JPH064028B2 - コラゲナ−ゼの製造方法 - Google Patents
コラゲナ−ゼの製造方法Info
- Publication number
- JPH064028B2 JPH064028B2 JP3262286A JP3262286A JPH064028B2 JP H064028 B2 JPH064028 B2 JP H064028B2 JP 3262286 A JP3262286 A JP 3262286A JP 3262286 A JP3262286 A JP 3262286A JP H064028 B2 JPH064028 B2 JP H064028B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagenase
- proline
- poly
- chromatography
- column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は脊椎動物のコラゲナーゼの製造方法に関するも
のである。
のである。
動物体の総蛋白質のうち約３０％はコラゲンによって占
められている。コラゲンが体内で分解代謝される際の律
速段階はコラゲナーゼが関与する反応段階であると考え
られており、コラゲナーゼは種々の疾病、例えばリュウ
マチ様関節炎、歯槽膿漏、角膜潰瘍、皮膚の異常、傷、
近年では腫瘍や癌など、との関連において注目されてい
る。
められている。コラゲンが体内で分解代謝される際の律
速段階はコラゲナーゼが関与する反応段階であると考え
られており、コラゲナーゼは種々の疾病、例えばリュウ
マチ様関節炎、歯槽膿漏、角膜潰瘍、皮膚の異常、傷、
近年では腫瘍や癌など、との関連において注目されてい
る。
従来の技術 脊椎動物のコラゲナーゼは、特異性に関して両棲網や哺
乳網などの網による差異はないと考えられている。コラ
ゲナーゼを得る方法には、ラット子宮、ヒト白血球、滑
液、黒色腫細胞などの組織・細胞から直接抽出する方法
と、ウシガエルのオタマジャクシやヒトの皮膚線維芽細
胞などの細胞培養液を原料とする方法が知られている。
コラゲナーゼの精製法は原料とするものにより種々の方
法が採られるが、概して一般的なイオン交換クロマトグ
ラフィーや分子篩などの方法を組み合わせて行われる。
コラゲナーゼの精製において注目すべきは、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを応用したいくつかの例であ
る。その主なものは、(1)コラゲナーゼの基質であるコ
ラゲンをリガンドとして用いる方法〔Eisen,A.Z.et a
l.：in Methods Enzymol.,34,420-424(1974)〕及び(2)
カリクレイン不活性化剤であるトラジロール（アプロチ
ニン）をリガンドとして用いる方法〔Christner,P.et a
l.：Biochemistry,21,6005-6011(1982)〕である。
乳網などの網による差異はないと考えられている。コラ
ゲナーゼを得る方法には、ラット子宮、ヒト白血球、滑
液、黒色腫細胞などの組織・細胞から直接抽出する方法
と、ウシガエルのオタマジャクシやヒトの皮膚線維芽細
胞などの細胞培養液を原料とする方法が知られている。
コラゲナーゼの精製法は原料とするものにより種々の方
法が採られるが、概して一般的なイオン交換クロマトグ
ラフィーや分子篩などの方法を組み合わせて行われる。
コラゲナーゼの精製において注目すべきは、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを応用したいくつかの例であ
る。その主なものは、(1)コラゲナーゼの基質であるコ
ラゲンをリガンドとして用いる方法〔Eisen,A.Z.et a
l.：in Methods Enzymol.,34,420-424(1974)〕及び(2)
カリクレイン不活性化剤であるトラジロール（アプロチ
ニン）をリガンドとして用いる方法〔Christner,P.et a
l.：Biochemistry,21,6005-6011(1982)〕である。
発明が解決しようとする問題点 しかし、これら研究上有用なアフィニティークロマトグ
ラフィーも製造工業においては必ずしも直接応用可能で
はない。コラゲンをリガンドに用いた場合には、コラゲ
ナーゼによるコラゲンの分解により漸次吸着体の吸着能
低下を招き、吸着体の再使用回数に制限がある。また、
トラジロールをリガンドとした場合には、トラジロール
がカリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプ
シノーゲンなどコラゲナーゼ以外にも多種類の蛋白質分
解酵素又はその前駆体を吸着するため、必ずしも精製を
うまく進めることができるとは限らない。
ラフィーも製造工業においては必ずしも直接応用可能で
はない。コラゲンをリガンドに用いた場合には、コラゲ
ナーゼによるコラゲンの分解により漸次吸着体の吸着能
低下を招き、吸着体の再使用回数に制限がある。また、
トラジロールをリガンドとした場合には、トラジロール
がカリクレイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプ
シノーゲンなどコラゲナーゼ以外にも多種類の蛋白質分
解酵素又はその前駆体を吸着するため、必ずしも精製を
うまく進めることができるとは限らない。
問題を解決するための手段 本発明者は、コラゲンの基本構造である 中に反復して存在するＬ−プロリンに注目し、ポリ−Ｌ
−プロリンをリガンドとしたアフィニティークロマトグ
ラフィーを行うことにより、ポリ−Ｌ−プロリンがコラ
ゲナーゼを高純度に精製するために極めて有効であるこ
とを見いだした。精製は、まず、途中までの精製をStri
cklinらの方法〔Stricklin et al.：Biochemistry,16,1
607-1615(1977)〕に準拠して行った。すなわち、線維芽
細胞の培養上澄液を原料として、硫酸アンモニウムによ
る分画およびＣＭ−セルロースクロマトグラフィーの段
階までの精製を行った。そのあと続いて臭化シアン−活
性化セファロース４Ｂにポリ−Ｌ−プロリンを結合して
調製したポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂカラム
による本発明の方法で更に精製を進めることによって、
高純度のコラゲナーゼを得ることができた。
−プロリンをリガンドとしたアフィニティークロマトグ
ラフィーを行うことにより、ポリ−Ｌ−プロリンがコラ
ゲナーゼを高純度に精製するために極めて有効であるこ
とを見いだした。精製は、まず、途中までの精製をStri
cklinらの方法〔Stricklin et al.：Biochemistry,16,1
607-1615(1977)〕に準拠して行った。すなわち、線維芽
細胞の培養上澄液を原料として、硫酸アンモニウムによ
る分画およびＣＭ−セルロースクロマトグラフィーの段
階までの精製を行った。そのあと続いて臭化シアン−活
性化セファロース４Ｂにポリ−Ｌ−プロリンを結合して
調製したポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂカラム
による本発明の方法で更に精製を進めることによって、
高純度のコラゲナーゼを得ることができた。
本酵素精製の中途段階であるＣＭ−セルロースクロマト
グラフィーをStricklinらの方法に従って行うと、コラ
ゲナーゼ活性は塩化ナトリウムの濃度が０．１Ｍ付近の
画分に溶出される。このコラゲナーゼ活性を有する画分
を、透析・脱塩等の処理をしないで，直接ポリ−Ｌ−プ
ロリン−セファロースのカラムへ添加してコラゲナーゼ
をカラムへ吸着させることができるので操作は簡易・迅
速であり、同時に透析等に起因する吸着や失活による損
失を最小限にとどめることができ、高収率な結果が得ら
れるものと考えられる。また、ポリ−Ｌ−プロリン−セ
ファロースカラムに吸着したコラゲナーゼは、０．１Ｍ
の塩化ナトリウムを含む緩衝液によってカラムを洗浄し
てもカラム上に保持されるので夾雑物質を洗い去ること
ができ、精製度を上げることができるものと考えられ
る。
グラフィーをStricklinらの方法に従って行うと、コラ
ゲナーゼ活性は塩化ナトリウムの濃度が０．１Ｍ付近の
画分に溶出される。このコラゲナーゼ活性を有する画分
を、透析・脱塩等の処理をしないで，直接ポリ−Ｌ−プ
ロリン−セファロースのカラムへ添加してコラゲナーゼ
をカラムへ吸着させることができるので操作は簡易・迅
速であり、同時に透析等に起因する吸着や失活による損
失を最小限にとどめることができ、高収率な結果が得ら
れるものと考えられる。また、ポリ−Ｌ−プロリン−セ
ファロースカラムに吸着したコラゲナーゼは、０．１Ｍ
の塩化ナトリウムを含む緩衝液によってカラムを洗浄し
てもカラム上に保持されるので夾雑物質を洗い去ること
ができ、精製度を上げることができるものと考えられ
る。
発明の効果 本発明の特徴は、コラゲナーゼの精製にポリ−Ｌ−プロ
リンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることにより、簡易・迅速・高収率にして且つ
再現性よく高純度のコラゲナーゼを得ることができ、し
かも用いたアフィニティー吸着体は繰り返し使用が可能
な点にある。
リンをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いることにより、簡易・迅速・高収率にして且つ
再現性よく高純度のコラゲナーゼを得ることができ、し
かも用いたアフィニティー吸着体は繰り返し使用が可能
な点にある。
高純度の脊椎動物コラゲナーゼを簡易・迅速・高収率に
得る方法を確立することは、医学・薬学等の産業分野に
おける同酵素の基礎的・応用的研究、ひいては臨床応用
への利用を可能ならしめるために必須の要件であり、十
分なる精製到達度と経済性を具備した該精製法は今後こ
れらの分野の発展に寄与することが期待される。
得る方法を確立することは、医学・薬学等の産業分野に
おける同酵素の基礎的・応用的研究、ひいては臨床応用
への利用を可能ならしめるために必須の要件であり、十
分なる精製到達度と経済性を具備した該精製法は今後こ
