JPH0640934A

JPH0640934A - Ｔｃｆ−ｉｉを有効成分とする肝臓疾患治療剤

Info

Publication number: JPH0640934A
Application number: JP4212227A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Masunaga; 博明升永; Nobuaki Fujise; 暢彰藤瀬
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-07-16
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 1994-02-15
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: JP3619526B2; ZA935119B

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト線維芽細胞由来の糖蛋白、ＴＣＦ−IIを
有効成分とする肝臓疾患治療剤。【効果】本発明の肝臓疾患治療剤は、ＴＣＦ−IIを有
効成分とすることによって急性肝炎、慢性肝炎、肝硬
変、脂肪肝あるいは胆汁鬱血型肝障害等の肝臓疾患を有
効に治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト線維芽細胞の生産す
る糖蛋白質、ＴＣＦ−IIを有効成分とする肝臓疾患治療
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト由来の線維芽細胞が生産する生理活
性物質、例えば腫瘍細胞障害性因子としてβ−インター
フェロンが存在することは広く知られている。またこの
β−インターフェロン以外にも線維芽細胞が生産する生
理活性物質としては特開昭58−146293号公報に記載のＣ
ＢＦとよばれる腫瘍細胞障害性糖蛋白質、特開昭61−33
120 号公報記載の分子量35,000〜45,000の腫瘍増殖阻害
因子（ＩＮＦ）、特開昭61−1872号公報記載の腫瘍増殖
因子ＦＮＦ、62−103021号公報記載の分子量40,000〜6
0,000、等電点pH 5.0±0.5 の細胞障害作用を有する生
理活性物質、特開昭64-10998号公報記載のヒト由来の線
維芽細胞の培養上澄みから得られる分子量36,000±1,00
0 、等電点pH10.5以上で特定のアミノ酸配列を示す腫瘍
細胞障害因子等が知られている。本発明者らはヒト線維
芽細胞由来の抗腫瘍性蛋白質を研究する過程において、
これまで報告されたこれらの蛋白質と全く異なる新規な
抗腫瘍性物質を発見し、さらにこの蛋白質をコードする
ｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全アミノ酸配列
を確定するとともに、有用性を確認した。この新規な抗
腫瘍性蛋白質とその遺伝子は、本出願人によって出願さ
れ、国際公開90／10651号として公開されている。この
新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＦ−IIと命名されている。こ
のＴＣＦ−IIは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性を
合わせもち、さらに肝臓実質細胞の増殖因子であるＨＧ
Ｆの多様なファミリーの一種であることが確認された。
ＴＣＦ−IIはＳＤＳ電気泳動による分子量測定では78,0
00±2,000 または74,000±2,000 の分子量を示し、還元
した場合52,000±2,000 の共通のバンドであるＡ鎖と3
0,000±2,000 または26,000±2,000 の２本のバンド
（Ｂ鎖、Ｃ鎖）を示す。ＴＣＦ−IIは肝臓実質細胞の増
殖因子であることから肝切除後の肝臓再生を目的とした
利用が可能であり、このような研究が行われているが、
まだ動物実験によりその効果を確認した例がなく、肝臓
疾患の治療薬として使用できることは知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはＴＣＦ−
IIの生理活性に注目し、抗腫瘍剤としての利用や疾病の
診断のマーカーとしての利用を検討してきた。本発明者
らは、ＴＣＦ−IIの肝臓に対する作用を研究する過程か
ら、ＴＣＦ−IIが単に肝実質細胞の増殖をもたらすだけ
でなく、種々の肝臓疾患に対し治療効果を有する事を見
いだした。これまでＴＣＦ−IIが種々の肝臓疾患に対し
治療効果を有することは確認されておらず、本発明者ら
によりはじめて種々の肝臓疾患に対し治療効果を有する
ことが見い出された。本発明は、ＴＣＦ−IIを有効成分
とする肝臓疾患治療剤を提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＴＣＦ−IIを
有効成分とする肝臓疾患治療剤に関する。本発明の有効
成分は、前記したようにヒト線維芽細胞由来の公知の糖
蛋白質である。このＴＣＦ−IIは、ＳＤＳ電気泳動法に
よる分子量測定で、非還元では78,000±2,000 又は74,0
00±2,000 であり、還元下では52,000±2,000 の共通バ
ンドＡと、30,000±2,000 のバンドＢ及び26,000±2,00
0 のバンドＣの２本のバンドとを示す。また等電点は
7.4〜8.6 で 723個のアミノ酸配列よりなる糖蛋白であ
る。上記ＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞培養液を濃縮
し、イオン交換体に吸着させ、その溶出液をアフィニテ
ィクロマトグラフィーを行って得ることもできるし（Ｗ
Ｏ90／10651 号公報）あるいは遺伝子工学的手法（ＷＯ
92／01053 号公報）によって得ることもできる。

