JPH06256200A - 抗腫瘍剤及びその製造方法 - Google Patents
抗腫瘍剤及びその製造方法Info
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- JPH06256200A JPH06256200A JP5064671A JP6467193A JPH06256200A JP H06256200 A JPH06256200 A JP H06256200A JP 5064671 A JP5064671 A JP 5064671A JP 6467193 A JP6467193 A JP 6467193A JP H06256200 A JPH06256200 A JP H06256200A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規な抗腫瘍剤及びその製造方法の提供
【構成】 ストレプトマイセス・ハチジョウエンシスの
培養液からゾーン電気泳動法を含む分離手段によって分
離されたタンパク質画分ＫＬ３中に存在し、セファデッ
クスＧ100 を用いるゲルクロマトグラフィーで通過し、
かつＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣにおい
て、溶出剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M
NaCl 含有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ
／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶
出剤で溶出する画分中に含まれる固形分を有効成分とし
て含有する抗腫瘍剤及びその製造方法。
培養液からゾーン電気泳動法を含む分離手段によって分
離されたタンパク質画分ＫＬ３中に存在し、セファデッ
クスＧ100 を用いるゲルクロマトグラフィーで通過し、
かつＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣにおい
て、溶出剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M
NaCl 含有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ
／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶
出剤で溶出する画分中に含まれる固形分を有効成分とし
て含有する抗腫瘍剤及びその製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な抗腫瘍剤及びその
製造方法に関するものである。
製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から、種々の抗腫瘍性抗生物質が微
生物より生産されていることが知られている。その内の
いくつかのものは、制癌剤として実用化されている。特
に、放線菌由来の制癌剤として、マイトマイシンＣ、ブ
レオマイシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチ
ン等が知られており、治療に応用されている。しかしな
がら多くの抗腫瘍性抗生物質が、骨髄抑制、胃腸障害、
心機能障害や脱毛といった副作用を伴い、癌の患者にと
って大きな負担となっている。又、多くの癌患者におい
て免疫能が低下し、癌の進行の促進が見られたり、各種
細菌に対する抵抗性が減弱し、重篤な感染症にかかりや
すくなる。このような背景から、近年、臨床サイドから
癌の治療法として、クオリティー・オブ・ライフという
概念が検討されるようになり、制癌剤の領域について
も、より副作用の少ない、かつ癌患者の免疫能を亢進し
て癌の治療を試みることが盛んになってきている。
生物より生産されていることが知られている。その内の
いくつかのものは、制癌剤として実用化されている。特
に、放線菌由来の制癌剤として、マイトマイシンＣ、ブ
レオマイシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチ
ン等が知られており、治療に応用されている。しかしな
がら多くの抗腫瘍性抗生物質が、骨髄抑制、胃腸障害、
心機能障害や脱毛といった副作用を伴い、癌の患者にと
って大きな負担となっている。又、多くの癌患者におい
て免疫能が低下し、癌の進行の促進が見られたり、各種
細菌に対する抵抗性が減弱し、重篤な感染症にかかりや
すくなる。このような背景から、近年、臨床サイドから
癌の治療法として、クオリティー・オブ・ライフという
概念が検討されるようになり、制癌剤の領域について
も、より副作用の少ない、かつ癌患者の免疫能を亢進し
て癌の治療を試みることが盛んになってきている。
【０００３】放線菌の１種であるストレプトマイセス・
ハチジョウエンシス（Streptomyceshachijoensis）ＩＦ
Ｏの"List of Cultures"(1988)によればストレプトバー
チシリウム・ハチジョウエンス(Streptoverticillium
hachijoense)とされている。〕由来の有効成分として、
膣トリコモナス症に有効なポリエン系抗生物質トリコマ
イシンの存在が知られている。また、添田はストレプト
マイセス・ハチジョウエンシスＨ−２６０９株（IFO 12
782)(ATCC 19769)から分子量1200の抗腫瘍物質を得てい
る( 特公昭49-42560号公報、防衛衛生 第14巻、第１
号、第１頁、1967、特公昭52-50278号公報) 。また、津
国らは同じ菌を用いて分子量 1.5万〜 3.5万の蛋白質を
主体とした抗腫瘍性物質を得ている( 特公昭56-9517 号
