JPH0743347B2 - Ｄｎａ塩基配列の決定方法およびその装置 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列の決定方法およびその装置

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JPH0743347B2
JPH0743347B2 JP60066383A JP6638385A JPH0743347B2 JP H0743347 B2 JPH0743347 B2 JP H0743347B2 JP 60066383 A JP60066383 A JP 60066383A JP 6638385 A JP6638385 A JP 6638385A JP H0743347 B2 JPH0743347 B2 JP H0743347B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、DNAストランドの塩基配列決定法に関する。
DNA塩基配列決定技術の一法では、同一のクローン化さ
れたDNAストランドに標識を付与する。このストランド
を４バツチに分割するが、各バツチは夫々アデニン、グ
アニン、シトシンおよびチミン（以下、Ａ、Ｇ、Ｃおよ
びＴと記す）なる４個の塩基タイプの１個の点で切断ま
たは合成される。次にアデニン−、グアニン−、シトシ
ン−およびチミン−切断されたバツチを電気泳動法で分
離する。電気泳動速度がDNA塩基配列を示す。
（従来の技術） この種の塩基配列決定法の先行技術では、DNAストラン
ドを放射性標識物で標識付けし、各分割試料（aliquo
t）毎に相異なる塩基タイプで切断し、電気泳動法で分
離したあと、該ゲルにフイルムを露出して現像し、バン
ドの塩基配列情報を得ていた。この静的検出タイプの長
さ範囲および解像度は、装置の大きさにより制限され
る。
この種の塩基配列法の別の先行技術では、各分割試料毎
に相異なる塩基タイプの単一ストランドを合成し、該ス
トランドにあとの検出のために放射性標識を付与する。
タンパク質の標識付与のために螢光標識を用い、該螢光
標識を光で断続照射してその螢光から特定タンパク質の
存在情報を得ることも先行技術で知られているところで
ある。
（発明が解決しようとする問題点） DNA塩基配列決定に関する前記先行技術は、以下のよう
な幾つかの欠点を有する。（１）比較的遅い。（２）少
くとも１部分手動である。（３）比較的短いDNAストラ
ンドに制限される。
従つて本発明の課題は、DNA塩基配列決定のための連続
的な装置および方法を提供することである。
（問題点を解決するための手段） 本発明のゲルまたは毛細管電気泳動装置を用いるDNA塩
基配列決定用の装置は、少くとも４個の同一チヤンネル
を有する第一分離装置、ならびに４種の核酸分子Ａ、
Ｇ、ＣおよびＴの相異なる末端のDNA断片を夫々受け入
れる少くとも４個の分離したチヤンネル導入部を有し、
かつ、DNA断片をその末端塩基に従つて４個の分離した
群に維持しながら、最後に導入されるバンドの分別前
に、DNA断片を前記の分離装置の端部から前進させる装
置により特徴ずけられる。該装置は、前記のDNA断片が
電気泳動装置に入る前に該断片をビオチンで標識付けす
る手段、螢光性標識をアビジンに付着させる手段、前記
のDNA断片を螢光化アビジンで標識付けする手段、前記
の標識を光パルスで選択的に照射する手段、背景螢光が
減少する時間にまたがり前記標識の螢光を検出する手
段、ならびに前記の螢光を、核酸基中の相異なる基で切
断された各DNA断片に対応する螢光標識化DNAバンドの時
間系列を示す電気信号に変換する手段を包含する前記の
検出手段を有することが有利である。
本発明の前記ならびにその他の諸特徴は、図面を参照し
ながら考慮することにより、以下の詳細な説明から更に
理解できるであろう。
第１図は、本発明の一実施態様のブロツクダイヤグラム
である。
第２図は、本発明の別の実施態様のブロツクダイヤグラ
ムである。
第３図は、第１および２図の実施態様の一部分の概略図
である。
第４図は、第３図の部分の別の実施態様である。
第５図は、第３図の部分の更に別の実施態様である。
第６図は、第１および２図の実施態様の一部のブロツク
ダイヤグラムである。
第７図は、第１および２図のブロツクダイヤグラムの一
部の論理回路ダイヤグラムである。
第８図は、第１および２図の実施態様の一部の回路の概
略ダイヤグラムである。
図１は、ビオチン標識付与系11、DNA切断系12、分離系1
4、検出および処理系16、ならびに標識長DNA源18を有す
るDNA塩基配列決定系10のブロツクダイヤグラムを示
す。ビオチン標識付与は、DNAクローン化ストランドを
４分割する前に行なう。適当な商業品ビオチンを、11で
示した容器内にある100塩基以上のクローン化されたス
トランドに添加する。ビオチン調製物は、大部分のDNA
断片の少くとも１端部に、当該技術分野で既知の方法に
てビオチン標識を付与するために十分なものでなければ
ならない。
ビオチン（biotin）が選択される理由は、アビジン（av
idin）に対して親和性を有すること、およびDNA断片に
付加した際に電気泳動の時のDNA断片の移動を実質的に
抑制するほど大分子でなく、分離系14での相異なるDNA
断片の識別を妨害しないためである。
ビオチンはあとでアビジンのような大分子と結合する標
識として選択されるものであるが、その他の標識を使用
してもよい。標識は、DNA断片に付着可能かつ螢光物質
その他の適当な検出可能物質で標識付けされる大分子に
対して強い親和性を有する特性を持つものでなければな