【０００５】すなわち、ＴＣＦ−IIは先に示したＷＯ90
／10651 号公報に開示された方法によって得られた、ヒ
ト線維芽細胞由来のものを用いることが可能である。ま
た同公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や
他の細胞により遺伝子組み換え操作により生産されたも
のであっても差し支えない。遺伝子操作によりＴＣＦ−
IIを製造する方法については、本発明者らにより出願さ
れ、ＷＯ92／01053 号公報として公開されている方法で
生産したものを用いることができる。また宿主細胞、微
生物の違いにより糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合し
ていないものであっても使用可能である。しかし糖鎖は
生体内の代謝速度に関係しているため糖鎖の結合してい
るものが望ましい。ＴＣＦ−IIは通常の単離精製法によ
ってさらに濃縮・精製することができる。例えば、有機
溶媒による沈殿法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクロ
ーナル抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動
法などが上げられる。これらの精製法の内モノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティークロマトについては、本
発明者により特願平３−177236号として出願されている
モノクローナル抗体を用いて精製することができる。得
られた精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥若しくは凍結保存す
ることができる。

【０００６】本発明の肝臓疾患治療剤は注射剤として投
与することができる。この場合、静注、動注、筋注ある
いは皮下注射のいずれでもよい。また必要に応じて、ア
ミノ酸、ビタミン、リン脂質、マロチレート、プレドニ
ゾロン、グリチルリチンなどの肝臓障害治療に用いられ
ている薬物と併用することができる。本発明の肝臓疾患
治療剤に含まれる、ＴＣＦ−IIの投与量は、投与患者の
症状や、病状、年令等によって定められるが、成人一人
あたり精製ＴＣＦ−IIとして100-30,000μｇ好ましく
は、500-3000μｇを含有する製剤を１週間に１〜７回投
与することができる。また患者の症状によっては長期間
の投与も可能である。

【０００７】以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に
説明する。

【実施例１】ＴＣＦ−IIの精製ＷＯ90／10651 号公報に開示された方法及び東尾らの方
法（Higasio,K.et.al.B.B.R.C.,vol.170,397-404,1990)
に準じて細胞を培養し精製ＴＣＦ−IIを得た。ヒト線維
芽細胞ＩＭＲ−90（ＡＴＣＣＣＣＬ 186）細胞を５％
子牛血清を含むＤＭＥＭ 100ｍｌをいれたローラーボト
ルに３×10⁶個移植し、0.5 〜２回転／分の回転速度で
回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が１×10
⁷個になったところでトリプシンにより細胞を剥離し細
胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミック 1
00ｇ（東芝セラミック社製）を殺菌して投入し、24時間
精置して培養した。その後上記培養液を 500ｍｌ加え、
培養を継続した。７〜10日ごとに培地を全量回収し、新
鮮培地を補給した。このようにして２ケ月間の生産を継
続し、ローラーボトル一本あたり４ｌの培養液を回収し
た。このようにして得た培養液当たりの比活性は32μ／
ｍｌであった。培養液 750ｌをアミコン社製メンブラン
フィルター（ＭＷ 6000 カット）処理によりＵＦ濃縮
し、ＣＭセファデックスＣ−50（ファルマシア社製）、
ＣｏｎＡセファロース（ファルマシア社製）、Ｍｏｎｏ
Ｓカラム（ファルマシア社製）ヘパリンセファロース
（ファルマシア社製）による５段階のクロマト精製を行
い、比活性5248000 ｕ／ｍｇの精製ＴＣＦ−IIを得た。

【０００８】

【実施例２】遺伝子組換ＴＣＦ−IIの生産ＷＯ92／01053 号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ
−II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−II
を得た。形質転換ナマルワ（Namalwa)細胞を培養し、培
養液20l を得た。この培養液をCM−セファデックスC-50
クロマト、Con-A セファロースCL-6B クロマト、MonoS
カラムを装着したHPLCの順に処理を行い、約11mgの活性
ＴＣＦ−IIを得た。

