JPH0670077B2 - 変形されたエグリンｂ又はｃ及びその製造方法並びにこれを含有する医薬 - Google Patents

変形されたエグリンｂ又はｃ及びその製造方法並びにこれを含有する医薬

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JPH0670077B2
JPH0670077B2 JP59139198A JP13919884A JPH0670077B2 JP H0670077 B2 JPH0670077 B2 JP H0670077B2 JP 59139198 A JP59139198 A JP 59139198A JP 13919884 A JP13919884 A JP 13919884A JP H0670077 B2 JPH0670077 B2 JP H0670077B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、エグリン(eglin)Ｂ及びエグリンＣの一次
構造を有する新規な変形されたプロテアーゼ阻害物質、
この物質の製造方法、及びこの物質から製造される医薬
に関する。
（従来の技術） 水蛭抽出物がプロテアーゼ阻害物質を含有することが知
られている。化学的名称エグリンＢ及びエグリンＣと銘
名された２種類のプロテアーゼ阻害物質が独国公開第28
08396号に記載されている。これらの物質はキモトリプ
シン、ズブチリシン、PMN−顆粒球エラスターゼ、及び
カテプシンＧを強く阻害するが、トリプシン及びパンク
レアゼラスターゼに対しては弱く阻害するに過ぎない。
両エグリンは70アミノ酸残基から成る。これらのＮ−末
端(Thr)は同一であり、そしてこれらは同一のＣ−末端
(‐Val-Gly)を有する。
エグリンは、現在のところPMN−顆粒球エラスターゼの
最も効果的な阻害剤に属する。PMN−顆粒球エラスター
ゼは中性プロテアーゼであって、組織及び可溶性蛋白質
の変性に関与する。
生物におけるこのプロテアーゼ、又はこれらのプロテア
ーゼ類のチェックされない放出により、炎症過程が悪化
し、そして非特異的な蛋白質分解による組織の変性が生
ずる可能性がある。従って、これらの今まで知られてい
る性質により、医療（炎症、敗血性ショック、肺気腫、
膵臟線維症等に対して）における使用に大きな興味が持
たれる。
（発明が解決しようとする問題点） この発明は、エグリンＢ及びＣに基礎を置き、単純化さ
れた構造及び天然の非変形生成物と同様の活性を有する
変形されたプロテアーゼ阻害物質を提供することを目的
とする。
（問題点を解決するための手段） この発明の対象は、エグリンＢ及びＣの一次構造を有
し、該一次構造が分子のＮ−末端における２〜10アミノ
酸単位及び／又は分子のＣ−末端における２〜６アミノ
酸単位が短縮されている変形されたプロテアーゼ阻害物
質である。
特に、エグリンＢ及びエグリンＣの一次構造を有する上
記の変形されたプロテアーゼ阻害物質の一次構造は、分
子のＮ−末端における２〜６アミノ酸単位及び／又は分
子のＣ−末端における２アミノ酸単位だけ短縮されてい
る。
この発明の変形されたプロテアーゼ阻害物質は、好まし
くは、次の一次構造： H-Ser-Glu-Leu-Lys-Ser-Phe-Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-
Thr-Val-Asp-Gln-Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Ty
r-Pro-Gln-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-Ser-
Pro-Val-Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Arg-Va
l-Phe-Tyr-Asn-Pro-Gly-Thr-Asn-Val-Val-Asn-His-Val-
Pro-His-Val-Gly-OH を有し、そしてキモトリプシン複合体についてKi＝5.52
×10-11モル/l（基質:SucAlaAlaProPhepNA）の解離定数
を有する変形されたプロテアーゼ阻害物質F1;及び次の
一次構造： H-Leu-Lys-Ser-Phe-Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-Thr-Val-
Asp-Gln-Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Tyr-Pro-Gl
n-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-Ser-Pro-Val-
Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Arg-Val-Phe-Ty
