JPS612077A - Ｄｎａ塩基配列の決定方法およびその装置 - Google Patents
Ｄｎａ塩基配列の決定方法およびその装置Info
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(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ＤＮＡストランドの塩基配列決定法に関する
。
。
ＤＮＡ塩基配列決定技術の一法では、同一のクローン化
されたＤＮＡストランドに標識を付与する。このストラ
ンドを４バツチに分割するが、各バッチは夫々アデニン
、グアニン、シトシンおよびチミン（以下Ａ、Ｇ、Ｃお
よびＴと記す）なる４個の塩基タイプの１個の点で切断
または合成される。次にアデニン−、グアニン−、シト
シン−およびチミン−切断されたバッチを電気泳動法で
分離する。電気泳動速度がＤＮＡ塩基配列を示す。
されたＤＮＡストランドに標識を付与する。このストラ
ンドを４バツチに分割するが、各バッチは夫々アデニン
、グアニン、シトシンおよびチミン（以下Ａ、Ｇ、Ｃお
よびＴと記す）なる４個の塩基タイプの１個の点で切断
または合成される。次にアデニン−、グアニン−、シト
シン−およびチミン−切断されたバッチを電気泳動法で
分離する。電気泳動速度がＤＮＡ塩基配列を示す。
（従来の技術）
この種の塩基配列決定法の先行技術では、ＤＮＡストラ
ンドを放射性標識物で標識付けし、各分割試料（ａｕ＋
１ｑｕｏｔ ）毎に相異なる塩基タイプで切断し、電気
泳動法で分離したあと、該ゲルにフィルムを露出して現
像し、バンドの塩基配列情報を得ていた。この静的検出
タイプの長さ範囲および解像度は、装置の大きさにより
制限される。
ンドを放射性標識物で標識付けし、各分割試料（ａｕ＋
１ｑｕｏｔ ）毎に相異なる塩基タイプで切断し、電気
泳動法で分離したあと、該ゲルにフィルムを露出して現
像し、バンドの塩基配列情報を得ていた。この静的検出
タイプの長さ範囲および解像度は、装置の大きさにより
制限される。
この種の塩基配列法の別の先行技術では、各分割試料毎
に相異なる塩基タイプの単一ストランドを合成し、該ス
トランドにあとの検出のために放射性標識を付与する。
に相異なる塩基タイプの単一ストランドを合成し、該ス
トランドにあとの検出のために放射性標識を付与する。
タンパク質の標識付与のために螢光標識を用い、該螢光
標識を光で断続照射してその螢光から特定タンパク質の
存在情報を得ることも先行技術で知られているところで
ある。
標識を光で断続照射してその螢光から特定タンパク質の
存在情報を得ることも先行技術で知られているところで
ある。
（発明が解決しようとする問題点）
ＤＮＡ塩基配列決定に関する前記先行技術は、以下のよ
うな幾つかの欠点を有する。（１）比較的遅い。（２）
少くとも１部分手動である。（３）比較的短いＤＮＡス
トランドに制限される。
うな幾つかの欠点を有する。（１）比較的遅い。（２）
少くとも１部分手動である。（３）比較的短いＤＮＡス
トランドに制限される。
従って本発明の課題は、ＤＮＡ塩基配列決定のだめの連
続的な装置および方法を提供することである。
続的な装置および方法を提供することである。
（問題点を解決するための手段）
本発明のゲルまたは毛細管電気泳動装置を用いるＤＮＡ
塩基配列決定用の装置は、少くとも４個の同一チャンネ
ルを有する第一分離装置、ならびに４種の核酸分子Ａ、
Ｇ、ＣおよびＴの相異なる末端のＤＮＡ断片を夫々受け
入れる少くとも４個の分離したチャンネル導入部を有し
、かつ、ＤＮＡ断片をその末端塩基に従って４個の分離
した群に維持しながら、最後に導入されるバンドの分別
前に、ＤＮＡ断片を前記の分離装置の端部から構成され
る装置により特徴ずけられる。該装置は、前記のＤＮＡ
断片が電気泳動装置に入る前に該断片をビオチンで標識
付けする手段、螢光性標識をアビジンに付着させる手段
、前記のＤＮＡ断片を螢光化アビジンで標識付けする手
段、前記の標識を光パルスで選択的に照射する手段、背
景螢光が減少する時間にまたがり前記標識の螢光を検出
する手段、ならびに前記の螢光を、核酸基中の相異なる
基で切断された各ＤＮＡ断片に対応する螢光標識化ＤＮ
Ａバンドの時間系列を示す電気信号に変換する手段を包
含する前記の検出手段を有することが有利である。
塩基配列決定用の装置は、少くとも４個の同一チャンネ
ルを有する第一分離装置、ならびに４種の核酸分子Ａ、
Ｇ、ＣおよびＴの相異なる末端のＤＮＡ断片を夫々受け
入れる少くとも４個の分離したチャンネル導入部を有し
、かつ、ＤＮＡ断片をその末端塩基に従って４個の分離
した群に維持しながら、最後に導入されるバンドの分別
前に、ＤＮＡ断片を前記の分離装置の端部から構成され
る装置により特徴ずけられる。該装置は、前記のＤＮＡ
断片が電気泳動装置に入る前に該断片をビオチンで標識
付けする手段、螢光性標識をアビジンに付着させる手段
、前記のＤＮＡ断片を螢光化アビジンで標識付けする手
段、前記の標識を光パルスで選択的に照射する手段、背
景螢光が減少する時間にまたがり前記標識の螢光を検出
する手段、ならびに前記の螢光を、核酸基中の相異なる
基で切断された各ＤＮＡ断片に対応する螢光標識化ＤＮ
Ａバンドの時間系列を示す電気信号に変換する手段を包
含する前記の検出手段を有することが有利である。
本発明の前記ならびにその他の諸特徴は、図面を参照し
ながら考慮することにより、以下の詳細な説明から更に
理解できるであろう。
ながら考慮することにより、以下の詳細な説明から更に
理解できるであろう。
第１図は、本発明の一実施態様のブロックダイヤグラム
である。
である。
第２図は、本発明の別の実施態様のブロックダイヤグラ
ムである。
ムである。
第３図は、第１および２図の実施態様の一部分の概略図
である。
である。
第４図は、第３図の部分の別の実施態様である。
第５図は、第３図の部分の更に別の実施態様である。
第６図は、第１および２図の実施態様の一部のブロック
タイヤグラムである。
タイヤグラムである。
第７図は、第１および２図のブロックダイヤグラムの一
