JPH0761268B2 - プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリ - Google Patents
プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリInfo
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- JPH0761268B2 JPH0761268B2 JP62042264A JP4226487A JPH0761268B2 JP H0761268 B2 JPH0761268 B2 JP H0761268B2 JP 62042264 A JP62042264 A JP 62042264A JP 4226487 A JP4226487 A JP 4226487A JP H0761268 B2 JPH0761268 B2 JP H0761268B2
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- escherichia coli
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有する
新規なプラスミド及びこのプラスミドで形質転換された
新規なエシェリチア・コリに関するものである。
新規なプラスミド及びこのプラスミドで形質転換された
新規なエシェリチア・コリに関するものである。
（従来の技術） ロイシン脱水素酵素は，臨床検査用酵素として，非常に
重要な酵素である。このロイシン脱水素酵素を生産でき
る微生物としては，常温菌であるバチルス・スフェリカ
ス（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細菌
が知られている。しかし，これらの菌より得られるロイ
シン脱水素酵素は，室温の水溶液中で１〜３週間のうち
に活性をほとんどを失うのが通例であり，熱安定性及び
長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を有
している。
重要な酵素である。このロイシン脱水素酵素を生産でき
る微生物としては，常温菌であるバチルス・スフェリカ
ス（Bacillus sphaericus）のようなバチルス属の細菌
が知られている。しかし，これらの菌より得られるロイ
シン脱水素酵素は，室温の水溶液中で１〜３週間のうち
に活性をほとんどを失うのが通例であり，熱安定性及び
長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を有
している。
それゆえ，ロイシン脱水素酵素を用いる臨床検査の分析
法の利点を最大限に発揮するうえで，熱に安定で，室温
で長時間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
法の利点を最大限に発揮するうえで，熱に安定で，室温
で長時間活性を失わないロイシン脱水素酵素の出現が熱
望されていた。
このため，先に本発明者らの一部がこのような観点か
ら，熱に安定で，長時間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果，好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見だし，特許出願した（特
開昭59−348841号公報）。
ら，熱に安定で，長時間活性を失わない性質を有するロ
イシン脱水素酵素を求めて鋭意研究した結果，好熱性の
バチルス属に属する細菌に上記の性質を有するロイシン
脱水素酵素が存在することを見だし，特許出願した（特
開昭59−348841号公報）。
しかし，この好熱性のバチルス属に属する細菌は，耐熱
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く，この酵素を効
率良く得るには，十分満足するものでなかった。
性のロイシン脱水素酵素の生産性が低く，この酵素を効
率良く得るには，十分満足するものでなかった。
一方，エシェリチア（Escherichia）属に属する細菌
は，本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有していな
い。
は，本来ロイシン脱水素酵素生産能を全く有していな
い。
また，組換DNA遺伝子工学に有用なプラスミド及びそれ
によって形質転換された微生物は良く知られている。例
えば，サイエンス（Science）198巻,1056頁（1978年）
には，プラスミドpBR322にラクトースプロモーターをつ
ないだプラスミドを導入した大腸菌内で動物タンパク質
が生産されることが記載されている。
によって形質転換された微生物は良く知られている。例
えば，サイエンス（Science）198巻,1056頁（1978年）
には，プラスミドpBR322にラクトースプロモーターをつ
ないだプラスミドを導入した大腸菌内で動物タンパク質
が生産されることが記載されている。
また，特開昭56−5093号公報には，サーマス属に属する
細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとしてプラ
スミドpBR322が用いられている。）を導入することによ
り形質転換されたエシェリチア（Escherichia）属に属
する細菌を用いて耐熱性の酵素を調製することが記載さ
れているが，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミド及びそれによって形質転換された微生物
については，全く何も記載されていないし，またその創
製に成功したとの報告もなされていない。
細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとしてプラ
スミドpBR322が用いられている。）を導入することによ
り形質転換されたエシェリチア（Escherichia）属に属
する細菌を用いて耐熱性の酵素を調製することが記載さ
れているが，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子を有
するプラスミド及びそれによって形質転換された微生物
については，全く何も記載されていないし，またその創
製に成功したとの報告もなされていない。
さらに，本発明者らの一部は，このような観点から，耐
熱性のロイシン脱水素酵素の生産性を向上させるために
常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素が発現でき
るプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良
く生産しうることのできる微生物を求めて鋭意研究した
結果，好熱性の微生物からロイシン脱水素酵素の遺伝子
を分離し，この遺伝子が公知のプラスミドDNAに導入し
うること及びこのようにして遺伝子を導入して得たプラ
スミドが前記の性質を有することを見い出し，さらにこ
のプラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリが大