公報）。また、本発明者は同じ菌を用いて分子量２万か
ら６万の蛋白質を主体とした抗腫瘍剤を得た（特開平2-
53729 号公報）。
ハチジョウエンシス（Streptomyceshachijoensis）ＩＦ
Ｏの"List of Cultures"(1988)によればストレプトバー
チシリウム・ハチジョウエンス(Streptoverticillium
hachijoense)とされている。〕由来の有効成分として、
膣トリコモナス症に有効なポリエン系抗生物質トリコマ
イシンの存在が知られている。また、添田はストレプト
マイセス・ハチジョウエンシスＨ−２６０９株（IFO 12
782)(ATCC 19769)から分子量1200の抗腫瘍物質を得てい
る( 特公昭49-42560号公報、防衛衛生 第14巻、第１
号、第１頁、1967、特公昭52-50278号公報) 。また、津
国らは同じ菌を用いて分子量 1.5万〜 3.5万の蛋白質を
主体とした抗腫瘍性物質を得ている( 特公昭56-9517 号
公報）。また、本発明者は同じ菌を用いて分子量２万か
ら６万の蛋白質を主体とした抗腫瘍剤を得た（特開平2-
53729 号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】癌化学療法の分野にお
いては、多様な癌の種類、症状に対応して多様な抗腫瘍
剤が要求されている。本発明は新規な抗腫瘍剤及びその
製造方法を提供することを目的とする。
いては、多様な癌の種類、症状に対応して多様な抗腫瘍
剤が要求されている。本発明は新規な抗腫瘍剤及びその
製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はストレプトマイ
セス・ハチジョウエンシスの培養液からゾーン電気泳動
法を含む分離手段によって分離されたタンパク質画分Ｋ
Ｌ３中に存在し、セファデックスＧ100 を用いるゲルク
ロマトグラフィーで通過し、かつＤＥＡＥ−セファロー
スを用いるＦＰＬＣにおいて、溶出剤としてトリエタノ
ールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含有トリエタノールア
ミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出
剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶出する画分中に含ま
れる固形分を有効成分として含有する抗腫瘍剤に関す
る。
セス・ハチジョウエンシスの培養液からゾーン電気泳動
法を含む分離手段によって分離されたタンパク質画分Ｋ
Ｌ３中に存在し、セファデックスＧ100 を用いるゲルク
ロマトグラフィーで通過し、かつＤＥＡＥ−セファロー
スを用いるＦＰＬＣにおいて、溶出剤としてトリエタノ
ールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含有トリエタノールア
ミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出
剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶出する画分中に含ま
れる固形分を有効成分として含有する抗腫瘍剤に関す
る。
【０００６】本発明はまたストレプトマイセス・ハチジ
ョウエンシスの培養液より菌体を除き、菌体除去液に塩
化亜鉛溶液を加えて生ずる沈澱を採取し、これに第二燐
酸ナトリウム溶液を加えてpH7.0 〜9.4 となして抽出を
行い、抽出液に親水性有機溶媒を加え、生ずる沈澱を水
に溶解した後透析し、透析内液に硫酸アンモニウム溶液
を加え、生ずる沈澱を水に溶解した後透析し、透析内液
をゾーン電気泳動に付してタンパク質画分を採取し、こ
れを透析し、透析内液をゲルとしてセファデックスＧ10
0 を用いるゲルクロマトグラフィーに付し、通過液を透
析し、透析内液をＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰ
ＬＣ(pharmacia liquid chromatography) に付し、溶出
剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含
有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋
Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶
出する画分中に含まれる固形分を有効成分とする抗腫瘍
剤に関する。
ョウエンシスの培養液より菌体を除き、菌体除去液に塩
化亜鉛溶液を加えて生ずる沈澱を採取し、これに第二燐
酸ナトリウム溶液を加えてpH7.0 〜9.4 となして抽出を
行い、抽出液に親水性有機溶媒を加え、生ずる沈澱を水
に溶解した後透析し、透析内液に硫酸アンモニウム溶液
を加え、生ずる沈澱を水に溶解した後透析し、透析内液
をゾーン電気泳動に付してタンパク質画分を採取し、こ
れを透析し、透析内液をゲルとしてセファデックスＧ10
0 を用いるゲルクロマトグラフィーに付し、通過液を透
析し、透析内液をＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰ
ＬＣ(pharmacia liquid chromatography) に付し、溶出
剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含
有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋
Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶
出する画分中に含まれる固形分を有効成分とする抗腫瘍
