JPH0630613B2 - インシュリンの製造方法 - Google Patents

インシュリンの製造方法

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JPH0630613B2
JPH0630613B2 JP60116297A JP11629785A JPH0630613B2 JP H0630613 B2 JPH0630613 B2 JP H0630613B2 JP 60116297 A JP60116297 A JP 60116297A JP 11629785 A JP11629785 A JP 11629785A JP H0630613 B2 JPH0630613 B2 JP H0630613B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はインシュリンの製造方法に関する。
〔発明の背景〕
従来、インシュリンは、二つの鎖を酸化法で結合させ、
これにより還元された鎖の６個のシステインスルフヒド
リル基（Ａ鎖において４個、Ｂ鎖において２個）をジス
ルフィド結合に変えることによって合成する（合成Ａ及
びＢ鎖から）か、又は再合成されてきた（天然Ａ鎖及び
Ｂ鎖から）。この方法によって、ジスルフィド結合は、
大部分無作為に形成され、このことは、それぞれシステ
イン基Ａ−６とＡ−１１、Ａ−７とＢ−７、Ａ−２０と
Ｂ−１９の間に正確に配置されたジスルフィド架橋を有
するインシュリンの収率は極めて低いことを意味する。
インシュリンの生物学的前駆物質としてプロインシュリ
ンが発見されたことにより、全体的に還元された線状プ
ロインシュリンのＡ−及びＢ−ポリペプチド部分（それ
ぞれインシュリンのＡ鎖及びＢ鎖に対応する部分）を酸
化により結合させてジスルフィド結合の無作為化を著し
く少なくし、遊離のＡ鎖及びＢ鎖の組合せに比べて正確
に折り畳まれたプロインシュリンが著しく高い収率で得
られることが判った〔シュタイナー(D.F.Steiner)ら：P
roc.Nat.Acad.Sci.、６０巻（１９６８）、６２２
頁〕。方法を調製用規模で可能にするには低すぎるプロ
インシュリン濃度でしか、高い収率は得られなかったと
しても、プロインシュリンのＢ−Ｃ−Ａポリペプチド配
列のＣ−部分（即ち、結合ペプチド）の機能、即ち、６
個のシステイン残基をプロインシュリンへの正確な酸化
に好ましい空間位置にもたらす作用は明らかに証明され
た。
形成されたプロインシュリンは、結合ペプチドを酵素に
よって除去しうる〔ケムラー（Ｗ．Kemmler）ら著：J.B
iol.Chem.２４６巻（１９７１）、６７８６頁〕点でイ
ンシュリンの生体外前駆物質として作用する。
その後、Ｃ−ペプチドより短い結合基を有し、特殊な酵
素又は化学的分解部位によって両方の末端で作用を受け
るプロインシュリン様化合物｛いわゆるミニプロインシ
ュリン〔ウォルマー(A.Wollmer)ら著、ホップ−サイラ
ー(Hoppe-Seyler)のZ.Physiol.Chem.３５５巻（１９７
４年）、１４７１〜１４７６頁及びディートリッヒ・ブ
ランデンブルク(Dietrich Brandenburg)ら著、ホップ−
サイラーのZ.Physiol.Chem.３５４巻（１９７３年）、
１５２１〜１５２４頁〕｝も、インシュリン前駆物質と
して作用する。
生合成インシュリン、特にヒトのものと同一のものを提
供する努力は、合成インシュリンと同じ方法にしたがっ
ていた。インシュリンＡ鎖及びＢ鎖を、別々の宿主生体
中で表現させ、次いで、前記のように結合させた〔チャ
ンス(R.E.Chance)ら：ダイアベーテス・ケア(Diabetes
Care)４巻（１９８２）、１４７頁〕。微生物を形質転
換させて、プリプロインシュリン又はプロインシュリン
をコードするベクターをクローニングし、プリプロイン
シュリン又はプロインシュリンをそのまま分泌させる
〔ギルバート(W.Gilbert)らの欧州特許出願公告第６６
９４号公報〕か、又はハイブリッド遺伝子産生物として
細胞内に蓄積させた〔ゲッデル(D.V.Goeddel)らの欧州
特許出願公告第５５９４５号公報〕。ミニプロインシュ
リン法も試みられた（ゲッテルの前掲文献）。
Ａ鎖及びＢ鎖を別々の発酵工程で調製し、次いで、それ
らの鎖を結合させることは、本来、実施不可能である。
二重発酵の不便は、プロインシュリン又はミニプロイン
シュリン調製法を選択することによって克服することが
できる。しかしながら、生合成インシュリン前駆物質と
してプロインシュリンを使用することは、若干の欠点を
伴う。プロインシュリンは発酵液中に分泌されようと、
又は宿主生体内に、恐らくハイブリッド遺伝子産生物と
して細胞内に蓄積されようと、実質的に無作為化された
ジスルフィド結合を含むらしい。このような“スクラン
ブル”生成物を正確に折り畳まれたプロインシュリンに
再び折り畳むことは、直接に実施するか〔ガットナー
(H.G.Gattner)らのオランダ特許出願第４５２３／８３
号明細書〕又は一本鎖ヘキサ−Ｓ−スルホネートを経て
実施する〔ヒル(F.B.Hill)：欧州特許出願公告第３７２
５５号公報〕。再折り畳み工程は、通常、ある程度の重
合、及び従って、回収の間煩雑な精製工程を使用する不
便を伴う。
更に、プロインシュリン型のインシュリン前駆物質は、
宿主細胞内又は発酵液中への分泌により酵素分解を受け
やすい。酵母においては、ヒトプロインシュリンは特に
２つの二塩基性配列(Arg31-Arg 32及びLys64-Arg65)の
ところで酵素分解に対して鋭敏である。明らかに、これ
らの分解は、Ｓ−Ｓ架橋を形成する前に起こって、Ｃ−
ペプチド、Ａ鎖及びＢ鎖を形成する。
〔発明の目的及びその要旨〕
本発明の目的は、Ａ部分とＢ部分との間のジスルフィド
架橋を大部分正しく配置させ、従来公知の生合成インシ
ュリン前駆物質より蛋白分解による劣化に対して著しく
抵抗性の生合成インシュリン前駆物質を産生させること
によって、前記欠点を回避することにある。
GlyA1からAsnA21までの完全なＡ鎖に続くPheB1からLys
B29までの短縮されたインシュリンＢ鎖からなる１本鎖
インシュリン前駆物質Ｂ（１−２９）−Ａ−（１−２
１）は公知である〔ジャン・マーカッセン(Jan Markuss
en)、“プロテオリティック・デグラデイション・オブ
・プロインシュリン・アンド・オブ・ザ・インターミデ
ィエイト・フォームス(Proteolytic degradation of pr
oinsulin and of the intermediate forms)”：プロイ
ンシュリン、インシュリン及びＣ−ペプチドに関するシ
ンポジウムの講演集、徳島、１９７８年７月１２〜１４
日、編集者：Ｓ．馬場ら〕。このインシュリン前駆物質
Ｂ（１−２９）−Ａ−（１−２１）は、ポルシンインシ
ュリンから半合成法で製造される。、まず、インシュリ
ンＢ（１−２９）及びＡ（１−２１）鎖を製造し、結合
させて、線状ペプチドＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）
を形成させた。ヘキサチオール形のこの化合物を生体外
で酸化して１本鎖デス−（Ｂ３０）インシュリン分子を
作った。
〔本発明の構成および効果〕
本発明は、前記１本鎖インシュリン前駆物質及びＢ（１
−２９）鎖のカルボキシル末端とＡ（１−２１）鎖のア
ミノ末端と結合させる架橋鎖を有する誘導体は、このよ
うなインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ−配列で
形質転換した酵母菌株を培養すると、高い収率でかつジ
スルフィド架橋が正しく配置されて表現されるという意
外な発見に基づくものである。
本発明の第一の面によれば、次の一般式（Ｉ）： Ｂ（１−２９）−（Ｘｎ−Ｙ）ｍ−Ａ（１−２１）
（Ｉ） 〔式中Ｘｎはｎ個の天然アミノ酸残基を有するペプチド
鎖を表し、ＹはLys又はArgを表し、ｎは０〜33の整数を
表し、ｍは０又は１を表し、Ｂ（１−２９）はPheB1か
らLysB29までのヒトインシュリンの短縮されたＢ−鎖を
表し、Ａ（１−２１）はヒトインシュリンのＡ鎖を表す
が、ペプチド鎖−Ｘｎ−Ｙ−は２個の隣接する塩基性ア
ミノ酸残基（即ち、Lys又はArg）を含まないものとす
る〕を有するペプチド鎖を含むインシュリン前駆物質を
コードする配列を含んでなるＤＮＡ配列が提供される。
前記の一般式（Ｉ）の好ましいインシュリン前駆物質
は、Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）である、即ち一般
式（Ｉ）においてｍ＝０の化合物及びＢ（１−２９）鎖
とＡ（１−２１）鎖との間に相対的に短い架橋鎖を有す
る化合物である。
ｍ＝１の場合、ｎは好ましくは１〜３３、更に好ましく
は１〜１５、更に好ましくは１〜８若しくは１〜５、最
も好ましくは１〜３若しくは１〜２である。Ｘは好まし
くはAla、Ser及びThrからなる群から選択され、個々のＸ
は同一又は異なる。このような好ましい化合物の例はＢ
（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-
Ａ（１−２１）である。
本発明の第二の面によれば、酵母中で一般式（Ｉ）のイ
ンシュリン前駆物質をコードする配列を含むＤＮＡ−配
