JPH0714852B2 - 化粧料用乳酸菌製剤 - Google Patents
化粧料用乳酸菌製剤Info
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- JPH0714852B2 JPH0714852B2 JP4284369A JP28436992A JPH0714852B2 JP H0714852 B2 JPH0714852 B2 JP H0714852B2 JP 4284369 A JP4284369 A JP 4284369A JP 28436992 A JP28436992 A JP 28436992A JP H0714852 B2 JPH0714852 B2 JP H0714852B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は化粧料用乳酸菌製剤に関
するものであり、より詳しくは、乳酸菌を培養した後、
回収した菌体を破砕及び遠心分離し、その上澄液に金属
イオンを添加して濾過して得た破砕液と、上記遠心分離
後沈殿させた細胞ペレットを、水又は有機溶媒及び非イ
オン系界面活性剤で抽出し濾過して得た抽出液からなる
乳酸菌製剤に関する。
するものであり、より詳しくは、乳酸菌を培養した後、
回収した菌体を破砕及び遠心分離し、その上澄液に金属
イオンを添加して濾過して得た破砕液と、上記遠心分離
後沈殿させた細胞ペレットを、水又は有機溶媒及び非イ
オン系界面活性剤で抽出し濾過して得た抽出液からなる
乳酸菌製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】最近、細胞に対する研究が進められるに
従って、機能性化粧品に対する関心が高まっている。そ
の機能性化粧品の原料開発において重要な側面の一つ
は、活性酸素類の消去である。
従って、機能性化粧品に対する関心が高まっている。そ
の機能性化粧品の原料開発において重要な側面の一つ
は、活性酸素類の消去である。
【０００３】該活性酸素類は、人及び他の動物におい
て、酸素代謝により発生する副産物であり、例えば、ス
ーパーオキサイドラジカル（Ｏ2−・）、ヒドロキシラ
ジカル（・ＯＨ）及びシングレット酸素（singlet oxyg
en，1Ｏ2）等である。
て、酸素代謝により発生する副産物であり、例えば、ス
ーパーオキサイドラジカル（Ｏ2−・）、ヒドロキシラ
ジカル（・ＯＨ）及びシングレット酸素（singlet oxyg
en，1Ｏ2）等である。
【０００４】活性酸素類は、脂質過酸化（lipid supero
xidation）、蛋白質変性、核酸の突然変異誘発等の作用
を有し、このような活性酸素類の作用は、老化、発癌の
根源的原因となっており（Leibvitz B.E.& Siegel B.
W.,1980 、 J.Gerontol 35:45）、生体の炎症反応（Wil
liam F.P.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:11
59 (1980)）及び各種疾患と関連している（Chikako Nis
higen M.D.et al., J Invest.Derma (1989)）。
xidation）、蛋白質変性、核酸の突然変異誘発等の作用
を有し、このような活性酸素類の作用は、老化、発癌の
根源的原因となっており（Leibvitz B.E.& Siegel B.
W.,1980 、 J.Gerontol 35:45）、生体の炎症反応（Wil
liam F.P.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:11
59 (1980)）及び各種疾患と関連している（Chikako Nis
higen M.D.et al., J Invest.Derma (1989)）。
【０００５】生体はこれらの有害活性酸素類に対し、例
えばスーパーオキサイドディスムターゼ（superoxide d
ismutase、ＳＯＤ）、カタラーゼ（catalase）又はグル
タチオンパーオキシダーゼ（glutathione peroxidase）
等の防御システムを有しているが、老化が始められるか
又はストレスを受けるようになると防御能が劣る。従っ
て、人為的に活性酸素類を除去する必要性が台頭し、Ｓ
ＯＤ、ラクトフェリン等が、使用ないし開発されてきて
いる。
えばスーパーオキサイドディスムターゼ（superoxide d
ismutase、ＳＯＤ）、カタラーゼ（catalase）又はグル
タチオンパーオキシダーゼ（glutathione peroxidase）
等の防御システムを有しているが、老化が始められるか
又はストレスを受けるようになると防御能が劣る。従っ
て、人為的に活性酸素類を除去する必要性が台頭し、Ｓ
ＯＤ、ラクトフェリン等が、使用ないし開発されてきて
いる。
【０００６】しかしながら、ＳＯＤは蛋白質であるの
で、脂質に対し難溶性であり、安定性が悪く、皮膚への
透過性が低い等の問題がある。又、ラクトフェリンは牛
乳から複雑な抽出工程を経て抽出しなければならないと
いう短所がある。
で、脂質に対し難溶性であり、安定性が悪く、皮膚への
透過性が低い等の問題がある。又、ラクトフェリンは牛
乳から複雑な抽出工程を経て抽出しなければならないと
いう短所がある。
【０００７】一方、機能性化粧品の開発において注目さ
れている側面は、皮膚における損傷されたＤＮＡのリペ
ア（repair）機能を活性化することである。
れている側面は、皮膚における損傷されたＤＮＡのリペ
ア（repair）機能を活性化することである。
【０００８】ＤＮＡは生体内の機能情報を有しており、
生命現象に関連した重要な機能を行っており、常に外部
から損傷の危険にさらされているが、生体にはリペアシ
ステム（repair system ）が存在するので、ＤＮＡはこ
のような危険から保護されている。
生命現象に関連した重要な機能を行っており、常に外部
から損傷の危険にさらされているが、生体にはリペアシ
ステム（repair system ）が存在するので、ＤＮＡはこ
のような危険から保護されている。
【０００９】しかしながら、老化及び外部からの持続的
な刺激は、このような回復機能を低下させ、これは細胞
の老化促進、癌化その他の各種の疾病を惹き起こす（V.
A. Bohr et al., 1989,Laboratory Investigation 61
(2):143 ）。特に紫外線に過度にさらされると、チミジ
ン二量体が形成され、これが細胞破壊あるいは遺伝的機
能の喪失を誘発させる直接的な原因となる。
な刺激は、このような回復機能を低下させ、これは細胞
の老化促進、癌化その他の各種の疾病を惹き起こす（V.
