JPH06197776A - Ｌ−リンゴ酸またはその塩の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 フマル酸またはその塩からＬ−リンゴ酸また
はその塩を高純度，高収率で生成させる。 【構成】 シュードモナス・フルオレッセンス・α−５
株の生産するフマラーゼをフマル酸またはその塩に作用
させてＬ−リンゴ酸またはその塩を製造する。 【効果】 変換率が高く、コハク酸の副生がほとんどな
いので、容易に高収率で高純度のＬ−リンゴ酸またはそ
の塩が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフマル酸にシュードモナ
ス・フルオレッセンスに属し、フマラーゼ活性の高めら
れた一変種の酵素を作用させてＬ−リンゴ酸を製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】Ｌ−リン
ゴ酸は、現在輸液の成分として利用されているが、光学
活性を有していることから医薬の原料などの用途が期待
されている。

【０００３】Ｌ−リンゴ酸の製造法としては、フマラー
ゼ活性を有する微生物をフマル酸を含有する培地に培養
し、培養物からＬ−リンゴ酸を採取する発酵法（特公昭
４０−４６１３等）が知られているが、収率が低く培
地，発酵物由来の不純物の除去が困難である。

【０００４】また、固定化により培地，発酵物，菌体由
来の不純物の混入を防ぐ方法（特公昭５２−３１９５
２）もあるが、コハク酸の副生がある為、高価な界面活
性剤処理が必要である。このコハク酸の副生は、Ｌ−リ
ンゴ酸の収率低下、単離困難ということを引き起こし、
細菌のフマラーゼを用いた場合必ずこの問題が生じるた
め菌体を加熱処理しコハク酸副生を抑制する方法（特公
昭６２−４８３８８）の様に、必ず何らかの処理をしな
ければならない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解消すべく、高フマラーゼ活性を有しフマル酸からコ
ハク酸に変換する酵素系の非常に弱い菌種の探索をおこ
ない鋭意検討した結果、シュードモナス・フルオレッセ
ンスが、フマル酸からコハク酸に変換する酵素系が非常
に弱く、コハク酸副生が非常に少ないことを発見した。

【０００６】そこで、自然界から分離したシュードモナ
ス・フルオレッセンスＦ−２５株に紫外線を照射し、α
−アミノ酪酸存在下で生育の良好な変異株を分離したと
ころ、フマラーゼ活性が親株より高くなった変異族を見
出し、これをα−５株と名付けた。

【０００７】本発明はこれらの新知見に基づくもので、
シュードモナス・フルオレッセンスに属するα−５株の
生産するフマラーゼをフマル酸またはその塩に作用させ
ることを特徴とするＬ−リンゴ酸またはその塩の製造法
である。

【０００８】本発明に用いるシュードモナス・フルオレ
ッセンスのα−５株は次の菌学的性質を示す。

【０００９】 形 態 桿 菌 大きさ ０．７−１×２−３μ グラム染色性 − 運動性 ＋ べん毛 極毛（２〜３本） カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ ＯＦ試験 酸化 ピオシアニンの産生 − ピオルビンの産生 − フルオレッシンの産生 ＋ アシルアミダーゼ − アルギニンジヒドラーゼ ＋ ４１℃での生育 − ４℃での生育 ＋ 脱窒反応 − ゼラチンの分解 ＋ でんぷんの分解 − トレハロースの酸化 − マルトースの酸化 −

【００１０】上記のα−５株は工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託された（寄託番号：微工研菌寄第１２７
３２号）。

【００１１】本発明においては、α−５株のフマラーゼ
をフマル酸またはその塩に作用させる。

【００１２】フマラーゼは本株の培養物、たとえば液体
培養の培養液，菌体、それらの酵素抽出物の形態でフマ
ル酸またはその塩に作用させることができる。

【００１３】上記菌株の培養については通常の培養法を
用いることができる。炭素源としては、グルコース，シ
ュークロース，マンノース，グリセリン，糖蜜等の糖
質，また菌の資化性によっては炭化水素，アルコール
類，有機酸等も用い得る。

【００１４】窒素源としては硫酸アンモニウム，尿素，
硝酸アンモニウム，硝酸ソーダ等の無機窒素源，あるい
はポリペプトン，酵母エキス，コーンスティプリカー，
アミノ酸等の有機窒素源を単独または組み合わせて用い
ることができる。