列を表現しうる複製可能の表現ベヒクルが提供される。
表現ベヒクルは、宿主微生物中で複製可能又は宿主生物
の染色体中に組み込み可能なプラスミドであってよい。
使用するベヒクルは、所望のＤＮＡ−配列の反復配列
（それぞれ、選択的分解部位で分離される）の表現につ
いてコードすることができる。
本発明の第三の面によれば、インシュリン前駆物質を表
現しうる表現ベヒクルを少なくとも１種含む形質転換体
酵母菌株を適当な栄養培地中で培養し、次いでインシュ
リン前駆物質を単離する一般式（Ｉ）のインシュリン前
駆物質の製造方法が提供される。
本発明の第四の面によれば、新規ヒトインシュリン前駆
物質が提供される。このような新規ヒトインシュリン前
駆物質は、下記の一般式(II)： Ｂ（１−２９）−Ｘｎ−Ｙ−Ａ（１−２１）(II) 〔式中種々の記号は前記の定義を有する〕を有する。好
ましい新規インシュリン前駆物質はＢ（１−２９）−Se
r-Lys-Ａ（１−２１）及びＢ（１−２９）−Ala-Ala-Ly
s-Ａ（１−２１）である。
本発明の第五の面によれば、酵母中で前記インシュリン
前駆物質をコードする配列を含んでなるＤＮＡ−配列を
表現可能な表現ベヒクルで形質転換された酵母菌株が提
供される。
インシュリン前駆物質を生ずる付加的蛋白質を用いてイ
ンシュリン前駆物質を表現させることもできる。付加的
蛋白質は、例えば内因性酵素による生体内分解に対して
インシュリン前駆物質を保護するか、又は所望の蛋白質
をペリプラスム間隙中に移動させ、最終的には細胞壁を
通って培地中に移動させるのに必要な情報を与える作用
を有することができる。
付加的蛋白質は、微生物自体によって又はその後の酵素
若しくは化学的分解によって付加的蛋白質を後に脱離さ
せることのできるＢ（１−２９）鎖のＮ−末端に隣接す
る選択的分解部位を含む。
従って、本発明は、前記のインシュリン前駆物質をコー
ドするＤＮＡ−配列を含み、該配列は更にインシュリン
前駆物質をコードし、インシュリン前駆物質のＢ（１−
２９）鎖のＮ−末端に隣接する選択的分解部位を含む付
加的アミノ酸−配列をコードする配列により上方に位置
する付加的ＤＮＡ−配列を含んでなる。
本発明の好ましい実施態様によれば、付加的アミノ酸配
列は、インシュリン前駆物質のＢ（１−２９）鎖のＮ−
末端に隣接する基本アミノ酸を少なくとも１個含む。
インシュリン前駆物質が酵母中に表現される場合、付加
的アミノ酸配列はインシュリン前駆物質のＢ（１−２
９）鎖のＮ−末端に隣接する２個の基本性アミノ酸（例
えばLys-Lys、Arg-Arg、Lys-Arg、Arg-Lys）を含むこと
ができ、酵母は基本アミノ酸と前駆物質との間でペプチ
ド結合を分解することができる。所望の蛋白質に隣接す
るGlu-Ala又はAsp-Ala分解部位は、酵母によって産生さ
れるジペプチダーゼ酵素によって酵母自体による付加的
アミノ酸配列を分離することを可能にする。
前駆物質のＢ（１−２９）鎖に結合したアミノ酸配列を
有するインシュリン前駆物質が分泌されるが、このアミ
ノ酸配列は不必要なアミノ酸配列をその後に脱離するた
めＢ（１−２９）鎖に隣接する選択的分解部位を含むイ
ンシュリン前駆物質がメチオニンを含まない場合には、
所望の蛋白質に隣接するメチオニンのところでの臭化シ
アン分解が行われるであろう。同様に、所望の蛋白質に
隣接するアルギニン−及びリジン−分解部位はトリプシ
ン様プロテアーゼで分解することができる。
分泌の目的で、インシュリンの前駆物質をコードするＤ
ＮＡ−配列は、シグナルペプチドについてコードする付
加的ＤＮＡ−配列に融合することができる。シグナルペ
プチドは、細胞から表現された蛋白質産生物を分泌する
間に形質転換体微生物によって脱離され、所望の産生物
を一層簡単に確実に単離する。分泌された産生物はイン
シュリン前駆物質であるか、又は前記のように後に除去
すべき付加的Ｎ−末端アミノ酸配列を含むことができ
る。
分泌は、表現ベヒクル中に酵母MFα１リーダー配列〔ク
ルジャン(Kurjan,J.)及びヘルスコウィツ(Herskowitz,
I.)、セル(Cell)、３０巻（１９８２）９３３−９４３
頁〕を含むことによって行われ、本発明の更に好ましい
実施態様によれば、インシュリン前駆物質をコードする
配列より上方に配置された付加的アミノ酸配列は、酵母
MFα１リーダーをコードする配列又はその部分を含む。
所望のＤＮＡ−配列の表現は、宿主生体中に所望の蛋白
質を表現するため所望の蛋白質産生物をコードするＤＮ
Ａ−配列に対して正しく配置されたプロモータ配列の制
御下にあるであろう。宿主生体に固有の遺伝子からのプ
ロモータを使用するのが好ましい。所望の蛋白質に関す
るＤＮＡ−配列には、転写終了暗号配列、好ましくは宿
主生体に対して固有の遺伝子からの終了暗号配列が続
く。宿主生体として酵母を使用する場合、プロモータ及
び終了暗号配列は、それぞれトリオースホスファーゼイ
ソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のプロモータ及び終了暗号
であるのが好ましい。
他のプロモータ、例えばホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ１）−及びMFα１−プロモータを利用すること
もできる。
本発明は、更に、前記の一般式（Ｉ）のインシュリン前
駆物質をコードするＤＮＡ配列を含む複製可能な表現ベ
ヒクルで酵母菌株を形質転換させ、形質転換された酵母
菌株を適当な栄養培地中で培養し、インシュリン前駆物
質を培地から回収し、ヒトインシュリンに生体外で変え
ることによってヒトインシュリンを製造する方法を含
む。
本発明によるインシュリン前駆物質を、オランダ特許出
願第５７４／８０号明細書（その開示内容を参考として
本明細書に含める）に記載されているように、トリプシ
ン又はトリプシン誘導体の存在でＬ−スレオニンエステ
ルでペプチド転移させ、次いで、公知方法でヒトインシ
ュリンのスレオニンエステルをヒトインシュリンに変え
ることによって成人インシュリンに変えることができ
る。
Ｂ（１−２９）鎖のＮ−末端に隣接する付加的アミノ酸
配列を有するインシュリン前駆物質を分泌する場合に
は、このようなアミノ酸配列は、ペプチド転移の前に生
体外で除去するか又はＢ（１−２９）鎖のＮ−末端に隣
接する基本アミノ酸を少なくとも１個含むべきである。
それというのは、トリプシンはペプチド転移の間に基本
アミノ酸とPheのアミノ基との間のペプチド結合を開裂
するからである。
添付図面は、本発明の好ましい実施態様を示すものであ
る。
第１図はプラスミドpMT３４４の製造を示し、第２図は
プラスミドpMT４７５の製造を示し、第３図はプラスミ
ドpMT２１２の製造を示し、第４図はプラスミドpMT４７
９の製造を示し、第５図はプラスミドpMT３１９の製造
を示し、第６図はプラスミドpMT５９８の製造を示し、
第７図はプラスミドpMT６１０の製造を示し、第８図は
プラスミドpT５の製造を示し、第９図はプラスミドpMT
６３９の製造を示す。
図面及び以下の説明の部分において、Ｂ（１−２９）の
代わりに表現Ｂ′を使用し、Ａ（１−２１）の代わりに
Ａを使用する。従って、Ｂ′Ａは表現Ｂ（１−２９）−
Ａ（１−２１）に等しい。
〔詳細な説明〕
１．ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａについてコードす
る遺伝子の製造 ヒトの膵臓からの精製した全ＲＮＡ〔チルウィン(Chirg
win,J.M.)、プルジビラ(Przybyla,A.E.)、マクドナルド
(McDonald,R.J.)及びルッター(Rutter,W.J.)、バイオケ
ミストリィ(Biochemistry)１８巻（１９７９）５２９４
〜５２９９頁〕をＡＭＶ逆転写酵素及び第一の鎖プライ
マーとしてｄ（ＧＣＴＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣ）
を用いて逆転写した〔ボェル(Boel,E.)、ブースト(Vuus
t,J.)、ノリス(Norris,F.)、ノリス(Norris,K.)ウィン
ド(Wind,A.)、レーフェルド(Rehfeld,J.F.)及びマーカ
ー(Marcker,K.A.)著、Proc.NatIAcad.Sci.USA８０、
（１９８３）２８６６〜２８６９〕。ヒトプロインシュ
リンｃＤＮＡの調製用尿素−ポリアクリルアミドゲル精
製を行った後、第二の鎖をこの鋳型上でＤＮＡポリメラ
ーゼの大きい断片及び第二の鎖プライマーとしてｄ（Ｃ
ＡＧＡＴＣＡＣＴＧＴＣＣ）を用いて合成した。Ｓ１核
酸の消化後、ヒトプロインシュリンｄｓ．ｃＤＮＡをポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、末端転
移酵素で末端を処理し、Ｅ．コリー(coli)においてpBR
３２７〔ソルベロン(Sorberon)ら著、ジーン(Gene)９
巻、（１９８０）、２８７〜３０５頁〕上のPstＩ部位
のクローニングした。ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ
をコードする遺伝子を含むプラスミドを保有する正しい
クローンを、制限エンドヌクレアーゼ分析によって組換
え体から同定し、ヌクレオチド配列分析によって確認し
た〔マクサム(Maxam,A.)及びギルバート(Gilbert,W.)