A. Bohr et al., 1989,Laboratory Investigation 61
(2):143 ）。特に紫外線に過度にさらされると、チミジ
ン二量体が形成され、これが細胞破壊あるいは遺伝的機
能の喪失を誘発させる直接的な原因となる。
【００１０】今迄、化粧料にＤＮＡリペア機能を付与す
るための化粧料用材料としては、植物抽出液、プラセン
タ抽出液、放線菌抽出液等の抗突然変異剤等が開発され
ている。しかし、植物又は放線菌由来の抽出物は、皮膚
への親和性が低く副作用を起こし、又、プラセンタ抽出
液はこのような問題点を有していないが生産量が制限さ
れているという問題点がある。
るための化粧料用材料としては、植物抽出液、プラセン
タ抽出液、放線菌抽出液等の抗突然変異剤等が開発され
ている。しかし、植物又は放線菌由来の抽出物は、皮膚
への親和性が低く副作用を起こし、又、プラセンタ抽出
液はこのような問題点を有していないが生産量が制限さ
れているという問題点がある。
【００１１】さらに機能性化粧料の開発に関連する他の
側面は、老化の進行に従って低下する皮膚の免疫機能を
活性化させ得る能力を有する化粧料用物質の提供にあ
る。免疫は生体の外部に対する主要な防御機構であっ
て、絶え間ない外部からの刺激に対し、生体を保持し得
る基本的手段である。しかしながら、老化は、生体の免
疫能を低下させ、紫外線はその重要な原因の一つとな
る。このようにして皮膚細胞の免疫機能が低下すれば、
皮膚癌及び各種の皮膚疾患を誘発するようになる。（At
sushi Uchida,Fragrance J.19(9):29(1991) ）。しかし
ながら、今迄のところ、満足し得る皮膚の免疫機能活性
化能を有する物質は開発されていないのが実情である。
側面は、老化の進行に従って低下する皮膚の免疫機能を
活性化させ得る能力を有する化粧料用物質の提供にあ
る。免疫は生体の外部に対する主要な防御機構であっ
て、絶え間ない外部からの刺激に対し、生体を保持し得
る基本的手段である。しかしながら、老化は、生体の免
疫能を低下させ、紫外線はその重要な原因の一つとな
る。このようにして皮膚細胞の免疫機能が低下すれば、
皮膚癌及び各種の皮膚疾患を誘発するようになる。（At
sushi Uchida,Fragrance J.19(9):29(1991) ）。しかし
ながら、今迄のところ、満足し得る皮膚の免疫機能活性
化能を有する物質は開発されていないのが実情である。
【００１２】一方、従来より、脱脂乳から保湿効果に優
れた化粧料物質を得ることができることが知られてお
り、特にＵＳＰ４，５２４，１３６号では、脱脂乳又は
脱脂粉乳中で乳酸菌の培養とプロテアーゼによるカゼイ
ン分解を同時に実施する第１段階と、乳酸菌の滅菌とプ
ロテアーゼの不活性化を同時に実施する第２段階からな
る透明な化粧料物質の製造方法を開示している。しかし
ながら、上記特許は、ラクテートが自然保湿因子として
有用であるとのことに着目したものであって、その目的
は、皮膚への吸収性と吸着性とを増進させた透明化粧料
を提供するものに過ぎない。
れた化粧料物質を得ることができることが知られてお
り、特にＵＳＰ４，５２４，１３６号では、脱脂乳又は
脱脂粉乳中で乳酸菌の培養とプロテアーゼによるカゼイ
ン分解を同時に実施する第１段階と、乳酸菌の滅菌とプ
ロテアーゼの不活性化を同時に実施する第２段階からな
る透明な化粧料物質の製造方法を開示している。しかし
ながら、上記特許は、ラクテートが自然保湿因子として
有用であるとのことに着目したものであって、その目的
は、皮膚への吸収性と吸着性とを増進させた透明化粧料
を提供するものに過ぎない。
【００１３】本発明者らは、脱脂乳又は脱脂粉乳に金属
イオンと蛋白質分解酵素及び乳酸菌を添加して培養した
後、乳酸菌を分離し、特定の処理をすれば、保湿効果と
有害酸素消去効果とに優れた化粧料物質が得られること
を明らかにした（大韓民国特許出願第９０−６４１９
号）。しかしながら、このような化粧料物質等は、損傷
されたＤＮＡのリペア機能の活性化がまだ充分でなく、
また、上記特許出願第９０−６４１９号に記載された化
粧料用乳酸菌培養液の製造過程では、分離された乳酸菌
を破砕した液のうち、上澄液のみを使用するため不経済
であり、その効果面においても不充分な面がある。
イオンと蛋白質分解酵素及び乳酸菌を添加して培養した
後、乳酸菌を分離し、特定の処理をすれば、保湿効果と
有害酸素消去効果とに優れた化粧料物質が得られること
を明らかにした（大韓民国特許出願第９０−６４１９
号）。しかしながら、このような化粧料物質等は、損傷
されたＤＮＡのリペア機能の活性化がまだ充分でなく、
また、上記特許出願第９０−６４１９号に記載された化
粧料用乳酸菌培養液の製造過程では、分離された乳酸菌
を破砕した液のうち、上澄液のみを使用するため不経済
であり、その効果面においても不充分な面がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従って、有害な活性酸
素類の消去効果、ＤＮＡのリペア機能活性化効果及び皮
膚の免疫機能活性化効果を示し、さらに皮膚への親和性
及び吸収性、皮膚への低刺激性等の、化粧料物質として
要求される特性を備えた化粧料物質の提供が所望されて
来た。
素類の消去効果、ＤＮＡのリペア機能活性化効果及び皮
膚の免疫機能活性化効果を示し、さらに皮膚への親和性
及び吸収性、皮膚への低刺激性等の、化粧料物質として
要求される特性を備えた化粧料物質の提供が所望されて
来た。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、乳酸菌を培養
した後、回収した菌体を破砕及び遠心分離して得た上澄
液に１０μＭ〜５００μＭの金属イオンを添加し、濾過
して得た破砕液と、上記遠心分離により沈殿させた細胞
ペレットを水又は有機溶媒及び非イオン系界面活性剤で
抽出し濾過して得た抽出液からなる化粧料用乳酸菌製剤
を提供するものである。
した後、回収した菌体を破砕及び遠心分離して得た上澄
液に１０μＭ〜５００μＭの金属イオンを添加し、濾過
して得た破砕液と、上記遠心分離により沈殿させた細胞
ペレットを水又は有機溶媒及び非イオン系界面活性剤で
抽出し濾過して得た抽出液からなる化粧料用乳酸菌製剤
を提供するものである。
【００１６】又、本発明は、乳酸菌を培養した後、回収
した菌体を破砕及び遠心分離して得た上澄液に１０μＭ