量の耐熱性のロイシン脱水素酵素を生産することを見い
出し，特許出願した（特開昭59−159775号公報及び特開
昭59−162882号公報）。
熱性のロイシン脱水素酵素の生産性を向上させるために
常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素が発現でき
るプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良
く生産しうることのできる微生物を求めて鋭意研究した
結果，好熱性の微生物からロイシン脱水素酵素の遺伝子
を分離し，この遺伝子が公知のプラスミドDNAに導入し
うること及びこのようにして遺伝子を導入して得たプラ
スミドが前記の性質を有することを見い出し，さらにこ
のプラスミドで形質転換されたエシェリチア・コリが大
量の耐熱性のロイシン脱水素酵素を生産することを見い
出し，特許出願した（特開昭59−159775号公報及び特開
昭59−162882号公報）。
（発明が解決しようとする問題点） 前記のプラスミドは常温微生物の発現が充分でなく，そ
れゆえ，このプラスミドで形質転換されたエシェリチア
・コリでは耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性がいま
だ充分ではなく，耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良
く得るには充分満足できるものではなかった。
れゆえ，このプラスミドで形質転換されたエシェリチア
・コリでは耐熱性のロイシン脱水素酵素の生産性がいま
だ充分ではなく，耐熱性のロイシン脱水素酵素を効率良
く得るには充分満足できるものではなかった。
（問題点を解決するための手段） そこで，本発明者らは，耐熱性のロイシン脱水素酵素の
生産性を向上させるため，常温微生物内で効率良く発現
できるプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素含量
の高い微生物を求めて鋭意研究した結果，嫌気性かつ好
熱性のクロストリジウム・サーモアセチィカム（Clostr
idium thermoacticum）AN28−４株の染色体DNA由来のロ
イシン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結し
た組み換え体プラスミドが前記の性質を有していること
を見い出し，かつ，このプラスミドで形質転換されたエ
シェリチア・コリ（Escherichia Coli）が耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を効率良く生産することを見い出し，本
発明を完成した。
生産性を向上させるため，常温微生物内で効率良く発現
できるプラスミド及び耐熱性のロイシン脱水素酵素含量
の高い微生物を求めて鋭意研究した結果，嫌気性かつ好
熱性のクロストリジウム・サーモアセチィカム（Clostr
idium thermoacticum）AN28−４株の染色体DNA由来のロ
イシン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結し
た組み換え体プラスミドが前記の性質を有していること
を見い出し，かつ，このプラスミドで形質転換されたエ
シェリチア・コリ（Escherichia Coli）が耐熱性のロイ
シン脱水素酵素を効率良く生産することを見い出し，本
発明を完成した。
すなわち，本発明は嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム・サーモアセチィカム（Clostridium thermoacticu
m）AN28−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子をベクタープラスミドに連結し，第１図の制限酵素
地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え体プラ
スミドpICD242及び嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム・サーモアセチィカム（Clostridium thermoacticu
m）AN28−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子をベクタープラスミドに連結し，第１図の制限酵素
地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え体プラ
スミドpICD242で形質転換されたエシェリチア・コリ（E
scherichia Coli）を要旨とするものである。
ム・サーモアセチィカム（Clostridium thermoacticu
m）AN28−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子をベクタープラスミドに連結し，第１図の制限酵素
地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え体プラ
スミドpICD242及び嫌気性かつ好熱性のクロストリジウ
ム・サーモアセチィカム（Clostridium thermoacticu
m）AN28−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子をベクタープラスミドに連結し，第１図の制限酵素
地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え体プラ
スミドpICD242で形質転換されたエシェリチア・コリ（E
scherichia Coli）を要旨とするものである。
本発明のプラスミドを得るには，例えばバイオキミカ・
エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophy
sica Acta）72,619〜629頁（1963年）に記載の方法に従
い，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子とベクターと
しての役割を有するDNAとを制限酵素で消化し，次いで
リガーゼを用いて結合することにより調製することがで
きる。
エト・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophy
sica Acta）72,619〜629頁（1963年）に記載の方法に従
い，耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝子とベクターと
しての役割を有するDNAとを制限酵素で消化し，次いで
リガーゼを用いて結合することにより調製することがで
きる。
本発明に用いられる耐熱性のロイシン脱水素酵素の遺伝
子としては，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム・サ
ーモアセチィカム（Clostridium thermoacticum）AN28