部の論理回路ダイヤグラムである。
部の論理回路ダイヤグラムである。
第８図は、第１および２図の実施態様の一部の回路の概
略ダイヤグラムである。
略ダイヤグラムである。
図１は、ビオチン標識付与系１１、ＤＮＡ切断系１２、
分離系１４、検出および処理系１６、ならびに標準長Ｄ
ＮＡ源１８を有するＤＮＡ塩基配列決定系１０のブロッ
クダイヤグラムを示す。ビオチン標識付与は、ＤＮＡク
ローン化ストランドを４分割する前に行なう。適当な商
業品ビオチンを、１１で示した容器内にある１００塩基
以上のクローン化されたストランドに添加する。ビオチ
ン調製物は、大部分のＤＮＡ断片の少くとも１端部に、
当該技術分野で既知の方法にてヒオチン標識を付与する
ために十分なものでなければならない。
分離系１４、検出および処理系１６、ならびに標準長Ｄ
ＮＡ源１８を有するＤＮＡ塩基配列決定系１０のブロッ
クダイヤグラムを示す。ビオチン標識付与は、ＤＮＡク
ローン化ストランドを４分割する前に行なう。適当な商
業品ビオチンを、１１で示した容器内にある１００塩基
以上のクローン化されたストランドに添加する。ビオチ
ン調製物は、大部分のＤＮＡ断片の少くとも１端部に、
当該技術分野で既知の方法にてヒオチン標識を付与する
ために十分なものでなければならない。
ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ ）が選択される理由は、アビ
ジン（ａｖｉｄｉｎ ） に対して親和性を有するこ
と、およびＤＮＡ断片に付加した際に電気泳動の時のＤ
ＮＡ断片の移動を実質的に抑制するほど大分子でなく、
分離系１４での相異なるＤＮＡ断片の識別を妨害しない
ためである。
ジン（ａｖｉｄｉｎ ） に対して親和性を有するこ
と、およびＤＮＡ断片に付加した際に電気泳動の時のＤ
ＮＡ断片の移動を実質的に抑制するほど大分子でなく、
分離系１４での相異なるＤＮＡ断片の識別を妨害しない
ためである。
ビオチンはあとでアビジンのような大分子と結合する標
識として選択されるものであるが、その他の標識を使用
してもよい。標識は、ＤＮＡ断片に付着可能かつ螢光物
質その他の適当な検出可能物質で標識付けされる大分子
に対して強い親和性を有する特性を持つものでなければ
ならない。標識は斯かる大きさでなければならぬが、同
時にアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の
相異なる塩基で切断された相異なる断片の移動度の正常
な差異を不明確にせぬような化学特性を有するものでな
ければならない。
識として選択されるものであるが、その他の標識を使用
してもよい。標識は、ＤＮＡ断片に付着可能かつ螢光物
質その他の適当な検出可能物質で標識付けされる大分子
に対して強い親和性を有する特性を持つものでなければ
ならない。標識は斯かる大きさでなければならぬが、同
時にアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の
相異なる塩基で切断された相異なる断片の移動度の正常
な差異を不明確にせぬような化学特性を有するものでな
ければならない。
更には、放射性リンまたは放射性硫黄、放射性炭素また
は三重水素等の放射性標識をＤＮＡ分子に添入し、分離
後にストランドをンンチレーンヨン液に添加してもよい
。
は三重水素等の放射性標識をＤＮＡ分子に添入し、分離
後にストランドをンンチレーンヨン液に添加してもよい
。
ＤＮＡ切断系１２は４通路を有し、標準長ＤＮＡ源１８
は分離系１４内に１路を有し、ＤＮＡ断片と標準断片が
別の通路を通るようにしである。分離によりＤＮＡスト
ランドを順序ずける分離系１４は、検出および処理系１
６に通じていて、該系で断片を互いに比較しかつ標準長
ＤＮＡ源１８からの標準物と比較分析し、もとの断片の
ＤＮＡ鎖に関する情報が得られる。
は分離系１４内に１路を有し、ＤＮＡ断片と標準断片が
別の通路を通るようにしである。分離によりＤＮＡスト
ランドを順序ずける分離系１４は、検出および処理系１
６に通じていて、該系で断片を互いに比較しかつ標準長
ＤＮＡ源１８からの標準物と比較分析し、もとの断片の
ＤＮＡ鎖に関する情報が得られる。
ＤＮＡ切断系１２には、２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃ１２０
Ｔなる同一のクローン化されたＤＮＡストランド源が４
個ある。通常このＤＮＡストランドは］＝ １００塩基以外の長さを有するものであるが、更に化学
処理にて切断され、２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０
Ｔの４容器の各々の中の断片は種々の長さになる。
Ｔなる同一のクローン化されたＤＮＡストランド源が４
個ある。通常このＤＮＡストランドは］＝ １００塩基以外の長さを有するものであるが、更に化学
処理にて切断され、２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０
Ｔの４容器の各々の中の断片は種々の長さになる。
一実施態様では、容器２０Ａは化学処理Ａでランダムに
切断されたＤＮＡストランドの断片を含有し、容器２０
Ｇは化学処理Ｇでランダムに切断されたＤＮＡストラン
ドの断片を含有し、容器２０Ｃは化学処理Ｃでランダム
に切断されたＤＮＡストランドの断片を含有し、かつ容
器２０Ｔは化学処理Ｔでランダムに切断されたＤＮＡス
トランドの断片を含有する。すなわち、各容器内の同一
断片は、適当な化学処理によシ所与の相異なる塩基で切
断される。
切断されたＤＮＡストランドの断片を含有し、容器２０
Ｇは化学処理Ｇでランダムに切断されたＤＮＡストラン
ドの断片を含有し、容器２０Ｃは化学処理Ｃでランダム
に切断されたＤＮＡストランドの断片を含有し、かつ容
器２０Ｔは化学処理Ｔでランダムに切断されたＤＮＡス
トランドの断片を含有する。すなわち、各容器内の同一
断片は、適当な化学処理によシ所与の相異なる塩基で切
断される。
容器内の断片は、容器２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２