【００１５】また、フマル酸等の有機酸や、Ｍｎ²⁺，Ｃ
ｏ²⁺，Ｍｇ²⁺，Ｍｏ²⁺を含む各種塩の添加により、生育
が促進される。リン源としてはリン酸一カリウム，リン
酸二ナトリウムを用い、緩衝能をもたせることにより菌
の生育が良好となる。

【００１６】培養法としては液体培養が適している。フ
マル酸塩を炭素源として用いると生育が良好で、培養の
進行と共にフマル酸が分解され、その分を連続して補充
すると高密度培養，連続培養が可能であり有利である。

【００１７】培養温度は２０°〜４０℃、好ましくは約
３０℃で、ｐＨは５〜１０、好ましくは６〜９である。
この条件で１０〜３０時間通気攪拌培養した後、菌体を
集めてフマル酸またはその塩に作用させてもよいが、本
菌はフマラーゼ活性が高くかつ高密度培養ができるので
その場合は、培養物を直接フマル酸またはその塩に作用
させても高収率でリンゴ酸を生成させることができる。

【００１８】所望により、培養菌体もしくは菌体の破砕
物，磨砕物等を担体に固定化し、固定化フマラーゼとし
て用いてもよい。

【００１９】本発明における上記の酵素反応は、上記の
培養物やその処理物をフマル酸またはその塩と水溶媒中
で接触させることにより進行させることができる。フマ
ル酸塩としては、たとえばナトリウム塩，カルシウム塩
などが用いられる。

【００２０】この反応はｐＨ２〜１０、反応温度１０〜
６０℃、好ましくは約２０〜５０℃で行われ、反応に要
する時間は通常約１〜４８時間である。

【００２１】α−５株はフマラーゼ活性が高く、コハク
酸をほとんど副生しないので、９９．９％以上の高純度
で、かつ遊離のＬ−リンゴ酸またはその塩を高収率で容
易に製造することができる。

【００２２】

【実施例】以下に実施例の形で本発明をさらに説明する
が、これによって本発明が限定されないことは言うまで
もない。

【００２３】実施例１

【表１】 培地組成 フマール酸 ２ｇｒ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ ０．６２ｇｒ （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ ０．４ｇｒ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５ｇｒ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２８ｇｒ コーンスティープリカ ０．２ｇｒ 蒸留水 １００ml ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整

【００２４】表１に示した組成の培地５０mlを５００ml
容坂口フラスコに入れ、親株のシュードモナス・フルオ
レッセンスＦ−２５菌及びその変異株であるシュードモ
ナス・フルオレッセンスα−５菌を接種し、３０℃にて
２４時間振とう培養する。得られた培養液から遠心分離
（５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）で集菌し、菌体量を一
定にするために、比濁法によりＯ．Ｄ．５５０ｎｍの値
を１００になるようにｐＨ７．０，１／１５Ｍ燐酸緩衝
液で調整し、該調整液１mlに１Ｍフマル酸ジナトリウム
溶液を１mlを加え、４０℃で１０分間反応させた。該反
応液中に生成したＬ−リンゴ酸は、２Ｎ塩酸を加えてフ
マル酸を沈澱させ、その上澄みに２，７−ナフタレンジ
オールを反応させて発色させる方法によって定量した。
その結果、親株であるシュードモナス・フルオレッセン
スＦ−２５菌の菌体を用いた場合、反応液中のＬ−リン
ゴ酸の含量は０．２ｍｇ／ｍｌであるのに対して、シュ
ードモナス・フルオレッセンスα−５菌の菌体を用いた
場合は１．２ｍｇ／ｍｌであった。

【００２５】実施例２ 表１に示した組成の培地５０mlを５００ml容坂口フラス
コに入れ、親株のシュードモナス・フルオレッセンスＦ
−２５菌及びその変異株であるシュードモナス・フルオ
レッセンスα−５菌を接種し、３０℃にて２４時間振と
う培養する。得られた培養液から遠心分離（５０００ｒ
ｐｍ，１０ｍｉｎ）で集菌した湿潤菌体約１．５ｇｒ
を、フマル酸カルシウム０．２６モルを１２０ｇｒの水
に懸濁したスラリーに添加し、４０℃で反応させたとこ
ろ親株のＦ−２５菌が４０時間後に変換率９７％に達し
たのに対し、α−５菌は１５時間で変換率９９％に達し
た。