−４株（昭和62年２月21日に通産省工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。その微生物寄託番号は第9214
号である）に由来するものを用いる。
子としては，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム・サ
ーモアセチィカム（Clostridium thermoacticum）AN28
−４株（昭和62年２月21日に通産省工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。その微生物寄託番号は第9214
号である）に由来するものを用いる。
また，ベクターとしての役割を有するDNAとしては，例
えばプラスミドDNAがあげられ，特にプラスミドpBR322
が好ましい。また，制限酵素としては，例えばHind III
があげられ，リガーゼとしては，例えばT4DNAリカーゼ
があげられる。
えばプラスミドDNAがあげられ，特にプラスミドpBR322
が好ましい。また，制限酵素としては，例えばHind III
があげられ，リガーゼとしては，例えばT4DNAリカーゼ
があげられる。
この方法でプラスミドpBR322に，クロストリジウム・サ
ーモアセチィカムAN28−４株の染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミドpICD242が
得られる。このプラスミドpICD242を昭和62年２月21日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続
を行ったが，このプラスミドは受託されなかった。
ーモアセチィカムAN28−４株の染色体DNA由来のロイシ
ン脱水素酵素の遺伝子を導入したプラスミドpICD242が
得られる。このプラスミドpICD242を昭和62年２月21日
に通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続
を行ったが，このプラスミドは受託されなかった。
次にこのプラスミドpICD242の理化学的性質を示す。
（１）常温微生物内で耐熱性のロイシン脱水素酵素を発
現させることができる。
現させることができる。
（２）第１図に示すごとく，下記制限酵素に対し，次の
切断感受性を有する。
切断感受性を有する。
制限酵素 切断部位数EcoR I ３ Hind III ２ Pst I ３ Sal I ５ BamH I １ 制限酵素の名称は，次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。EcoR I ；エシェリチア・コリHind III ；ヘモフィラス・インフルエンザPst I ；プロビデンシア・スチュアーティーSal I ；ストレプトマイセス・アルブスBamH I ；バチルス・アミロリクエファシエンス 制限酵素による切断部位数は，過剰の制限酵素存在下で
プラスミドpICD242を消化し，その消化物をアガロース
ゲル電気泳動にかけ，分離可能な断片の数から決定され
る。
称である。EcoR I ；エシェリチア・コリHind III ；ヘモフィラス・インフルエンザPst I ；プロビデンシア・スチュアーティーSal I ；ストレプトマイセス・アルブスBamH I ；バチルス・アミロリクエファシエンス 制限酵素による切断部位数は，過剰の制限酵素存在下で
プラスミドpICD242を消化し，その消化物をアガロース
ゲル電気泳動にかけ，分離可能な断片の数から決定され
る。
（３）分子量は約5.8メガダルトンである。
本発明のエシェリチア・コリは，上記の嫌気性かつ好熱
性のクロストリジウム・サーモアセチィカム（Clostrid
ium thermoacticum）AN28−４株の染色体DNA由来のロイ
シン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア・
コリであり，このプラスミドpICD242を用いてエシェリ
チア・コリを形質転換させるには，例えば，ジャーナル
・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology53巻,159〜162頁（1970年）の方法に従っ
て,0℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記のプラ
スミドpICD242とエシェリチア・コリc600とを接触させ
ることにより行えばよい。
性のクロストリジウム・サーモアセチィカム（Clostrid
ium thermoacticum）AN28−４株の染色体DNA由来のロイ
シン脱水素酵素遺伝子をベクタープラスミドに連結した
組み換え体プラスミドで形質転換されたエシェリチア・
コリであり，このプラスミドpICD242を用いてエシェリ
チア・コリを形質転換させるには，例えば，ジャーナル
・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology53巻,159〜162頁（1970年）の方法に従っ
て,0℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記のプラ
スミドpICD242とエシェリチア・コリc600とを接触させ
ることにより行えばよい。
以上のようにして形質転換されたエシェリチア・コリの
例として，プラスミドpICD242が導入されたエシェリチ
ア・コリc600−pICD242株があげられる。
例として，プラスミドpICD242が導入されたエシェリチ
ア・コリc600−pICD242株があげられる。
この菌株は，公知のエシェリチア・コリc600〔ネイチャ
ー（Nature）217巻,1110〜1114頁（1968）を参照〕と，
耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアンピシリン耐
性を有する点以外は同じ菌学的性質を有している。この
菌株は，非伝達性を伝達性に変えることなく，また非病
原性を病原性に変えることなく安全性が保持されてい
る。特に，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム（Clos
tridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子を組み込んだ耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能を
有するエシェリチア・コリの報告はなかった。このこと
から，エシェリチア・コリc600−pICD242株は新菌株で
あると考えられるので，昭和62年２月21日に通産省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物受
託番号は第9213号である。
ー（Nature）217巻,1110〜1114頁（1968）を参照〕と，
耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能及びアンピシリン耐