著、メソッヅ・イン・エンツィモロジィ(Methods in En
zymology)、６５巻（１９８０）、４９９〜５６０頁、
サンガー(Sanger,F.)、ニックレン(Nicklen,S.)及びク
ールソン(Coulson,A.R.)、Proc.Matl.Acad.Sci.USA７４
巻、（１９７７）５４６３〜５４６７頁〕。
２．ヒトインシュリンの前駆物質についてコードする遺
伝子の製造 ヒトインシュリンのＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）を
コードする遺伝子を、環状１本鎖Ｍ−１３バクテリオフ
ァージベクター中に挿入されたＣ−ペプチドコード領域
におけるフレーム欠失の際に７５bpを有するヒトインシ
ュリン配列の部位特異性突然変異によって製造した。Ｍ
１３鋳型に化学的に合成した１９−マー欠失プライマー
をアニールした変形方法を使用した〔Ｋ．ノリスら著、
Nucl.Acids.Res.１１巻（１９８３）５１０３〜５１１
２頁〕。短い酵素伸長反応の後、“ユニバーサル”１５
−マーＭ１３ジデオキシ配列プライマーを添加し、次い
で、酵素による伸長及び結合を行った。２本鎖制限断片
(Bam H1-HindIII)を部分的に２本鎖の環状DNAから切断
し、BamHI及びHindIIIを用いてPBr３２２中に結合させ
た。
従って、Ｍ−１３バクテリオアージ中にMFα１−Ｂ−Ｃ
−Ａをコードするフラグメントを挿入し、それぞれ化学
的に合成した３０−マー及び２７−マー欠失プライマー
並びに前記の“ユニバーサル”１５−マーＭ１３ジデオ
キシ配列プライマーでヒトプロインシュリン配列を部位
特異性突然変異を起こさせることによって、Ｂ（１−２
９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）及びＢ（１−２９）
−Ser-Lys-Ａ（１−２１）を作った。２本鎖制限断片
（Xbal-EcoR １）を部分的に２本鎖の環状ＤＮＡから切
断し、それぞれpUC１３及びpT５に結合させた。E.コリ
ー(coli)の形質転換及び再形質転換によってＢ（１−２
９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）をコードする遺伝子
を含むプラスミドpMT５９８及びＢ（１−２９）−Ser-L
ys-Ａ（１−２１）をコードする遺伝子を含むpMT６３０
を保有する被形質転換体を同定した。
前記と同様の方法で、Ｍ１３ｍｐ１１バクテリオファー
ジにＭＦα１−Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）をコー
ドする断片を挿入し、化学的に合成した４６−マー欠失
プライマー（５′−ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＴＡＡＡ
ＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＣＡ
ＴＴＧＴＧ−３′）及び“ユニバーサル”プライマーで
Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）配列の部位特異性突然
変異を起こさせることによって、Ｂ（１−２９）−Thr-
Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-Ａ（１−２１）を作
った。また、同様の操作でＢ（１−２９）−Thr-Arg-Gl
u-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-
Gly-GlY-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Le
u-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Ａ（１−２１）をコードす
る遺伝子を製造した。
３．プラスミドの構成 ヒトインシュリン（Ｂ′Ａ）のＢ（１−２９）−Ａ（１
−２１）をコードする遺伝子をpMT３１９から制限断片
として単離し、ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩｐ）〔アル
バー(T.Alber)及びＧ．川崎著、サッカロミセス・セレ
ビジエ (Saccharomyces cerevisiae)のトリオースホスフェート
イソメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、J.Mol.Applie
d Genet.１巻（１９８２）４１９〜４３４頁〕、MFα１
リーダー配列〔カージャン(J.Kurjan)及びヘルスコウィ
ツ(Herskowitz)著、酵母フェロモン遺伝子の構造：推定
のα−ファクターは完成α−ファクターの４種の縦列コ
ピーを含む。セル(Cell)、３０巻（１９８２）９３３〜
９４３頁〕及びＳ．セレビジエ（Ｓ．cerevisiae）（Ｔ
ＰＩＴ）のＴＰＩからの転写終了配列についてコードす
る断片と結合させた。これらの断片は、Ｂ′Ａをコード
する遺伝子について高い割合の転写を確実にする配列を
提供し、また、Ｂ′Ａを分泌路に極在化させ、場合によ
り増殖培地中に排出することのできる予備配列を提供す
る。Ｂ′Ａに関するこの表現単位（ＴＰＩｐ−MFα１リ
ーダー−Ｂ′Ａ−ＴＰＩＴ）を次に、酵母２μ起原の複
製及び選択可能のマーカーLEU２を含むプラスミドベク
ター上に置いてpMT３４４、即ちＢ′Ａについての酵母
表現ベクターを作った。
酵母中のα−ファクターの生体内突然変異の間にMFα１
リーダーペプチドの最後の（Ｃ−末端）の６個のアミノ
酸(Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)をα−ファクター前駆動
物質から、Lyr-Arg配列を認識するエンドペプチダーゼ
及びGlu-Ala基を除去するアミノジペプチダーゼの連続
作用によって除去する〔ジュリウス(Julius,D)ら著、セ
ル(Cell)３２巻（１９８３）８３９〜８５２頁〕。酵母
アミノジペプチダーゼの必要を排除するため、ＭＦα１
リーダーのＣ−末端Glu-Ala-Glu-Alaについてコードす
る配列を生体外突然変異により除去した。生ずる酵母表
現プラスミドpMT475は、ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー
（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala）−Ｂ′Ａ−ＴＰＩＴにつ
いてコードする挿入部を含む。
好ましい構成においては、修飾された表現単位は、単に
増殖培地中のグルコースの存在によって選択されうる安
定な高コピー数酵母プラスミドＣＰＯＴ（ＡＴＣＣNO.