らない。標識は斯かる大きさでなければならぬが、同時
にアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の相
異なる塩基で切断された相異なる断片の移動度の正常な
差異を不明確にせぬような化学特性を有するものでなけ
ればならない。
更には、放射性リンまたは放射性硫黄、放射性炭素また
は三重水素等の放射性標識をDNA分子に添入し、分離後
にストランドをシンチレーシヨン液に添加してもよい。
DNA切断系12は４通路を有し、標準長DNA源18は分離系14
内に１路を有し、DNA断片と標準断片が別の通路を通る
ようにしてある。分離によりDNAストランドを順序ずけ
る分離系14は、検出および処理系16に通じていて、該系
で断片を互いに比較してかつ標準長DNA源18からの標準
物と比較分析し、もとの断片のDNA鎖に関する情報が得
られる。
DNA切断系12には、20A、20G、20C、20Tなる同一のクロ
ーン化されたDNAストランド源が４個ある。通常このDNA
ストランドは100塩基以上の長さを有するものである
が、更に化学処理にて切断され、20A、20G、20Cおよび2
0Tの４容器の各々の中の断片は種々の長さになる。
一実施態様では、容器20Aは化学処理Ａでランダムに切
断されたDNAストランドの断片を含有し、容器20Gは化学
処理Ｇでランダムに切断されたDNAストランドの断片を
含有し、容器20Cは化学処理Ｃでランダムに切断されたD
NAストランドの断片を含有し、かつ容器20Tは化学処理
Ｔでランダムに切断されたDNAストランドの断片を含有
する。すなわち、各容器内の同一断片は、適当な化学処
理により所与の相異なる塩基で切断される。
容器内の断片は、容器20A、20G、20Cおよび20Tの断片を
夫々Ａ−DNA断片、Ｇ−DNA断片、Ｃ−DNA断片およびＴ
−DNA断片と称する。これらの断片は、容器20A、20G、2
0Cおよび20Tから、対応する22A、22G、22Cおよび22Tな
る導管を経て流れ、分離系14に接触する。
標準長DNA源18は既知の相異なる長さの参照DNA断片源を
有し、導管22Sを経て分離系14に流れる。これらの参照
断片は既知の長さを有し、従つてそれらが分離系14を通
過する移動時間は、以下で説明するように時計すなわち
計時手段となる。好適実施態様では、100塩基のクロー
ン化されたストランドを、４バツチに分割する前にビチ
オンで標識付けするが、４バツチに分割のあと、特定の
化学処理を施す前に標識を付与してもよい。
分離系14には26S、26A、26G、26Cおよび26Tなる５個の
電気泳動チヤンネルがある。好適実施態様の電気泳動チ
ヤンネル26S、26A、26G、26Cおよび26Tには、各ゲル路
長が同一でそれに同一の電場を印加したゲル電気泳動装
置があり、５個のチヤンネルを通して試料を連続的に移
動させる。ゲルおよび電場は、DNAストランド移動速度
のチヤンネル間差が５％以下となるように選択される。
更には、電場を時間と共に変化させ、小分子が検出され
たあとに大分子の速度を増大させること、ならびに、各
チヤンネル内での移動がチヤンネル間の同期性維持に必
要な精度内に入るよう、時計チヤンネルからのフイード
バツクに基いて各チヤンネル内の速度を調節し、各チヤ
ンネル内の差を補償することも可能である。
ゲルは同一の材料、化学的誘導体および長さのものが好
ましく、電場のバラツキは各チヤンネルの中間値の５％
以内にあることが好ましい。しかしながら、ゲル内での
DNA移動を全チヤンネルにわたり均一にせねばならぬ要
求を最小にするため、２個以上の参照チヤンネルを使用
し、参照チヤンネルを試料チヤンネルに隣接させること
もできる。
電気泳動チヤンネル26Sは、ビオチンで標識付けされた
既知長DNAの断片を受け入れ、ゲル内を移動させる。同
様にして、26A、26G、26Cおよび26Tの各電気泳動チヤン
ネルは、切断系20A、20G、20Cおよび20Tからビオチン標
識された断片を受け入れ、それらを試料電気泳動チヤン
ネル内で遂次移動させ、各断片は参照電気泳動チヤンネ
ル26Sと同一の電場のもとでその移動度に従つて移動す
る。
DNA鎖に関する情報を提供するため、検出および処理系1
6には、30S、30A、30G、30Cおよび30Tなる５個のアビジ
ン源、32S、32A、32G、32Cおよび32Tなる５個の検出系
ならびに相関（correlation）系34がある。アビジン源3
0S、30A、30G、30Cおよび30Tは、夫々検出系32S、32A、
32G、32Cおよび32Tに連結している。分離系14内の電気
泳動チヤンネル26S、26A、26G、26Cおよび26Tの夫々に
対応する出力は、検出系32S、32A、32G、32Cおよび32T
の対応系に接続されている。検出系では、螢光標識を付
着したアビジンとDNA断片を結合し、螢光標識が付着し
たアビジンにより標識付けされたDNAを検出系内の試料
室に供給し、断片の存否を示すバンドを検出する。バン
ドの検出を断片の長さに関連する。
検出系32S、32A、32G、32Cおよび32Tからの各出力は、
導線を介して相関系34に電気的に接続されており、相関
係は各検出系からの情報を相関させてDNA鎖に関する情
報を提供するマイクロプロセツサー系である。
各アビジン源30S、30A、30G、30Cおよび30Tは、既知の
供給業者から購入したアビジンを含有し、好適実施態様
における各アビジン分子には３個の螢光物質分子が結合
している。アビジン源はDNA断片と接触するように配置
され、電気泳動チヤンネルに隣接して配されるゲル部分