【０００９】

【実施例３】ＴＣＦ−II製剤の生産例本実施例においては、上記実施例２の方法により得るこ
とのできた遺伝子組み換えＴＣＦ−IIの静注用、皮下
用、筋注用注射製剤の生産例を示した。 (1) ＴＣＦ−II 20μg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に 2mlずつ分注し、凍
結乾燥密封した。 (2) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に 2mlずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００１０】 (3) ＴＣＦ−II 20μg ツイーン80 2mg ソルビトール 4ｇ上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に 2mlずつ分注し、凍
結乾燥密封した。 (4) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 2mg グリシン 2ｇ上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に 2mlずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００１１】 (5) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 1mg ソルビトール 2ｇグリシン 1ｇ上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (6) ＴＣＦ−II 20μg ソルビトール 4ｇヒト血清アルブミン 50mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１２】 (7) ＴＣＦ−II 40μｇグリシン 2ｇヒト血清アルブミン 50mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (8) ＴＣＦ−II 10mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１３】

【発明の効果】本発明によりＴＣＦ−IIを有効成分とし
て含有する肝臓疾患治療剤が提供される。以下に本実施
例により製造した治療剤の効果を確認した実験例を示
し、本発明の効果を説明する。

【００１４】

【実験例１】急性肝障害、慢性肝障害、肝硬変に対する治療効果 (1) 方法７０％肝切除をおこなった正常肝、急性障害肝（肝炎
型、実質細胞障害型）、慢性障害肝および肝硬変に対す
る治療効果を確認した。ウィスター系雄ラットを用い、
７週齢（体重 200g)で肝臓の70％切除を行った正常肝ラ
ット(n=6) 、肝切除直後に 500μg/kgのガラクトサミン
を皮下投与した急性肝炎ラット(n=9-10)、肝切除直後に
0.3ml/kgの四塩化炭素を経口投与した急性実質細胞障害
肝ラット(n=10)をそれぞれ作製した。また、７週齢から
0.7ml/kgの四塩化炭素を週2 回4 週間または10週間の反
復経口投与を行ったラットに同様の肝切除を施し、慢性
障害肝ラット(n=10)と肝硬変ラット(n=9-10)をそれぞれ
作製した。なお、慢性障害肝ラットでは肝切除直後に0.
3ml/kgの四塩化炭素を経口投与して急性実質細胞障害肝
ラットと同様の急性症状を惹起し、ＴＣＦ−IIに対する
反応性を比較した。ＴＣＦ−IIは肝切除直後から12時間
間隔で静脈内に投与し、正常肝切除ラットには20、100
、500 μg/kgの３容量を、それ以外のラットには 500
μg/kgを投与して 0.1％ヒト血清アルブミン添加PBS 投
与群と比較した。正常肝切除ラットに対するＴＣＦ−II
の作用を検討するために、術後48時間目でトロンボテス
ト値と血清トリグリセリド、術後72時間目で血清総蛋白
と血清HDL コレステロール、術後96時間目で肝重量、肝
DNA 量および肝総蛋白量を測定した。 (2) 結果 70％肝臓切除術によりトロンボテスト値の遅延、血清ト
リグリセリド、血清総蛋白およびHDL コレステロールの
低下が観察されたが、ＴＣＦ−IIはいずれのパラメータ
も用量依存的に改善させた。正常肝、急性障害肝、慢性
障害および肝硬変ラットにおいて、それぞれ肝切除48時
間目のトロンボテスト値（図１）、血漿フィブリノーゲ
ン（図２）、血清トリグリセリド（図３）及び血清総蛋
白（図４）、肝重量（図５）、肝総蛋白量（図６）、肝
DNA 量（図７）は、いずれの場合もＴＣＦ−II投与群が
0.1％ヒト血清アルブミン添加 PBS投与群よりこれらの
パラメーターが改善した。

【００１５】

【実験例２】脂肪肝に対する効果 (1) 方法 7週齢のウィスター系雄ラットにDL−エチオニンを250mg
/kgの投与量で４日間繰り返し腹腔内に投与した。これ
らのラット(n=10)にＴＣＦ−II(50 および 500μg/kg)
を12時間間隔で静脈内に投与し、48時間目のプロトロン
ビン時間(pT)、アンチトロンビII活性(AT III)、尿素態
窒素（BUN)、総コレステロール(T-CHO) 、リン脂質(P
L)、HDL コレステロール(HDL) および肝実質細胞1000個
当たりの分裂期細胞数(Mitotic index) ならびに72時間
目の血清中の総蛋白(TP)、トランスアミナーゼ(GOT) お
よび乳酸脱水素酵素(LDH) を測定した。 (2) 結果各測定値の平均値と標準誤差値を表1 に示した。ＴＣＦ
−IIは50μg/kg以上の投与量でエチオニン脂肪肝ラット
の諸症状を容量依存的に改善した。