剤に関する。
【０００７】本発明はまた上記における、溶出剤として
Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.55である溶出剤で溶出して得られ
る、溶出液を透析するか、透析内液を必要に応じ濃縮も
しくは乾燥するか、または必要に応じ最終透析内液もし
くは濃縮もしくは乾燥物と常用の医薬用担体とを混合す
ることを特徴とする抗腫瘍剤の製造方法に関する。
Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.55である溶出剤で溶出して得られ
る、溶出液を透析するか、透析内液を必要に応じ濃縮も
しくは乾燥するか、または必要に応じ最終透析内液もし
くは濃縮もしくは乾燥物と常用の医薬用担体とを混合す
ることを特徴とする抗腫瘍剤の製造方法に関する。
【０００８】本発明は抗腫瘍剤の有効成分は、ストレプ
トマイセス・ハチジョウエンシスの培養上清液より得る
ことができる。ストレプトマイセス・ハチジョウエンシ
スの菌学的性状は、「抗トリコモナス・抗ガン作用を有
する新抗生物質、トリコマイシンについて」（細谷ら、
ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス第10巻、第56
4 頁、1952年）において、ストレプトマイセス・ハチジ
ョウエンシスのＨ−２６０９株について述べられてお
り、また「スタディーズ オン ザ アンチバイオティ
クス サブスタンス プロデューシング ストレインズ
Ｈ２０７５、Ｈ−２６０９アンドＨ−３０３０」（ザ
ジャーナル オブ アンチバイオティクスシリーズＡ、
第７巻、第１号、第10頁、1954年）において、ストレプ
トマイセス・ハチジョウエンシスのＨ−２６０９株及び
Ｈ−２０７５株について述べられている。また、Ｈ−２
６０９株は IFO 12782号として寄託されている。本発明
においてはＨ−２６０９株、Ｈ−２０７５株、Ｈ−３０
３０株を具体的菌株として用いることができるが、それ
らに限らず、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス
に属し、上記有効成分中の活性本体である有機物成分を
生産する限り、他の野性株も使用でき、さらにはこれら
の微生物の常法による変異処理（例えば紫外線照射、変
異剤処理、遺伝子工学的処理）によって得られる変異株
も使用可能である。
トマイセス・ハチジョウエンシスの培養上清液より得る
ことができる。ストレプトマイセス・ハチジョウエンシ
スの菌学的性状は、「抗トリコモナス・抗ガン作用を有
する新抗生物質、トリコマイシンについて」（細谷ら、
ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス第10巻、第56
4 頁、1952年）において、ストレプトマイセス・ハチジ
ョウエンシスのＨ−２６０９株について述べられてお
り、また「スタディーズ オン ザ アンチバイオティ
クス サブスタンス プロデューシング ストレインズ
Ｈ２０７５、Ｈ−２６０９アンドＨ−３０３０」（ザ
ジャーナル オブ アンチバイオティクスシリーズＡ、
第７巻、第１号、第10頁、1954年）において、ストレプ
トマイセス・ハチジョウエンシスのＨ−２６０９株及び
Ｈ−２０７５株について述べられている。また、Ｈ−２
６０９株は IFO 12782号として寄託されている。本発明
においてはＨ−２６０９株、Ｈ−２０７５株、Ｈ−３０
３０株を具体的菌株として用いることができるが、それ
らに限らず、ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス
に属し、上記有効成分中の活性本体である有機物成分を
生産する限り、他の野性株も使用でき、さらにはこれら
の微生物の常法による変異処理（例えば紫外線照射、変
異剤処理、遺伝子工学的処理）によって得られる変異株
も使用可能である。
【０００９】この放線菌ストレプトマイセス・ハチジョ
ウエンシスの培養は、前記先行技術に記載された方法、
例えば以下に示すような方法によって行うことができ
る。栄養源としては、従来放線菌の培養に利用されてい
る公知のものが使用できる。例えば、炭素源としてグル
コース、糖蜜、澱粉、デキストリン、スクロース、水
飴、動植物油等を使用しうる。また窒素源として大豆
粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素等を使用しうる。その他必要に応じて、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバル
ト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成する
ことができる無機塩類を添加することは、有効である。
また菌の発育を助け、有効成分の生産を促進するような
有機及び無機物を適当に添加することができる。培養方
法としては、好気的条件での培養法が適しており、培養
に適当な温度は23〜30℃であるが、多くの場合24〜28℃
で培養する。また、培養に適当なpH域は7.0 〜9.0 であ
る。上記条件下に通常３日〜２週間培養を行うことによ
り活性の高い培養液を得ることができる。
ウエンシスの培養は、前記先行技術に記載された方法、
例えば以下に示すような方法によって行うことができ
る。栄養源としては、従来放線菌の培養に利用されてい
る公知のものが使用できる。例えば、炭素源としてグル
コース、糖蜜、澱粉、デキストリン、スクロース、水
飴、動植物油等を使用しうる。また窒素源として大豆
粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、肉エキス、ペ
プトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、尿素等を使用しうる。その他必要に応じて、ナトリ
ウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバル
ト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイオンを生成する
ことができる無機塩類を添加することは、有効である。
また菌の発育を助け、有効成分の生産を促進するような
有機及び無機物を適当に添加することができる。培養方
法としては、好気的条件での培養法が適しており、培養
に適当な温度は23〜30℃であるが、多くの場合24〜28℃
で培養する。また、培養に適当なpH域は7.0 〜9.0 であ
る。上記条件下に通常３日〜２週間培養を行うことによ
り活性の高い培養液を得ることができる。
【００１０】培養液からの有効成分の分離は以下のごと
くして行われる。ここで以下のＫＬαまでの分離工程は
特開平2-53729 号公報に記載された方法によって行うこ
とができる。例えばまず、培養液から菌体を遠心分離等
によって除去し、その上清に塩化亜鉛水溶液を加えて生
ずる沈澱を採取し、これに第二リン酸ナトリウムを加え
て抽出を行い、この抽出液にメタノールを加えて沈澱す
る画分を採取する。この沈澱のために用いられる溶媒と
しては親水性有機培養であればよく、メタノール、エタ
ノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコー
ル、アセトン、イソブチルケトン等のケトン系溶媒等が
用いられる。この沈澱は大量の第二リン酸ナトリウムを
含むため、セロファンチューブを用いて透析を行い、透
析内液を凍結乾燥して粗製画分（ＫＬ１）を得る。次
に、この粗製画分ＫＬ１を硫酸アンモニウムによる沈澱
法によって、大まかに画分し、淡黄褐色の粉末であるタ
ンパク質画分（ＫＬ２）を得る。このときの硫酸アンモ
ニウムの濃度はある範囲内で任意に選べるが、約60％前
後が望ましく、また沈澱より硫酸アンモニウムを取り除
く方法としては、透析によることができる。
くして行われる。ここで以下のＫＬαまでの分離工程は
特開平2-53729 号公報に記載された方法によって行うこ
とができる。例えばまず、培養液から菌体を遠心分離等
によって除去し、その上清に塩化亜鉛水溶液を加えて生
ずる沈澱を採取し、これに第二リン酸ナトリウムを加え
て抽出を行い、この抽出液にメタノールを加えて沈澱す
る画分を採取する。この沈澱のために用いられる溶媒と
しては親水性有機培養であればよく、メタノール、エタ
ノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコー
ル、アセトン、イソブチルケトン等のケトン系溶媒等が
用いられる。この沈澱は大量の第二リン酸ナトリウムを
含むため、セロファンチューブを用いて透析を行い、透
析内液を凍結乾燥して粗製画分（ＫＬ１）を得る。次
に、この粗製画分ＫＬ１を硫酸アンモニウムによる沈澱
法によって、大まかに画分し、淡黄褐色の粉末であるタ
ンパク質画分（ＫＬ２）を得る。このときの硫酸アンモ
ニウムの濃度はある範囲内で任意に選べるが、約60％前
後が望ましく、また沈澱より硫酸アンモニウムを取り除
く方法としては、透析によることができる。
【００１１】透析は半透膜の分子膜を利用した高分子成
分の分離法の一つであり、半透膜としては一般にセロフ
ァン膜、コロジオン膜、ゼラチン膜、動物膜等が利用さ
れているが、この発明も低分子の無機塩類、夾雑物を除
く目的があるから、透析もセロファンチーフ等を利用し
た任意の公知手段を用いて行うことができる。透析は一
般に外液を水として行えばよい。この画分はさらに、ゾ
ーン電気泳動法によってタンパク質画分を採取し、透析
によって夾雑物を除いて、淡黄褐色の粉末（ＫＬ３）を
得ることができる。さらに、このタンパク質画分（ＫＬ
３）はゲルクロマトグラフィーによって精製され得る。
すなわち、セファデックスＧ１００（デキストランの橋
かけ重合体であって、制限分子量10万以下のゲル濾過剤
担体。なお、本発明においてはセファデックスＧ100 は
その同等物も含む意味で使用するものとする。）の通過
液を透析、凍結乾燥して、淡黄褐色粉末（ＫＬα）を得
る。ＫＬαは分子量約10万以下のタンパク質を主体と
し、糖を含有する画分である。なお、ＫＬ１〜ＫＬαで
示された各画分は透析及び／または凍結乾燥して粉末と
して得ているが、これらの工程を行わず各次の段階へ移
行することができ、また途中でのこれらの工程を省き、
最後にこれらの工程を行ってもよい。また、各工程での
透析を行う場合、これを適宜限外濾過に代えることがで
きる。これらのことは以下のＫＬ８に至る工程について
も同様である。
分の分離法の一つであり、半透膜としては一般にセロフ
ァン膜、コロジオン膜、ゼラチン膜、動物膜等が利用さ
れているが、この発明も低分子の無機塩類、夾雑物を除
く目的があるから、透析もセロファンチーフ等を利用し
た任意の公知手段を用いて行うことができる。透析は一
般に外液を水として行えばよい。この画分はさらに、ゾ
ーン電気泳動法によってタンパク質画分を採取し、透析
によって夾雑物を除いて、淡黄褐色の粉末（ＫＬ３）を
得ることができる。さらに、このタンパク質画分（ＫＬ
３）はゲルクロマトグラフィーによって精製され得る。
すなわち、セファデックスＧ１００（デキストランの橋
かけ重合体であって、制限分子量10万以下のゲル濾過剤
担体。なお、本発明においてはセファデックスＧ100 は
その同等物も含む意味で使用するものとする。）の通過
液を透析、凍結乾燥して、淡黄褐色粉末（ＫＬα）を得
る。ＫＬαは分子量約10万以下のタンパク質を主体と
し、糖を含有する画分である。なお、ＫＬ１〜ＫＬαで
示された各画分は透析及び／または凍結乾燥して粉末と