r-Asn-Pro-Gly-Thr-Asn-Val-Val-Asn-His-Val-Pro-His-
Val-Gly-OH を有し、そしてキモトリプシン複合体についてKi＝5.37
×10-11モル/l（基質:SucAlaAlaProPhepNA）の解離定数
を有する変形されたプロテアーゼ阻害物質F2である。
この発明の変形された阻害物質はキモトリプシンと複合
体化合物を形成する。すなわち、これらはプロテアーゼ
であるキモトリプシンを阻害する。第１表から明らかな
通り、この発明の化合物の複合体化合物の解離定数はエ
グリンＣのそれに匹敵する。
解離定数は、N.M.Green及びE.Work,Biochemical Journa
l 54,349-352頁の公知の方法により測定される。
この発明の短縮されたエグリンは、驚くべきことに阻害
効果が十分に維持されている変形された生成物である。
この発明のプロテアーゼ阻害剤は多くの利点により区別
される。これらはエグリンに比べて短いペプチド鎖を有
するために、より容易に合成することができ、そしてさ
らにアレルゲン活性が低く、そしてより良好な吸収能を
有する。
この発明の化合物は、例えばエグリンＢ又はＣの酵素的
分解により、あるいは化学合成により得られる。
エグリンＢ又はＣのこの発明に従う酵素的分解は、ペプ
チダーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼ、すなわちア
ミノ酸鎖をカルボキシ末端から切断するプロテアーゼ、
及びアミノペプチダーゼ、すなわちアミノ末端からアミ
ノ酸鎖を攻撃するプロテアーゼを用いる限定された蛋白
質分解により行われる。この発明の方法にとって適当で
あり、そして担体に付着することができるものはカルボ
キシペプチダーゼＡ、ロイシンアミノペプチダーゼＡ、
並びにカテプシンA,B,C及びＤである。しかしながら、
カルボキシペプチダーゼＹ、及びカテプシンＣが特に適
当である。カテプシンＣは、ジペプチジルアミノペプチ
ダーゼとして、蛋白質の非置換アミノ末端からジペプチ
ドを逐次切り離す。次に、エグリンＣ、並びにカテプシ
ンＣを用いる分解によって得られる変形生成物F1及びF2
のアミノ酸酸列（Ｎ−末端から始まる）を比較すること
により、カテプシンＣの作用の態様を示す。
エグリンC:Thr Glu Phe Gly Ser Glu Leu Lys- F1: Ser Glu Leu Lys- F2: Leu Lys- エグリンC:-Ser Phe Pro Glu Val Val… F1 :-Ser Phe Pro Glu Val Val… F2 :-Ser Phe Pro Glu Val Val… 限定された蛋白質分解による変形されたプロテアーゼ阻
害物質の製造のための前記の方法は、 （ａ）エグリンＢ又はＣをpH4〜７の適切な緩衝液系に
入れ； （ｂ）適切な緩衝液系に溶解されたペプチダーゼを加
え、そして所望により0.5％のラウリル硫酸ナトリウム
を加え； （ｃ）この混合物を２〜72時間、10℃〜40℃にてインキ
ュベートし； （ｄ）反応混合物をクロマトグラフィーにより精製し；
そして、 （ｅ）脱塩する； ことを含んで成る。
変形された阻害物質F1の製造方法は好ましくは、 （ａ）エグリンＣを１％酢酸に溶解し； （ｂ）上記の溶液に、４％ピリジン，水,0.5％酢酸,0.1
NHCl,0.375M2−メルカプトエタノール,0.2M EDTAから成
る緩衝液系中カテプシンＣ(20U/1.14ml)の溶液を加え、
そしてpHを5.0に調整し； （ｃ）この混合物を37℃にて４時間インキュベートし；
そして、 （ｄ）反応混合物を、セファデックスSP−C25陽イオン
交換体上で、0.05M酢酸アンモニウム(pH5.0)により平衡
化し、そして0.05M酢酸アンモニウム、及び0.05M酢酸ア
ンモニウム中0.4M塩化ナトリウムの等容量から調製され
るpH5.0におけるグラジエントにより溶出することによ
り精製する； ことを含んで成る。
変形された阻害物質F2の製造方法は、 （ａ）エグリンＣを１％酢酸に溶解し； （ｂ）上記の溶液に、４％ピリジン，水,0.5％酢酸,0.1
N塩酸,0.375M2−メルカプトエタノール,0.2M EDTAから
成る緩衝液系中カテプシンＣ(20U/1.14ml)の溶液を加
え、そしてpHを5.0に調整し； （ｃ）この混合物を37℃にて48時間インキュベートし；
そして、 （ｄ）反応混合物を、セファデックスSP−C25陽イオン
交換体上で、0.05M酢酸アンモニウム(pH5.0)により平衡
化し、そして0.05M酢酸アンモニウム、及び0.05M酢酸ア
ンモニウム中0.4M塩化ナトリウムの等容量から調製され
るpH5.0におけるグラジエントにより溶出することによ
り，但し、まず変形されたプロテアーゼ阻害物質F1を溶