【００２６】実施例３ フマル酸ジナトリウム２．８ｇｒ／ｄｌ，（ＮＨ₄ ）₂
ＳＯ₄ ０．４ｇｒ／ｄｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２８ｇｒ／
ｄｌ，Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ０．６２ｇｒ／ｄ
ｌ，ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．５ｇｒ／ｄｌ，コーンス
ティープリカー，０．４ｇｒ／ｄｌの組成を有しｐＨ
７．０に調整した培地５０mlを入れた５００ml容量の坂
口フラスコにシュードモナス・フルオレッセンスα−
５，ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６
７，またはブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＩ．
Ｆ．Ｏ．１２６１２を接種し、３０℃，２４時間振とう
培養する。得られた培養液を遠心分離で集菌し、フマル
酸カルシウム０．２５８ｍｏｌを水１２０mlに懸濁した
スラリーに添加し、４０℃で反応させた結果、表２に示
すようにシュードモナス・フルオレッセンスα−５に
は、コハク酸の副生がほとんど見られなかったのに対
し、他の２菌株はリンゴ酸に対して５％以上のコハク酸
が副生した。

【００２７】

【表２】 （註．Ｐ．ｆ．はシュードモナス・フルオレッセンス、
Ｂ．ｆ．はブレビバクテリウム・フラバム、Ｂ．ａ．は
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスの略）

【００２７】実施例４

【表３】 培地組成 フマール酸 ６ｇｒ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ ０．６２ｇｒ （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １．２ｇｒ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５ｇｒ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２８ｇｒ コーンスティープリカー １．２ｇｒ 蒸留水 １００ml ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整

【００２８】表１に示した組成の培地５０mlを５００ml
容量坂口フラスコにいれ、シュードモナス・フルオレッ
センスα−５菌を接種し、３０℃にて２４時間振とう培
養する。次にこの培養物１５０mlを表３に示した組成の
培地２Ｌを入れた５Ｌ容量ジャーファーメンターに植菌
し３０℃、通気量１．７ｖ．ｖ．ｍ、攪拌１０００ｒｐ
ｍにて、フマル酸スラリーでｐＨを７〜７．５に制御し
ながら２４時間培養した。得られた培養液５８０ｇｒ
を、フマル酸カルシウム９９６ｇｒ（６．４７ｍｏｌ）
を３Ｌの水に懸濁したスラリーに添加し、４０℃，１５
時間反応させた結果、フマル酸からの９９％以上の変換
率でＬ−リンゴ酸が生成した。この生成したＬ−リンゴ
酸カルシウムを５００mlの水で噴霧洗浄することにより
純度９９．９４％のＬ−リンゴ酸カルシウムが得られ
た。次に常法によりカルシウムを除去し、遊離のＬ−リ
ンゴ酸結晶７８０ｇｒ（ｄｒｙ）が得られた。またＨＰ
ＬＣ及びペーパークロマトグラフィーで分析した結果コ
ハク酸は検出されなかった。

【００２９】実施例５ 表１に示す組成の培地５０mlを５００ml容量坂口フラス
コにいれ、シュードモナス・フルオレッセンスα−５菌
を接種し、３０℃にて２４時間振とう培養する。得られ
た培養液を遠心分離して菌体を得、この菌体３ｇｒを、
３０mlの水に懸濁し、アルギン酸ナトリウム２ｇｒを水
７０mlに溶かした液と混合する。混合液を０．１Ｍの塩
化カルシウム溶液に滴下しゲルを形成させる。得られた
固定化菌体５６ｇｒを、フマル酸カルシウム０．２５８
ｍｏｌを水１２０mlに懸濁したスラリーに添加し、４５
℃で反応させた結果、２４時間後にフマル酸からの変換
率で９９％以上のＬ−リンゴ酸が生成した。