〜５００μＭの金属イオンを添加し、濾過して得た破砕
液と、上記遠心分離により沈殿させた細胞ペレットを水
又は有機溶媒及び非イオン系界面活性剤で抽出し濾過し
て得た抽出液を含有し、マンニトール又はフラボノイド
等の低分子量活性酸素類消去剤を更に含有することを特
徴とする化粧料用乳酸菌製剤を提供するものである。
した菌体を破砕及び遠心分離して得た上澄液に１０μＭ
〜５００μＭの金属イオンを添加し、濾過して得た破砕
液と、上記遠心分離により沈殿させた細胞ペレットを水
又は有機溶媒及び非イオン系界面活性剤で抽出し濾過し
て得た抽出液を含有し、マンニトール又はフラボノイド
等の低分子量活性酸素類消去剤を更に含有することを特
徴とする化粧料用乳酸菌製剤を提供するものである。
【００１７】以下、本発明を詳しく説明する。
【００１８】本発明による化粧料用乳酸菌製剤を得るた
めに用いられる乳酸菌は、ラ クトバシルス ブルガリク
ス（ Lactobacillus bulgaricus）、エル．アシドフィ
ルス（L.ac idophilus ）、エル．ヘルベチカス（L. hel
veticus ）、エル．カセ イ（L. casei ）等のラクトバ
シルス属と、ストレプトコッ カス サーモフィルス（St
reptococcus thermophilus ）等のストレプトコッカス
属の乳酸菌等が含まれる。
めに用いられる乳酸菌は、ラ クトバシルス ブルガリク
ス（ Lactobacillus bulgaricus）、エル．アシドフィ
ルス（L.ac idophilus ）、エル．ヘルベチカス（L. hel
veticus ）、エル．カセ イ（L. casei ）等のラクトバ
シルス属と、ストレプトコッ カス サーモフィルス（St
reptococcus thermophilus ）等のストレプトコッカス
属の乳酸菌等が含まれる。
【００１９】乳酸菌の培養に用いられる培地は、脱脂乳
（skim milk ）、脱脂粉乳（skim milk powder）、ＭＲ
Ｓブロス培地（MRS broth medium、ディフコ社）又はロ
ゴサブロス培地（Rogasa broth medium 、ディフコ社）
等の公知で慣用されている乳酸菌培養用培地から選ばれ
得る。
（skim milk ）、脱脂粉乳（skim milk powder）、ＭＲ
Ｓブロス培地（MRS broth medium、ディフコ社）又はロ
ゴサブロス培地（Rogasa broth medium 、ディフコ社）
等の公知で慣用されている乳酸菌培養用培地から選ばれ
得る。
【００２０】乳酸菌は、培地に１〜５％の濃度に接種さ
れ、培養は一般的に３５〜４０℃で２０〜２５時間行な
う。一方、培養中に生成されるカゼインを分解させるた
めに、プロテアーゼ、特に中性プロテアーゼ又は酸性プ
ロテアーゼを培地に添加することが好ましい。培養ブロ
スから菌体を回収することは、通常の方法、例えば６０
００ｇ×３０分の条件で遠心分離を行って実施すること
ができる。
れ、培養は一般的に３５〜４０℃で２０〜２５時間行な
う。一方、培養中に生成されるカゼインを分解させるた
めに、プロテアーゼ、特に中性プロテアーゼ又は酸性プ
ロテアーゼを培地に添加することが好ましい。培養ブロ
スから菌体を回収することは、通常の方法、例えば６０
００ｇ×３０分の条件で遠心分離を行って実施すること
ができる。
【００２１】回収された菌体は生理食塩水（０．９％Ｎ
ａＣｌ）又は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（potassiu
m phosphate buffer,pH7.5）で数回洗浄する。
ａＣｌ）又は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（potassiu
m phosphate buffer,pH7.5）で数回洗浄する。
【００２２】洗浄された菌体は、生理食塩水（０．９％
ＮａＣｌ）又は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、例え
ば、５〜２０％程度の濃度に調整され、次いで、ダイノ
ミル（Dyno Mill ）を利用（直径０．１ｍｍのガラスビ
ーズ、3000r.p.m.）するか、又は、文献に記載された方
法（Brian Austin et al., 1981.Manual of Methodsfor
General Bacteriology published by ASM ）によって
破砕させる。
ＮａＣｌ）又は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中、例え
ば、５〜２０％程度の濃度に調整され、次いで、ダイノ
ミル（Dyno Mill ）を利用（直径０．１ｍｍのガラスビ
ーズ、3000r.p.m.）するか、又は、文献に記載された方
法（Brian Austin et al., 1981.Manual of Methodsfor
General Bacteriology published by ASM ）によって
破砕させる。
【００２３】破砕した懸濁液を、遠心分離（１５０００
ｇ、３０分）して上澄液を得た後、少なくとも１種の金
属イオンを１０〜５００μＭの量で添加し、分子量限界
（cut off ）が１００００ダルトン（dalton）の限外濾
過膜を利用して濾過する。得られた濾過液を“破砕液”
とする。上澄液に添加される金属イオンはＣｕ、Ｆｅ、
Ｍｎ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎｉ等の二価イオンであって単独で
又は混合して使用することができる。これら金属は、例
えば、硫酸塩、リン酸塩、塩化物、臭化物、クエン酸塩
等の無機酸塩又は有機酸塩の形態で使用される。特に、
無機酸塩、殊に、硫酸塩が好ましく使用できる。これら
金属塩は、１種単独で又は２種以上を混合して使用され
る。
ｇ、３０分）して上澄液を得た後、少なくとも１種の金
属イオンを１０〜５００μＭの量で添加し、分子量限界
（cut off ）が１００００ダルトン（dalton）の限外濾
過膜を利用して濾過する。得られた濾過液を“破砕液”
とする。上澄液に添加される金属イオンはＣｕ、Ｆｅ、
Ｍｎ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｎｉ等の二価イオンであって単独で