内にある。この用法では、ゲルのこの部分のpHは、３個
の螢光物質分子で標識付けされたアビジンが電気泳動で
移動するのを回避するため、約８でなければならない。
ビオチン化されたDNAストランドがpH8のゲル部分に到達
すると、ゲルのこの部分の定常状態にあるか、極くゆつ
くりとしか移動していない螢光化アビジンを拾い上げる
であろう。
螢光化アビジンを含むゲルセクシヨンを調製するため、
螢光化アビジンをチヤンネルの出口端部から内部に向つ
て電気泳動させる。本実施態様では、螢光化アビジン
は、そのpHがゲルの第二部分のpHよりも若干高めなの
で、この方法に徐々に移動する。別法として、螢光化ア
ビジンをゲル内に混合してもよい。
螢光物質−アビジン−ビオチン−DNAなる複合分子はpH8
のゲル内では酸性なので、ゲルのこの部分から移出を続
け、溶離剤により検出系内の試料室を通過する。その
際、アビジンを付着せずに行つたのと同様の分離が維持
され、実質的な変化はなかった。別法として、DNA断片
のバンドを螢光標識化アビジンを含有する可動性の液体
に電気泳動で移動させ、該アビジンと結合せてもよい。
該アビジンはDNA断片の端部に付着したビオチンと選択
的に結合し、未反応の螢光化アビジンは、クロマトグラ
フイー等の標準技術により螢光物質−アビジン−ビオチ
ン−DNA複合物から分離される。
各検出系は、バンドの存否を検出してそれらの検出を電
気信号に変換するための光学系を有する。電気信号は相
関系34に伝達され、該相関系は標識長DNA18源からの標
準断片ならびに容器20A、20G、20Cおよび20TからのＡ、
Ｇ、ＣおよびＴ断片の両者に関するDNA断片の塩基配列
を示す。
図２は、別なる実施態様のクロマトグラフ装置A10の簡
略化したブロツクダイヤグラムを示すものである。本装
置は、図１の電気泳動装置に類似しており、成分は参照
数字の前に文字Ａを付して同様な方法で示す。
本実施態様では、図１に20A、20G、20Cおよび20Tで示し
たDNA塩基配列決定系10なる実施態様のDNAおよび化学処
理Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ用の容器の代りに、クロマトグラ
フ装置10は、サンガー（Sanger）法（エフ．サンガー
（F.Sanger）、エス．ニツクレン（S.Nicklen）および
エー．アール．クールソン（A.R.Coulson）著、「チエ
インターミネーターによるDNA塩基配列の決定法」、プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・ユー．エス．エイ（Proceedings
of the National Academy of Science,USA）第74巻第12
号第5463−5467頁、1977年）に依るDNA処理用の容器を
有し、図２の実施態様A10で、一般にA12で一括されるA2
0A、A20G、A20CおよびA20Tとして示している。
本法では、DNAストランドを分離し、これを鋳型としてD
NAを合成するために使用し、合成は所与の塩基Ａ、Ｇ、
ＣまたはＴのところでランダムに終結し、複数の相異な
る分子量のDNAストランドが得られる。この限定合成
は、合成を終結させるヌクレオチドを用いることにより
得られ、別々の容器内で行なわれる。各容器は夫々特殊
なＡヌクレオチド、特殊なＧヌクレオチド、特殊なＣヌ
クレオチドおよび特殊なＴヌクレオチドを有する。これ
らの特殊なヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドまた
は標識付けされたヌクレオチドであり、両者とも合成を
終結させる。
従つて各４バツチは、塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちあ
る１個の塩基のところでランダムに終結する。
本実施態様でも、図１に示した方法でDNA断片の一端部
をビオチンにて標識付けしてもよい。しかしながら、図
２の好適実施態様では、ビオチンによる標識の代りに、
図２のA12で示したチヤンネルに通す前に、A11で示すよ
うなDNAの逆向き相補繰返し（inverted complementary
repeat）によりDNA断片に標識を付与する。逆向き相補
繰返しの設計は、オリゴヌクレオチドとして知られる小
DNA断片の設計法として有利である。本法は文献ならび
に「ホスホルアミダイト成分とプロセス」（米国特許第
4,415,732号）等の特許に広く記載されており、その開
示をここに引用する。
電気泳動後に、逆向き相補繰返しは二重（duplex）DNA
のパリンドロームからヘアピンを形成し、続いてこれが
臭化エチジウムと結合して検出系で検出される。検出系
は、螢光標識に適当な光の波長でなく、挿入された臭化
エチジウムに適当な光の波長を用いる。高感度検出技術
を用いる場合には、逆向き繰返しは使用せず、たまたま
二重DNAを形成する未知DNA部分間に挿入された臭化エチ
ジウムを検知することにより、あるいは単鎖DNAに付着
した臭化エチジウムにより、あるいはDNA自身の固有螢
光により検出されるであろう。放射性標識を使用する場
合には、放射性標識およびシンチレーシヨン流体の組合
せが発する光を検知することにより検出が行なわれる。
図３は、当該技術分野で既知のゲルのスラブ27を有する
分離系を示す図である。一般的に29Aで示す５個の試料
分配管は、ゲル27の一端部にある一列に配列されたスロ
ツト51で終り、斯かるスロツトは負電極47Aを有する負
電位緩衝槽29と接触し、かつ、31Aに位置する他端部の