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、フマル酸またはその塩
からＬ−リンゴ酸またはその塩への転換率９９％以上を
達成できるので、反応混合物から未反応のフマル酸を除
去する操作を省略でき、またコハク酸をほとんど副生し
ないので、その副生を抑制する手段を必要とせず、副生
コハク酸を除去する必要もない。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年４月１５日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】そこで、自然界から分離したシュードモナ
ス・フルオレッセンスＦ−２５株に紫外線を照射し、α
−アミノ酪酸存在下で生育の良好な変異株を分離したと
ころ、フマラーゼ活性が親株より高くなった変異株を見
出し、これをα−５株と名付けた。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】実施例１

【表１】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】実施例２ 表１に示した組成の培地５０ｍｌを５００ｍｌ容坂口フ
ラスコに入れ、親株のシュードモナス・フルオレッセン
スＦ−２５菌及びその変異株であるシュードモナス・フ
ルオレッセンスα−５菌を接種し、３０℃にて２４時間
振とう培養する。得られた培養液から遠心分離（５００
０ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）で集菌した湿潤菌体約１．５ｇ
ｒを、フマル酸カルシウム０．２６ｍｏｌを１２０ｇｒ
の水に懸濁したスラリーに添加し、４０℃で反応させた
ところ親株のＦ−２５菌が４０時間後に変換率９７％に
達したのに対し、α−５菌は１５時間で変換率９９％に
達した。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】フマル酸ジナトリウム２．８ｇｒ／ｄｌ，
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４０．４ｇｒ／ｄｌ，ＫＨ_２ＰＯ
_４０．２８ｇｒ／ｄｌ，Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ
０．６２ｇｒ／ｄｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５ｇ
ｒ／ｄｌ，コーンスティープリカー，０．４ｇｒ／ｄｌ
の組成を有しｐＨ７．０に調整した培地５０ｍｌを入れ
た５００ｍｌ容量の坂口フラスコにシュードモナス・フ
ルオレッセンスα−５，ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１４０６７，またはブレビバクテリウム・アン
モニアゲネスＩ．Ｆ．Ｏ．１２６１２を接種し、３０
℃，２４時間振とう培養する。得られた培養液を遠心分
離で集菌し、フマル酸カルシウム０．２５８ｍｏｌを水
１２０ｍｌに懸濁したスラリーに添加し、４０℃で反応
させた結果、表２に示すようにシュードモナス・フルオ
レッセンスα−５には、コハク酸の副生がほとんど見ら
れなかったのに対し、他の２菌株はリンゴ酸に対して５
％以上のコハク酸が副生した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】削除

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】

【表２】 実施例４

【表３】 表１に示した組成の培地５０ｍｌを５００ｍｌ容量坂口
フラスコにいれ、シュードモナス・フルオレッセンスα
−５菌を接種し、３０℃にて２４時間振とう培養する。
次にこの培養物１５０ｍｌを表３に示した組成の培地２
Ｌを入れた５Ｌ容量ジャーファーメンターに植菌し３０
℃、通気量１．７ｖ．ｖ．ｍ、攪拌１０００ｒｐｍに
て、フマル酸スラリーでｐＨを７〜７．５に制御しなが
ら２４時間培養した。得られた培養液５８０ｇｒを、フ
マル酸カルシウム９９６ｇｒ（６．４７ｍｏｌ）を３Ｌ
の水に懸濁したスラリーに添加し、４０℃，１５時間反
応させた結果、フマル酸からの９９％以上の変換率でＬ
−リンゴ酸が生成した。この生成したＬ−リンゴ酸カル
シウムを５００ｍｌの水で噴霧洗浄することにより純度
９９．９４％のＬ−リンゴ酸カルシウムが得られた。次
に常法によりカルシウムを除去し、遊離のＬ−リンゴ酸
結晶７８０ｇｒ（ｄｒｙ）が得られた。またＨＰＬＣ及
びペーパークロマトグラフィーで分析した結果コハク酸
は検出されなかった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードモナス・フルオレッセンスに属
   するα−５株の生産するフマラーゼをフマル酸またはそ
   の塩に作用させることを特徴とするＬ−リンゴ酸または
   その塩の製造法。
2. 【請求項２】 フマラーゼがα−５株の培養物，菌体ま
   たはその処理物の形態で用いられる請求項１記載の製造
   法。