３９６８５）に転移させた。Ｂ′Ａについての、生ずる
酵母表現ベクターをpMT４７９と番号を付けた。
MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala）−Ｂ（１
−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）をコードする断
片をpMT５９８から制限断片として単離し、ＴＰＩプロ
モーター及びＴＰＩ終了暗号についてコードする断片と
結合させ、前記の高コピー数酵母プラスミドＣＰＯＴに
転移させた。Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２
１）についての、生ずる表現ベクターをpMT６１０と番
号を付けた。
挿入ＴＰＩｐ−MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-
Ala）−Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）−Ｔ
ＰＩＴを含むフラグメントをpMT６３０から制限断片と
して単離し、ＣＰＯＴに転移させた。Ｂ（１−２９）−
Ser-Lys-Ａ（１−２１）についての、生ずる酵母表現ベ
クターをpMT６３９と番号を付けた。
挿入ＴＰＩｐ−MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-
Ala）−Ｂ（１−２９）−Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu
-Gln-Lys-Ａ（１−２１）−ＴＰＩＴを含む断片をＣＰ
ＯＴのSph1-BamH I中に挿入されたPBr３２２のSph1-Bam
H I断片を含むＣＰＯＴ誘導体である高コピー数酵母プ
ラスミドＣＰＯＴ中に挿入した。Ｂ（１−２９）−Thr-
Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-Ａ（１−２１）につ
いでの、生ずる酵母表現ベクターをｐ１１２６と番号を
付けた。
４．形質転換 プラスミドpMT３４４及びpMT４７５を、ヒンネン(Hinne
n)らによって記載されたように〔A.ヒンネン、ヒックス
(J.B.Hicks)及びフィンク(G.R.Fink.酵母の形質転換、P
roc.Nat.Aca.Sci.７５（１９７８）１９２９頁〕ロイシ
ンプロトトロフィについて選択することによってＳ．セ
レビジエ(cerevisiae)leu２突然変異体に形質転換し
た。
プラスミドpMT４７９、pMT６１０、pMT６３９及びｐ１
１２６を、グルコースでの生育について選択することに
よってＴＰＩ遺伝子中の欠失を有するＳ．セレビジエ(c
erevisiae)菌株に形質転換した。このような菌株は、通
常、唯一種の炭素源としてグルコースでは増殖できず、
ガラクトースラクテート培地上で極めて緩徐に生育す
る。この欠失は、Ｓ．セレビジエ(cerevisiae)leu２遺
伝子で上記遺伝子の大部分を欠失し、置換することによ
って得られるトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝
子中の突然変異による。生育不全であるため、ＴＰＩに
ついてコードする遺伝子を含むプラスミドについて強力
な選択があるpMT４７９は、pMT４７９についてコードす
る遺伝子は、シゾー・ポンベ(Schizo/pombe)ＴＰＩ遺伝
子を含む。
５．酵母におけるヒトインシュリン前駆物質の表現 インシュリン標準品の代わりに、問題のインシュリン前
駆物質標準品を使用する以外は、ヘディング(Heding,
L.)〔ダイアベートロジア(Diabetologia)、８巻２６０
〜２６６頁１９７２年〕によって記載されたようにし
て、インシュリンについてラジオイムノアッセイによっ
てヒトインシュリン型の表現産生物を測定した。標準品
の純度は、ＨＰＬＣで測定して約９８％であり、標準品
中のペプチドの現実の濃度は、アミノ酸分析によって測
定した。形質転換された酵母菌株中の免疫反応性ヒトイ
ンシュリン前駆動物質の表現濃度を第１図にまとめる。
表現産生物の単離及び特性を例７〜９及び１２〜１３に
示す。
６．ヒトインシュリンのＢ３０エステルへのヒトインシ
ュリン前駆物質の変換 ヒトインシュリンエステルへのヒトインシュリン前駆物
質の変換は、逆相でＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフ
ィー）によって定量的に行うことができる。４×３００
mmの“ミューボンダパック（μBondapak）Ｃ１８カラ
ム”(Waters Ass.)を使用し、0.２Ｍの硫酸アンモニウ
ム（硫酸で3.５のpH値に調節）を含み、２６〜５０％の
アセトニトリルを含む緩衝液を用いて溶離を実施した。
最適アセトニトリル濃度は、インシュリン前駆物質から
どのエステルを分離したいかに左右される。ヒトインシ
ュリンメチルエステルの場合には、約２６％（ｖ／ｖ）
のアセトニトリルで分離が達成される。
ＨＰＬＣカラムに適用する前に、１０容量のアセトンを
添加して、反応混合物中の蛋白質を沈澱させた。沈澱を
遠心分離によって単離し、真空乾燥し、１Ｍ酢酸に溶か
した。
実験の部 （実施例） 例１ Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリンについて
コードする遺伝子の構成 材料及び方法 “ユニバーサル”１５−マーＭ１３ジデオキシ配列プラ
イマーｄ（ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ）、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ及び制限酵素は、ニュー・イングランド
・バイオラブス(New England Biolabs)から得た。ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ“クレナウ・フラグメント(Klenow fr
agment)”及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｐ−
Ｌバイオケミカルス(Biochemicals)から購入した。（γ
−Ｐ）−ＡＴＰ（７５００Ci／ミリモル）は、ニュウ・
イングランド・ニュウクリア(New England Nuclear)か
ら得た。オリゴヌクレオチド合成のための支持体は、バ
チェム(Bachem)からのアミノメチル化され、１％架橋さ
れたポリスチレンビードに３′−Ｏ−スクシニル基を介
して結合された５′−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ２−イ
ソブチリルデオキシグアノシンであった。
Ｍ13 mp 10 insHXΔPstファージの構成 ｐ２８５から単離した２８４bpの大きいプロインシュリ
ンをコードするHindIII−XbaI断片をHindIII−XbaIで切
断したＭ13 mp 10 RFにクローニングすることによって
Ｍ13 mp 10誘導ファージmp 10 insHXを作った。Ｍ13 mp
10RFは、ウィスコンシン州ミルウォキーのP-Lバイオケ
ミカルス社(P-L Biochemicals Inc.)から入手しうる
（カタログNO.1541）。
完全PstI消化、次いでE.コリー(coli)JM103の結合及び
形質転換によってmp 10 insHX,RFからＭ13 mp 10 insHX
ΔPstを作った。生ずるファージは、Ｃ−ペプチドをコ
ードする領域でフレーム欠失に７５の塩基対を有するヒ
トプロインシュリンをコードする配列を保有する。１本
鎖ファージを記載されているようにして製造した〔メッ
シングMessing,J.)及びビエイラ(Vieira,J.)、(1982)、
ジーン(Gene)１９巻２６９〜２７６頁〕。
オリゴデオキシリボヌクレオチド合成 １９−マー欠失プライマーｄ（ＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧ
ＧＣＡＴＴＧＴＧ）を、１％架橋されたポリスチレン支
持体上でトリエステル法によって合成した〔Ｈ．伊藤、
Ｙ．池、Ｓ．生田及びＫ．板倉著（１９８２）Nucl.Aci
ds Res.10、1755〜1769〕。ポリマーを短いカラムに充填
し、溶剤及び試薬をＨＰＬＣポンプ及びコントロールモ
ジュールを用いて半自動的に供給した。保護基を除去し
た後に、リクロソーブ(LiChrosorb)RP１８カラム〔クロ
ムパック(Chrompack)｛フリッツ(Fritz,H.-J.)ベラガジ
ェ(Belagaje,R.)、ブラウン(Brown,E.L.)、フリッツ(Fr
itz,R.H.)、ジョーンズ(Jones,R.A.)、リース(Lees,R.
G.)及びコーラナ(Khorana,H.G.)、(1978)、バイオケミ
ストリィ(Biochemistry)１７巻１２５７〜１２６８頁〕
上でＨＰＬＣによってオリゴヌクレオチドを精製した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドの５′−３２Ｐ−標識 ５０mMのトリス−HCl、pH9.５、１０mMのMgCl2、５mMの
ＤＴＴ、0.４％のグリセロール、１２０pmoleのＡＴ
Ｐ、５０μCiの（γ−32Ｐ）−ＡＴＰ（１０pmole）、
１２０pmoleのオリゴヌクレオチド及び３０単位のＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応混合物６０μ中
で１９−マーを５′−末端で標識した。反応を３７℃で
３０分実施し、１００℃で３分加熱することによって終
了した。標識したオリゴヌクレオチドをpH7.５の0.０５
Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩中でセファデックス
(Sephadex)Ｇ５０超微細品のカラム（１×８cm）上でク
ロマトグラフィーすることにより未反応の（γ−
３２Ｐ）−ＡＴＰから分離した。
コロニーのハイブリッド化のため、記載されているよう
な“コールド”ＡＴＰ〔ボエル(Boel,E.)、ブースト(Vu
ust,J.)、ノリス(Norris,F.)、ノリス(Norris,K.)、ウ
ィンド(Wind,A.)、レーフェルド(Rehfeld,J.)及びマー
カー(Marcker,K.)(1983)、Prpc.Natl.Acad.Sci.USA８
０、２８６６〜２８６９頁〕を添加せずにオリゴヌクレ
オチドを標識した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドをプライマーとするＤ
ＮＡの合成 １本鎖Ｍ13 mp 10 insHXΔPst(0.4pmole)を２０μの
５０mMのNaCl、２０mMのトリス−HCl、pH7.５、１０mM
のMgCl2及び１mMのＤＤＴ中の１９−マー５′−
（32Ｐ）−標識オリゴデオキシリボヌクレオチドプライ
マー（１０pmole）とともに５５℃で５分間インキュベ
ートし、１１℃で３０分アニールした。次に、それぞれ
2.２mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２
０mMのトリス−HCl、pH7.５、１０mMのMgCl2、５０nMの
NaCl及び１mMのＤＤＴからなるｄ−ＮＴＰ−混合物９μ
を添加し、続いてＥ．コリー(coli)ＤＮＡポリメラー
ゼＩ〔クレナウ(Klenow)〕７単位を添加した。混合物を
１１℃で３０分保持し、６５℃で１０分加熱した。ジデ
オキシ配列に関する１５−マーユヌバーサルプライマー
(4pmole)を添加し、混合物を更に１分６５℃で加熱し
た。１１℃に冷却した後、２０mMのトリス−HCl、pH7.