５個の出口管はゲル27の孔ならびに正電極53Aを有する
正電位緩衝槽31で終了している。電気泳動にかける材料
はスロツト29A内に挿入され、ゲル27に加えられた電場
によりゲル内を頂部から底部へと移動し、31A群の対応
出口管に入る。ゲルスラブ27は両側にガラス板27Aおよ
び27Bを有し、試料とゲルを閉じ込めている。緩衝槽31
からの緩衝液は、管31Aに接続されたポンプで緩衝液源5
7から吸引され、ゲル27に直角に流れて入る。緩衝液は
電気泳動で移動してきたDNAを全て捉えて出口孔31Aに導
き、後記の感知装置に運ぶか、あるいはスラブ27からの
電気泳動処理されたDNAストランドに更に電気泳動を施
すべく他のゲルスラブへ導くのである。
図４は、ゲル電気泳動の別の実施態様B26Aを示す図であ
り、一般的にB29Aで示したＡチヤンネル用の負電位緩衝
液装置、B27Aで示したＡ末端DNA用のゲル電気泳動チヤ
ンネルおよびB31Aで示した該チヤンネル用の正電位緩衝
液装置を有する。本実施態様は、温度調節を更に容易に
し、従つて図３のスラブ27で起り得る温度差に基く移動
速度の変化を軽減させるため、各チヤンネルを細い円筒
ゲルにしたものである。更には、同期化を適正に維持す
るため、各チヤンネル毎に電場を独立に調整することも
できる。
この目的で、チヤンネルB27Aは、33で示すクロマトグラ
フカラムのような内径0.5乃至１ミリメートルのパイレ
ツクスカラムを有し、その内部にゲルを充填する。ゲル
の調製は、暖かい間にカラム内に挿入し、それを硬化さ
せることによりなされる。カラム33は、DNAの分離に十
分な長さを有する。標識としてビオチン−アビジン−螢
光物質を使用する実施態様では、はじめに螢光化アビジ
ンを35の出口端部から上方に電気泳動させ、37の入口端
部から入るDNAと遭遇させる。カラムの温度は通常のク
ロマトグラフ温度調節装置39で調節され、該温度調節装
置はカラムの周りをガラスケースで覆つたものであつ
て、液体を一端例えば41で受け入れ、43から取り出す。
チヤンネルB27Aの一端部には、プレキシガラス製カツプ
状容器45内の緩衝溶液を供給する衝撃液装置B29Aがあ
り、該衝撃液装置は入口端部37上まで延長しており、内
部に負電圧の電極47を有する。
出口端部でも、同様に緩衝液を含有する緩衝液室51があ
り、該室は電極53で接地され、緩衝液内にゲルカラムB2
7Aの出口端部35を浸している。緩衝液室はプレキシガラ
ス製であり、その下端がマイクロオリフイス55で終わる
次第に細くなるオリフイスの形状を有し、出口端部35か
らでてくるDNA含有−緩衝液流を通過させて前記の断続
光源で検出できるようにしている。新緩衝液の供給のた
め、緩衝液貯蔵器57がポンプ59を介して緩衝液装置51の
頂部に接続されており、その流速は出口端部近傍で渦が
生ぜず、かつ、緩衝液の信号対雑音比を最適とするのに
十分な流速に設定される。別の実施態様では、緩衝液−
DNAの流動溶液を流液セルに移し、螢光分光計または特
別に設計されたHPLC螢光検出器で検出する。
一実施態様として緩衝液に臭化エチジウムを含有させ、
300または390ナノメートルで励起させて590ナノメート
ルで検出する方法もある。
図５は、カラム33およびゲルに代る更に別の実施態様C2
6Aを示すものであり、これは一般に毛細管泳動法に使用
される毛細管カラム61、63および65を有する。これらの
カラムには、ゲルでなく緩衝溶液を充填して電気泳動用
に使用する。この場合、図４の実施態様の１本のカラム
の代りに数本の毛細管を使用する。従つて、Ａ、Ｇ、Ｃ
またＴ型塩基の同一バンドが数本の平行な毛細管束を通
るか、または塩基の型毎に１種の塩基が一本の毛細管を
通過する。
ゲルチヤンネルまたは毛細管等の分離路の長さは、DNA
の長さが50乃至10,000程度の塩基の範囲では２メートル
以下でなければならない。しかしながら、DNAの長さの
範囲が増大するにつれて、必要時間が長くなる。また、
各分離に要する時間は、1/2秒乃至５分間である。
図６は、検出系32Aのブロツクダイヤグラムを示す図で
ある。検出系32S、32G、32Cおよび32Tは検出系32Aと実
質的に同一であり、従つて系32Aのみを詳細に説明す
る。検出系32Aは、電気泳動チヤンネル42、試料室43、
光源44および光学検出系46を有する。
一実施態様では、螢光化アビジン源中の螢光物質で標識
付けされたアビジンは、チヤンネル26Aから導管48を通
るＡ型末端ストランドを受け入れるゲル内に流入し、ビ
オチン化DNA断片に付着する。実際、電気泳動チヤンネ
ル42は、連続的電気泳動のために電気泳動チヤンネル26
Aの端部に位置するゲル部分でありうる。螢光化アビジ
ンが電気泳動チヤンネル42でビオチン化DNAに付着した
あと、その複合分子を電気泳動チヤンネル42から試料室
へ溶出させる。
別の実施態様ではDNAを前記のパリンドロームで標識付
けするが、この場合には検出系は別波長の光を使用し、
螢光化アビジン源40は必要でなくなり、臭化エチジウム
源40Aが必要となろう。
試料室43は光源44にて照射される。光源44からの光は光
学検出系46で検出されて電気信号に変換され、導線50A
を経て相関系34（図１）に伝達される。一実施態様で
は、螢光化アビジン源40は、DNAおよび関連物質中の背
景（バツクグラウンド）螢光よりも十分長い螢光期間を
有する螢光標識物質を含有し、信号を背景螢光からはつ
きりと分離することができる。本実施態様での螢光標識
の崩壊寿命は、検出信号中の雑音として表わされる背景