して得ているが、これらの工程を行わず各次の段階へ移
行することができ、また途中でのこれらの工程を省き、
最後にこれらの工程を行ってもよい。また、各工程での
透析を行う場合、これを適宜限外濾過に代えることがで
きる。これらのことは以下のＫＬ８に至る工程について
も同様である。
【００１２】なお、特開平2-53729 号公報ではＫＬαを
さらにスーパーローズ１２（ファルマシア製）を担体と
したクロマトグラフィーにより分画し、有効画分のみを
集め、透析、凍結乾燥して得た淡黄色粉末をＫＬ４とし
ている。このＫＬ４はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法による分子量測定で分子量が20,000〜60,000
の範囲であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る等電点が 5.0〜 7.0の範囲であり、ニンヒドリン反応
が陽性で、紫外線吸収スペクトルでタンパク質特有のス
ペクトルを示すことが報告されている。
さらにスーパーローズ１２（ファルマシア製）を担体と
したクロマトグラフィーにより分画し、有効画分のみを
集め、透析、凍結乾燥して得た淡黄色粉末をＫＬ４とし
ている。このＫＬ４はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法による分子量測定で分子量が20,000〜60,000
の範囲であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る等電点が 5.0〜 7.0の範囲であり、ニンヒドリン反応
が陽性で、紫外線吸収スペクトルでタンパク質特有のス
ペクトルを示すことが報告されている。
【００１３】ＫＬαはついで陰イオン交換用カラムＤＥ
ＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶出剤と
して50M トリエタノールアミン−HCl (pH7.5) からなる
トリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含有50mMト
リエタノールアミン−HCl(pH7.5)からなる0.5M NaCl 含
有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋
Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶
出する画分を得る。この操作は具体的には次のようにし
て行うことができる。すなわち、ＫＬαをＤＥＡＥ−セ
ファロースを用いるＦＰＬＣに付し、Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が
0.425 である溶出剤で溶出する画分を分離し、ついで１
で溶出する画分を透析し、透析内液を凍結乾燥して淡黄
褐色粉末（ＫＬ６）を得る。これを、再びＤＥＡＥ−セ
ファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶出剤としてＢ／
（Ａ＋Ｂ）が0.525 である溶出剤で溶出する画分を分離
し、ついで１で溶出する画分を透析し、透析内液を凍結
乾燥して淡黄褐色粉末（ＫＬ７）を得る。これをさらに
ＤＥＡＥ−セロファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶
出剤としてＢ／（Ａ＋Ｂ）が0.55である溶出剤で溶出す
る画分を得る。上記操作においてＢ／（Ａ＋Ｂ）が0.42
5 である溶出剤で溶出する工程は省いてもよい。得られ
た0.55の溶出剤で溶出する画分を透析し、透析内液を凍
結乾燥して白色ないし淡黄色粉末（ＫＬ８）を得る。本
発明の抗腫瘍剤はこの最終透析内液またはその濃縮物も
しくは乾燥物よりなるか、またはこれに必要に応じ常用
の医薬用担体を混合せしめることによって製造すること
ができる。
ＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶出剤と
して50M トリエタノールアミン−HCl (pH7.5) からなる
トリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M NaCl 含有50mMト
リエタノールアミン−HCl(pH7.5)からなる0.5M NaCl 含
有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ／（Ａ＋
Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶出剤で溶
出する画分を得る。この操作は具体的には次のようにし
て行うことができる。すなわち、ＫＬαをＤＥＡＥ−セ
ファロースを用いるＦＰＬＣに付し、Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が
0.425 である溶出剤で溶出する画分を分離し、ついで１
で溶出する画分を透析し、透析内液を凍結乾燥して淡黄
褐色粉末（ＫＬ６）を得る。これを、再びＤＥＡＥ−セ
ファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶出剤としてＢ／
（Ａ＋Ｂ）が0.525 である溶出剤で溶出する画分を分離
し、ついで１で溶出する画分を透析し、透析内液を凍結
乾燥して淡黄褐色粉末（ＫＬ７）を得る。これをさらに
ＤＥＡＥ−セロファロースを用いるＦＰＬＣに付し、溶
出剤としてＢ／（Ａ＋Ｂ）が0.55である溶出剤で溶出す
る画分を得る。上記操作においてＢ／（Ａ＋Ｂ）が0.42
5 である溶出剤で溶出する工程は省いてもよい。得られ
た0.55の溶出剤で溶出する画分を透析し、透析内液を凍
結乾燥して白色ないし淡黄色粉末（ＫＬ８）を得る。本