０Ｔの断片を夫々Ａ−ＤＮＡ断片、Ｇ−ＤＮＡ断片、Ｃ
−ＤＮＡ断片およびＴ−ＤＮＡ断片と称する。これらの
断片は、容器２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０Ｔから
、対応する２２Ｎ、２２Ｇ１２２Ｃおよび２２Ｔなる導
管を経て流れ、分離系１４に接触する。
０Ｔの断片を夫々Ａ−ＤＮＡ断片、Ｇ−ＤＮＡ断片、Ｃ
−ＤＮＡ断片およびＴ−ＤＮＡ断片と称する。これらの
断片は、容器２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０Ｔから
、対応する２２Ｎ、２２Ｇ１２２Ｃおよび２２Ｔなる導
管を経て流れ、分離系１４に接触する。
標準長ＤＮＡ源１８は既知の相異なる長さの参照ＤＮＡ
断片源を有し、導管２２Ｓを経て分離系１４に流れる。
断片源を有し、導管２２Ｓを経て分離系１４に流れる。
これらの参照断片は既知の長さを有し、従ってそれらが
分離系１４を通過する移動時間は、以下で説明するよう
に時計すなわち計時手段となる。好適実施態様では、１
００塩基のクローン化されたストランドを、４バツチに
分割する前にピオチンで標識付けするが、４バツチに分
割のあと、特定の化学処理を施す前に標識を付与しても
よい。
分離系１４を通過する移動時間は、以下で説明するよう
に時計すなわち計時手段となる。好適実施態様では、１
００塩基のクローン化されたストランドを、４バツチに
分割する前にピオチンで標識付けするが、４バツチに分
割のあと、特定の化学処理を施す前に標識を付与しても
よい。
分離系１４には２６８，２６Ａ１２６Ｇ１２６Ｃおよび
２６Ｔなる５個の電気泳動チャンネルがある。好適実施
態様の電気泳動チャンネル２６８．２６Ａ、２６Ｇ、２
６Ｃおよび２６Ｔには、各ゲル路長が同一でそれに同一
の電場を印加したゲル電気泳動装置があり、５個のチャ
ンネルを通して試料を連続的に移動させる。ゲルおよび
電場は、ＤＮ Ａ ス） ７ンド移動速度のチャンネル
開蓋が５チ以下となるように選択される。更には、電場
を時間と共に変化させ、小分子が検出されたあとに大分
子の速度を増大させること、ならびに、各チャンネル内
での移動がチャンネル間の同期性維持に必要な精度内に
入るよう、時計チャンネルからのフィードバックに基い
て各チャンネル内の速度を調節し、各チャンネル内の差
を補償することも可能である。
２６Ｔなる５個の電気泳動チャンネルがある。好適実施
態様の電気泳動チャンネル２６８．２６Ａ、２６Ｇ、２
６Ｃおよび２６Ｔには、各ゲル路長が同一でそれに同一
の電場を印加したゲル電気泳動装置があり、５個のチャ
ンネルを通して試料を連続的に移動させる。ゲルおよび
電場は、ＤＮ Ａ ス） ７ンド移動速度のチャンネル
開蓋が５チ以下となるように選択される。更には、電場
を時間と共に変化させ、小分子が検出されたあとに大分
子の速度を増大させること、ならびに、各チャンネル内
での移動がチャンネル間の同期性維持に必要な精度内に
入るよう、時計チャンネルからのフィードバックに基い
て各チャンネル内の速度を調節し、各チャンネル内の差
を補償することも可能である。
ゲルは同一の材料、化学的誘導体および長さのものが好
ましく、電場は各チャンネルの中間値の５％以内におる
ことが好ましい。しかしながら、ゲル内でのＤＮＡ移動
を全チャンネルにわたり均一にせねばならぬ要求を最小
にするため、２個以上の参照チャンネルを使用し、参照
チャンネルを試料チャンネルに隣接させることもできる
。
ましく、電場は各チャンネルの中間値の５％以内におる
ことが好ましい。しかしながら、ゲル内でのＤＮＡ移動
を全チャンネルにわたり均一にせねばならぬ要求を最小
にするため、２個以上の参照チャンネルを使用し、参照
チャンネルを試料チャンネルに隣接させることもできる
。
電気泳動チャンネル２６８は、ビオチンで標識付けされ
た既知長ＤＮＡの断片を受け入れ、ゲル内を移動させる
。同様にして、２６Ａ、２６Ｇ。
た既知長ＤＮＡの断片を受け入れ、ゲル内を移動させる
。同様にして、２６Ａ、２６Ｇ。
２６Ｃおよび２６Ｔの各電気泳動チャンネルは、切断系
２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０Ｔからビオチン標識
された断片を受け入れ、それらを試料電気泳動チャンネ
ル内で遂次移動させ、各断片は参照電気泳動チャンネル
２６Ｓと同一の電場のもとてその移動度に従って移動す
る。
２０Ａ、２０Ｇ、２０Ｃおよび２０Ｔからビオチン標識
された断片を受け入れ、それらを試料電気泳動チャンネ
ル内で遂次移動させ、各断片は参照電気泳動チャンネル
２６Ｓと同一の電場のもとてその移動度に従って移動す
る。
ＤＮＡ鎖に関する情報を提供するため、検出および処理
系１６には、３０８，３０Ａ、３０Ｇ。
系１６には、３０８，３０Ａ、３０Ｇ。
３０Ｃおよび３０Ｔなる５個のアビジン源、３２Ｓ、３
２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔなる５個の検出系な
らびに相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ）系３４がある
。アビジン源３０Ｓ、３０Ａ、３０Ｇ、３０Ｃおよび３
０Ｔは、夫々検出系３２Ｓ、３２Ａ１３２Ｇ、３２Ｃお
よび３２Ｔに連結している。分離系１４内の電気泳動チ
ャンネル２６８．２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃおよび２６Ｔ
の夫々に対応する出力は、検出系３２８，３２Ａ、３２
Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔの対応系に接続されている。検
出系では、螢光標識を付着したアビジンとＤＮＡ断片を
結合し、螢光標識が付着したアビジンにより標識付けさ
れたＤＮＡを検出系内の試料室に供給し、断片の存否を
示すバンドを検出する。ハンドの検出は断片の長さに関
連する。