性を有する点以外は同じ菌学的性質を有している。この
菌株は，非伝達性を伝達性に変えることなく，また非病
原性を病原性に変えることなく安全性が保持されてい
る。特に，嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム（Clos
tridium）属に属する細菌由来のロイシン脱水素酵素遺
伝子を組み込んだ耐熱性のロイシン脱水素酵素生産能を
有するエシェリチア・コリの報告はなかった。このこと
から，エシェリチア・コリc600−pICD242株は新菌株で
あると考えられるので，昭和62年２月21日に通産省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した。その微生物受
託番号は第9213号である。
本発明のエシェリチア・コリを培養するに際して用いら
れる栄養培地の炭素源として，例えばグルコース，シュ
ークロース，フルクトース，澱粉加水分解物，糖蜜，亜
硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸などの有機酸類，さ
らには使用する細菌が資化しうるアルコール類，脂肪酸
及びグリセリンなどが使用でき，窒素源として，例えば
硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，リン酸アンモニ
ウム，アミノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキスなど
の無機又は有機物が使用できる。さらに，無機塩類とし
て，例えばカリウム，ナトリウム，リン酸，亜鉛，鉄，
マグネシウム，アンガン，銅，カルシウム，コバルトな
どの各塩類，必要に応じて微量金属塩，コール・スティ
ープ・リカー，ビタミン類，核酸などを使用してもよ
く，細菌の一般的栄養培地が使用できる。
れる栄養培地の炭素源として，例えばグルコース，シュ
ークロース，フルクトース，澱粉加水分解物，糖蜜，亜
硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸などの有機酸類，さ
らには使用する細菌が資化しうるアルコール類，脂肪酸
及びグリセリンなどが使用でき，窒素源として，例えば
硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，リン酸アンモニ
ウム，アミノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキスなど
の無機又は有機物が使用できる。さらに，無機塩類とし
て，例えばカリウム，ナトリウム，リン酸，亜鉛，鉄，
マグネシウム，アンガン，銅，カルシウム，コバルトな
どの各塩類，必要に応じて微量金属塩，コール・スティ
ープ・リカー，ビタミン類，核酸などを使用してもよ
く，細菌の一般的栄養培地が使用できる。
これらの培地を用いて，本発明のエシェリチア・コリを
20℃〜45℃，好ましくは35℃〜40℃，最適には37℃で約
10〜20時間,pHを7.0〜7.4,最適には7.2で好気的に培養
すればよい。
20℃〜45℃，好ましくは35℃〜40℃，最適には37℃で約
10〜20時間,pHを7.0〜7.4,最適には7.2で好気的に培養
すればよい。
次に得られた培養物から本発明における耐熱性のロイシ
ン脱水素酵素が採取されるが，培養物，分離生菌体，分
離菌体の処理物，粗酵素抽出液，精製酵素などのあらゆ
る段階で採取できる。その際の精製法としては，通常の
酵素精製法を用いることができる。特に本発明では，耐
熱性のロイシン脱水素酵素を採取するに先立って，破砕
液を加熱処理すれば，耐熱性を有しない酵素や蛋白質が
熱変性することにより選択的に耐熱性のロイシン脱水素
酵素が得られるので有利である。この加熱処理の条件と
しては，例えば50〜80℃の温度で５〜30分間処理すれば
よい。このようにして処理した後，分離精製して耐熱性
のロイシン脱水素酵素を得てもよいが，そのまま酵素液
として利用できる。
ン脱水素酵素が採取されるが，培養物，分離生菌体，分
離菌体の処理物，粗酵素抽出液，精製酵素などのあらゆ
る段階で採取できる。その際の精製法としては，通常の
酵素精製法を用いることができる。特に本発明では，耐
熱性のロイシン脱水素酵素を採取するに先立って，破砕
液を加熱処理すれば，耐熱性を有しない酵素や蛋白質が
熱変性することにより選択的に耐熱性のロイシン脱水素
酵素が得られるので有利である。この加熱処理の条件と
しては，例えば50〜80℃の温度で５〜30分間処理すれば
よい。このようにして処理した後，分離精製して耐熱性
のロイシン脱水素酵素を得てもよいが，そのまま酵素液
として利用できる。
本発明によって得られる耐熱性のロイシン脱水素酵素
は，特開昭59−34884号公報や特開昭59−159778号公報
に記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化学的性
質を有する。
は，特開昭59−34884号公報や特開昭59−159778号公報
に記載の耐熱性のロイシン脱水素酵素と同じ理化学的性
質を有する。
（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお，耐熱性のロイシン脱水素酵素の活性は，アミノ
酸，核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid27,84〜88（19
73）〕に記載されているロイシン脱水素酵素活性の測定
法に準じた。すなわちpH10.5の120μmoleのグリシン−K
Cl−KOH緩衝液中で,2.5μmoleのNADと,20μmoleのＬ−
ロイシンを含む混合液を調製し，その混合液に適当量の
粗酵素抽出液を加えて，最終容量を0.8mlとし,25℃ある
いは55℃における還元型NADの単位時間あたりの増加を3
40nmの吸光度の増加として測定する方法で行った。
酸，核酸〔Amino Acid and Nucleic Acid27,84〜88（19
73）〕に記載されているロイシン脱水素酵素活性の測定
法に準じた。すなわちpH10.5の120μmoleのグリシン−K
Cl−KOH緩衝液中で,2.5μmoleのNADと,20μmoleのＬ−
ロイシンを含む混合液を調製し，その混合液に適当量の
粗酵素抽出液を加えて，最終容量を0.8mlとし,25℃ある
いは55℃における還元型NADの単位時間あたりの増加を3
40nmの吸光度の増加として測定する方法で行った。
また，実施例及び参考例中の％は，容量％を示す。
実施例１ （ａ）クロストリジウム・サーモアセチィカムの染色体
DNAの分離。
DNAの分離。
クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４株（微
工研菌寄第9214号）から，バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）7
2巻,619〜629頁（1963年）に記載の方法に準じ，染色体
DNAを分離した。