れらの分野の発展に寄与することが期待される。
実施例 原料としてヒト胎盤血管壁の線維芽細胞を１０％牛胎仔
血清を含むダルベッコのモディファイドイーグルズメデ
ィウム中で２日間培養（細胞密度＝１×１０6細胞／m
l）した培養上澄５．１を用いて行った精製について
説明する。精製はすべて０−４℃において行った。
血清を含むダルベッコのモディファイドイーグルズメデ
ィウム中で２日間培養（細胞密度＝１×１０6細胞／m
l）した培養上澄５．１を用いて行った精製について
説明する。精製はすべて０−４℃において行った。
また、コラゲナーゼ活性の測定はCawstonとBarrettの方
法〔Cawston,T.E.and Barrett,A.J.：Anal.Biochem.,9
9,340-345(1979)〕に従って行い、１単位(U)のコラゲナ
ーゼ活性は２５℃で１時間に１μg（９４０cpm）の繊維
状〔１−14C〕アセチル化コラゲンを可溶化する活性と
定義した。
法〔Cawston,T.E.and Barrett,A.J.：Anal.Biochem.,9
9,340-345(1979)〕に従って行い、１単位(U)のコラゲナ
ーゼ活性は２５℃で１時間に１μg（９４０cpm）の繊維
状〔１−14C〕アセチル化コラゲンを可溶化する活性と
定義した。
まず、Stricklinらの方法に従って培養上澄に固体の硫
酸アンモニウムを５５％飽和になるよう加え、３０分間
撹拌をしたのち１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し
て沈澱を捕集した。得られた沈澱を３６０mlの１０ｍＭ
塩化カルシウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、０．１ｍＭ塩化カルシウムを
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
対して十分に透析した。透析後の標品を０．１ｍＭ塩化
カルシウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）によって平衡化したＣＭ５２カラム（２×３
２cm）にチャージし、カラムを１０倍容の１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）で洗浄した。続いてカラム
の６倍容ずつの１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）と１ｍＭ塩化カルシウム
及び３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−塩酸（ｐＨ７．５）とによる直線型濃度勾配溶出法
によりコラゲナーゼ活性を溶出した。コラゲナーゼ活性
は塩化ナトリウム濃度が大体１００ｍＭの画分に溶出さ
れた。コラゲナーゼ活性を含む画分を集め、次に本発明
のポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂによる精製へ
と進む。用いたポリ−Ｌ−プロリン−セファロースは、
セファロース１ml当たりに２．６mgのポリ−Ｌ−プロリ
ン（平均分子量４０，０００）を結合させたものを用い
た。ポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂカラム
（１．７×８．８cm）をあらかじめ１ｍＭ塩化カルシウ
ム及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によって平衡化してお
き、これに上記のＣＭ５２クロマトグラフィーで得られ
たコラゲナーゼ活性を含む画分を直接通過せしめる。続
いてカラムを３倍容の平衡化に用いたのと同じ緩衝液に
より洗浄したあと、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を５０
０ｍＭに上げてコラゲナーゼをカラムから溶出した。こ
のようにして得られたポリ−Ｌ−プロリン−セファロー
スクロマトグラフイー後の精製コラゲナーゼ標品は、同
クロマトグラフィー前の標品に比較して２３０ｎｍにお
ける吸光度当たりの比活性が８倍上昇していた（表１参
照）。同クロマトグラフィーでの酵素活性の回収率は約
５０％であった（表１参照）。また、この精製標品をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したあと、
銀染色により分析をした結果は、ポリ−Ｌ−プロリン−
セファロースクロマトグラフィーにより標品中に混在す
る夾雑蛋白質の種類が極めて減少することを示した。す
なわち、銀染色したゲル上で、同クロマトグラフィー前
の標品中に多数存在したバンドも同クロマトグラフィー
後の標品では分子量５５，０００、２７，０００及び２
０，０００に相当する３本になっており、まだ完全精製
には至っていないものの、コラゲナーゼが高度に精製さ
れたことを示した。
酸アンモニウムを５５％飽和になるよう加え、３０分間
撹拌をしたのち１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し