２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔなる５個の検出系な
らびに相関（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ）系３４がある
。アビジン源３０Ｓ、３０Ａ、３０Ｇ、３０Ｃおよび３
０Ｔは、夫々検出系３２Ｓ、３２Ａ１３２Ｇ、３２Ｃお
よび３２Ｔに連結している。分離系１４内の電気泳動チ
ャンネル２６８．２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃおよび２６Ｔ
の夫々に対応する出力は、検出系３２８，３２Ａ、３２
Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔの対応系に接続されている。検
出系では、螢光標識を付着したアビジンとＤＮＡ断片を
結合し、螢光標識が付着したアビジンにより標識付けさ
れたＤＮＡを検出系内の試料室に供給し、断片の存否を
示すバンドを検出する。ハンドの検出は断片の長さに関
連する。
検出系３２８，３’２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔ
からの各出力は、導線を介して相関系３４に電気的に接
続されており、相関係は各検出系からの情報を相関させ
てＤＮＡ鎖に関する情報を提供するマイクロプロセッサ
−系である。
からの各出力は、導線を介して相関系３４に電気的に接
続されており、相関係は各検出系からの情報を相関させ
てＤＮＡ鎖に関する情報を提供するマイクロプロセッサ
−系である。
各アビジン源３０Ｓ、３０Ａ、３０Ｇ、３０Ｃおよび３
０Ｔは、既知の供給業者から購入したアビジンを含有し
、好適実施態様における各アビジン分子には３個の螢光
物質分子が結合している。
０Ｔは、既知の供給業者から購入したアビジンを含有し
、好適実施態様における各アビジン分子には３個の螢光
物質分子が結合している。
アビジン源はＤＮＡ断片と接触するように配置され、電
気泳動チャンネルに隣接して配されるゲル部分内にある
。この用法では、ゲルのこの部分のｐＨは、３個の螢光
物質分子で標識付けされたアビジンが電気泳動で移動す
るのを回避するため、約８でなければならない。ビオチ
ン化されたＤＮＡストランドがｐＨ８のゲル部分に到達
すると、ゲルのこの部分で定常状態にあるか、極くゆっ
くりとしか移動していない螢光化アビジンを拾い上げる
であろう。
気泳動チャンネルに隣接して配されるゲル部分内にある
。この用法では、ゲルのこの部分のｐＨは、３個の螢光
物質分子で標識付けされたアビジンが電気泳動で移動す
るのを回避するため、約８でなければならない。ビオチ
ン化されたＤＮＡストランドがｐＨ８のゲル部分に到達
すると、ゲルのこの部分で定常状態にあるか、極くゆっ
くりとしか移動していない螢光化アビジンを拾い上げる
であろう。
螢光化アビジンを有する第二部分を調製するため、螢光
化アビジンをチャンネルの出口端部から内部に向って電
気泳動させる。本実施態様では、螢光化アビジンは、そ
のｐＨがゲルの第二部分のｐＨよりも若干高めなので、
この方向に徐々に移動する。別法として、螢光化アビジ
ンをゲル内に混合してもよい。
化アビジンをチャンネルの出口端部から内部に向って電
気泳動させる。本実施態様では、螢光化アビジンは、そ
のｐＨがゲルの第二部分のｐＨよりも若干高めなので、
この方向に徐々に移動する。別法として、螢光化アビジ
ンをゲル内に混合してもよい。
螢光物質−アビジン−ビオチン−ＤＮＡなる複合分子は
ｐ）Ｉ８のゲル内では酸性なので、ゲルのこの部分から
移出を続け、溶離剤により検出系内の試料室を通過する
。その際、アビジンを付着せずに行ったのと同様の分離
が維持され、実質的に変更されなかった。別法として、
ＤＮＡ断片のバンドを螢光標識化アビジンを含有する可
動性の液体に電気泳動で移動させ、該アビジンと結合せ
てもよい。該アビジンはＤＮＡ断片の端部に付着したビ
オチンと選択的に結合し、未反応の螢光化アビジンは、
クロマトグラフィー等の標準技術により螢光物質−アビ
ジン−ビオチン−ＤＮＡ複合物から分離される。
ｐ）Ｉ８のゲル内では酸性なので、ゲルのこの部分から
移出を続け、溶離剤により検出系内の試料室を通過する
。その際、アビジンを付着せずに行ったのと同様の分離
が維持され、実質的に変更されなかった。別法として、
ＤＮＡ断片のバンドを螢光標識化アビジンを含有する可
動性の液体に電気泳動で移動させ、該アビジンと結合せ
てもよい。該アビジンはＤＮＡ断片の端部に付着したビ
オチンと選択的に結合し、未反応の螢光化アビジンは、
クロマトグラフィー等の標準技術により螢光物質−アビ
ジン−ビオチン−ＤＮＡ複合物から分離される。
各検出系は、バンドの存否を検出してそれらの検出を電
気信号に変換するだめの光学系を有する。
気信号に変換するだめの光学系を有する。
電気信号は相関系３４に伝達され、該相関系は標準長Ｄ
ＮＡ１８源からの標準断片ならびに容器２０Ａ、２０Ｇ
、２０Ｃおよび２０ＴからのＡｌＧ、ＣおよびＴ断片の
両者に関するＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
ＮＡ１８源からの標準断片ならびに容器２０Ａ、２０Ｇ
、２０Ｃおよび２０ＴからのＡｌＧ、ＣおよびＴ断片の
両者に関するＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
図２は、別なる実施態様のクロマトグラフ装置ＡＩＯの
簡略化したブロックダイヤグラムを示すものである。本
装置は、図１の電気泳動装置に類似しており、成分は参
照数字の前に文字Ａを付して同様な方法で示す。
簡略化したブロックダイヤグラムを示すものである。本
装置は、図１の電気泳動装置に類似しており、成分は参
照数字の前に文字Ａを付して同様な方法で示す。
本実施態様では、図１に２ ＯＡ、 ２０Ｇ、 ２０Ｃ
および２０Ｔで示したＤＮＡ塩基配列決定系１０なる実
施態様のＤＮＡおよび化学処理Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ用の