又は混合して使用することができる。これら金属は、例
えば、硫酸塩、リン酸塩、塩化物、臭化物、クエン酸塩
等の無機酸塩又は有機酸塩の形態で使用される。特に、
無機酸塩、殊に、硫酸塩が好ましく使用できる。これら
金属塩は、１種単独で又は２種以上を混合して使用され
る。
【００２４】一方、遠心分離により沈殿された細胞ペレ
ットに、乾燥重量の２０〜５０倍（例えば細胞ペレット
１ｇあたり２０〜５０ｍｌ）の割合で水又は希釈された
エタノール又はメタノール等の極性有機溶媒及び０．０
１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）の非イオン系界面活性剤を入れ
て室温に２〜５日間放置するか又は３０分〜３時間、例
えば、９０℃〜１２０℃程度の温度で加熱抽出した後、
抽出液を分子量限界１００００ダルトンの限外濾過膜を
利用して濾過する。得られた濾液を“抽出液”とする。
ットに、乾燥重量の２０〜５０倍（例えば細胞ペレット
１ｇあたり２０〜５０ｍｌ）の割合で水又は希釈された
エタノール又はメタノール等の極性有機溶媒及び０．０
１〜０．１％（Ｗ／Ｖ）の非イオン系界面活性剤を入れ
て室温に２〜５日間放置するか又は３０分〜３時間、例
えば、９０℃〜１２０℃程度の温度で加熱抽出した後、
抽出液を分子量限界１００００ダルトンの限外濾過膜を
利用して濾過する。得られた濾液を“抽出液”とする。
【００２５】本発明において使用し得る非イオン系界面
活性剤は、通常化粧料に用いられるもの等であり、例え
ば、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８
０、又はポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル
等が挙げられる。
活性剤は、通常化粧料に用いられるもの等であり、例え
ば、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ６０、ＴＷＥＥＮ８
０、又はポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル
等が挙げられる。
【００２６】本発明による化粧料用乳酸菌製剤は上記破
砕液（ａ）と抽出液（ｂ）を、（ａ）：（ｂ）の重量比
で１０：１〜１：１０、好ましくは２：１〜１：２、最
も好ましくは、２：１の割合で含有する。
砕液（ａ）と抽出液（ｂ）を、（ａ）：（ｂ）の重量比
で１０：１〜１：１０、好ましくは２：１〜１：２、最
も好ましくは、２：１の割合で含有する。
【００２７】本発明による化粧料用乳酸菌製剤は破砕液
と抽出液に加えて、その活性酸素類除去効果を高めるた
めに、マンニトール、フラボノイド等の低分子活性酸素
類消去剤を更に含有することができる。該低分子活性酸
素類消去剤の添加量は、通常１０μＭ〜１ｍＭである。
と抽出液に加えて、その活性酸素類除去効果を高めるた
めに、マンニトール、フラボノイド等の低分子活性酸素
類消去剤を更に含有することができる。該低分子活性酸
素類消去剤の添加量は、通常１０μＭ〜１ｍＭである。
【００２８】本発明により得られる化粧料用乳酸菌製剤
は、有害な活性酸素類消去効果、チミジン二量体除去に
よる損傷されたＤＮＡリペア機能の活性化効果及び細胞
の免疫活性化効果に優れており、スキンローション、化
粧水、アストリンゼント、フェーシャルクリーム、ロー
ション、ボディローション、クレンジングクリーム、ク
レンジングローション、ハンドローション、エッセン
ス、フェーシャルパック、マッサージクリーム等の通常
の化粧料に添加して用いることができる。また、シャン
プー、リンス、ヘヤクリーム、ヘアスプレー等の毛髪化
粧料に添加して用いることもできる。添加の方法や量
は、制限的でなく、添加量は通常０．０１〜１．０重量
％程度である。
は、有害な活性酸素類消去効果、チミジン二量体除去に
よる損傷されたＤＮＡリペア機能の活性化効果及び細胞
の免疫活性化効果に優れており、スキンローション、化
粧水、アストリンゼント、フェーシャルクリーム、ロー
ション、ボディローション、クレンジングクリーム、ク
レンジングローション、ハンドローション、エッセン
ス、フェーシャルパック、マッサージクリーム等の通常
の化粧料に添加して用いることができる。また、シャン
プー、リンス、ヘヤクリーム、ヘアスプレー等の毛髪化
粧料に添加して用いることもできる。添加の方法や量
は、制限的でなく、添加量は通常０．０１〜１．０重量
％程度である。
【００２９】このように、上記本発明の破砕液（ａ）と
抽出液（ｂ）からなる化粧料用乳酸菌製剤は、それ自体
公知の各種化粧料に添加して使用され、通常皮膚に適用
される。これら化粧料は、一般に成人に対して、本発明
の前記破砕液（ａ）及び抽出液（ｂ）からなる乳酸菌製
剤が、一日当たり０．０００１〜０．０３ｇ程度となる
ような量で適用すれば、良好な結果が得られる。
抽出液（ｂ）からなる化粧料用乳酸菌製剤は、それ自体
公知の各種化粧料に添加して使用され、通常皮膚に適用
される。これら化粧料は、一般に成人に対して、本発明
の前記破砕液（ａ）及び抽出液（ｂ）からなる乳酸菌製
剤が、一日当たり０．０００１〜０．０３ｇ程度となる
ような量で適用すれば、良好な結果が得られる。
【００３０】
【実施例】以下の実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれらにのみに限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれらにのみに限定されるものではな
い。
【００３１】実施例１ スキムミルク（無脂固形分(solids-non-fat content)１
０％）１リットルに、バチルス ズブチルス（Bacillus
subtilis ）由来の中性プロテアーゼ１種（力価8000
（PU）Tyr Cas.F.R./g）を１．０％添加して、４５℃で
３０分間反応させて作った培地を減菌した後、冷却し、
ラクトバシルス ブルガリクス（L.bulg aricus）を２〜
３％に接種して、４０℃付近で４８時間培養させた後、
遠心分離（6000g 、20分）して細胞を回収する。
０％）１リットルに、バチルス ズブチルス（Bacillus
subtilis ）由来の中性プロテアーゼ１種（力価8000