５、１０mMのMgCl2、１０mMのＤＴＴ、それぞれ0.８mM
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、2.４mMの
ＡＴＰ及び１０３単位のＴ４リガーゼを含む溶液２６μ
を添加し、次いで9.５単位のＥ．コリー(coli)ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレナウ）を添加した。混合物の最終
容量は６４μであった。１１℃で３時間インキュベー
トした後、２０μの４Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、容
量をＴＥ−緩衝剤（１０mMのトリス-HCl、pH8.０、１mM
のＥＤＴＡ）に調節した。
混合物をフェノール−クロロホルムで２回抽出した。Ba
mHI及びHindIIIで分解したpBR３２２の精製した大きい
断片0.９μｇ（0.３pmole）を担体ＤＮＡとして添加し
た。水相のエーテル抽出後、ＤＮＡをエタノール沈澱に
よって単離した。
エンドヌクレアーゼ消化 前記のようにして製造したＤＮＡをそれぞれ合計２２μ
の緩衝液（５０mMのNaCl、１０mMのトリス−HCl、pH
7.５、１０mMのMgCl2、１mMのＤＤＴ、４mMのスペルミ
ジン）中で制限エンドヌクレアーゼBamHI及びHindIIIの
それぞれ１６単位及び２０単位で消化した。混合物をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し、次いでエーテルで抽
出し、ＤＮＡをエタノール沈澱によって単離し、次いで
１２μの水に溶かした。２μを７Ｍ尿素６％ポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動に使用した。
結合 ＤＮＡの１部（５μ）に、６６mMのトリス−HCl、pH
7.４、１０mMのMgCl2、１mMのＡＴＰ、１mMのＤＤＴ、
４０μｇ／mlのゼラチンを含む合計４１μ中の、BamH
I及びHindIIIで切断されたpBR３２２の精製された大き
いフラグメントの新しい部分（0.３８μｇ）及びＴ４
ＤＮＡリガーゼ４００単位を添加した。結合を１６℃で
１６時間実施した。
形質転換 結合混合物２0.５μを使用して、CaCl2で処理したE.
コリー(coli)MC 1000（ｒ−，ｍ＋）を形質転換させ
た。細菌をＬＢ−平板寒天上に置き、アンピシリンに対
する耐性（１００μｇ／ml）について選択した。Ｍ13 m
p 10 insHXΔPst 1 pmol当たり2.６×１０３個のコロニ
ーが得られた。
コロニーのハイブリッド形成 １２３個の形質転換コロニーを新しいアンピシリン平板
上に取り、３７℃で一夜増殖させた。コロニーをホワッ
トマン(Whatman)５４０紙に移し、定着させた〔ゲル
ゲン(Gergen,J.P.)、ステルン(Stern,G.H.)及びウェン
シンク(Wensink,P.C.)著(1979)、Nucl.Acids Res.７
巻、2115〜2136頁〕。0.９ＭのNaCl、0.０９Ｍのトリス
−HCl、pH7.５、0.００６ＭのＥＤＴＡ、0.２％のフィ
コル(Ficoll)、0.２％のポリビニルピロリドン、0.２％
のウシ血清アルブミン、0.１％のＳＤＳ及び５０μｇ／
mlの鮭精液ＤＮＡを含む密封プラスチックバック中で６
５℃で２時間予備ハイブリッド形成を実施した。次に、
8.５×１０６cpmの32Ｐ−標識１９−マーを添加し、４
５℃で一夜ハイブリッド形成を実施した。フィルターを
0.９ＭのNaCl、0.０９Ｍのクエン酸ナトリウムで０℃で
５分間、３回洗浄し、次いで、オートラジオグラフィを
実施し、４５℃で１分、１回洗浄し、再びオートラジオ
グラフィを実施した。４５℃で洗浄した後、突然変異し
たプラスミドを含む３個のコロニーを認めることができ
た。
突然変異したプラスミドのエンドヌクレアーゼ分析 突然変異株を含むと思われるコロニーからのプラスミド
を迅速方法〔イッシュ−ホロヴィッツ(Ish-Horowicz,
D.) 及びブルケ(Burke,J.F.)著、(1981)、Nucl.Acids
Res.９巻、2989〜2998頁〕によって調製し、BamHI及びH
indIIIの混合物で消化し、次いで、２％アガロースゲル
上での電気泳動によって分析した。１７９個の塩基対の
断片の存在から、３個のコロニーが突然変異プラスミド
を含むことが確認された。
再形質転換 “突然変異株”と同定されたコロニーは、後代のヘテロ
二重らせんであるプラスミドを含む。２つの突然変異株
コロニーからのプラスミドを用いてCaCl2で処理したE.
コリー(coli)MC 1000（ｒ−，ｍ＋）を再び形質転換さ
せることにより純粋な変異体を得ることができた。各平
板から、５個のアンピシリン耐性コロニーを単離し、プ
ラスミドＤＮＡを調製し、前記のようなエンドヌクレア
ーゼ分解によって分析した。５個のうち３個及び５個の
うち５個がそれぞれ純粋な変異体であることが判った。
更に使用するため、一つのプラスハドpMT３１９を選択
した。
ＤＮＡ配列分析 ５μｇのpMT３１９を標準条件下にBamHIで分解し、フェ
ノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。BamHI粘着
性末端の補充を、クレナウ(Klenow)ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びα−32Ｐ−ｄＡ
ＴＰを用いて実施した。
フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた後、ＤＮ
ＡをEcoRIで消化した。欠失を有するＰ−標識断片を２
％アガロースゲル上での電気泳動で精製し、マクサム−
ギルバート(Maxam-Gilbert)法〔マクサム，A.及びビル
バート，W.、(1980)、メソッヅ・イン・エンツィモロジ
ィ(Methods in Enzymology)６５巻、４９９〜５６０
頁〕により配列を分析した。
例２ ヒトインシュリン（Ｂ′Ａ）のＢ（１−２９）−Ａ（１
−２１）を表現する酵母プラスミドpMT３４４の構成 Ｂ′Ａについてコードする遺伝子を含む、前記のように
して製造したプラスミドpMT３１９を制限酵素HindIII及
びXbaIで切断し、２％アガロースゲルから0.１８kb断片
を単離した〔マニアティス(T.Maniatis)、フリッチュ
(E.F.Fritsch)及びサムブルック(J.Sambrook)著、モレ
キュラ・クローニング(Molecular Cloning）、コールド
・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor
Press）、1982年）〕。同様に、Ｓ．セレビジエ(cerevi
siae)ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩｐ）〔アルバー(T.Al
ber)及びG.川崎著、サッカロミセス・セレビジエ(Sacch
aromyces cerevisiae)のトリオースホスフェートイソメ
ラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、J.Mol.Applied Gene
t. １巻（１９８２）４１９〜４３４頁〕及びＭＦα１
リーダー配列〔クルジャン(J.Kurjan)及びヘルスコヴィ
ツ(I.Herskowitz)、酵母フェロモン遺伝子(MFα)の構
造：推定のα−ファクター前駆物質は成熟αファクター
の４種の縦列コピーを含む。セル(Cell)３０巻（１９８
２）９３３〜９４３頁〕を含む断片(6.5kb XhoI-HindII
I)を１９８３年１１月１日付け米国特許出願第547,748
号明細書に記載されているようにして製造したプラスミ
ドｐ２８５から単離した。ｐ２８５は、挿入ＴＰＩｐ−
MFα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩＴを含み、酵母菌
株Ｚ３３(ATCCNO.20681)として寄託された。ＴＰＩ転写
終了配列（ＴＰＩＴ）〔アルバー(T.Alber)及びG.川崎
著、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerev
isiae)のトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子の
ヌクレオチド配列、J.Mol.Applied Genet. １巻（１９
８２）４１９〜４３４頁〕を含む断片(0.7kb XbaI-BamH
I)もｐ２８５から単離した。最後に、酵母ベクターYRp1
3（ブローチ(J.R.Broach.)著、２μｍ環状配列を使用す
る高コピー酵母ベクターの構成。メソッヅ・エンツィモ
ロジィ(Methods Enzymology)１０１巻(1983)３０７〜３
２５頁〕から5.4kb XhoI-BamHI断片を単離した。前記の
４種の断片を結合させ〔マニアティス(T.Maniatis)、フ
リッチュ(E.F.Fritsch)及びサムブルック(J.Sambrook)
著、モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold S
pring Harbor Press）、1982〕、アンピシリン耐性につ
いて選択してＥ．コリー(coli)に形質転換させた〔マニ
アティス(T.Maniatis)、フリッチュ(E.F.Fritsch)及び
サムブルック(J.Sambrook)著、モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press）、1982
年〕。形質転換体からプラミスドを単離し、これらのう
ちの一つ、pMT３４４の構造を制限地図によって証明し
た。pMT３４４の構造及び主な特徴を第１図に示す。
例３ 修飾ＭＦα１リーダーの後にヒトインシュリン（Ｂ′
Ａ）のＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）を表現する酵母
プラスミドpMT４７５の構成 最後の４個のアミノ酸(Glu-Ala-Glu-Ala)を欠くＭＦα
１リーダー〔クルジャン(J.Kurjan)及びヘルスコビィツ
(I.Herskowitz)、酵母フェロモン遺伝子（ＭＦα）の構
造：推定のα−ファクター前駆物質は清純αファクター
の４種の縦列コピーを含む。セル(Cell)３０巻(1982年)
９３３〜９４３頁〕の後にＢ′Ａを表現するプラスミド
を構成するため、Ａ配列及びＢ′配列の一部を含む0.１
４kb XbaI-EcoRII断片をpMT３１９から単離した。同様
にＢ′遺伝子の５′基部をpM２１５から0.３６kb EcoRI
-EcoRII断片として単離した。プラスミドpM２１５は、
ｐ２８５からのプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ遺伝子を含
むEcoRI-XbaI断片をpUC13〔ビエイラ(Vieira)らによっ
てpUC８及びpUC９について記載されたようにして製造、
ジーン(Gene)１９巻、２５９〜２６８頁（１９８２
年）〕にサブクローニングし、その後ＭＦα１リーダー
とプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ遺伝子との接合点でGlu-
Ala-Glu-Alaについてコードする１２個の塩基を生体外
で環状で除去した。Ｂ′Ａ遺伝子を含むこれら２片をEc
oRI-XbaIで消化したpUC１３ベクター（第２図参照）に
結合させてpMT４７３を得た。0.５kb EcoRI-XbaI断片内
に含まれる修飾遺伝子をpMT４７３から単離し、次い
で、pMT３４２からの二つの断片（4.3 kb XbaI-EcoRV及
び3.3 kb EcoRV-EcoRI）に結合させた。pMT３４２は、
挿入されたＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−
ＴＰＩＴを有する酵母ベクターpMT２１２である。精製
するプラスミド、pMT４７５は挿入部：ＴＰＩｐ−ＭＦ
α１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala) −Ｂ′Ａ−
ＴＰＩＴを含む。プラスミド、pMT３４２、pMT４７３及
びpMT４７５の構成を第２図に略示する。ベクターpMT２
１２の構成を第３図に示す。プラスミドpMLB1034は、ベ
ルマン(M.L.Berman)ら著、アドバンスド・バクテリアル
・ジェネティクス(Advanced Bacterial Genetics)、コ
ールド・スプリング・ハーバー・(Cold Spring Harbo
r）(1982年)４９〜５１頁に記載されており、pUC１２は
pUC１３について記載した（ビエイラらの前掲文献）の
と同様にして製造した。
例４ 安定な酵母プラスミドpMT479へのＢ（１−２９）−Ａ
（１−２１）（Ｂ′Ａ）遺伝子の挿入 pMT４７５の修飾Ｂ′Ａ遺伝子を2.1 kb BamHI−部分Sph
1断片として単離し、プラスミドＣＰＯＴ（ＡＴＣＣNO.