発明の抗腫瘍剤はこの最終透析内液またはその濃縮物も
しくは乾燥物よりなるか、またはこれに必要に応じ常用
の医薬用担体を混合せしめることによって製造すること
ができる。
【００１４】本有効成分の治療への適用については、注
射剤として使用することが好ましいが、経口、坐薬等の
剤系にして使用することもできる。注射剤としては皮下
の他、筋肉内、静脈内注射剤のいずれでもよく、懸濁
液、溶液もしくは使用時溶解させる粉末等の剤系が用い
られる。本発明の有効成分の投与量は患者の症状に応じ
て適宜選択されるが、一般に成人において１〜100mg/kg
を１日１〜数回に分け投与するのが好ましく、投与方法
としては皮下、筋肉内、静脈内もしくは患部への注射ま
たは経口によってなされるのが好ましい。
射剤として使用することが好ましいが、経口、坐薬等の
剤系にして使用することもできる。注射剤としては皮下
の他、筋肉内、静脈内注射剤のいずれでもよく、懸濁
液、溶液もしくは使用時溶解させる粉末等の剤系が用い
られる。本発明の有効成分の投与量は患者の症状に応じ
て適宜選択されるが、一般に成人において１〜100mg/kg
を１日１〜数回に分け投与するのが好ましく、投与方法
としては皮下、筋肉内、静脈内もしくは患部への注射ま
たは経口によってなされるのが好ましい。
【００１５】注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝液pH調節剤
（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩
化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安
息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等) 等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまた殺菌固体組成物として製造し、用時
滅菌水等に溶解して使用することもできる。経口投与剤
は胃腸器官による吸収に適した形に製剤する。錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤は常用の製薬補助
剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチ
ン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリド
ン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラク
トース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウ
ム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸
マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリ
カ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセ
ルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を
包含することができる。
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝液pH調節剤
（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤（塩
化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキシ安
息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル等) 等の
水以外の他の製薬補助剤を含有することができる。該製
剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物への殺菌剤
の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌することがで
きる。該製剤はまた殺菌固体組成物として製造し、用時
滅菌水等に溶解して使用することもできる。経口投与剤
は胃腸器官による吸収に適した形に製剤する。錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤は常用の製薬補助
剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチ
ン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリド
ン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラク
トース、スクロース、コーンスターチ、リン酸カルシウ
ム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸
マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリ
カ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセ
ルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を
包含することができる。
【００１６】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１培養 放射菌保存用寒天培地にて継代培養したストレプトマイ
セス・ハチジョウエンシスＨ−2609を放線菌増殖用培地
（組成：プロテオースペプトン1.0 ％、ポリペプトン