螢光の持続時間の少くとも10倍でなければならない。
既知の適当な螢光標識物質の幾つかの例を以下に示す。
（１）生成錯体が所望の性質を有する、稀土類元素が有
機化合物に結合した稀土類−有機錯体、例えばユーロピ
ウムベンゾイルアセトネートおよびユーロピウムベンゾ
トリフルオロアセトネート（エス．アイ．ワイスマン
（S.I.Weissman）、ジヤーナル・オブ・ケミカル・フイ
ジツクス（Journal of Chemical Physics）第10巻第214
−217頁、1942年に記載あり、同文献を引用する。）
（２）ピレンブテレート（pyrenebuterate）（クノツプ
（Knopp）およびウエーバー（Weber）、ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biolo
gical Chemistry）第242巻第1353頁（1963年）および第
244巻第3609頁（1969年）に記載あり、同文献を引用す
る。）（３）フルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）、（４）ローダミンイソチオシアネート（RITC）、
（５）テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TR
ITC）、（６）フイコエリトリンおよび（７）それらの
同族体および置換誘導体。斯かる物質はリサーチオーガ
ニツクス社（Research Organics、米国オハイオ州クリ
ーブランド）等から商業的に入手可能である。好適実施
態様における螢光化アビジンは、ベクターラボラトリー
ズ社（Vector Laboratories Inc.米国カリフオルニア州
94010バーリンガム、ロリンスロード1429）から購入で
きる。
光源44は、断続光源52と変調器54を有する。断続光源52
は、螢光標識の吸収スペクトルの範囲内にある光を発す
るように選択される。各種の螢光標識が使用されるの
で、この周波数は螢光標識毎に異なる。或る実施態様で
は、変調器54は、結合標識からの螢光を測定する時間内
に、背景螢光物質からの螢光が消滅するようなパルス間
隔を選択するように断続光源52を調節する。
これらパルス間の時間は全消滅期間を包含する十分に長
い時間である。これは、付着された螢光標識の消滅時間
が、背景の雑音螢光に比べて相対的に長いために達成さ
れるのであり、従つて光学検出系46による測定がなされ
る前に一定の時間を置くことができる。代表例での光パ
ルスの持続時間は約３ナノ秒であり、背景螢光の崩壊は
約10ナノ秒継続し、一方アビジンに付着した螢光標識の
崩壊寿命は100ナノ秒である。
代表的な光学検出系46は、レーザーからの励起パルスの
開始後約50ナノ秒で読み始め、約150ナノ秒間すなわち
３ナノ秒パルスの開始後200ナノ秒後まで読みを継続す
る。好適実施態様では断続レーザー光源を使用するけれ
ども、広域帯の光源をフイルターまたはモノクロメータ
ーと組合せて使用し、標識の狭帯域吸収スペクトルを提
供してもよい。
別の実施態様では、周波数が典型的には10KHzの連続光
源を実質的に変調深さ100％かつデユーテイーサイクル
（dutycycle）50％で、変調する電気−光学的変調器を
使用する。パルス発生器は、信号を励振器（driver）を
経由して変調器および参照信号としてロツクイン増幅器
（loc−in amplifier）の両者に提供する。
特定のDNA断片を示す電気泳動チヤンネル42の電気泳動
ゲル内バンドを検出するため、光学検出系46はある種の
検視光学装置（viewing optics）60、フイルター62、お
よび光学検出系64を有する。光学検出系64は変調器54に
電気的に接続され、電気泳動チヤンネル42内のDNA断片
バンドの存否を示す導線50Aへの電気信号を開閉する。
好適実施態様におけるフイルター62は、螢光標識の高放
出スペクトルに対応する透過帯域の干渉フイルターを有
する。斯かるフイルターは当該技術分野で知られるとこ
であり、螢光標識の一般的放出帯域に対応する帯域のフ
イルターは商業的に購入することができる。更には、長
波長透過性干渉フイルターおよび／または着色ガラスフ
イルターもある。別の実施態様では、フイルターの代り
にモノクロメーターを使用する。
検視光学装置60は、フイルター62と並列で配置され、光
学検出系64に光の焦点を合せるためのレンズ系から構成
される。これは通常の光学系のいずれでもよく、光学検
出系64は半導体検出器または光電子増倍管を有するもの
でなければならず、斯かる例にはEMIジエンコン社（EMI
Gencon、米国ニユーヨーク、プレインビユー）製のモ
デルEMI9798Aがある。
第一の実施態様では、光電子増倍管または半導体の出力
は、変調器54からの信号に応答して開閉され、断続レー
ザー光源からの各パルスより一定の時間遅れで発生す
る。例えば、時間遅れは、電気信号を増幅器に加える
前、従つて電気信号を導線50Aまたはその出力が導線50A
に電気的に接続されている増幅器へ供する前に包含され
る。好適実施態に於ける時間遅れは50マイクロ秒であ
り、ゲートまたは増幅器はモノステーブル（monostabl
e）多調波発振器により約150ナノ秒間開放状態に維持さ
れる。第二の実施態様では、変調器の方形波出力を、ロ
ツクイン増幅器を用いて検出器からの信号と比較する。
第三の実施態様では、変調を行なわない。
図７は、標準チヤンネルの入力回路70S、ゲート系72、
デコーダ74、記憶系76および読み出し系78を有する相関
系34のブロツクダイヤグラムを示す図である。標準チヤ