（PU）Tyr Cas.F.R./g）を１．０％添加して、４５℃で
３０分間反応させて作った培地を減菌した後、冷却し、
ラクトバシルス ブルガリクス（L.bulg aricus）を２〜
３％に接種して、４０℃付近で４８時間培養させた後、
遠心分離（6000g 、20分）して細胞を回収する。
【００３２】回収された細胞を、０．９％ＮａＣｌ溶液
に１０％の濃度になるように懸濁した後、ダイノミル
（3000r.p.m ．直径0.1mm ガラスビーズ）にて３Ｌ／時
間になるように連続的に破砕させる。破砕された懸濁液
を、遠心分離（15000g,30 分）し、上澄液を得た後、１
０μＭのＭｎＳＯ4 を入れて分子量限界１０，０００ダ
ルトンの限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000：ワット
マン(Whatman) 社製品）を利用して濾過し、２５０ｍｌ
の濾液を得る。これを“破砕液”とする。
に１０％の濃度になるように懸濁した後、ダイノミル
（3000r.p.m ．直径0.1mm ガラスビーズ）にて３Ｌ／時
間になるように連続的に破砕させる。破砕された懸濁液
を、遠心分離（15000g,30 分）し、上澄液を得た後、１
０μＭのＭｎＳＯ4 を入れて分子量限界１０，０００ダ
ルトンの限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000：ワット
マン(Whatman) 社製品）を利用して濾過し、２５０ｍｌ
の濾液を得る。これを“破砕液”とする。
【００３３】一方、上記遠心分離により沈殿させた細胞
ペレットを回収し、乾燥重量の２０倍の水を加えた後、
０．０１％（Ｗ／Ｖ）のＴＷＥＥＮ８０（ポリオキシエ
チレン(80)ソルビタンモノオレエート) を入れ、沸騰さ
せながら３時間抽出し、次いで分子量限界１０，０００
ダルトンの限外濾過膜（商品名ＮＭＷＣ１０，０００）
に通過させて１５０ｍｌの濾液を得る。これを“抽出
液”とする。
ペレットを回収し、乾燥重量の２０倍の水を加えた後、
０．０１％（Ｗ／Ｖ）のＴＷＥＥＮ８０（ポリオキシエ
チレン(80)ソルビタンモノオレエート) を入れ、沸騰さ
せながら３時間抽出し、次いで分子量限界１０，０００
ダルトンの限外濾過膜（商品名ＮＭＷＣ１０，０００）
に通過させて１５０ｍｌの濾液を得る。これを“抽出
液”とする。
【００３４】実施例２ ＭＲＳ ブロス培地（ディフコ社製品）に２〜３％のス
トレプトコッカス サーモフィルス（Streptococcus
thermophilus）を接種した後、実施例１と同様な条件下
で上澄液を得、１００μＭのＦｅＳＯ4 と１００μＭの
ＮｉＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏを加え、限外濾過膜（商品名 Ｎ
ＭＷＣ10,000）で濾過して２００ｍｌの濾液を得た。こ
れを“破砕液”とする。
トレプトコッカス サーモフィルス（Streptococcus
thermophilus）を接種した後、実施例１と同様な条件下
で上澄液を得、１００μＭのＦｅＳＯ4 と１００μＭの
ＮｉＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏを加え、限外濾過膜（商品名 Ｎ
ＭＷＣ10,000）で濾過して２００ｍｌの濾液を得た。こ
れを“破砕液”とする。
【００３５】一方、沈殿した細胞ペレットに、乾燥重量
の３０倍量の７０％エタノールを加え、０．０５％（Ｗ
／Ｖ）のＴＷＥＥＮ２０（ポリオキシエチレン(20)ソル
ビタンモノラウレート）を添加した後、２時間加熱抽出
し、限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で濾過して
１８０ｍｌの濾液を得る。これを“抽出液”とする。
の３０倍量の７０％エタノールを加え、０．０５％（Ｗ
／Ｖ）のＴＷＥＥＮ２０（ポリオキシエチレン(20)ソル
ビタンモノラウレート）を添加した後、２時間加熱抽出
し、限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で濾過して
１８０ｍｌの濾液を得る。これを“抽出液”とする。
【００３６】実施例３ ロゴサブロス培地（ROGOSA Broth medium 、ディフコ社
製品）に２〜３％のラクトバシルス ヘルベチ カス（La
ctobacillus helveticu s ）を接種した後、実施例１と
同様な条件下で上澄液を得て２００μＭのＺｎＳＯ4 を
添加し、限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で濾過
して１８０ｍｌの濾液を得た。これを“破砕液”とし
た。
製品）に２〜３％のラクトバシルス ヘルベチ カス（La
ctobacillus helveticu s ）を接種した後、実施例１と
同様な条件下で上澄液を得て２００μＭのＺｎＳＯ4 を
添加し、限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で濾過
して１８０ｍｌの濾液を得た。これを“破砕液”とし
た。
【００３７】一方、沈殿させた細胞ペレットに、乾燥重
量の３０倍の５０％メタノールを加え、０．０５％（Ｗ
／Ｖ）のＴＷＥＥＮ２０を添加した後、室温で３日間放
置し、これを限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で
濾過して１２０ｍｌの濾液を得た。これを“抽出液”と
した。
量の３０倍の５０％メタノールを加え、０．０５％（Ｗ
／Ｖ）のＴＷＥＥＮ２０を添加した後、室温で３日間放
置し、これを限外濾過膜（商品名 ＮＭＷＣ10,000）で
濾過して１２０ｍｌの濾液を得た。これを“抽出液”と
した。
【００３８】試験例１ 乳酸菌製剤の有害活性酸素類消去効果 実施例１、２及び３で得た破砕液と抽出液とをそれぞれ
１：１、１：２及び２：１の割合で混合し、これらの混
合物に対し次の試験法によってスーパオキサイドアニオ
ンラジカルの消去効果を測定した。
１：１、１：２及び２：１の割合で混合し、これらの混
合物に対し次の試験法によってスーパオキサイドアニオ
ンラジカルの消去効果を測定した。
【００３９】スーパーオキサイドアニオンラジカル（su
peroxide anion radical）を消去する効果は、キサンチ