容器の代りに、クロマトグラフ装置１０は、サンガー（
Ｓａｎｇｅｒ ）法（エフ、サンガー （Ｆ、 Ｓａｎ
ｇｅｒ ）、ニス、ニツクレン（Ｓ。
および２０Ｔで示したＤＮＡ塩基配列決定系１０なる実
施態様のＤＮＡおよび化学処理Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ用の
容器の代りに、クロマトグラフ装置１０は、サンガー（
Ｓａｎｇｅｒ ）法（エフ、サンガー （Ｆ、 Ｓａｎ
ｇｅｒ ）、ニス、ニツクレン（Ｓ。
Ｎ１ｃｋｌｅｎ ）およびニー、アール、クールンン（
Ａ。
Ａ。
Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ ）著、「チェインターミネータ−
によるＤＮＡ塩基配列の決定法」、プロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー−オブ・サイエン
ス・ニー、ニス、エイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）第７４巻第１２号第
５４６３−５４６７頁、１９７７年）に依るＤＮＡ処理
用の容器を有し、図２の実施態様へ１０で、一般にＡ１
２で一括されるＡ２０Ａ、Ａ２０Ｇ％Ａ２０ＣおよびＡ
２０Ｔとして示している。
によるＤＮＡ塩基配列の決定法」、プロシーディンゲス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー−オブ・サイエン
ス・ニー、ニス、エイ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）第７４巻第１２号第
５４６３−５４６７頁、１９７７年）に依るＤＮＡ処理
用の容器を有し、図２の実施態様へ１０で、一般にＡ１
２で一括されるＡ２０Ａ、Ａ２０Ｇ％Ａ２０ＣおよびＡ
２０Ｔとして示している。
不法では、ＤＮＡストランドを分離し、これを洟型とし
てＤＮ’Ａを合成するために使用し、合成は所与の塩基
Ａ、Ｇ％ＣまたはＴのところでランダムに終結し、複数
の相異なる分子量のＤＮＡストランドが得られる。この
限定合成は、合成を終結させるヌクレオチドを用いるこ
とにより得られ、別々の容器内で行なわれる。各容器は
夫々特殊なＡヌクレオチド、特殊なＣヌクレオチド、特
殊なＣヌクレオチドおよび特殊なＴヌクレオチドを有す
る。これらの特殊なヌクレオチドはジテオキシヌクレオ
チドまたは標識付けされたヌクレオチドであり、両者と
も合成を終結させる。
てＤＮ’Ａを合成するために使用し、合成は所与の塩基
Ａ、Ｇ％ＣまたはＴのところでランダムに終結し、複数
の相異なる分子量のＤＮＡストランドが得られる。この
限定合成は、合成を終結させるヌクレオチドを用いるこ
とにより得られ、別々の容器内で行なわれる。各容器は
夫々特殊なＡヌクレオチド、特殊なＣヌクレオチド、特
殊なＣヌクレオチドおよび特殊なＴヌクレオチドを有す
る。これらの特殊なヌクレオチドはジテオキシヌクレオ
チドまたは標識付けされたヌクレオチドであり、両者と
も合成を終結させる。
従って各４バツチは、塩基Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちあ
る１個の塩基のところでランダムに終結する。
る１個の塩基のところでランダムに終結する。
本実施態様でも、図１に示した方法でＤＮＡ断片の一端
部をビオチンにて標識付けしてもよい。
部をビオチンにて標識付けしてもよい。
しかしながら、図２の好適実施態様では、ビオチンによ
る標識の代りに、図２のＡ１２で示したチャンネルに通
す前に、Ａｌｌで示すようなりＮＡの逆向き相補繰返し
く １ｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｒ
ｅｐｅａｔ ）によりＤＮＡ断片に標識を付与する。
る標識の代りに、図２のＡ１２で示したチャンネルに通
す前に、Ａｌｌで示すようなりＮＡの逆向き相補繰返し
く １ｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｒ
ｅｐｅａｔ ）によりＤＮＡ断片に標識を付与する。
逆向き相補繰返しの設計は、オリゴヌクレオチドとして
知られる小ＤＮＡ断片の設計法として有利である。本性
は文献ならびに「ホスホルアミダイト成分とプロセス」
（米国特許第４，４１５，７３２号）等の特許に広く
記載されており、その開示をここに引用する。
知られる小ＤＮＡ断片の設計法として有利である。本性
は文献ならびに「ホスホルアミダイト成分とプロセス」
（米国特許第４，４１５，７３２号）等の特許に広く
記載されており、その開示をここに引用する。
電気泳動後に、逆向き相補繰返しは二重（ｄｕｐｌｅｘ
）ＤＮＡのパリンドロームからヘアピンを形成し、続い
てこれが臭化エチジウムと結合して検出系で検出される
。検出系は、螢光標識に適当な光の波長でなく、挿入さ
れた臭化エチジウムに適当な光の波長を用いる。高感度
検出技術を用いる場合には、逆向き繰返しは使用せず、
たまたま二重ＤＮＡを形成する未知ＤＮＡ部分間に挿入
された臭化エチジウムを検知することにより、あるいは
単鎖ＤＮＡに付着した臭化エチジウムによシ、するいは
ＤＮＡ自身の固有螢光により検出されるであろう。放射
性標識を使用する場合には、放射性標識およびシンチレ
ーション流体の組合せが発する光を検知することによシ
検出が行なわれる。
）ＤＮＡのパリンドロームからヘアピンを形成し、続い
てこれが臭化エチジウムと結合して検出系で検出される
。検出系は、螢光標識に適当な光の波長でなく、挿入さ
れた臭化エチジウムに適当な光の波長を用いる。高感度
検出技術を用いる場合には、逆向き繰返しは使用せず、
たまたま二重ＤＮＡを形成する未知ＤＮＡ部分間に挿入
された臭化エチジウムを検知することにより、あるいは
単鎖ＤＮＡに付着した臭化エチジウムによシ、するいは
ＤＮＡ自身の固有螢光により検出されるであろう。放射
性標識を使用する場合には、放射性標識およびシンチレ