ンネルの入力回路70Sは、ORゲート74Sに電気的に接続さ
れ、ORゲート74Sはその他のチヤンネルＡ、Ｇ、Ｃおよ
びＴ、ならびにチヤンネル70Sと同様にチヤンネルＡ、
Ｇ、ＣおよびＴからの各チヤンネル入力信号を受けるゲ
ート系72に電気的に接続されている。
ゲート74Sは記憶系76に電気的に接続され、該記憶は核
酸塩基の特定の１種を有するDNA断片または標準チヤン
ネルのDNA断片の存在を示す信号をゲート74Sから受け取
る。記憶系76は、連鎖をプリントアウトするための読み
出し系78に電気的に接続されている。
標準チヤンネルの入力回路70Sは、パルスシエーパー（P
ulse Shaper）82A、二進計数器84S、クロツク80の時間
遅延系94Sおよびラツチ（latch）86Sを有し、パルスシ
エーパー82Sの入力は導線50Sに電気的に接続されてお
り、その出力は二進計数器84Sならびに時間遅延系94Sを
経てORゲート74Sに接続されている。二進計数器84Sはラ
ツチ86に接続されて時間増分信号をラツチ86に伝え、ラ
ツチ86の出力は、ORゲート74Sからの信号の引金がかか
ると、記憶系76の入力部の一つに印加される。導線50S
は、それがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミン
の出力でなく、標準クロツクチヤンネルの出力であるこ
とを除き、導線50A、50G、50Cおよび50T（図２）に対応
するものである。
ラツチ86およびデコーダ74は、ゲート74Sからのパルス
信号を受けて記憶系76に書き込むが、それは特定のDNA
断片が検出系32A、32G、32Cおよび32T（図１）に受け取
られ検出された時間を示すためにあとでプリントされる
クロツク時限パルスを示す区別された信号の記録であ
る。二進計数器84Sは、それに接続されているクロツク8
0から刻時パルスを受けて、ラツチ86に伝達するための
時間を表わす二進信号を内有する。
スイツチ回路72は、デコーダ74を有し、該デコーダは、
Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ型のDNA断片が入力導線50A、50G、5
0Cおよび50T（図１および図２）上に出現した際にその
存在を示す信号を受け取るため、夫々チヤンネル70A、7
0G、70Cおよび70Tからの４個の入力部に電気的に接続さ
れている。導線50A、50G、50Cおよび50T上の各信号は、
夫々のパルスシエーパー82A、82G、82Cおよび82Tに加え
られ、その出力は対応する導線92A、92G、92Cおよび92T
を経て、デコーダ74の相異なる入力部およびORゲート74
Sの相異なる入力部に電気的に接続されており、従つて
デコーダ74はDNA断片の存在を示す信号を、ORゲート74S
から導線90Sを経た信号と共に受け取り、記憶系76に伝
える。ORゲート74Sは、チヤンネル70Sから較正信号を受
け取つた際またはチヤンネル70A、70G、70Cおよび70Tの
いずれかから信号を受け取つた際に斯かる信号を伝え、
従つて記憶系96は較正信号またはDNAを示す信号を受け
取り、記憶系76内での一定の遅延時間後に読み出し系78
に伝えて読み出しに供する。
ORゲート74Sは、遅延ライン94Sにて付与された一定の遅
延時間後にチヤンネル70Sからの較正信号を受け取る
が、チヤンネル70A、70G、70Cおよび70Tには斯かる対応
遅延はない。しかしながら、以下で説明するように、同
様な遅延がデコーダ74内にもあり、従つてDNA断片の出
現は、チヤンネル70Sからの較正信号の時間フレーム（f
rame）に対応する時間フレームで記憶系76へ伝達され
る。デコーダ74の出力は、導線100を介して記憶系76に
電気的に接続されている。
図８は、遅延ライン94、ORゲート102ならびにアデニ
ン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の末端を有す
るDNA断片を夫々示す複数のコーデイングチヤンネル74
A、74G、74Cおよび74Tを有するデコーダ74回路の概要ダ
イヤグラムを示す図である。
チヤンネル74Aは、導線92Aおよび90Aに電気的に接続さ
れた入力部を有するANDゲート106を内有し、導線70Aに
てORゲート74S（図７）からの刻時信号を受け取り、導
線92Aにてアデニン末端断片の存在を示す信号をその別
の入力部に受ける。
チヤンネル74GはANDゲート108、ANDゲート110および遅
延ライン112を有する。グアニン末端系を示す導線92G
は、ANDゲート108および110の入力部に電気的に接続さ
れている。ANDゲート108の出力はORゲート102の入力部
の一つに接続され、ANDゲート110の出力は遅延ライン11
2を経てORゲート102の入力部に電気的に接続され、継続
する２個のパルスをゲート102に付与する。すなわち、
チヤンネル74AはANDゲート106の出力部から１個の出力
パルスをORゲート102の入力部の一つに加えるのに対
し、チヤンネル74Gは２個のパルスを加えるのである。
いずれの場合も、パルス連鎖がDNA断片ＡまたはＧタイ
プの特定の一方の存在を示すのである。
同様に、チヤンネル74CはANDゲート114、116および118
を内有し各ゲートは導線92Cおよび90Cに電気的に接続さ
れた２個の入力部を有する。またチヤンネル74TはANDゲ
ート120、122、124および126を内有し、各ゲートは導線
92Tに電気的に接続された入力部の１つと90Tに接続され