ンオキシダーゼ（xanthin oxidase ）を利用した酸素測
定法によって測定する。
peroxide anion radical）を消去する効果は、キサンチ
ンオキシダーゼ（xanthin oxidase ）を利用した酸素測
定法によって測定する。
【００４０】 ０．５Ｍリン酸カリウム（potassium phosphate ）緩衝液 ２００μｌ、 １６％トリトン（triton）Ｘ−１００ （シグマ社製品） １００μｌ、 １０ｍＭ Ｅ．Ｄ．Ｔ．Ａ． １０μｌ、 １．２ｍＭ ＮＴＣ（ネオ−テトラゾリウムクロライド(Neo-Tetrazolium Chl oride)） ３００μｌ、 キサンチンオキシダーゼ （１Unit/nl ） １５０μｌ。
【００４１】以上の試薬を混合し、これに、表１に示し
た各試料２００μｌを添加する。スーパーオキサイド
ディスムターゼを参考物質として用いる。ヒポキサンチ
ン（hypoxanthin ）１００μｌを加え、少量の水を入れ
て３７℃で２０分間反応させる。反応終了後に５４０ｎ
ｍにおいて吸光度を測定し、キサンチンオキシダーゼの
作用によりヒポキサンチンから生成するスーパーオキサ
イドアニオンラジカルによるネオ−テトラゾリウムクロ
ライド（ＮＴＣ）の還元を５０％阻害するスーパーオキ
サイド ディスムターゼ（ＳＯＤ）活性を１単位とす
る。測定値は２回繰り返した実験結果を平均したもので
ある。
た各試料２００μｌを添加する。スーパーオキサイド
ディスムターゼを参考物質として用いる。ヒポキサンチ
ン（hypoxanthin ）１００μｌを加え、少量の水を入れ
て３７℃で２０分間反応させる。反応終了後に５４０ｎ
ｍにおいて吸光度を測定し、キサンチンオキシダーゼの
作用によりヒポキサンチンから生成するスーパーオキサ
イドアニオンラジカルによるネオ−テトラゾリウムクロ
ライド（ＮＴＣ）の還元を５０％阻害するスーパーオキ
サイド ディスムターゼ（ＳＯＤ）活性を１単位とす
る。測定値は２回繰り返した実験結果を平均したもので
ある。
【００４２】上記試験の結果を表１に示した。
【００４３】
【表１】
【００４４】表１から明らかな様に、本発明の破砕液と
抽出液の混合物はそれぞれ高い活性を示し、特に２：１
の混合物は高い効果を示した。
抽出液の混合物はそれぞれ高い活性を示し、特に２：１
の混合物は高い効果を示した。
【００４５】試験例２ 乳酸菌製剤のＤＮＡリペア活性化効果 試験例１における試料に対して、次の試験法によって損
傷されたＤＮＡのリペア活性化効果を測定した。
傷されたＤＮＡのリペア活性化効果を測定した。
【００４６】動物細胞に紫外線を照射して生成されたチ
ミジン二量体は、生体内修復機構によってリペアされる
が、リペア機能が高い程チミジン吸収率（uptake）が増
加する。この吸収率を測定することによりＤＮＡ修復能
を評価する方法をＵＤＳ（Unscheduled DNA Synthesis
）といい、その方法は次のとおりである。
ミジン二量体は、生体内修復機構によってリペアされる
が、リペア機能が高い程チミジン吸収率（uptake）が増
加する。この吸収率を測定することによりＤＮＡ修復能
を評価する方法をＵＤＳ（Unscheduled DNA Synthesis
）といい、その方法は次のとおりである。
【００４７】ヒトの上皮細胞からガラスカバースリップ
（glass coverslip ）を利用して分離したケラチノサイ
ト（Keratinocyte）を、ＫＧＭ培地（クロネティックス
（Clonetics ）社製品）中で２４時間培養する。培養し
た細胞に、フィリップスＧ１５Ｔ８ゲルミサイダルバル
ブ（Germicidal Bulb ）にて１０Ｊ／ｍ2 になるように
１０分間紫外線を照射し、２．５ｍＭヒドロキシウレア
（hydroxyurea ）と１０μＣｉ／ｍｌの 3Ｈ−チミジン
を加えて３時間培養する。この際、０．１、０．３及び
０．５％の試料も更に加えて、対照群には添加しない。
（glass coverslip ）を利用して分離したケラチノサイ
ト（Keratinocyte）を、ＫＧＭ培地（クロネティックス
（Clonetics ）社製品）中で２４時間培養する。培養し
た細胞に、フィリップスＧ１５Ｔ８ゲルミサイダルバル
ブ（Germicidal Bulb ）にて１０Ｊ／ｍ2 になるように
１０分間紫外線を照射し、２．５ｍＭヒドロキシウレア
（hydroxyurea ）と１０μＣｉ／ｍｌの 3Ｈ−チミジン
を加えて３時間培養する。この際、０．１、０．３及び
０．５％の試料も更に加えて、対照群には添加しない。
【００４８】０．１ｍＭ冷チミジンを加えて１時間の
後、細胞を固定し、コニカ（Konica）ＮＲ−Ｍ2 エマル
ジョンでコーティングする。４℃で１週間放置した後、
ギームザ（giemsa）溶液で染色し、リキッドシンチレー
ションスペクトロスコピー（liquid-scintillation spe
ctroscopy ）により放射活性を検出する。ＵＤＳは１０
０個の非Ｓ相の核（non s phase nuclei）におけるグレ
イン（grain ）数をカウントして測定する。測定値は、
３回繰り返した実験結果を平均したものである。
後、細胞を固定し、コニカ（Konica）ＮＲ−Ｍ2 エマル
ジョンでコーティングする。４℃で１週間放置した後、
ギームザ（giemsa）溶液で染色し、リキッドシンチレー
ションスペクトロスコピー（liquid-scintillation spe
ctroscopy ）により放射活性を検出する。ＵＤＳは１０
０個の非Ｓ相の核（non s phase nuclei）におけるグレ
イン（grain ）数をカウントして測定する。測定値は、
３回繰り返した実験結果を平均したものである。
【００４９】上記試験の結果を、図１に示した。図１に
おいて、数字１は実施例１で得た破砕液と抽出液の２：
１混合物、２は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：１
混合物、３は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：２混
合物、４は実施例２で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、５は実施例３で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、及び６は試料を添加しない対照群を示す。