て沈澱を捕集した。得られた沈澱を３６０mlの１０ｍＭ
塩化カルシウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解し、０．１ｍＭ塩化カルシウムを
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
対して十分に透析した。透析後の標品を０．１ｍＭ塩化
カルシウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）によって平衡化したＣＭ５２カラム（２×３
２cm）にチャージし、カラムを１０倍容の１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）で洗浄した。続いてカラム
の６倍容ずつの１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ７．５）と１ｍＭ塩化カルシウム
及び３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−塩酸（ｐＨ７．５）とによる直線型濃度勾配溶出法
によりコラゲナーゼ活性を溶出した。コラゲナーゼ活性
は塩化ナトリウム濃度が大体１００ｍＭの画分に溶出さ
れた。コラゲナーゼ活性を含む画分を集め、次に本発明
のポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂによる精製へ
と進む。用いたポリ−Ｌ−プロリン−セファロースは、
セファロース１ml当たりに２．６mgのポリ−Ｌ−プロリ
ン（平均分子量４０，０００）を結合させたものを用い
た。ポリ−Ｌ−プロリン−セファロース４Ｂカラム
（１．７×８．８cm）をあらかじめ１ｍＭ塩化カルシウ
ム及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）によって平衡化してお
き、これに上記のＣＭ５２クロマトグラフィーで得られ
たコラゲナーゼ活性を含む画分を直接通過せしめる。続
いてカラムを３倍容の平衡化に用いたのと同じ緩衝液に
より洗浄したあと、緩衝液の塩化ナトリウム濃度を５０
０ｍＭに上げてコラゲナーゼをカラムから溶出した。こ
のようにして得られたポリ−Ｌ−プロリン−セファロー
スクロマトグラフイー後の精製コラゲナーゼ標品は、同
クロマトグラフィー前の標品に比較して２３０ｎｍにお
ける吸光度当たりの比活性が８倍上昇していた（表１参
照）。同クロマトグラフィーでの酵素活性の回収率は約
５０％であった（表１参照）。また、この精製標品をＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したあと、
銀染色により分析をした結果は、ポリ−Ｌ−プロリン−
セファロースクロマトグラフィーにより標品中に混在す
る夾雑蛋白質の種類が極めて減少することを示した。す
なわち、銀染色したゲル上で、同クロマトグラフィー前
の標品中に多数存在したバンドも同クロマトグラフィー
後の標品では分子量５５，０００、２７，０００及び２
０，０００に相当する３本になっており、まだ完全精製
には至っていないものの、コラゲナーゼが高度に精製さ
れたことを示した。
Claims (1)
- 【請求項１】ポリ−Ｌ−プロリンをリガンドとするアフ
ィニティークロマトグラフィーを用いることを特徴とす
る脊椎動物のコラゲナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262286A JPH064028B2 (ja) | 1986-02-17 | 1986-02-17 | コラゲナ−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262286A JPH064028B2 (ja) | 1986-02-17 | 1986-02-17 | コラゲナ−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62190079A JPS62190079A (ja) | 1987-08-20 |
| JPH064028B2 true JPH064028B2 (ja) | 1994-01-19 |
Family
ID=12363951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3262286A Expired - Lifetime JPH064028B2 (ja) | 1986-02-17 | 1986-02-17 | コラゲナ−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH064028B2 (ja) |
-
1986
- 1986-02-17 JP JP3262286A patent/JPH064028B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62190079A (ja) | 1987-08-20 |
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