出し、次に変形されたプロテアーゼ阻害物質F2を溶出す
ることにより精製する； ことを含んで成る。
インキュベーション時間がエグリン分子の分解の程度を
決定することは容易に理解できよう。例えば、エグリン
ＣをカテプシンＣにより分解する場合、４時間のインキ
ュベーションの後には変形生成物F1のみが得られ、24時
間後には変形生成物F1が変形生成物F2と共に得られ、そ
して48時間後には変形生成物F2が支配的に得られる。反
応経過を、ディスク電気泳動（pH8.9;15％ゲル;No.2Mau
rer系に相当する）により追跡することができる。得ら
れたRf値は次の通りである。
エグリンＣ :0.52 変形生成物F1:0.42 変形生成物F2:0.3 上記のようにして得られた変形された阻害物質F1及びF2
は電気泳動的に均一である（No.2Maurerゲル系における
非連続的ゲル電気泳動による確認）。
さらに、この発明の化合物は化学的手段により得られ
る。化学合成は、適当に保護されている場合がある対応
するアミノ酸単位を用いて、それ自体公知の方法に従っ
て行うことができる。特に、このペプチド合成は、存在
するアミノ基、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基の
少なくとも１つが保護基を担持している、この発明の化
合物に対応する化合物の保護基の除去を含む。この合成
は、変形されたプロテアーゼ阻害物質F1及びF2の合成を
例示する次の方式によりさらに詳細に例示される（Houb
en Weyl,Vol.15/I Synthesevon Peptiden,Georg Thiem
Verlag,スタットガルト,1974,に従う略号を使用す
る）。
1.変形されたプロテアーゼ阻害物質F1の合成 上記のアミノ酸配列は、第２表１〜７に示すようにして
まず７個の部分配列（配列Ｉ〜VII）を合成し、これら
を第３表に示すように連結して配列XIIIを形成し、これ
を脱保護することにより形成する。
2.変形されたプロテアーゼ阻害剤F2の合成 この化合物は、第４表に記載した合成配列XIIを使用
し、これと次の第４表に記載する保護されたノナペプチ
ドXVとを連結して化合物XVIを得、これを脱保護するこ
とにより合成される。
この発明に従って得られる変形されたエグリンは、価値
ある薬理学的性質を有し、そしてエグリンと同様に（例
えば独国公開第2808396号を参照のこと）予防的に、又
は特に治療的に使用することができる。
この発明の新規化合物は、肺疾患、例えば白血球エラス
ターゼにより生ずる肺疾患、例えば肺気腫及びARDS（急
性呼吸器疾患症候群）、場合によってはさらに膵臟線維
症の予防及び治療のために、さらには敗血病性ショック
の場合に消炎剤及び抗炎症剤として使用することができ
る。上記の疾患症状の予防又は治療のための、この発明
の新規なエグリン化合物の使用もまたこの発明の対象で
ある。
この発明の他の対象は、この発明のプロテアーゼ阻害物
質の少なくとも１つを、場合によっては常用の担体及び
アジュバントと組合わせて含んで成る医薬、並びにその
製造に関する。
この医薬は、特に上記の症状の場合に使用され、この場
合、例えば非経口的に（例えば静脈内もしくは肺内
に）、又は局所的に投与する。投与量は第一に特定の投
与形態並びに治療及び予防の目的に依存して異る。
投与は静脈注射により、又は例えばバート器を用いて吸
入により肺内に行う。従って、非経口投与のための医薬
は単位投与形において、適用方法に依存して約10〜50mg
のこの発明の化合物を含有する。この医薬組成物は、活
性成分のほかに、好ましくは浸透圧調整用の塩化ナトリ
ウム、マンニトール又はソルビトールを含有する。この
医薬組成物は、凍結乾燥形又は形であってよく、溶液は
抗細菌性防腐剤、例えば0.2〜0.3％のヒドロキシ安息香
酸メチルエステル又はエチルエステルを有利に含有する
ことができる。
局所投与のための薬剤は、水溶液、ローションもしくは
ゼリー、油性溶液もしくは懸濁液、又は脂肪含有軟膏も
しくは特に乳剤性の軟膏であってよい。水溶液の形の医
薬は、例えば、この発明の活性成分をpH4〜7.5の水性緩
衝液に溶解し、そして必要により他の活性成分、例えば
抗炎症剤、及び／又は高分子増粘剤、例えばポリビニル
ピロリドン、及び／又は防腐剤を添加することにより製
造される。活性成分の濃度は溶液10ml又はゼリー10g当
り約0.1mg〜約5mg、好ましく0.25mg〜1.0mgとする。
局所投与のための油性適用剤は、この発明の活性成分を
油に懸濁し、場合によっては湿潤剤、例えばステアリン
酸アルミニウム、及び／又はHLB値（親水性−親脂性バ
ランス）が10以下の界面活性剤、例えば多価アルコール
の脂肪酸モノエステル、例えばグリセリンモノエステ
ル、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステア
レート又はソルビタンモノオレエートを添加して製造す
る。脂肪含有軟膏は、例えば、場合によってはHLB値が1
0以下の界面活性剤を添加して塗布可能な脂肪基剤中に
この発明の活性成分を懸濁することにより得られる。乳
剤軟膏は、HLB値が10以下の界面活性剤の添加のもとで
この発明の活性成分の水溶液を軟質の塗布可能な脂肪基
剤中ですりつぶすことにより得られる。これらすべての
適用剤はまた防腐剤を含有することができる。活性成分
の濃度は、基剤10g当り約0.1mg〜約5mg、好ましく0.25m
g〜1.0mgとする。
肺内投与により呼吸器を処置するための吸入剤は、例え
ばエーロゾル又はスプレーであり、これらは薬理活性物
質を溶液又は懸濁液の液滴の形で散布することができ
る。薬理活性物質が溶液の形で存在する製剤は、そのほ
かに適当な噴射剤、さらには必要により追加の溶剤及び
／又は安定剤を含有することができる。噴射剤の代りに
圧縮空気を使用することができ、この場合、この圧縮空
気は適当な圧縮−圧縮解除装置により必要な場合に発生
させることができる。投与のためには、医療に導入され
そして知られているバード吸入器が特に好ましい。この
装置の場合、活性成分の溶液を装置に入れ、そしてわず
かの加圧により霧化し、そして患者の肺に送入する。
年齢、固体の状態及び疾患の種類に依存して、体重約70
kgの温血動物（ヒト及び動物）の場合、肺内投与の場合
の投与量は１吸入当り約10〜30mg（１日１〜２回吸入）
であり、そして静脈投与の場合、例えば持続注入の場
合、１日投り約10〜150mgである。
免疫的方法、例えばELISAにより測定することができる
医療的に有効な喀痰濃度及び血漿濃度は10〜200μg/ml
である。
次に例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但し、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。
例1.限定蛋白質分解による、変形された阻害物質F1の製
造 40μｌの４％ピリジン、79μｌの水、40μｌの0.5％酢
酸、32μｌの0.1N塩酸、８μｌの0.375M2−メルカプト
エタノール、及び２μｌの0.2M EDTAから成る緩衝液系2
00μｌにカテプシンＣの溶液(20U/1.14ml)を加えてイン
キュベーション溶液を調製する。1mlのカテプシンＣイ
ンキュベーション溶液を、150μｌの１％酢酸中2.7mg
（337nモル）のエグリンＣの溶液に加え、そしてこの混
合物をpH5.0に調整する。37℃にて４時間インキュベー
トした後、この混合物をセファデックスSP−C25陽イオ
ン交換体（カラム:0.5cm×50cm）に適用する。カラム中
の材料をpH5.0の0.05M酢酸アンモニウムにより平衡化す
る。５時間後、カラムを、同容量(250ml)の0.05M酢酸ア
ンモニウムと、0.05M酢酸アンモニウム中0.4M塩化ナト
リウムとから調製されたpH5.0のグラジエントにより溶
出する。流速を1.6ml/時に調節する。画分容量を0.8ml
とする。脱塩するため、画分を、アミコン(Amicon)8MC
ミクロフィルター系において、UM2膜を用いて１％酢酸
に対して透析(diafiltration)する。
ディスク電気泳動（pH8.9;15％ゲル;No.2Maurer系に対
応する）において、上記のようにして得られた変形され
た阻害物質F1が0.42のRf値、及びKi＝5.52×10-11モル/
lの解離定数を有する。
アミノ酸分析のため、脱塩したアリコートを真空中窒素
のもとで24時間及び48時間加水分解し、そしてアミノ酸
分析器（Durrum,2nモルプログラム）において分析す
る。Ｎ−末端の決定をダンシル法により行う。配列の明
白な帰属のために10段階のエドマン分解を行う。
例2.限定蛋白質分解による、変形された阻害物質F2の製
造 変形された阻害物質F2の製造方法は上記の方法と同じで
ある。但し反応溶液を37℃にて48時間インキュベートす
る。反応混合物をクロマトグラフ処理する場合、変形さ
れた阻害物質F1がまず溶出し、そして次に変形された阻
害物質F2が溶出する。
ディスク電気泳動（pH8.9;15％ゲル;No.2Maurer系に対
応する）において、変形された阻害物質F2は0.3のRf値
を有し、そしてKi＝5.37×10-11モル/lの解離定数を有
する。
阻害物質F1と同様にしてアミノ酸分析、Ｎ−末端決定、
及び配列の帰属のためのエドマン分解を行う。
例3.変形されたプロテアーゼ阻害物質F1又はF2を含有す
る非経口投与用製剤 例１又は２に従って得られた溶液を0.9％NaCl溶液に対
して透析する。次に、同じNaCl溶液により、前記溶液の
濃度を1mg/ml又は10mg/mlに調整する。この溶液を限外