ーション流体の組合せが発する光を検知することによシ
検出が行なわれる。
図３は、当該技術分野で既知のゲルのスラブ２７を有す
る分離系２６Ａを示す図である。一般的に２９Ａで示す
５個の試料分配管は、ゲル２７の一端部にある一列に配
列されたスロット５１で終り、斯かるスロットは負電極
４７Ａを有する負電位緩衝槽２９と接触し、かつ、３１
Ａに位置する他端部の５個の出口管はゲル２７の孔なら
びに正電極５３Ａを有する正電位緩衝槽３１で終了して
いる。
る分離系２６Ａを示す図である。一般的に２９Ａで示す
５個の試料分配管は、ゲル２７の一端部にある一列に配
列されたスロット５１で終り、斯かるスロットは負電極
４７Ａを有する負電位緩衝槽２９と接触し、かつ、３１
Ａに位置する他端部の５個の出口管はゲル２７の孔なら
びに正電極５３Ａを有する正電位緩衝槽３１で終了して
いる。
電気泳動にかける材料はスロット２９Ａ内に挿入され、
ゲル２７に加えられた電場によりゲル内を頂部から底部
へと移動し、３１Ａ群の対応出口管に入る。ゲルスラブ
２７は両側にガラス板２’７ Ａおよび２７Ｂを有し、
試料とゲルを閉じ込めている。緩衝槽３１からの緩衝液
は、管３１Ａに接続されたポンプで緩衝液源５７から吸
引され、ケル２７に直角に流れて入る。緩衝液は電気泳
動で移動してきたＤＮＡを全て捉えて出口孔３１Ａに導
き、後記の感知装置に運ぶか、あるいはスラブ２７から
の電気泳動処理されたＤＮＡストランドに更に電気泳動
を施すべく他のゲルスラブへ導くのである。
ゲル２７に加えられた電場によりゲル内を頂部から底部
へと移動し、３１Ａ群の対応出口管に入る。ゲルスラブ
２７は両側にガラス板２’７ Ａおよび２７Ｂを有し、
試料とゲルを閉じ込めている。緩衝槽３１からの緩衝液
は、管３１Ａに接続されたポンプで緩衝液源５７から吸
引され、ケル２７に直角に流れて入る。緩衝液は電気泳
動で移動してきたＤＮＡを全て捉えて出口孔３１Ａに導
き、後記の感知装置に運ぶか、あるいはスラブ２７から
の電気泳動処理されたＤＮＡストランドに更に電気泳動
を施すべく他のゲルスラブへ導くのである。
図４は、ゲル電気泳動の別の実施態様Ｂ２６Ａを示す図
であり、一般的に８２９Ａで示したＡチャンネル用の負
電位緩衝液装置、Ｂ２７Ａで示したＡ末端ＤＮＡ用のゲ
ル電気泳動チャンネルおよびＢ５１Ａで示しだ該チャン
ネル用の正電位緩衝液装置を有する。本実施態様は、温
度調節を更に容易にし、従って図３のスラブ２７で起シ
得る温度差に基く移動速度の変化を軽減させるため、各
チャンネルを細い円筒ゲルにしたものである。更に（は
、同期化を適正に維持するため、各チャンネル毎に電場
を独立に調整することもできる。
であり、一般的に８２９Ａで示したＡチャンネル用の負
電位緩衝液装置、Ｂ２７Ａで示したＡ末端ＤＮＡ用のゲ
ル電気泳動チャンネルおよびＢ５１Ａで示しだ該チャン
ネル用の正電位緩衝液装置を有する。本実施態様は、温
度調節を更に容易にし、従って図３のスラブ２７で起シ
得る温度差に基く移動速度の変化を軽減させるため、各
チャンネルを細い円筒ゲルにしたものである。更に（は
、同期化を適正に維持するため、各チャンネル毎に電場
を独立に調整することもできる。
この目的で、チャンネルＢ２７Ａは、３３で示すクロマ
トグラフカラムのような内径０．５乃至１ミリメートル
のパイレックスカラムを有し、その内部にゲルを充填す
る。ゲルの調製は、暖かい間にカラム内に挿入し、それ
を硬化させることによりなされる。カラム３３は、ＤＮ
Ａの分離に十分な長さを有する。標識としてビオチン−
アビジン−螢光物質を使用する実施態様では、はじめに
螢光化アビジンを３５の出口端部から上方に電気泳動さ
せ、３７の入口端部から入るＤＮＡと遭遇させる。カラ
ムの温度は通常のクロマトクラフ温度調節装置３９で調
節され、該温度調節装置はカラムの周りをガラスケース
で覆ったものであって、液体を一端例えば４１で受け入
れ、４３から取り出す。
トグラフカラムのような内径０．５乃至１ミリメートル
のパイレックスカラムを有し、その内部にゲルを充填す
る。ゲルの調製は、暖かい間にカラム内に挿入し、それ
を硬化させることによりなされる。カラム３３は、ＤＮ
Ａの分離に十分な長さを有する。標識としてビオチン−
アビジン−螢光物質を使用する実施態様では、はじめに
螢光化アビジンを３５の出口端部から上方に電気泳動さ
せ、３７の入口端部から入るＤＮＡと遭遇させる。カラ
ムの温度は通常のクロマトクラフ温度調節装置３９で調
節され、該温度調節装置はカラムの周りをガラスケース
で覆ったものであって、液体を一端例えば４１で受け入
れ、４３から取り出す。
チャンネルＢ２７Ａの一端部には、プレキシカラス製カ
ップ状容器４５内の緩衝溶液を供給する緩衝液装置Ｂ２
９Ａがあり、該緩衝液装置は入口端部３７上まで延長し
ており、内部に負電圧の電極４７を有する。
ップ状容器４５内の緩衝溶液を供給する緩衝液装置Ｂ２
９Ａがあり、該緩衝液装置は入口端部３７上まで延長し
ており、内部に負電圧の電極４７を有する。
出口端部でも、同様に緩衝液を含有する緩衝液室５１が
あり、該室は電極５３で接地され、緩衝液内にゲルカラ
ムＢ２７Ａの出口端部３５を浸している。緩衝液室はプ
レキシガラス製であり、その下端がマイクロオリフィス
５５で終了次第に細くなるオリフィスの形状を有し、出
口端部３５からでてくるＤＩ’ＪＡ含有−緩衝液流を通
過させて前記の断続光源で検出できるようにしている。
あり、該室は電極５３で接地され、緩衝液内にゲルカラ
ムＢ２７Ａの出口端部３５を浸している。緩衝液室はプ
レキシガラス製であり、その下端がマイクロオリフィス
５５で終了次第に細くなるオリフィスの形状を有し、出
口端部３５からでてくるＤＩ’ＪＡ含有−緩衝液流を通
過させて前記の断続光源で検出できるようにしている。
新緩衝液の供給のため、緩衝液貯蔵器５７がポンプ５９
を介して緩衝液装置５１の頂部に接続されており、その
流速は出口端部近傍で渦が生ぜず、かつ、緩衝液の信号
対雑音比を最適とするのに十分な流速に設定される。別
の実施態様では、緩衝液−ＤＮＡの流動溶液を流液セル