おいて、数字１は実施例１で得た破砕液と抽出液の２：
１混合物、２は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：１
混合物、３は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：２混
合物、４は実施例２で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、５は実施例３で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、及び６は試料を添加しない対照群を示す。
【００５０】図１に示したように、本発明の乳酸菌製剤
である実施例１、２及び３の破砕液と抽出液の混合物は
優れたＤＮＡリペア活性化効能を有する。
である実施例１、２及び３の破砕液と抽出液の混合物は
優れたＤＮＡリペア活性化効能を有する。
【００５１】試験例３ 乳酸菌製剤の皮膚免疫機能活性化効果 96ウエルプレートに、抗ヒトＩｇＧ抗血清（ anti-huma
n immunogloblin(IgG)anti-serum ）(3.5mg/ml)を5mM
炭酸ナトリウムバッファー(pH9.0) で１００倍に希釈し
たものを、５０μｌづつ分注し、常温で８時間コーティ
ングさせる。０．０１％ＴＷＥＥＮ８０が添加されたＴ
ＢＳ(Tris buffered saline:10mMトリス−pH7.0, 0.15
M NaCl）で洗浄した後、ＴＢＳＡ（1%牛血清アルブミン
を含有するＴＢＳ）を１００μｌ加え、１時間コーティ
ングさせる。
n immunogloblin(IgG)anti-serum ）(3.5mg/ml)を5mM
炭酸ナトリウムバッファー(pH9.0) で１００倍に希釈し
たものを、５０μｌづつ分注し、常温で８時間コーティ
ングさせる。０．０１％ＴＷＥＥＮ８０が添加されたＴ
ＢＳ(Tris buffered saline:10mMトリス−pH7.0, 0.15
M NaCl）で洗浄した後、ＴＢＳＡ（1%牛血清アルブミン
を含有するＴＢＳ）を１００μｌ加え、１時間コーティ
ングさせる。
【００５２】次いで、５０μｌの下記Ｂ細胞培養液を加
え１時間反応させた後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ホース
ラディッシュ ペルオキシダーゼ）をＴＢＳで１０００
倍希釈したもの２００μｌを加え、１時間反応させる。
ＯＰＤ（o-フェニレンジアミン）で発色させた後、４９
０ｎｍで吸光度を測定する。
え１時間反応させた後、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ホース
ラディッシュ ペルオキシダーゼ）をＴＢＳで１０００
倍希釈したもの２００μｌを加え、１時間反応させる。
ＯＰＤ（o-フェニレンジアミン）で発色させた後、４９
０ｎｍで吸光度を測定する。
【００５３】標準ヒトＩｇＧを利用して作成した標準曲
線から、試料のＩｇＧの量を逆算する。
線から、試料のＩｇＧの量を逆算する。
【００５４】〔Ｂ細胞培養液の調製〕１０％ウシ胎児血
清、５０μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（フ
ローラボラトリーズ）に、Ｔ細胞を２×１０6 ｃｅｌｌ
／ｍｌの濃度になるように接種した後、試料を濃度が
０．５％になるように添加する。３７℃にて培養器で２
日間培養する。Ｔ細胞の培養上澄液を、Ｂ細胞培地（１
０％ウシ胎児血清培地）に１０％（v/v ）になるように
添加し、６日間培養する。こうして、Ｂ細胞培養液を得
た。
清、５０μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（フ
ローラボラトリーズ）に、Ｔ細胞を２×１０6 ｃｅｌｌ
／ｍｌの濃度になるように接種した後、試料を濃度が
０．５％になるように添加する。３７℃にて培養器で２
日間培養する。Ｔ細胞の培養上澄液を、Ｂ細胞培地（１
０％ウシ胎児血清培地）に１０％（v/v ）になるように
添加し、６日間培養する。こうして、Ｂ細胞培養液を得
た。
【００５５】上記試験の結果を図２に示した。図２にお
いて、数字１は、実施例１で得た破砕液と抽出液の２：
１混合物、２は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：１
混合物、３は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：２混
合物、４は実施例２で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、５は実施例３で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、及び６は試料を添加しない対照群を示す。
いて、数字１は、実施例１で得た破砕液と抽出液の２：
１混合物、２は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：１
混合物、３は実施例１で得た破砕液と抽出液の１：２混
合物、４は実施例２で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、５は実施例３で得た破砕液と抽出液の２：１混合
物、及び６は試料を添加しない対照群を示す。
【００５６】図２に示す如く、本発明の乳酸菌製剤であ
る実施例１、２、３の破砕液と抽出液の混合物は、優れ
た皮膚免疫機能活性化効果を示すことが判る。
る実施例１、２、３の破砕液と抽出液の混合物は、優れ
た皮膚免疫機能活性化効果を示すことが判る。
【００５７】
【発明の効果】以上の試験で知り得るように、本発明に
よって提供される乳酸菌製剤は優れた有害活性酸素消去
活性を示し、同時に優れたＤＮＡリペア活性化効果及び
皮膚の免疫機能活性化作用を示す。
よって提供される乳酸菌製剤は優れた有害活性酸素消去
活性を示し、同時に優れたＤＮＡリペア活性化効果及び
皮膚の免疫機能活性化作用を示す。
【図１】本発明乳酸菌製剤による皮膚のＤＮＡリペア活
性化効果を示すグラフである。
性化効果を示すグラフである。
【図２】本発明の乳酸菌製剤による皮膚の免疫機能活性
化作用を示すグラフである。
化作用を示すグラフである。