３９６８５）の約１１ kb BamHI-Sph1断片に結合させて
プラスミドpMT４７９を得た（第４図）。プラスミドＣ
ＰＯＴは、元のpBR３２２Bg 11−BamHI断片をpUC１３か
らの同様のBg 11−BamHI断片で置換し、その後、BamHI-
SalI断片としてS.ポンベ(pombe)ＴＰＩ遺伝子（ＰＯ
Ｔ）を挿入〔１９８４年５月２５日出願の米国特許第61
4,734号明細書〕することによって修飾してＣＰＯＴと
してベクターＣ１／１に基づくものである。Ｃ１／１
は、pJDB２４８〔ベッグス(Beggs)ら著、ネイチャー(Na
ture)２７５巻、１０４〜１０９頁（１９７８年）〕か
ら欧州特許出願第0103409Ａ号明細書に記載されている
ようにして誘導されたものである。
例５ 形質転換 Ｓ．セレビジエ(cerevisiae)菌株MT１１８（ａ、Leu
２、ura３、trp１）をＹＰＤ培地〔シェルマン(Sherma
n)ら著、メソッヅ・イン・イースト・ジェネティクス(M
ethods in Yeast Genetics)、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring Harbor Laborato
ry)、1981年〕上で2.１のＯＤ600になるまで増殖させ
た。１００mlの培養液を遠心分離により採取し、水１０
mlで洗浄し、再遠心分離し、（1.２Ｍのソルビット、２
３mMのNa2ＥＤＴＡ、pH＝8.０、6.７mg/mlのジチオスレ
イトール）１０ml中に再懸濁した。懸濁液を３０℃で１
５分インキュベートし、遠心分離し、細胞を〔1.２Ｍの
ソルビット、１０mMのNa2EDTA、0.１のクエン酸ナトリ
ウム、pH5.８、２mgのノボチーム(Novozym、商標)２３
４酵素）１０ml中に再懸濁した。懸濁液を３０℃で３０
分インキュベートし、細胞を遠心分離によって集め、1.
２Ｍのソルビット１０ml及びＣＡＳ〔1.２Ｍのソルビッ
ト、１０mMのCaCl2、１０mMのトリス（トリス＝トリス
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）pH7.５〕１０ml
中で洗浄し、ＣＡＳ２ml中に再懸濁した。形質転換のた
め、ＣＡＳに再懸濁した細胞0.１mlを約１μｇのプラス
ミドpMT３４４と混合し、室温で１５分放置した。１ml
の（２０％ポリエチレングリコール４０００、１０mMの
CaCl2、１０mMのトリス、pH7.５）を添加し、混合物を
更に３０分室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレ
ットを0.１mlのＳＯＳ（1.２Ｍのソルビット、３３％ｖ
／ｖのＹＰＤ、6.７mMのCaCl2、１４μｇ／mlのロイシ
ン）中に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし
た。次いで、懸濁液を遠心分離し、ペレットを0.５mlの
1.２Ｍのソルビット中に再懸濁した。５２℃の６mlのト
ップ寒天〔ロイシンを省き、1.２Ｍのソルビット及び2.
５％の寒天を含むシェルマンらのＳＣ培地｛メソッヅ・
イン・イースト・ジェネティクス(Methods in Yeast Ge
netics)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リィ(Cold Spring Harbor Laboratory)、1981年｝〕添
加し、懸濁液を同じ寒天固化ソルビット含有培地を含む
平板の上に注いだ。３０℃で３日後に形質転換体コロニ
ーを採取し、再び単離し、液体培養を開始するため使用
する。このような形質転換体の一つMT３５０（＝MT１１
８／MT３４４）を更に特性決定するため選択した。
プラスミドpTM４７９を前記と同じ操作によりＳ．セレ
ビジエ(cerevisiae)菌株MT３６２（α、Leu２）に形質
転換させ、形質転換体MT３７１（＝MT３６２／MT４７
５）を単離した。
菌株Ｅ２−７Ｂ Ｘ Ｅ１１−３Ｃ（ａ／α、Δtpi／
Δtpi、pep4-3／pep4-3；この株をMT５０１と言う）へ
のpMT４７９の形質転換を下記の点を変えて前記のよう
に実施した： １）形質転換前にMT５０１をYPGaL〔１％バクト(Bacto)
酵母エキス、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、
１％乳酸塩〕上で0.６のＯＤ600まで増殖させた。２）
ＳＯＳ溶液は、ＹＰＤの代わりにYPGaLを含んでいた。
形質転換体の一つMT５１９（＝MT５０１／PMT４７９）
を更に特性決定するため選択した。
出願人は、形質転換した微生物MT３５０、MT３７１及び
MT５１９を１９８４年５月１４日にＤ−３４００ゲッテ
ィンゲン、グリーゼバッハシュトラーセ８のドイツ微生
物寄託（ＤＳＭ）に寄託し、それぞれ参照番号ＤＳＭ２
９５７、ＤＳＭ２９５８及びＤＳＭ２９５９を与えられ
た。
例６ 酵母におけるＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュ
リンの表現 菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）及びMT３７１（ＤＳＭ
２９５８）をロイシンを省いた合成完全ＳＣ培地〔シェ
ルマン(Sherman)ら著、メソッヅ・イン・イースト・ジ
ェネティクス(Methods in Yeast Genetics)、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ(Cold Spring H
arbor Laboratory)、１９８１年〕中で増殖させた。各
菌株について、２のバッフル付きフラスコ中の１の
培養液２つを７〜１０のＯＤ600nmに達するまで３０℃
で振盪した。これらを次に、遠心分離し、上澄み液を更
に分析するため取り除いた。
菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）を同様に増殖させる
が、ＹＰＤ培地〔シェルマン(Sherman)ら著、メソッヅ
・イン・イースト・ジェネティクス(Methods in Yeast
Genetics)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリィ(Cold Spring Harbor Laboratory)、１９８１
年〕上で１５のＯＤ600nmに達するまで増殖させ、遠心
分離し、上澄み液を前記のように分析のため分離した。
例７ 酵母菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの表現 酵母菌株MT３５０（ＤＳＭ２９５７）を前記の例６に記
載したように増殖させ、この菌株からの上澄み液１１０
０mlからの表現産生物を下記のようにして単離した。
リクロプレプ(LiChroprep)（商標）RP−１８〔メルク(M
erck)、art.9303）を５０mMのNH4HCO3、６０％エタノー
ルで３回洗浄し、その後６×１cmのカラム中に充填し
た。カラムを５０mMのNH4HCO3５０mlで平衡にした。酵
母上澄み液１１００mlに９６％エタノール５５mlを添加
し、混合物をカラムに一夜適用した（流速７０ml/h）。
カラムを0.５ＭNaCl１０ml及びH2O１０mlで洗浄し、ペ
プチドを５０mMのNH4HCO3、６０％のEtOHで溶離した。
溶離液（５ml）を真空遠心分離により1.４mlに濃縮（エ
タノールを除去）し、容量を２５mMのＨＥＰＥＳ緩衝液
（pH＝7.４）で１０mlに調節した。試料を抗インシュリ
ン免疫吸収カラム（ＡＩＳカラム）（2.５×4.５cm）に
適用した。このカラムは、適用前に５mlのNaFAM-緩衝液
〔ヘディング(Heding,L.)、ダイアベートロジア(Diabet
ologia)８巻、２６０〜２６６頁、１９７２年〕で４
回、５mlの２５mMＨＥＰＥＳ−緩衝液で２回洗浄してお
いた。適用後、カラムを室温で３０分放置し、その後、
２５mMＨＥＰＥＳ−緩衝液４mlで１０回洗浄した。ペプ
チド２０％のHAcで溶離した。溶離液のpH値をNH4OHで7.