工研菌寄第9214号）から，バイオキミカ・エト・バイオ
フィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）7
2巻,619〜629頁（1963年）に記載の方法に準じ，染色体
DNAを分離した。
まず，クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４
株をトリプティコース17g/l,フィトン3g/l,グルコース6
g/l,塩化ナトリウム2.5g/l,チオグリコール酸ナトリウ
ム0.5g/l,L−システィン0.25g/l,亜硫酸ナトリウム0.1g
/l,そしてpH7.2に調製した培地2lで,60℃で24時間静置
培養した後，遠心分離にて集菌した。
株をトリプティコース17g/l,フィトン3g/l,グルコース6
g/l,塩化ナトリウム2.5g/l,チオグリコール酸ナトリウ
ム0.5g/l,L−システィン0.25g/l,亜硫酸ナトリウム0.1g
/l,そしてpH7.2に調製した培地2lで,60℃で24時間静置
培養した後，遠心分離にて集菌した。
次に12mgのリゾチームを6mlのサリン（saline）−EDTA
溶液（0.15M NaClと0.1M EDTAを含み,pH8.0に調製。）
に溶かし，この溶液に集菌した菌株を加え，よく攪拌し
た。これを37℃で約10分間加温し，菌体が溶菌し始めた
ら，直ちに凍結した。
溶液（0.15M NaClと0.1M EDTAを含み,pH8.0に調製。）
に溶かし，この溶液に集菌した菌株を加え，よく攪拌し
た。これを37℃で約10分間加温し，菌体が溶菌し始めた
ら，直ちに凍結した。
この凍結した菌体に50mlのトリス−SDS緩衝液（10mg/ml
SDSと0.1M NaClを含むpH9.0に調製された0.1Mトリス緩
衝液。）を加えて攪拌し，さらに60℃に加温し，完全に
溶菌させた。
SDSと0.1M NaClを含むpH9.0に調製された0.1Mトリス緩
衝液。）を加えて攪拌し，さらに60℃に加温し，完全に
溶菌させた。
この溶菌液に56mlの80％フェノールを加えて，約20分間
振とうさせ，フェノール抽出を行い，夾雑蛋白質を除去
した。この抽出された粗DNA溶液に２倍容量の冷エタノ
ールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り,70,8
0,90％のエタノール各10ml中に順次，数分ずつ浸漬した
後,20mlの希サリン−サイトレート（saline−citrate）
溶液（0.015M NaCl,0.0015M Na3−クエン酸に調製。）
に溶かし，さらに濃saline−cltrate溶液（1.5M NaCl,
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を2ml加えて，粗DNA液
を調製した。
振とうさせ，フェノール抽出を行い，夾雑蛋白質を除去
した。この抽出された粗DNA溶液に２倍容量の冷エタノ
ールを加えてガラス棒で繊維状の沈殿を巻き取り,70,8
0,90％のエタノール各10ml中に順次，数分ずつ浸漬した
後,20mlの希サリン−サイトレート（saline−citrate）
溶液（0.015M NaCl,0.0015M Na3−クエン酸に調製。）
に溶かし，さらに濃saline−cltrate溶液（1.5M NaCl,
0.15M Na3−クエン酸に調製。）を2ml加えて，粗DNA液
を調製した。
この粗DNA液を500μg/ml位にうすめて，リボヌクレアー
ゼＡ〔R NaseA（シグマ社製）〕を50μg/ml,リボヌクレ
アーゼT1〔R NaseT1（シグマ社製）〕を30μg/mlになる
ように加え37℃で30分間加温した。冷却後，等量の80％
フェノールを加え，フェノール抽出を行い，抽出DNAを
エタノール沈殿にて回収し，さらに上記の希saline−ci
trate溶液20mlに溶解させ，さらに上記の濃saline−cit
rate溶液を2ml加えることにより，染色体DNAの抽出液を
調製した。
ゼＡ〔R NaseA（シグマ社製）〕を50μg/ml,リボヌクレ
アーゼT1〔R NaseT1（シグマ社製）〕を30μg/mlになる
ように加え37℃で30分間加温した。冷却後，等量の80％
フェノールを加え，フェノール抽出を行い，抽出DNAを
エタノール沈殿にて回収し，さらに上記の希saline−ci
trate溶液20mlに溶解させ，さらに上記の濃saline−cit
rate溶液を2ml加えることにより，染色体DNAの抽出液を
調製した。
（ｂ）ベクタープラスミドpBR322の調製。
プラスミドpBR322（Bethesda Research Laboratories社
製）を導入したエシェリチア・コリC600株を,2lのＬ−
培地（ポリペプトン10g/l,酵母エキス5g/l,グルコース1
g/l,塩化ナトリウム5g/lでpH7.2に調製。）で対数増殖
前期になるまで37℃で通気培養した後,10mlのクロラム
フェニコール溶液（3.6mg/mlとなるようにエタノールで
調製。）を添加し，さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。
製）を導入したエシェリチア・コリC600株を,2lのＬ−
培地（ポリペプトン10g/l,酵母エキス5g/l,グルコース1
g/l,塩化ナトリウム5g/lでpH7.2に調製。）で対数増殖
前期になるまで37℃で通気培養した後,10mlのクロラム
フェニコール溶液（3.6mg/mlとなるようにエタノールで
調製。）を添加し，さらに37℃で15分間通気培養してプ
ラスミドpBR322を増殖させた。
次に遠心分離にて集菌した菌を80mlのTE−シュクロース
緩衝液（200mg/mlシュクロース,20mM EDTAを含み,pH8.0
に調製された0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し，さらに8
mlのリゾチーム溶液（5mg/mlとなるように上記TE−シュ
クローム緩衝液にて調製。）を添加し，さらに28mlの5M
NaCl溶液と4mlの40mg/mlSDS溶液を加えた。
緩衝液（200mg/mlシュクロース,20mM EDTAを含み,pH8.0
に調製された0.05Mトリス緩衝液。）に懸濁し，さらに8
mlのリゾチーム溶液（5mg/mlとなるように上記TE−シュ
クローム緩衝液にて調製。）を添加し，さらに28mlの5M
NaCl溶液と4mlの40mg/mlSDS溶液を加えた。
この混合液を37℃で２時間反応させた後，遠心分離にて
粗プラスミドDNAを分離した。
粗プラスミドDNAを分離した。
次に,1/2容量の80％フェノールを加えてフェノール処理
を行い，夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラス
ミドを冷イソプロパノールにて沈殿回収し，さらにTE緩
衝液（0.14M NaCl,1mM EDTAを含む,pH7.5に調製された2
0mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混合液に2mgのR