0.5％、塩化ナトリウム0.75％、無水グルコース 0.5
％、バクトビーフエキストラクト 0.3％、バレイショデ
ンプン2.0 ％）100ml に接種し、24℃、１〜２週間、振
盪培養した。培養液からの粗製画分 培養液５ｌを遠心分離して菌体を除き、上清液に50％塩
化亜鉛溶液を1/20量加え、4,000rpmで遠心分離して得ら
れる沈澱物に10％第二リン酸ナトリウム溶液を培養液量
の1/4 量加え溶解させた。次いで4,000rpmで遠心分離し
て沈澱物を除き、その上清液に４倍量のメタノールを加
え、得られた沈澱物を減圧乾燥させ、水に溶解し、凍結
乾燥させた。収量は27g であった。
る。 実施例１培養 放射菌保存用寒天培地にて継代培養したストレプトマイ
セス・ハチジョウエンシスＨ−2609を放線菌増殖用培地
（組成：プロテオースペプトン1.0 ％、ポリペプトン
0.5％、塩化ナトリウム0.75％、無水グルコース 0.5
％、バクトビーフエキストラクト 0.3％、バレイショデ
ンプン2.0 ％）100ml に接種し、24℃、１〜２週間、振
盪培養した。培養液からの粗製画分 培養液５ｌを遠心分離して菌体を除き、上清液に50％塩
化亜鉛溶液を1/20量加え、4,000rpmで遠心分離して得ら
れる沈澱物に10％第二リン酸ナトリウム溶液を培養液量
の1/4 量加え溶解させた。次いで4,000rpmで遠心分離し
て沈澱物を除き、その上清液に４倍量のメタノールを加
え、得られた沈澱物を減圧乾燥させ、水に溶解し、凍結
乾燥させた。収量は27g であった。
【００１７】精製 上記の物質を精製水に溶解させ、セロファンチューブに
入れ、外液を精製水として透析を行い、内液を凍結乾燥
して淡黄褐色粉末（ＫＬ１）約400mg を得た。この粉末
ＫＬ１を精製水に溶解し、硫酸アンモニウムを加えて、
硫酸アンモニウム濃度を60％として得られた沈澱物を精
製水に溶解、セロファンチューブに入れ、外液を精製水
として透析した。内液を凍結乾燥して淡黄褐色の粉末
（ＫＬ２）150mg を得た。次いで、この粉末をベロナー
ル緩衝液(pH8.0) に溶解し、可溶性澱粉を支持体として
ゾーン電気泳動を行い、陽極側に移動する画分を集め
た。この画分を水に溶かし、セロファンチューブに入
れ、外液を精製水として透析し、内液を凍結乾燥して淡
黄褐色の粉末（ＫＬ３）90mgを得た。粉末ＫＬ３を0.15
M 食塩含有0.05M リン酸緩衝液(pH7.0) に溶解し、セフ
ァデックスG100（ファルマシア製）カラムを通し、通過
液を透析した後、凍結乾燥して淡黄褐色の粉末（ＫＬ
α）35mgを得た。
入れ、外液を精製水として透析を行い、内液を凍結乾燥
して淡黄褐色粉末（ＫＬ１）約400mg を得た。この粉末
ＫＬ１を精製水に溶解し、硫酸アンモニウムを加えて、
硫酸アンモニウム濃度を60％として得られた沈澱物を精
製水に溶解、セロファンチューブに入れ、外液を精製水
として透析した。内液を凍結乾燥して淡黄褐色の粉末
（ＫＬ２）150mg を得た。次いで、この粉末をベロナー
ル緩衝液(pH8.0) に溶解し、可溶性澱粉を支持体として
ゾーン電気泳動を行い、陽極側に移動する画分を集め
た。この画分を水に溶かし、セロファンチューブに入
れ、外液を精製水として透析し、内液を凍結乾燥して淡
黄褐色の粉末（ＫＬ３）90mgを得た。粉末ＫＬ３を0.15
M 食塩含有0.05M リン酸緩衝液(pH7.0) に溶解し、セフ
ァデックスG100（ファルマシア製）カラムを通し、通過
液を透析した後、凍結乾燥して淡黄褐色の粉末（ＫＬ
α）35mgを得た。
【００１８】35mgのＫＬαをトリエタノールアミン−Ｈ
ＣＩ(pH7.5) 緩衝液に溶解し、ファルマシア社製のＦＰ
ＬＣクロマトグラフにセットした陰イオン交換カラムＦ
ＰＬＣ−ＤＥＡＥ−セファロースに通塔し、50mMトリエ
タノールアミン−ＨＣＩ(pH7.5) 緩衝液Ａと0.5M NaCl
含有50mMトリエタノールアミン−ＨＣＩ(pH7.5) 緩衝液
Ｂとの混合割合を変えた溶出剤を使用して分画を行っ
た。まず、緩衝液ＡとＢとの混合比Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.
425 の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ４Ａ）と混合比が１
の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ６）とに分離した。次
に、ＫＬ６について混合比0.525 の溶出剤で溶出する画
分（ＫＬ６Ａ）と混合比が１の溶出剤で溶出する画分
（ＫＬ７）とに分離した。次に、ＫＬ７について混合比
0.55の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ８）と混合比１の溶
出剤で溶出する画分（ＫＬ７Ｂ）とに分離した。これら
の画分は透析して低分子量成分を分離したのち、凍結乾
燥した。ＫＬ８は白色ないし淡黄色の粉末であり、収量
は1.3mg であった。また、ＫＬ６は淡黄褐色の粉末、Ｋ
Ｌ７は淡黄褐色の粉末であり、その収量はそれぞれ７m
g、3.5mg であった。各段階のクロマトグラムを図１〜
３に示す。図１はＫＬαの分画、図２はＫＬ６の分画、
図３はＫＬ７の分画のクロマトグラムである。
ＣＩ(pH7.5) 緩衝液に溶解し、ファルマシア社製のＦＰ
ＬＣクロマトグラフにセットした陰イオン交換カラムＦ
ＰＬＣ−ＤＥＡＥ−セファロースに通塔し、50mMトリエ
タノールアミン−ＨＣＩ(pH7.5) 緩衝液Ａと0.5M NaCl
含有50mMトリエタノールアミン−ＨＣＩ(pH7.5) 緩衝液
Ｂとの混合割合を変えた溶出剤を使用して分画を行っ
た。まず、緩衝液ＡとＢとの混合比Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.