た他の入力部の１つを有する。ANDゲート74Cからの出力
はORゲート102の一入力部に電気的に接続され、ANDゲー
ト116の出力は遅延系128を経てORゲート102の入力部に
電気的に接続され、かつ、ANDゲート118の出力は遅延系
128より長い遅延系130を経てORゲート106の一入力部に
電気的に接続されている。この配列では、シトニン末端
のDNA系が存在すると、ORゲート102に３個のパルスをも
たらす。
ANDゲート120の出力はORゲート102の一入力部に電気的
に接続され、ANDゲート122の出力は遅延系132を経てOR
ゲート102の一入力部に電気的に接続され、ANDゲート12
4の出口は遅延系132よりも長い遅延系134を経てORゲー
ト102の一入力部に電気的に接続され、かつ、ANDゲート
126の出力は遅延系134よりも長い遅延系136を経てORゲ
ートの一入力部に電気的に接続される。このようにする
と、チミン末端断片が存在すれば、ORゲート102の入力
部に一連の４個の信号をもたらす。ORゲート102の出力
は、遅延系94S（図７）と同じ時間遅れの遅延系94を経
て出力導線100に印加され、特定DNA群の存在を示すコー
ド化信号を、時間信号で調整した記憶系76（図７）に提
供する。
DNA配列決定操作では、100以上の塩基を有するで読み始
め、約150ナノ秒間すなわち３ナノ秒大きさに従つて分
離し、続いて１種以上の螢光分子で標識付けされたアビ
ジンで標識を付与する。次にこのバンドを光で検出する
が、放出スペクトルの読み出しは、雑音からの分離のた
めに、放出スペクトル励起後の十分な時間を経て行なわ
れる。
DNA断片をビオチンで標識付けするには、クローン化さ
れたDNAストランドを調製し、切断して幾つかの断片と
なし、そのあと先ずビオチンで標識を付け、次にそれを
４分割試料にする。同様にビオチンで標識付けされ、電
気泳動下で種々の移動速度を有する標準DNAストランド
源は、更なる較正バツチを形成する。この４個のバツチ
は、夫々アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩
基の相異なる１種に関する化学処理によりランダムに切
断されたものである。別法として、DNAストランドを分
離し、ランダムに特定の塩基タイプに合成させるための
鋳型として使用してもよい。いずれの場合も、該DNAス
トランドは、ビオチンで標識を付与されるか、DNAの逆
向き相補連鎖で標識を付与されるか、放射性標識で標識
を付与されるか、または標識を付与されないままであ
る。
該DNA断片を分離するため、標準ラダー（ladder）源を
含有するビチオン標識付与断片を、夫々相異なるチヤン
ネルまたは相異なるカラム内のゲルを通して電気泳動に
付す。ゲルと電場は均一でなければならないが、参照チ
ヤンネルを用いると均一性に対する要求は減少する。数
種の相異なる試料を移動させるための単一のスラブを使
用する際には、チヤンネルを分離し、かつ、試料を移動
させる電位が均一となるようにチヤンネルを電場の中心
近くに集めねばならない。分離ゲルの好適pHは7.5−８
である。
DNA断片は、電気泳動の間にその長さに従つて分離す
る。すなわち、最も速い移動部分は、DNAストランドの
標識端部に最も近い最初の塩基で切断または合成された
断片である。チヤンネルが分かれているので、チヤンネ
ルからの断片中の最初の塩基がＡ、Ｇ、ＣまたはＴの何
であるかが知られる。ゲル内の時間的に次のバンドは次
の切断点であり、最初のものよりも一塩基長いものであ
る。と云うのは、それがDNAストランドのビオチン化端
部から最初の塩基と第二の塩基の両者を包含するからで
ある。同様にして、電気泳動時に第三のバンドを形成す
る断片は、最初の３個の塩基単位を包含するであろう、
等々。
多数の塩基を使用するので、多数の切断点があり、各バ
ンドの断片の密度は比較的低い。従つて、ゲルと電場
を、検出のために十分な幅、十分な高密度を有しかつ適
度に分離されたバンドを与えるように選択せねばならな
い。連続法でのゲルスラブの長さは、ゲル内を完全に移
動するはじめの数バンドが十分に分別され、一方終りの
バンドが未分別のままでいるように十分長いものでなけ
ればならない。更に詳細には、少くとも10パーセントの
バンドが分別されてゲル内を電気泳動し、一方最も動き
にくいハンドがゲルの入口端部近くで未分別のままでい
るようにするのである。
一実施態様として、低密度バンド測定のための光増幅を
行なうには、１種以上の螢光分子で標識を付与されたア
ビジンが混合されている領域にそのバンドを電気泳動さ
せる。アビジンは大分子でありかつビオチンに強く引か
れているので、各バンド内のDNA断片が螢光標識アビジ
ン領域に移動してくると、アビジン標識が付与される。
32S、32A、32G、32Cおよび32T（図１）に示すようなア
ビジン標識が付与されたあと、それらは各々図２に示す
ような検出系に移動する。
アビジン分子は大分子なので、同一アビジン分子に多数
の螢光標識が付着し、従つて適度の検出を可能とする。
次に螢光標識を付与された断片を検出系内の試料室に移
動させる。検出系内でのそれらの相対的順序は維持され
ている。分離度が最小とならぬように、ゲル内での移動
速度は十分速いものでなければならない。
バンドは試料室内に溶出され、そこで各光源が、螢光標
識または第二実施態様の臭化エチジウム標識の最適吸収
スペクトルのパルス光すなわち断続光を約３ナノ秒間照
射する。３ナノ秒パルス光の開始後約50ナノ秒間にわた
り光は検出器で検出され、その結果得られた電気信号は
増幅される。この光は検出され相関されて、各検出系の