NaseAを添加し,37℃で２時間反応させ，上記と同様の方
法でフェノール処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出
された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて回
収した。これを，さらに10mlの上記のTE緩衝液に溶解さ
せ，アガロースゲル濾過にて夾雑RNAをさらに除去し，
得られた粗DNAをエタノール沈殿にて再び回収した。
を行い，夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラス
ミドを冷イソプロパノールにて沈殿回収し，さらにTE緩
衝液（0.14M NaCl,1mM EDTAを含む,pH7.5に調製された2
0mMトリス緩衝液。）に溶解した。この混合液に2mgのR
NaseAを添加し,37℃で２時間反応させ，上記と同様の方
法でフェノール処理にて夾雑RNAを除去した。この抽出
された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈殿にて回
収した。これを，さらに10mlの上記のTE緩衝液に溶解さ
せ，アガロースゲル濾過にて夾雑RNAをさらに除去し，
得られた粗DNAをエタノール沈殿にて再び回収した。
この沈殿を23.1mlの0.02Mトリス緩衝液（pH8.0に調
製。）に溶解し，さらに23.7gの塩化セシウムと0.6mlの
エチジウムブロマイド溶液（10mg/mlに調製。）を加
え，約40時間超遠心することにより，プラスミドDNAを
分離し，次にノルマルブタノールにより，エチジウムブ
ロマイドを除去した。この分離したプラスミドを0.01M
のTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むpH7.5に調製された0.01M
トリス緩衝液。）で透析することにより，精製プラスミ
ドpBR322を得た。
製。）に溶解し，さらに23.7gの塩化セシウムと0.6mlの
エチジウムブロマイド溶液（10mg/mlに調製。）を加
え，約40時間超遠心することにより，プラスミドDNAを
分離し，次にノルマルブタノールにより，エチジウムブ
ロマイドを除去した。この分離したプラスミドを0.01M
のTE緩衝液（0.1mM EDTAを含むpH7.5に調製された0.01M
トリス緩衝液。）で透析することにより，精製プラスミ
ドpBR322を得た。
（ｃ）プラスミドpICD242の創製。
（ａ）の方法で得られたクロストリジウム・サーモアセ
チィカムの染色体DNA10μｇと制限酵素Hind III（宝酒
造社製）30ユニットを,7mM Mgcl2,150mM NaCl,0.2mM ED
TA,7mM2−メルカプトエタノール,0.01％BSAを含むpH7.5
に調製した10mMトリス緩衝液100μｌに入れ,37℃で30分
間反応させてDNAを消化させた後,65℃で５分間加熱し，
Hind IIIを不活性化し，冷エタノールにて消化DNA断片
を沈殿回収した。
チィカムの染色体DNA10μｇと制限酵素Hind III（宝酒
造社製）30ユニットを,7mM Mgcl2,150mM NaCl,0.2mM ED
TA,7mM2−メルカプトエタノール,0.01％BSAを含むpH7.5
に調製した10mMトリス緩衝液100μｌに入れ,37℃で30分
間反応させてDNAを消化させた後,65℃で５分間加熱し，
Hind IIIを不活性化し，冷エタノールにて消化DNA断片
を沈殿回収した。
次に，（ｂ）の方法で得られたプラスミドpBR322 3μｇ
に制限酵素Hind III3ユニットを加え，上記と同様の緩
衝液中で37℃で10時間反応させ，上記と同様の方法で消
化プラスミドDNAを回収した。こうして得られた消化染
色体及びプラスミドのDNAを混合し,T4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）を用い,6.6mM MgCl2,10mM DTT,66μM ATPを
含むpH7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で,13℃で16時
間反応させ，消化DNAを再結合することにより，プラス
ミドpICD242を得た。
に制限酵素Hind III3ユニットを加え，上記と同様の緩
衝液中で37℃で10時間反応させ，上記と同様の方法で消
化プラスミドDNAを回収した。こうして得られた消化染
色体及びプラスミドのDNAを混合し,T4DNAリガーゼ（宝
酒造社製）を用い,6.6mM MgCl2,10mM DTT,66μM ATPを
含むpH7.6に調製した66mMトリス緩衝液中で,13℃で16時
間反応させ，消化DNAを再結合することにより，プラス
ミドpICD242を得た。
実施例２ 実施例１で得たプラスミドpICD242を用いてエシェリチ
ア・コリの形質転換を行った。
ア・コリの形質転換を行った。
まず，宿主菌のエシェリチア・コリc600r-m-株を50mlの
上記のＬ−培地にて培養し，遠心分離にて集菌後,50ml
の0.1M MgCl2溶液に懸濁し，さらに遠心分離を行って最
終的には2.5mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。
上記のＬ−培地にて培養し，遠心分離にて集菌後,50ml
の0.1M MgCl2溶液に懸濁し，さらに遠心分離を行って最
終的には2.5mlの0.1M MgCl2溶液に懸濁させた。
このようにして得られたエシェリチア・コリc600r-m-株
の懸濁液0.2mlに（ｃ）の方法で得られたプラスミドpIC
D242を含む混合物を0.1ml加え,0℃で30分間処理したの
ち,42℃で２分間処理した。
の懸濁液0.2mlに（ｃ）の方法で得られたプラスミドpIC
D242を含む混合物を0.1ml加え,0℃で30分間処理したの
ち,42℃で２分間処理した。
次にこれに3mlの前記したＬ−培地を加え,37℃で１時間
培養し，さらにアンピシリン（15μg/mlに調製。）の入
ったＬ−寒天培地（Ｌ−培地１当り,15gの寒天を加え
たもの。）で37℃で培養後，生じたコロニーを，さらに
テトラサイクリン（25μg/mlに調製。）の入ったＬ−寒
天培地で培養後，生えてこないコロニーを見出すことに
より，プラスミドpICD242の導入されたエシエリチア・
コリc600−pICD242が得られた。
培養し，さらにアンピシリン（15μg/mlに調製。）の入
ったＬ−寒天培地（Ｌ−培地１当り,15gの寒天を加え
たもの。）で37℃で培養後，生じたコロニーを，さらに
テトラサイクリン（25μg/mlに調製。）の入ったＬ−寒
天培地で培養後，生えてこないコロニーを見出すことに
より，プラスミドpICD242の導入されたエシエリチア・
コリc600−pICD242が得られた。
次にこうして得られたエシェリチア・コリc600−pICD24
2のコロニーより，アンピシリン（15μg/mlに調製。）
の入った上記のグリセロール培地（ポリペプトン10g/l,
酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,グリセロール2g/l,塩
化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウム2g/l,リン酸２カリ
ウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/l,ビオチン４μg/l,そ
してpH7.2に調製）100mlで37℃で16時間，振とう培養を
行った。これを遠心分離にて集菌，洗浄後,5mlの0.01％
２−メルカプトエタノールを含み,pH7.4に調製した0.01
Mのリン酸緩衝液に懸濁し,0℃で５分間の超音波処理に
て菌体を破砕し，遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
2のコロニーより，アンピシリン（15μg/mlに調製。）
の入った上記のグリセロール培地（ポリペプトン10g/l,
酵母エキス2.5g/l,肉エキス2g/l,グリセロール2g/l,塩
化ナトリウム5g/l,リン酸１カリウム2g/l,リン酸２カリ
ウム2g/l,硫酸マグネシウム0.1g/l,ビオチン４μg/l,そ
してpH7.2に調製）100mlで37℃で16時間，振とう培養を
行った。これを遠心分離にて集菌，洗浄後,5mlの0.01％
２−メルカプトエタノールを含み,pH7.4に調製した0.01
Mのリン酸緩衝液に懸濁し,0℃で５分間の超音波処理に
て菌体を破砕し，遠心分離にて粗酵素抽出液を得た。
このようにして得た粗酵素抽出液の耐熱性のロイシン脱
水素酵素の活性を測定したところ,8.9ユニット/mg・プ
ロティンであった。これはDNA供与菌であるクロストリ
ジウム・サーモアセチィカムAN28−４株のロイシン脱水
素酵素の活性（0.010ユニット/mg・プロティン）よりも
800倍以上の活性があった。
水素酵素の活性を測定したところ,8.9ユニット/mg・プ
ロティンであった。これはDNA供与菌であるクロストリ
ジウム・サーモアセチィカムAN28−４株のロイシン脱水
素酵素の活性（0.010ユニット/mg・プロティン）よりも
800倍以上の活性があった。
また，このロイシン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液は,2
−メルカプトエタノールを0.01％含むpH7.2の10mMリン
酸緩衝液中,70℃で20分間加熱処理したところ,80％以上
の残存活性を有していた。
−メルカプトエタノールを0.01％含むpH7.2の10mMリン
酸緩衝液中,70℃で20分間加熱処理したところ,80％以上
の残存活性を有していた。
次にこの菌株から実施例１の（ｃ）と同様の方法でプラ
スミドpICD242を分離して，水平型アガロースゲル電気
泳動でプラスミドpICD242の性質を調べた。
スミドpICD242を分離して，水平型アガロースゲル電気
泳動でプラスミドpICD242の性質を調べた。
電気泳動に用いた緩衝液として,2.5mM EDTA−Na,89mMの
硼酸を含みpH8.3に調製した89mMのトリス緩衝液を用
い，ゲルとしてこの緩衝液に0.7％のアガロースと0.5mg
/lに調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用
い，これに，プラスミドpICD242とプラスミドpBR322,さ
らに分子量マーカーとしてのラムダファージDNAのHindI
II（宝酒造社製）消化断片を各１μgDNAを同一アガロー
スゲル上で同時に巾1cm当たり,7Vの定付加電圧で３〜４
時間，泳動させた。次に紫外線ランプでバンドを判定
し，プラスミドpICD242の大きさを調べた結果，分子量
が約5.8メガダルトンであった。
硼酸を含みpH8.3に調製した89mMのトリス緩衝液を用
い，ゲルとしてこの緩衝液に0.7％のアガロースと0.5mg
/lに調製したエチジウムブロマイドを加えたものを用
い，これに，プラスミドpICD242とプラスミドpBR322,さ
らに分子量マーカーとしてのラムダファージDNAのHindI
II（宝酒造社製）消化断片を各１μgDNAを同一アガロー
スゲル上で同時に巾1cm当たり,7Vの定付加電圧で３〜４
時間，泳動させた。次に紫外線ランプでバンドを判定
し，プラスミドpICD242の大きさを調べた結果，分子量
が約5.8メガダルトンであった。
また，このプラスミドpICD242を制限酵素EcoR I,Hind I
II,BamH I,Pst I,Sal Iでそれぞれの制限酵素の適性条
件で反応させ，プラスミドpICD242を消化させた。
II,BamH I,Pst I,Sal Iでそれぞれの制限酵素の適性条
件で反応させ，プラスミドpICD242を消化させた。
各制限酵素にて得られた消化試料は，上記と同様の方法
でアガロースゲル電気泳動を行い，各制限酵素による切
断部位数による切断部位数を調べた結果，プラスミドpI
CD242は第１図に示すごとく，以下の切断感受性を有す
る。
でアガロースゲル電気泳動を行い，各制限酵素による切
断部位数による切断部位数を調べた結果，プラスミドpI
CD242は第１図に示すごとく，以下の切断感受性を有す
る。
制限酵素 切断部位数EcoR I ３ Hind III ２ Pst I ３ Sa I ５ BamH I １ さらに，プラスミドpICD242は，Hind III切断部位数に
て，クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４株
のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体DNA断片と
プラスミドpBR322DNAとが結合していることが明らかで
ある。
て，クロストリジウム・サーモアセチィカムAN28−４株
のロイシン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体DNA断片と
プラスミドpBR322DNAとが結合していることが明らかで
ある。
参考例1,比較例１ 実施例２で得たエシェリチア・コリc600−pICD242株を
アンピシリン（15μg/mlに調製。）を含む前記グリセロ
ール培地100mlにて37℃で16時間振とう培養した。培養
後，遠心分離にて集菌し,0.01％の２−メルカプトエタ
ノールを含むpH7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液5mlに
懸濁し，約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。その
菌体破砕液の酵素活性を測定したところ，培地１当た
りのロイシン脱水素酵素活性は9500ユニットであること
が判り，これは以下の比較例１に比べて約10倍近くも活
性があり，生産性が著しく向上していることが明らかで
ある。
アンピシリン（15μg/mlに調製。）を含む前記グリセロ
ール培地100mlにて37℃で16時間振とう培養した。培養
後，遠心分離にて集菌し,0.01％の２−メルカプトエタ
ノールを含むpH7.4に調製した0.01Mリン酸緩衝液5mlに