【００１６】

【表１】

【００１７】

【実験例３】胆汁鬱滞型肝障害に対する効果 (1) 方法 7週齢のウィスター系雄ラットに50mg/kg のα−ナフチ
ルイソチオシアネートを経口投与した。ＴＣＦ−IIはα
−ナフチルイソチオシアネート投与直後より12時間間隔
で2 回静脈内に投与した。ＴＣＦ−II投与後12時間目に
採血を行い、血清中のトランスアミナーゼ(GOT,GPT) 、
アルカリフォスファターゼ(ALP)P、γ−グルタミールト
ランスペプチダーゼ（γ−GTP)、総ビリルビン(T-BIL)
、直接型ビリルビン(D-BIL) および肝異物排泄機能検
査(BSP試験) を行った。 (2) 結果各測定値の平均値と標準誤差値を表2 に示した。ＴＣＦ
−IIは500 μg/kgの投与量で各パラメーターとも改善を
示し、胆汁鬱滞型肝障害の諸症状を改善した。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【実験例４】急性肝炎に対する効果 (1) 方法 7週齢のウィスター系雄ラット(n=8) に1g/kg のガラク
トサミンを皮下投与した。ＴＣＦ−IIはガラクトサミン
投与直後より250 μg/kgを4 時間間隔で4 回静脈内に投
与し、これを2 日間繰り返した。ガラクトサミン投与後
48時間目に採血を行い、血清中のトランスアミナーゼ(G
OT,GPT) 、γ−グルタミールトランスペプチダーゼ（γ
−GTP)、血清総蛋白(TP)、総コレステロール(T-CHO) 、
トリグリセリド(TG)、リン脂質(PL)、β−リポ蛋白（β
−Lipo) ならびに、肝重量、肝蛋白量、肝DNA 量を測定
した。 (2) 結果各測定値の平均値と標準誤差値を表3 に示した。ＴＣＦ
−IIは250 μg/kgの投与量で各パラメーターとも改善を
示し、急性肝炎の諸症状を改善した。

【００２０】

【表３】

【００２１】

【実験例５】投与方法による治療効果 (1) 方法ウィスター系雄ラットを用い、７週齢（体重 200g)で肝
臓の70％切除を行った正常肝ラットに肝切除直後よりＴ
ＣＦ−IIを12時間間隔の間歇静脈内投与法(n=6) と昼夜
持続点滴静脈内注入法(n=12)の2 投与方法による作用強
度を比較した。投与量はいずれも1 日当たり1mg/kgとな
るように設定し、肝切除48時間目の血清総蛋白、アルブ
ミン、トリグリセリド、HDL-コレステレロールならびに
トロンボテスト値を測定し、さらに肝臓重量を測定し、
肝臓再生率を切除肝重量から産出した。 (2) 結果 70％肝臓切除後のＴＣＦ−II投与による、血清総蛋白
（図８）、アルブミン（図９）、ＨＤＬ−コレステロー
ル（図10）、トリグリセリド（図11）、再生率（図12）
及びトロンボテスト値（図13）のそれぞれの変化を示
す。いずれのパラメータも持続点滴を採用したほうが改
善効果を示した。以上の実験結果により本発明による肝
臓疾患治療薬は、これまで治療の困難であった人の肝臓
疾患に対し有効に働くものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】肝臓切除各種病態ラットに対するトロンボテス
ト値を示す。

【図２】肝臓切除各種病態ラットの血清フィブリノーゲ
ン量を示す。

【図３】肝臓切除各種病態ラットの血清トリグリセリド
量を示す。

【図４】肝臓切除各種病態ラットの血清総蛋白量を示
す。

【図５】肝臓切除各種病態ラットの肝臓重量を示す。

【図６】肝臓切除各種病態ラットの肝臓蛋白量を示す。

【図７】肝臓切除各種病態ラットの肝臓ＤＮＡ量を示
す。

【図８】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投与
または持続投与した場合の血清総蛋白量を示す。

【図９】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投与
または持続投与した場合の血清アルブミン量を示す。

【図１０】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投
与または持続投与した場合のHDL-コレステロール値を示
す。

【図１１】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投
与または持続投与した場合の血清トリグリセリド値を示
す。

【図１２】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投
与または持続投与した場合の肝再生率を示す。

【図１３】肝臓切除ラットに対し、ＴＣＦ−IIを間歇投
与または持続投与した場合のトロンボテスト値を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＣＦ−IIを有効成分として含有する肝
臓疾患治療剤。
【請求項２】肝臓疾患が急性肝炎、慢性肝炎、肝硬
変、脂肪肝あるいは胆汁鬱血型肝障害である請求項１記
載の肝臓疾患治療剤。