に移し、螢光分光計または特別に設計されたＨＰＬＣ螢
光検出器で検出する。
を介して緩衝液装置５１の頂部に接続されており、その
流速は出口端部近傍で渦が生ぜず、かつ、緩衝液の信号
対雑音比を最適とするのに十分な流速に設定される。別
の実施態様では、緩衝液−ＤＮＡの流動溶液を流液セル
に移し、螢光分光計または特別に設計されたＨＰＬＣ螢
光検出器で検出する。
一実施態様として緩衝液に臭化エチジウムを含有させ、
３００または３９０ナノメートルで励起させて−５９０
ナノメートルで検出する方法もある。
３００または３９０ナノメートルで励起させて−５９０
ナノメートルで検出する方法もある。
図５は、カラム３３およびゲルに代る更に別の実施態様
Ｃ２６Ａを示すものであり、これは一般に毛細管電気泳
動法で使用される毛細管カラム６１．６３および６５を
有する。これらのカラムには、ゲルでなく緩衝溶液を充
填して電気泳動用に使用する。この場合、図４の実施態
様の１本のカラムの代りに数本の毛細管を使用する。従
って、Ａ、Ｇ、ＣまたＴ型塩基の同一バンドが数本の平
行な毛細管束を通るか、または塩基の型缶に１種の塩基
が一本の毛細管を通過する。
Ｃ２６Ａを示すものであり、これは一般に毛細管電気泳
動法で使用される毛細管カラム６１．６３および６５を
有する。これらのカラムには、ゲルでなく緩衝溶液を充
填して電気泳動用に使用する。この場合、図４の実施態
様の１本のカラムの代りに数本の毛細管を使用する。従
って、Ａ、Ｇ、ＣまたＴ型塩基の同一バンドが数本の平
行な毛細管束を通るか、または塩基の型缶に１種の塩基
が一本の毛細管を通過する。
ゲルチャンネルまたは毛細管等の分離路の長さは、ＤＮ
Ａの長さが５０乃至１０，０００程度の塩基の範囲では
２メートル以下でなければならない。
Ａの長さが５０乃至１０，０００程度の塩基の範囲では
２メートル以下でなければならない。
しかしながら、ＤＮＡの長さの範囲が増大するにつれて
、必要時間が長くなる。また、各分離に要する時間は、
％秒乃至５分間である。
、必要時間が長くなる。また、各分離に要する時間は、
％秒乃至５分間である。
図６は、検出系３２Ａのブロックダイヤグラムを示す図
である。検出系３２Ｓ、３２Ｇ、３２Ｇおよび３２Ｔは
検出系３２Ａと実質的に同一であシ、従って系３２Ａの
みを詳細に説明する。検出系３２Ａは、電気泳動チャン
ネル４２、試料室４３、光源４４および光学検出系４６
を有する。
である。検出系３２Ｓ、３２Ｇ、３２Ｇおよび３２Ｔは
検出系３２Ａと実質的に同一であシ、従って系３２Ａの
みを詳細に説明する。検出系３２Ａは、電気泳動チャン
ネル４２、試料室４３、光源４４および光学検出系４６
を有する。
一実施態様では、螢光化アビジン源中の螢光物質で標識
付けされたアビジンは、チャンネル２６Ａから導管４８
を通るＡ型末端ストランドを受け入れるゲル内に流入し
、ビオチン化ＤＮＡ断片に付着する。実際、電気泳動チ
ャンネル４２は、連続的電気泳動のために電気泳動チャ
ンネル２６Ａの端部に位置するゲル部分でありうる。螢
光化アビジンが電気泳動チャンネル４２でビオチン化Ｄ
ＮＡに付着したあと、その複合分子を電気泳動チャンネ
ル４２から試料室へ溶出させる。
付けされたアビジンは、チャンネル２６Ａから導管４８
を通るＡ型末端ストランドを受け入れるゲル内に流入し
、ビオチン化ＤＮＡ断片に付着する。実際、電気泳動チ
ャンネル４２は、連続的電気泳動のために電気泳動チャ
ンネル２６Ａの端部に位置するゲル部分でありうる。螢
光化アビジンが電気泳動チャンネル４２でビオチン化Ｄ
ＮＡに付着したあと、その複合分子を電気泳動チャンネ
ル４２から試料室へ溶出させる。
別の実施態様ではＤＮＡを前記のパリンドロームで標識
付けするが、この場合には検出系は別波長の光を使用し
、螢光化アビジン源４ｏは必要でなくなり、臭化エチジ
ウム源４ＯＡが必要となろう。
付けするが、この場合には検出系は別波長の光を使用し
、螢光化アビジン源４ｏは必要でなくなり、臭化エチジ
ウム源４ＯＡが必要となろう。
試料室４３は光源４４にて照射される。光源４４からの
光は光学検出系４６で検出されて電気信号に変換され、
導線５０Ａを経て相関系３４（図１）に伝達される。一
実施態様では、螢光化アビジン源４０は、Ｉ）ＮＡおよ
び関連物質中の背景ｉバックグラウンド）螢光よりも十
分長い螢光期間を有する螢光標識物質を含有し、信号を
背景螢光からはっきりと分離することができる。本実施
態様での螢光標識の崩壊寿命は、検出信号中の雑音とし
て表わされる背景螢光の持続時間の少くとも１０倍でな
ければならない。
光は光学検出系４６で検出されて電気信号に変換され、
導線５０Ａを経て相関系３４（図１）に伝達される。一
実施態様では、螢光化アビジン源４０は、Ｉ）ＮＡおよ
び関連物質中の背景ｉバックグラウンド）螢光よりも十
分長い螢光期間を有する螢光標識物質を含有し、信号を
背景螢光からはっきりと分離することができる。本実施
態様での螢光標識の崩壊寿命は、検出信号中の雑音とし
て表わされる背景螢光の持続時間の少くとも１０倍でな
ければならない。
既知の適当な螢光標識物質の幾つかの例を以下に示す。
（１）生成錯体が所望の性質を有する、稀土類元素が有
機化合物に結合した稀土類−有機錯体、例えばユーロピ
ウムベンゾイルアセトネートおよびユーロピウムベンシ
トリフルオロアセトネート（ニス。
機化合物に結合した稀土類−有機錯体、例えばユーロピ
ウムベンゾイルアセトネートおよびユーロピウムベンシ
トリフルオロアセトネート（ニス。
アイ、ワイスマン（Ｓ、 １． Ｗｅｉｓｓｍａｎ ）
、ジャーナル・オブーケミカルｅフィジックス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ）
第１０巻第２）４−２）７頁、１９４２年に記載あり、
同文献を引用スル。）（ｚピレンブチｖ−ト（ｐｙｒｅ
ｎｅｂｕｔｅｒａｔｅ）（クツツブ（Ｋｎｏｐｐ ）お
よびウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ ）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２