０に調節し、プール液を真空回転により５００μに濃
縮した。前の工程からの試料を更に、１０μウォーター
ス・ミューボンダパック(Waters μBondapak)Ｃ−１８
カラム（3.９×３００mm）上でＨＰＬＣ上で精製した。
Ａ及びＢ緩衝液はそれぞれH2O中の0.１％ＴＦＡ及びMeC
N中の0.０７％ＴＦＡであった。カラムを２５％のＢで
平衡にし（流速：1.５ml／分）、ペプチドを線勾配のMe
CN（１％／分）で溶離し。２７６nmで検出した。各精製
工程での収率を前記のラジオイムノアッセイによって測
定し、第２表に精製をまとめる。全収率は６８％であっ
た。
免疫反応性Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリ
ン材料を含む唯一のピークがＨＰＬＣカラムから検出さ
れた。このピークからのペプチド材料を単離し、アミノ
酸配列分析に付した。配列分析は、ヘウィック(Hewick,
R.M.)らによってJ.Biol.Chem.２５６巻、７９９０〜７
９９７頁（１９８１年）に記載されたようなガス相配列
分析装置〔アプライド・ビオシステム(Applied Biosyst
em)４７０Ａ型〕を用いて実施した。配列分析の結果か
ら、表現産生物は３種のペプチドからなると結論するこ
とができた： (Glu-Ala)2−Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュ リン ８９％ Glu-Ala-−Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリ ン ２％ Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリン ９％ ペプチドは、示した相対的量で存在した。
例８ 酵母菌株MT３７１（ＤＳＭ２９５８）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの表現 酵母菌株MT３７１（ＤＳＭ２９５８）を前記の例６に記
載したように増殖させ、この菌株からの上澄み液６６５
mlからの表現産生物を例７に記載したようにして単離し
た。全収率は、３９％に相当する５０nmolであった。ペ
プチド物質をＨＰＬＣカラムから単離し、例７に記載し
たように配列を分析した。配列分析の結果（Ｎ−末端か
ら１８個の基）から、ペプチドは均一なＢ（１−２９）
−Ａ（１−２１）インシュリンであると結論することが
できた。
これらの結果を例７で得られた結果と比較することは、
ＭＦα１リーダーのＣ−末端からGlu-Ala-Glu-Ala配列
を除去することの当否を示す。例７から、酵母ジペプチ
ダーゼ酵素が、酵母細胞からインシュリン前駆物質を分
泌する前にＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリ
ンからGlu-Ala及びGlu-Ala-Glu-Alaを脱離するのにあま
り効率的に作用しないことが判る。
例９ 酵母菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）におけるＢ（１−
２９）−Ａ（１−２１）インシュリンの表現 酵母菌株MT５１９（ＤＳＭ２９５９）を前記の例６に記
載したように増殖させ、上澄み液７０mlからの表現産生
物を例７に記載したようにして単離した。全収率は、５
７％に相当する１１６nmolであった。ペプチド物質を例
７に記載したように配列分析した。Ｎ−末端から確認さ
れた４２個の残基から判断して、ペプチドは均一なＢ
（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリンであった。
約５nmolのペプチドをベックマン(Beckman)１２１Ｍ型
アミノ酸分析装置で分析した。下記のアミノ酸組成が認
められた： 第３表 精製したＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）インシュリン
のアミノ酸分析 例１０ Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）を表現す
る酵母プラスミドpMT６１０の構成 pMT３４２（例３参照）からの4.３ kb EcoRV-Xbal及び
3.３ kb EcoRI-EcoRV断片をpM２１５（例３参照）から
の0.６ kb EcoRV-Xbal断片に結合させた。得られたプ
ラスミドpMT４６２は挿入ＭＦα１リーダー（マイナスG
lu-Ala-Glu-Ala）−Ｂ−Ｃ−Ａを保有する。Ｂ−Ｃ−Ａ
をコードする断片をＢ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ
（１−２１）をコードする断片に変えるため、変形部位
特異性突然変異操作〔Ｋ．ノリス(Norris)らの前掲文
献〕を使用した。pMT４６２をコードするＭＦα１リー
ダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala）−Ｂ−Ｃ−Ａからの
0.６ kb EcoRI-Xbal断片をXbal-EcoRIで切断したＭ１
３mp１０ ＲＦファージ中に挿入した。前記のEcoRI-Xb
al挿入部を含む１本鎖Ｍ１３ファージを３０−マーｄ
（ＴＴＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧ
ＧＧＴＧＴＧ）プライマー（ＫＦＮ１５）及び“ユニバ
ーサル”１５−マーＭ１３プライマーｄ（ＴＣＣＣＡＧ
ＴＣＡＣＧＡＣＧＴ）（例１参照）とともにインキュベ
ートし、９０℃で５分加熱し、アニールするため、徐々
に室温に冷却した。次に、ｄ−ＮＴＰ−ミックス、クレ
ナウポリメラーゼ及びＴ４リガーゼを添加することによ
って部分的に２本鎖のＤＮＡを作った。フェノールで抽
出し、エタノールで沈澱させ、再懸濁した後、ＤＮＡを
制限酵素Apal、Xbal及びEcoRlで切断した。更に、フェノ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させ、再懸濁した後、
ＤＮＡをEcoRI-Xbalで切断したpUC１３に結合させた。
結合混合物をＥ．コリー(coli)（ｒ−，ｍ＋）菌株に形
質転換させ、プラスミドを多数の形質転換体から調製し
た。プラスミド調製物をEcoRl及びXbalで切断し、0.５
及び0.６kbのところでバンドを示す調製物をＥ．コリー
(coli)に再形質転換させた。再形質転換から、0.５kb挿
入部を有するpUC１３だけを保有する形質転換体を選択
した。このプラスミドpMT５９８のEcoRI-Xbal挿入部の
配列がMFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala）−
Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）をコード
することをマクサム−ギルバート(Maxam-Gilbert)法で
確認した。pMT５９８からのXbal-EcoRl挿入部は、pMT５
９８の0.５ kb Xbal-EcoRl断片をpT５の5.５ kb Xbal
-EcoRI断片と結合させることによってＴＰＩプロモータ
及びＴＰＩ停止剤を用いて得られた。挿入ＴＰＩｐ−Ｍ
Ｆα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩＴを保有するpT５
の構造を第８図に示す。生ずるプラスミドpMT６０１は
挿入ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Gl
u-Ala）−Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２
１）ＴＰＩＴをBamHI及び部分的にSph1で切断し、2.１
kb断片をBamHI及びSph1で切断したＣＰＯＴ中に挿入
した。生ずるプラスミドpMT６１０を酵母の形質転換の
ため使用した。
例１１ Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）を表現する酵
母プラスミドpMT６３９の構成 pMT４６２（例１０参照）からのＢＣＡをコードする断
片を、例１０に記載した操作と同様にして２７−マーｄ
（ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＡＣＴＴＧＧＧＴ
ＧＴＧ）プライマーＫＦＮ３６と“ユニバーサル”１５
−マーＭ１３プライマーとの混合物での部位特異性突然
変異によってＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）
に変えた。クレナウ(Klenow)ポリメラーゼを用いて補充
し、Ｔ４リガーゼで結合した後、部位的に２本鎖のＤＮ
ＡをApal、EcoRI及びXbalで消化し、プラスミドpT５から
の5.５ kb Xbal-EcoRl断片と結合させる（例１０参
照）。Ｅ．コリー(coli)に形質転換及び再形質転換した
後、挿入MFα１リーダー（マイナスGlu-Ala-Glu-Ala）
−Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）を含む
プラスミドpMT６３０を単離し、挿入部の配列を確認し
た。挿入ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（マイナスGlu-Al
a-Glu-Ala）−Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−
２１）ＴＰＩＴを含むプラスミドpMT６３９を得るた
め、例１０に記載したように更に操作した。pMT６３９
の構成を第９図に示す。
例１２ 酵母菌株MT６２０におけるＢ（１−２９）−Ala-Ala-Ly
s-Ａ（１−２１）の表現 Ｓ．セレビジエ(cerevisiae)菌株MT５０１（例５参照）
を例５にpMT４７９について記載したようにしてpMT６１
０で形質転換した。形質転換株コロニーを３０℃で３日
後に採取し、単離し、液体培養を開始するため使用す
る。このような形質転換MT６２０（＝MT５０１／pMT６
１０）を更に特性決定するため選択した。出願人はMT６
２０を、１９８５年１月１６日にドイツ微生物寄託（Ｄ
ＳＭ）に寄託し、参照番号ＤＳＭ ３１９６を与えられ
た。
MT６２０をＹＰＤ培地上で増殖させた。２のバッフル
付きフラスコ中の２の培養液を３０℃で１５のＯＤ
600nmになるまで振盪した。遠心分離後、上澄み液を更
に分析のため除去した。ラジオイムノアッセイにより測
定される表現レベルは1.２μmol／であった。上澄み
液８４０mlからの表現産生物を例７に記載したようにし
て精製した（ＲＰ−１８カラム、抗インシュリンセファ
ロース及びＨＰＬＣ）。全収率は約１０％に相当する１
００nmolであった。ペプチド物質をＨＰＬＣカラムから
単離し、例７に記載したようにして配列を決定した。３
５エドマン(Edman)分解サイクル(degradation cycle)を
実施した（第４表）。配列決定の結果から、Ｂ（１−２
９）及びＡ（１−２１）鎖を分離する３個のアミノ酸残
基の鎖の位置を確認した（第４表参照）。
例１３ 酵母菌株MT６４３におけるＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ
（１−２１）の表現 Ｓ．セレビジエ(cerevisiae)菌株MT５０１を例５にpMT
４７９について記載したようにしてpMT６３９で形質転
換した。形質転換MT６４３（＝MT５０１／pMT６３９）
を更に特性決定するため選択した。出願人はMT６４３
を、１９８５年１月１６日にＤＳＭに寄託し、参照番号
ＤＳＭ ３１９７を与えられた。
MT６４３を例１２に記載したように増殖させた。遠心分
離後、上澄み液を更に分析のため除去した。
ラジオイムノアッセイにより測定されるインシュリン前
駆物質の表現レベルは1.６μmol／であった。MT６４
３からの上澄み液からの表現産生物を例７に記載したよ
うにして単離した。ＨＰＬＣカラムから単離したペプチ
ド物質を例７に記載したようにして配列分析に付した。
配列決定の結果から、Ｂ（１−２９）及びＡ（１−２
１）鎖を分離する２個のアミノ酸残基の鎖の位置を確認
した。
例１４ Thr(But)-OBut(B30)ヒトインシュリンへのＢ（１−２
９）−Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）２０mgを１０Ｍ酢酸0.