過（0.22μｍの細孔を有する膜を使用）により無菌化
する。この無菌化した溶液は、静脈内投与、持続点滴注
入、及び吸入器（例えばバード形吸入器）における霧化
のために直接使用することができる。
フロントページの続き (72)発明者 ヨハネス ドツツ ドイツ連邦共和国，8000 ミユンヘン 70，アーバレシユトラーセ ４ (72)発明者 ハンス フリツツ ドイツ連邦共和国，8011 ホーヘンブル ン，ノイリンゲルシユトラーセ 15

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エグリンＢ又はＣのＮ−末端における２〜
    10個のアミノ酸が除去されている、変形されたエグリン
    Ｂ又はＣ。
  2. 【請求項２】エグリンＢ又はＣのＮ−末端における２〜
    ６個のアミノ酸が除去されている、特許請求の範囲第１
    項記載の変形されたエグリンＢ又はＣ。
  3. 【請求項３】エグリンＣのＮ−末端における４〜６個の
    アミノ酸が除去されている、特許請求の範囲第１項記載
    の変形されたエグリンＣ。
  4. 【請求項４】次の一次構造： H-Ser-Glu-Leu-Lys-Ser-Phe-Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-
    Thr-Val-Asp-Gln-Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Ty
    r-Pro-Gln-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-Ser-
    Pro-Val-Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Arg-Va
    l-Phe-Tyr-Asn-Pro-Gly-Thr-Asn-Val-Val-Asn-His-Val-
    Pro-His-Val-Gly-OH を有し、そしてキモトリプシン複合体についてKi＝5.52
    ×10-11モル/l（基質:SucAlaAlaProPhepNA）の解離定数
    を有する特許請求の範囲第１項記載の変形されたエグリ
    ン。
  5. 【請求項５】次の一次構造： H-Leu-Lys-Ser-Phe-Pro-Glu-Val-Val-Gly-Lys-Thr-Val-
    Asp-Gln-Ala-Arg-Glu-Tyr-Phe-Thr-Leu-His-Tyr-Pro-Gl
    n-Tyr-Asp-Val-Tyr-Phe-Leu-Pro-Glu-Gly-Ser-Pro-Val-
    Thr-Leu-Asp-Leu-Arg-Tyr-Asn-Arg-Val-Arg-Val-Phe-Ty
    r-Asn-Pro-Gly-Thr-Asn-Val-Val-Asn-His-Val-Pro-His-
    Val-Gly-OH を有し、そしてキモトリプシン複合体についてKi＝5.37
    ×10-11モル/l（基質:SucAlaAlaProPhepNA）の解離定数
    を有する特許請求の範囲第１項記載の変形されたエグリ
    ン。
  6. 【請求項６】エグリンＢ又はＣのＮ−末端における２〜
    10個のアミノ酸が除去されている変形されたエグリンＢ
    又はＣの製造方法において、エグリンＢ又はＣを限定さ
    れた蛋白質分解により酵素的に分解し；あるいはこの発
    明の化合物に対応し、存在するアミノ基、ヒドロキシル
    基及び／又はカルボキシル基の少なくとも１つにおいて
    保護基を有する化合物中に存在する保護基を除去するこ
    とを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】エグリンＢ又はＣのＮ−末端における２〜
    10個のアミノ酸が除去されている変形されたエグリンＢ
    又はＣの製造方法において、 （ａ）エグリンＢ又はＣをpH4〜７の適切な緩衝液系に
    入れ； （ｂ）適切な緩衝液系に溶解されたペプチダーゼを加
    え、そして所望により0.5％のラウリル硫酸ナトリウム
    を加え； （ｃ）この混合物を２〜72時間、10℃〜40℃にインキュ
    ベートし； （ｄ）反応混合物をクロマトグラフィーにより精製し；
    そして （ｅ）脱塩する； ことを含んで成る特許請求の範囲第６項に記載の方法。
  8. 【請求項８】エグリンＢ又はＣのＮ−末端において２〜
    10個のアミノ酸が除去されている変形されたエグリンＢ
    又はＣを、医薬として適当な担体と共に混合して又は組
    合わせて含んで成るプロテアーゼ阻害医薬。
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