懸濁し，約５分間の超音波処理で菌体を破砕した。その
菌体破砕液の酵素活性を測定したところ，培地１当た
りのロイシン脱水素酵素活性は9500ユニットであること
が判り，これは以下の比較例１に比べて約10倍近くも活
性があり，生産性が著しく向上していることが明らかで
ある。
その後，遠心分離にて粗酵素抽出液を得，その粗酵素抽
出液を70℃で30分間熱処理した後，遠心分離し，その上
澄液のロイシン脱水素酵素活性を測定したところ,46ユ
ニット/mg・プロティンの活性があり，粗酵素抽出液を7
0℃で30分間熱処理することにより，熱処理前に比べて
比活性が約５倍向上した。
出液を70℃で30分間熱処理した後，遠心分離し，その上
澄液のロイシン脱水素酵素活性を測定したところ,46ユ
ニット/mg・プロティンの活性があり，粗酵素抽出液を7
0℃で30分間熱処理することにより，熱処理前に比べて
比活性が約５倍向上した。
次に,7.5％濃度のアクリルアミドを用いた調製用電気泳
動，スーパーローズ12ゲルクロマトカラム（フアルマシ
ア製,2本を直列に連結）による高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して比活性116ユニット/mg・プロティンの耐
熱性のロイシン脱水素酵素を得た。
動，スーパーローズ12ゲルクロマトカラム（フアルマシ
ア製,2本を直列に連結）による高速液体クロマトグラフ
ィーで精製して比活性116ユニット/mg・プロティンの耐
熱性のロイシン脱水素酵素を得た。
この酵素は,pH9.4の7.5％アクリルアミド電気泳動法に
よる単一なバンドを与え，従来のバチルス・ステアロサ
ーモフイルス由来のロイシン脱水素酵素の性質と同じで
あった。
よる単一なバンドを与え，従来のバチルス・ステアロサ
ーモフイルス由来のロイシン脱水素酵素の性質と同じで
あった。
比較のため，バチルス・ステアロサーモフイルス由来の
遺伝子を組み込んだエシェリチア・コリc600−pICR1
（微工研菌寄第6937号）を公知文献（特開昭59−159778
号公報）に従い，前記グリセロール培地100mlにて37℃
で16時間振盪培養し，遠心分離にて集菌した後,0.01％
の２−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した0.0
1Mリン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理で
菌体を破砕して破砕液を得た。この破砕液についてロイ
シン脱水素酵素の活性を測定したところ，培地１当た
り1000ユニットであった（比較例１）。
遺伝子を組み込んだエシェリチア・コリc600−pICR1
（微工研菌寄第6937号）を公知文献（特開昭59−159778
号公報）に従い，前記グリセロール培地100mlにて37℃
で16時間振盪培養し，遠心分離にて集菌した後,0.01％
の２−メルカプトエタノールを含むpH7.4に調製した0.0
1Mリン酸緩衝液5mlに懸濁し，約５分間の超音波処理で
菌体を破砕して破砕液を得た。この破砕液についてロイ
シン脱水素酵素の活性を測定したところ，培地１当た
り1000ユニットであった（比較例１）。
（発明の効果） 本発明のプラスミドは，上記したように有用な微生物，
例えば，常温で生育する細菌を形質転換して多量の耐熱
性のロイシン脱水素酵素生産能を賦与することができ
る。また，このプラスミドで形質転換された本発明のエ
シェリチア・コリは，多量の耐熱性のロイシン脱水素酵
素を生産するため，臨床検査用試薬等の分野に極めて有
用である。
例えば，常温で生育する細菌を形質転換して多量の耐熱
性のロイシン脱水素酵素生産能を賦与することができ
る。また，このプラスミドで形質転換された本発明のエ
シェリチア・コリは，多量の耐熱性のロイシン脱水素酵
素を生産するため，臨床検査用試薬等の分野に極めて有
用である。
第１図は本発明に用いられるプラスミドpICD242の制限
酵素地図である。 S:Sal I,E:EcoR I,P:Pst I,B:BamH I,H:Hind III
酵素地図である。 S:Sal I,E:EcoR I,P:Pst I,B:BamH I,H:Hind III
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (2)
- 【請求項１】嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム・サ
ーモアセチィカム（Clostridium thermoacticum）AN28
−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺伝子を
ベクタープラスミドに連結し，下記（ａ）で示される制
限酵素地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え
体プラスミドpICD242。 - 【請求項２】嫌気性かつ好熱性のクロストリジウム・サ
ーモアセチィカム（Clostridium thermoacticum）AN28
−４株の染色体DNA由来のロイシン脱水素酵素遺伝子を
ベクタープラスミドに連結し，下記（ａ）で示される制
限酵素地図を有する分子量約5.8メガダルトンの組換え
体プラスミドpICD242で形質転換されたエシェリチア・
コリ（Escherichia Coli）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042264A JPH0761268B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042264A JPH0761268B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63207388A JPS63207388A (ja) | 1988-08-26 |
| JPH0761268B2 true JPH0761268B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=12631175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62042264A Expired - Lifetime JPH0761268B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | プラスミド及びそれで形質転換されたエシエリチア・コリ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0761268B2 (ja) |
-
1987
- 1987-02-24 JP JP62042264A patent/JPH0761268B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63207388A (ja) | 1988-08-26 |
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