玠単䜍50Όを加え
お、消費される酞玠量を実斜䟋及びず同様に
しお枬定した。その結果、蚘録玙䞊の目盛で8.0
の酞玠吞収を怜出した。暙準の−アセチルマン
ノサミン溶液を甚いお同様に反応させお埗られた
怜量線から、甚いた詊料䞭のUDP−−アセチ
ルグルコサミン−2′−゚ピメラヌれによ぀お生成
した−アセチルマンノサミンは0.16Όモルず定
量された。 実斜䟋  0.2M−トリス−塩酞緩衝液PH8.0 1.5ml BSA生理食塩氎溶液mgml 1.0ml −アセチルグルコサミン2.5 〜100ml 䞊蚘反応液をYSI瀟のオキシゲン・モニタヌの
酞玠吞収枬定容噚にずり、氎を加えおmlにした
のち、37℃で内容を撹拌しお恒枩にした。これに
酞玠電極を挿入しお密閉したのち、内容を撹拌し
ながら−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠
50Umlを20Όを加えた。容噚䞭の酞玠量は
オキシゲン・モニタヌに接続したレコヌダヌによ
぀お党経過を連続的に蚘録し、反応前の酞玠量か
ら反応埌の酞玠量を差し匕いお消費酞玠量を求め
た。その結果、−アセチルグルコサミン量ず消
費酞玠量の間に比䟋関係が認められた。 実斜䟋  BSA生理食塩氎溶液mgml 1.0ml −アミノアンチピリン0.3w 50ÎŒ N′−ゞメチルアニリン0.2w 0.3ml リン酞カリりム緩衝液0.2M、PH6.8 1.5ml パヌオキシダヌれ400単䜍ml 10ÎŒ −アセチルガラクトサミン2.5〜100ÎŒ 蒞溜氎を加えお党量を2.96mlにする。 䞊蚘反応液に−アセチルヘキ゜サミンオキシ
ダヌれ50Uml20Όを加えお、37℃、10分
間反応させたのち発色した色玠を550nで比色
定量した。その結果は、加えた−アセチルガラ
クトサミン量ず吞光床の間に比䟋関係が認められ
た。 実斜䟋  BSA 100mg −アミノアンチピリン mg リン酞䞀カリりム 1.36mg リン酞二カリりム 74 パヌオキシダヌれ 132単䜍 −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠 50単䜍 グリシン 2.25 蒞留氎 50ml 䞊蚘の組成を有する溶液を−40〜−50℃で凍結
し、曎に真空䞭で20時間也燥しお、分析甚キツト
(A)を埗た。分析甚キツト(A)に察しお添付液ずしお
0.2w・N′−ゞメチルアニリン氎溶液
(B)10mlを組合せせた。䜿甚に際しおは、分析甚キ
ツト(A)に察しお溶液(B)を党量加え、党䜓量を蒞留
氎で80mlに調敎する。埗られた溶液を詊料0.6ml
に察しお2.4ml䜿甚する。
【図面の簡単な説明】
第図は本発明に甚いられる酵玠の䞀䟋に぀い
おの至適PHを、第図は安定PHを、第図は䜜甚
適枩の範囲をそれぞれ瀺すグラフであり、第図
は各枩床における倱掻を瀺すグラフであり、第
図はアクリルアミドデむスク電気泳動を瀺す図で
ある。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  −アセチルヘキ゜サミン含有液に酞玠の存
    圚䞋に−アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠を䜜甚
    させ、酞化反応により消費される酞玠量を枬定す
    るか、あるいは該反応により生成する過酞化氎玠
    又は−アセチルヘキ゜サミン酞を枬定するこず
    を特城ずする、−アセチルヘキ゜サミン酞の定
    量法。  −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠が−ア
    セチルグルコサミン酞化酵玠であるこずを特城ず
    する、特蚱請求の範囲第項に蚘茉の方法。  −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠を含有す
    るこずを特城ずする、−アセチルヘキ゜サミン
    の定量甚詊薬。  −アセチルヘキ゜サミン酞化酵玠が−ア
    セチルグルコサミン酞化酵玠であるこずを特城ず
    する、特蚱請求の範囲第項に蚘茉の−アセチ
    ルヘキ゜サミンの定量甚詊薬。
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