端部にある検出器で示されるようなチヤンネルに従つ
て、DNAの塩基配列を与える。
前記の説明から判るように、本発明のDNA配列決定系は
連続的な配列決定を可能とするものであつて、連続的、
自動的に多数の塩基を処理できる。これは、連続的電気
泳動法を、第一分離終期のアビジン付着による増幅と組
合せることにより達成される。
本発明の好適実施態様をある程度詳細に説明してきた
が、前記の説明に照らして、多数の修正および変法が可
能である。従つて、前記の特定の説明例以外にも、特許
請求の範囲内で、本発明の実施は可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の一実施態様のブロツクダイヤグラム
である。 第２図は、本発明の別の実施態様のブロツクダイヤグラ
ムである。 第３図は、第１図および第２図の実施態様の一部分の概
略図である。 第４図は、第３図の部分の別の実施態様である。 第５図は、第３図の部分の更に別の実施態様である。 第６図は、第１図および第２図の実施態様の一部のブロ
ツクダイヤグラムである。 第７図は、第１図および第２図のブロツクダイヤグラム
の一部の論理回路ダイヤグラムである。 第８図は、第１図および第２図の実施態様の一部の回路
の概略ダイヤグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも一つの泳動チャンネルを有する
    ゲル電気泳動部；四つの塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの一つ
    で終結したDNAフラグメントを該チャンネルに導入する
    ための少なくとも一つの試料導入部；泳動されたDNAフ
    ラグメントを標識する手段；標識されたフラグメントを
    検出する手段；および、ゲル電気泳動部に電圧を負荷す
    る手段を含んでなる、DNAをゲル電気泳動により同定す
    る装置において、 後からバンドを形成すべき移動度がより小さいフラグメ
    ントが未分離の間に、移動度のより大きいフラグメント
    のバンドがゲルから未だ排出されずに十分に分離される
    ようにされていること、および 上記標識手段は、フラグメントを蛍光標識する手段であ
    り、そして上記検出手段は、光を照射するためのレーザ
    ーおよび泳動されたフラグメントのバンドを蛍光により
    オンラインで連続的に検出する光検知回路を有すること
    を特徴とする上記装置。
  2. 【請求項２】電気泳動部が塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの一
    つで終結したフラグメントのいずれか二種以上のための
    複数のチャンネルを有し、さらに光検知回路が異なる塩
    基で終結したDNAフラグメントの各々に相当する蛍光標
    識DNAのバンドを泳動時間の順に示す電気信号に変換す
    る手段を含む、請求項１の装置。
  3. 【請求項３】電気泳動部が塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの一
    つで終結した各フラグメントのための四つの同じチャン
    ネルを有する、請求項１または２記載の装置。
  4. 【請求項４】分析すべきDNA鎖から複数の塩基を有する
    不特定長さの複数フラグメント鎖を調製し、該フラグメ
    ント試料を電気泳動チャンネルに導入し、そして該フラ
    グメントを蛍光標識し、該標識フラグメントを検出する
    ことを含む、DNAフラグメントの同定方法において、 フラグメントをチャンネル内で分離するに際して、後か
    らバンドを形成すべき移動度がより小さいフラグメント
    のバンドが未分離の間に、移動度のより大きいフラグメ
    ントのバンドがゲルから未だ排出されずに十分に分離さ
    れるように電気泳動を行い；該フラグメントを蛍光標識
    し；標識フラグメントに光を照射し；そして標識フラグ
    メントが形成したバンドから放出される蛍光を各フラグ
    メントの移動の時間順に連続的につきとめて記録する、
    ことからなる上記方法。
  5. 【請求項５】少なくとも10％のフラグメントがチャンネ
    ルを泳動して分離されているときに、最も移動度の小さ
    いフラグメントはチャンネル入口部分に未分離状態に存
    在するように電気泳動を行う、請求項４の方法。
  6. 【請求項６】分析すべきDNAから調製される鎖が、Ａ、
    Ｇ、ＣおよびＴに対応する一つの塩基で終結させた不特
    定長さの複数断片であり、そしてこれらの複数断片は各
    塩基で終結させたもの毎に四つのチャンネルの対応する
    一つに導入され、そして異なる塩基で終結したフラグメ
    ントが各チャンネル毎に蛍光により同定される請求項５
    の方法。
  7. 【請求項７】泳動フラクションの蛍光標識されたバンド
    を、蛍光標識剤の最適吸収スペクトルに実質的に適合す
    る狭いバンド幅のレーザー光線でスキャンし；該標識剤
    からの蛍光放出を実質的に該標識剤の発光スペクトルに
    適合する狭い選択バンド幅を通して検出し、そしてDNA
    フラグメントの配列を求めるために、各チャンネルで泳
    動されるバンドを泳動時間順に検出して記録する、請求
    項４、５または６の方法。
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