１mlに溶かした。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中の1.
５４Ｍ Thr(But)-OBut0.２６mlを添加した。混合物を
１２℃に冷却した。
0.０５Ｍ酢酸カルシウム0.０３５mlに溶解したトリプシ
ン2.８mgを添加した。１２℃で７２時間後、アセトン４
mlを添加して蛋白質を沈澱させ、遠心分離により単離
し、真空中で乾燥した。ここで、Thr(But)-OBu(B30)ヒ
トインシュリンへのＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）の
変換率は、ＨＰＬＣにより６４％であった。
例１５ Thr-OMe(B30)ヒトインシュリンへのＢ（１−２９）−Ａ
（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ａ（１−２１）２０mgを１０Ｍ酢酸0.
１mlに溶かした。ジメチルスルホキシドとブタン−１，
４−ジオールとの１／１（ｖ／ｖ）混合物中の1.５４Ｍ
Thr-OMe 0.２６mlを添加した。水の0.０７ml中のアク
ロモバクター・リチクス(Achromobaster lyticus)から
のリシルエンドペプチダーゼ（日本国大阪の和光純薬工
業株式会社）１mgを添加した。２５℃で１２０時間後、
アセトン４mlを添加して蛋白質を沈澱させ、遠心分離に
より単離し、真空中で乾燥した。Thr-OMe(B30)ヒトイン
シュリンへのＢ（１−２９）−Ａ（１−２１）の変換率
は、ＨＰＬＣにより７５％であった。
例１６ Thr-OBut(B30)ヒトインシュリンへのＢ（１−２９）−S
er-Lys-Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）２０mgを水中
の３4.３％酢酸（ｖ／ｖ）及び４2.２％Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ｖ／ｖ）の混合物0.１mlに溶かした。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のヒドロアセテート塩
として２ＭThr-OBut0.２mlを添加した。混合物を１２℃
に恒温保持した。0.０５Ｍ酢酸カルシウム0.０５mlに溶
解したトリプシン２mgを添加した。１２℃で２４時間
後、アセトン４mlを添加して蛋白質を沈澱させ、遠心分
離により単離し、真空中で乾燥した。Thr-OBut(B30)ヒ
トインシュリンへのＢ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−
２１）の変換率は、ＨＰＬＣにより８５％であった。
例１７ Thr-OBut(B30)ヒトインシュリンへのＢ（１−２９）−A
la-Ala-Lys-Ａ（１−２１）の変換 Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）２０mgを
水中の３4.３％酢酸（ｖ／ｖ）及び４2.２％Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド（ｖ／ｖ）の混合物0.１mlに溶かし
た。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のヒドロアセテー
ト塩として２ＭのThr-OBut0.２mlを添加した。混合物を
１２℃に恒温保持した。0.０５Ｍ酢酸カルシウム0.０５
ml中のトリプシン２mgを添加した。１２℃で９６時間
後、アセトン４mlを添加して蛋白質を沈澱させ、遠心分
離により単離し、真空中で乾燥した。Thr-OBut(B30)ヒ
トインシュリンへのＢ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ
（１−２１）の変換率は、ＨＰＬＣにより８４％であっ
た。
例１８ 種々のヒトインシュリンエステルからのヒトインシュリ
ンの製造 組成アセトンを沈澱物中のヒトインシュリンエステル
を、メソッヅ・イン・ダイアベーテス・リサーチ(Metho
ds in Diabetes Research)、１巻４０７〜４０８頁〔ラ
ーナー(J.Larner)及びポールS.Pohl)編集、ジョーン・
ウィリィ・ソンズ(John Wiley Sons)、ニューヨーク、1
984年発行〕に記載されているようにゲル過及びアニ
オン交換クロマトグラフィーによって精製した。この方
法は、３種のヒトインシュリンエステルのいずれにも適
用可能であった。ほぼ１００％の収率でヒトインシュリ
ンを生じる、種々のエステル基の分解は、前掲文献の４
０９頁に記載されているように、Thr-OMe(B30)ヒトイン
シュリンの加水分解並びにThr(But)-OBut(B30)ヒトイン
シュリン及びThr-OBut(B30)ヒトインシュリンのトリフ
ルオロ酢酸によるアシドリシスによって実施した。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpMT３４４の製造工程図、 第２図はプラスミドpMT４７５の製造工程図、 第３図はプラスミドpMT２１２の製造工程図、 第４図はプラスミドpMT４７９の製造工程図、 第５図はプラスミドpMT３１９の製造工程図、 第６図はプラスミドpMT５９８の製造工程図、 第７図はプラスミドpMT６１０の製造工程図、 第８図はプラスミドpT５の製造工程図、 第９図はプラスミドpMT６３９の製造工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 モーゲンズ トリエル ハンセン デンマーク国，デイーケー‐3650 オルス タイツケ，ビンケルベユ 21 (72)発明者 ラルス トヒム デンマーク国，デイーケー‐2880 ゲント フテ，スキフテベイ 22 (72)発明者 キエルド ノルリス デンマーク国，デイーケー‐3460 ビルケ ロード，エスケモセガルドサツレ 18 (72)発明者 ハンス オレ ボイグト デンマーク国，デイーケー‐2800 リング ビ，フビデガルドスパルケン 36 (56)参考文献 特開 昭57−50948（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−159489（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】インシュリンの製造方法において、次の一
    般式（Ｉ）： Ｂ（１−２９）−（Ｘｎ−Ｙ）ｍ−Ａ（１−２１）
    （Ｉ） 〔式中Ｘｎはｎ個の天然アミノ酸残基を有するペプチド
    鎖を表し、ＹはLys又はArgを表し、ｎは０〜33の整数を
    表し、ｍは０又は１を表し、Ｂ（１−２９）はPheB1か
    らLysB29までのヒトインシュリンの短縮されたＢ−鎖を
    表し、Ａ（１−２１）はヒトインシュリンのＡ鎖を表す
    が、ペプチド鎖−Ｘｎ−Ｙ−は２個の隣接する塩基性ア
    ミノ酸残基を含まないものとし、且つ、式（Ｉ）はＢ−
    鎖の１位のアミノ酸からＡ鎖の21位のアミノ酸までの１
    本のペプチド鎖を示す〕を有するペプチド鎖を含むイン
    シュリン前駆物質をコードする配列を含んでなる発現ベ
    クターにより形質転換された酵母を培地中で培養し、発
    現されたインシュリン前駆物質を回収し、そして該イン
    シュリン前駆物質をヒトインシュリンに転換することを
    特徴とする方法。
  2. 【請求項２】ｍが０である特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. 【請求項３】ｍが１であり、ｎが１〜８である特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】ペプチド鎖が、 Ｂ（１−２９）−Ala-Ala-Lys-Ａ（１−２１）である特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】ペプチド鎖が、 Ｂ（１−２９）−Ser-Lys-Ａ（１−２１）である特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】前記発現ベクターがプラスミドpM344であ
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記発現ベクターがプラスミドpMT475であ
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記発現ベクターがプラスミドpMT479であ
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記発現ベクターがプラスミドpMT610であ
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記発現ベクターがプラスミドpMT639で
    ある、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
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