425 の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ４Ａ）と混合比が１
の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ６）とに分離した。次
に、ＫＬ６について混合比0.525 の溶出剤で溶出する画
分（ＫＬ６Ａ）と混合比が１の溶出剤で溶出する画分
（ＫＬ７）とに分離した。次に、ＫＬ７について混合比
0.55の溶出剤で溶出する画分（ＫＬ８）と混合比１の溶
出剤で溶出する画分（ＫＬ７Ｂ）とに分離した。これら
の画分は透析して低分子量成分を分離したのち、凍結乾
燥した。ＫＬ８は白色ないし淡黄色の粉末であり、収量
は1.3mg であった。また、ＫＬ６は淡黄褐色の粉末、Ｋ
Ｌ７は淡黄褐色の粉末であり、その収量はそれぞれ７m
g、3.5mg であった。各段階のクロマトグラムを図１〜
３に示す。図１はＫＬαの分画、図２はＫＬ６の分画、
図３はＫＬ７の分画のクロマトグラムである。
【００１９】抗腫瘍活性 マウス白血病腫瘍細胞 P-388を減菌生理食塩水に懸濁
し、ＣＤＦ1 （BALB/c×DBA/2)マウス１群６匹に 106個
／マウス腹腔内移植した。薬剤は水溶液にして、腫瘍移
植後１日目から９日目まで９回腹腔内投与した。薬剤非
投与の対照群としては１０匹のマウスを当てた。効果の
判定は投与群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の各々の平均生存
日数を求め、T/C ％で表示した。結果を次表に示す。
し、ＣＤＦ1 （BALB/c×DBA/2)マウス１群６匹に 106個
／マウス腹腔内移植した。薬剤は水溶液にして、腫瘍移
植後１日目から９日目まで９回腹腔内投与した。薬剤非
投与の対照群としては１０匹のマウスを当てた。効果の
判定は投与群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の各々の平均生存
日数を求め、T/C ％で表示した。結果を次表に示す。
【００２０】
【表１】 マウス P-388白血病に対する薬剤の抗腫瘍活性 ─────────────────────────────── 薬 剤 投与量（mg/kg/day) T/C（％） ─────────────────────────────── ＫＬ６ ２．５ １２０ ＫＬ７ ２．５ １２０ １．２５ １２４ ＫＬ８ ２．５ １４３ １．２５ １２６ ０．６３ １１７ ０．３１ １０７ ───────────────────────────────
【図１】実施例１のＦＰＬＣによるＫＬ６の分離に関す
るクロマトグラムを示す。
るクロマトグラムを示す。
【図２】実施例１のＦＰＬＣによるＫＬ７の分離に関す
るクロマトグラムを示す。
るクロマトグラムを示す。
【図３】実施例１のＦＰＬＣによる最終有効成分ＫＬ８
の分離に関するクロマトグラムを示す。
の分離に関するクロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 1/06 Ｃ１２Ｒ 1:465） 7804−4Ｂ (72)発明者 河野 恵 東京都調布市多摩川５丁目３番地１ ネオ コーポ202 (72)発明者 笹津 備規 東京都日野市大字下田397番地の５ (72)発明者 野口 雅久 東京都八王子市南大沢５丁目７番地２− 501
Claims (4)
- 【請求項１】 ストレプトマイセス・ハチジョウエンシ
スの培養液からゾーン電気泳動法を含む分離手段によっ
て分離されたタンパク質画分ＫＬ３中に存在し、セファ
デックスＧ100 を用いるゲルクロマトグラフィーで通過
し、かつＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣにお
いて、溶出剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.
5M NaCl 含有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比
Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の
溶出剤で溶出する画分中に含まれる固形分を有効成分と
して含有する抗腫瘍剤。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス・ハチジョウエンシ
スの培養液より菌体を除き、菌体除去液に塩化亜鉛溶液
を加えて生ずる沈澱を採取し、これに第二燐酸ナトリウ
ム溶液を加えてpH7.0 〜9.4 となして抽出を行い、抽出
液に親水性有機溶媒を加え、生ずる沈澱を水に溶解した
後透析し、透析内液に硫酸アンモニウム溶液を加え、生
ずる沈澱を水に溶解した後透析し、透析内液をゾーン電
気泳動に付してタンパク質画分を採取し、これを透析
し、透析内液をゲルとしてセファデックスＧ100 を用い
るゲルクロマトグラフィーに付し、通過液を透析し、透
析内液をＤＥＡＥ−セファロースを用いるＦＰＬＣに付
し、溶出剤としてトリエタノールアミン緩衝液Ａと0.5M
NaCl 含有トリエタノールアミン緩衝液Ｂとの混合比Ｂ
／（Ａ＋Ｂ）が0.525 の溶出剤では溶出せず、0.55の溶
出剤で溶出する画分中に含まれる固形分を有効成分とす
る抗腫瘍剤。 - 【請求項３】 透析に代えて適宜限外濾過を用いる請求
項２の抗腫瘍剤 - 【請求項４】 請求項２における、溶出剤としてＢ／
（Ａ＋Ｂ）が0.55である溶出剤で溶出して得られる、溶
出液を透析するか、透析内液を必要に応じ濃縮もしくは
乾燥するか、または必要に応じ最終透析内液もしくは濃
縮もしくは乾燥物と常用の医薬用担体とを混合すること
を特徴とする抗腫瘍剤の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5064671A JPH06256200A (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 抗腫瘍剤及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5064671A JPH06256200A (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 抗腫瘍剤及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256200A true JPH06256200A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13264883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5064671A Pending JPH06256200A (ja) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | 抗腫瘍剤及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06256200A (ja) |
-
1993
- 1993-03-01 JP JP5064671A patent/JPH06256200A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050809 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051206 |