１ 実施例１で得た破砕液と抽出液の２：１混合物 ２ 実施例１で得た破砕液と抽出液の１：１混合物 ３ 実施例１で得た破砕液と抽出液の１：２混合物 ４ 実施例２で得た破砕液と抽出液の２：１混合物 ５ 実施例３で得た破砕液と抽出液の２：１混合物 ６ 試料を添加しない対照群
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 7/40 7252−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (6)
- 【請求項１】 （ａ）乳酸菌を培養した後回収した菌体
を破砕及び遠心分離して得た上澄液に１０μＭ〜５００
μＭの金属イオンを添加し、濾過して得た破砕液と、
（ｂ）上記工程（ａ）の遠心分離により沈殿させた細胞
ペレット（cell pellet）を水又は有機溶媒及び非イオ
ン系界面活性剤で抽出し濾過して得た抽出液からなり、
前記破砕液の抽出液に対する割合が重量比で１０：１〜
１：１０であることを特徴とする化粧料用乳酸菌製剤。 - 【請求項２】 乳酸菌が、ラクトバシルス（Lactobacil
lus ）属又はストレプトコッカス（Streptococcus ）属
に属する菌であることを特徴とする請求項１に記載の化
粧料用乳酸菌製剤。 - 【請求項３】 金属イオンが、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍ
ｇ、Ｚｎ、Ｎｉ等の二価イオンであって、単独又は混合
して用いることを特徴とする請求項１に記載の化粧料用
乳酸菌製剤。 - 【請求項４】 有機溶媒が、メタノール及びエタノール
からなる極性有機溶媒群から選ばれたものであることを
特徴とする請求項１に記載の化粧料用乳酸菌製剤。 - 【請求項５】 濾過を、分子量限界１０，０００ダルト
ンの限外濾過膜を利用して実施することを特徴とする請
求項１に記載の化粧料用乳酸菌製剤。 - 【請求項６】 マンニトール又はフラボノイド等の低分
子量活性酸素類消去剤を更に含有することを特徴とする
請求項１に記載の化粧料用乳酸菌製剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1991-18556 | 1991-10-22 | ||
| KR1019910018556A KR950014592B1 (ko) | 1991-10-22 | 1991-10-22 | 화장료용 유산균제재 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05201828A JPH05201828A (ja) | 1993-08-10 |
| JPH0714852B2 true JPH0714852B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=19321598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4284369A Expired - Lifetime JPH0714852B2 (ja) | 1991-10-22 | 1992-10-22 | 化粧料用乳酸菌製剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5324515A (ja) |
| JP (1) | JPH0714852B2 (ja) |
| KR (1) | KR950014592B1 (ja) |
| FR (1) | FR2682596B1 (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6348346B1 (en) * | 1994-05-27 | 2002-02-19 | University Of Kentucky Research Foundation | Method of inhibiting binding activity of immunoglobulins |
| JP3004890B2 (ja) * | 1995-03-28 | 2000-01-31 | 雪印乳業株式会社 | 病原体感染防御剤 |
| JP2971027B2 (ja) * | 1996-03-13 | 1999-11-02 | 雪印乳業株式会社 | 美白剤 |
| IT1296148B1 (it) * | 1996-11-22 | 1999-06-09 | Renata Maria Anna Ve Cavaliere | Uso di batteri lattici per accrescere il livello delle ceramidi della pelle e delle mucose, e composizioni dermatologiche e cosmetiche atte |
| RU2141336C1 (ru) * | 1999-02-11 | 1999-11-20 | Закрытое акционерное общество Межрегиональный центр "Адаптоген" | Способ выделения биологически активных веществ из растительного сырья |
| WO2000069399A1 (fr) * | 1999-05-14 | 2000-11-23 | Japan Applied Microbiology Research Institute Co., Ltd. | Stimulants de la pousse des cheveux |
| RU2147891C1 (ru) * | 1999-09-24 | 2000-04-27 | Маленков Андрей Георгиевич | Способ приготовления лекарственного препарата |
| EP1110555A1 (fr) * | 1999-12-22 | 2001-06-27 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Agent anti-adhesion de la flore pathogene de la peau |
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