４２巻第１３５３頁（１９６３年）および第２４４巻第
３６０９頁（１９６９年）に記載あり、同文献を引用す
る。）（３）フルオレセインインチオンアネート（ＦＩ
ＴＣ）、（４）ローダミンインチオシアネート（ＲＩＴ
Ｃ）、（５）テトラメチルローダミンインチオシアネー
ト、（ＴＲＩＴＣ）、（６）フイコエリトリンおよび（
７）それらの同族体および置換誘導体。斯かる物質はリ
サーチオーガニックス社（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｏｒｇａ
ｎｉｃｓ、米国オハイオ州クリーブランド）等から商業
的に入手可能である。
、ジャーナル・オブーケミカルｅフィジックス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ）
第１０巻第２）４−２）７頁、１９４２年に記載あり、
同文献を引用スル。）（ｚピレンブチｖ−ト（ｐｙｒｅ
ｎｅｂｕｔｅｒａｔｅ）（クツツブ（Ｋｎｏｐｐ ）お
よびウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ ）、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２
４２巻第１３５３頁（１９６３年）および第２４４巻第
３６０９頁（１９６９年）に記載あり、同文献を引用す
る。）（３）フルオレセインインチオンアネート（ＦＩ
ＴＣ）、（４）ローダミンインチオシアネート（ＲＩＴ
Ｃ）、（５）テトラメチルローダミンインチオシアネー
ト、（ＴＲＩＴＣ）、（６）フイコエリトリンおよび（
７）それらの同族体および置換誘導体。斯かる物質はリ
サーチオーガニックス社（Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｏｒｇａ
ｎｉｃｓ、米国オハイオ州クリーブランド）等から商業
的に入手可能である。
好適実施態様における螢光化アビジンは、ベクターラボ
ラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓＩｎｃ、 米国カリフォルニア州９４ｏ１ｏバーリ
ンガム、ロリンスロート１４２９ ）から購入できる。
ラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓＩｎｃ、 米国カリフォルニア州９４ｏ１ｏバーリ
ンガム、ロリンスロート１４２９ ）から購入できる。
光源４４は、断続光源５２と変調器５４を有する。断続
光源５２は、螢光標識の吸収スペクトルの範囲内にある
光を発するように選択される。各種の螢光標識が使用さ
れるので、この周波数は螢光標識毎に異なる。成る実施
態様では、変調器５４は、結合標識からの螢光を測定す
る時間内に、背景螢光物質からの螢光が消滅するような
パルス間隔を選択するように断続光源５２を調節する。
光源５２は、螢光標識の吸収スペクトルの範囲内にある
光を発するように選択される。各種の螢光標識が使用さ
れるので、この周波数は螢光標識毎に異なる。成る実施
態様では、変調器５４は、結合標識からの螢光を測定す
る時間内に、背景螢光物質からの螢光が消滅するような
パルス間隔を選択するように断続光源５２を調節する。
これらパルス間の時間は全消滅期間を包含する十分に長
い時間である。これは、付着された螢光標識の消滅時間
が、背景の雑音螢光に比べて相対的に長いために達成さ
れるのであシ、従って光学検出系４６による測定がなさ
れる前に一定の時間を置くことができる。代表例での光
パルスの持続時間は約３ナノ秒であり、背景螢光の崩壊
は約１０ナノ秒継続し、一方アビジンに付着した螢光標
識の崩壊寿命は１００ナノ秒である。
い時間である。これは、付着された螢光標識の消滅時間
が、背景の雑音螢光に比べて相対的に長いために達成さ
れるのであシ、従って光学検出系４６による測定がなさ
れる前に一定の時間を置くことができる。代表例での光
パルスの持続時間は約３ナノ秒であり、背景螢光の崩壊
は約１０ナノ秒継続し、一方アビジンに付着した螢光標
識の崩壊寿命は１００ナノ秒である。
代表的な光学検出系４６は、レーザーからの励起パルス
の開始後約５０ナノ秒で読み始め、約１５０ナノ秒間す
なわち３ナノ秒パルスの開始後２００ナノ秒後まで読み
を継続する。好適実施態様では断続レーザー光源を使用
するけれども、広域帯の光源をフィルターまたはモノク
ロメータ−と組合せて使用し、標識の狭帯域吸収スペク
トルを提供してもよい。
の開始後約５０ナノ秒で読み始め、約１５０ナノ秒間す
なわち３ナノ秒パルスの開始後２００ナノ秒後まで読み
を継続する。好適実施態様では断続レーザー光源を使用
するけれども、広域帯の光源をフィルターまたはモノク
ロメータ−と組合せて使用し、標識の狭帯域吸収スペク
トルを提供してもよい。
別の実施態様では、周波数が典型的にはｌ０ＫＨｚの連
続光源を実質的に変調深さ１００％かつデユーティ−サ
イクル（ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ ） ５０％で、変調する
電気−光学的変調器を使用する。パルス発生器は、信号
を励振器（ｄｒｌｖｅｒ ）を経由して変調器および参
照信号としてロックイン増幅器（ｌｏｃ−４ｎ ａｍｐ
ｌｉｆｉｅｒ ）の両者に提供する。
続光源を実質的に変調深さ１００％かつデユーティ−サ
イクル（ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ ） ５０％で、変調する
電気−光学的変調器を使用する。パルス発生器は、信号
を励振器（ｄｒｌｖｅｒ ）を経由して変調器および参
照信号としてロックイン増幅器（ｌｏｃ−４ｎ ａｍｐ
ｌｉｆｉｅｒ ）の両者に提供する。
特定のＤＮＡ断片を示す電気泳動チャンネル４２の電気
泳動ゲル内バンドを検出するため、光学検出系４６はあ
る種の検視光学装置（ｖｉｅｗｉｎｇｏｐｔｉｃｓ ）
６０、フィルター６２、および光学検出系６４を有す
る。光学検出系６４は変調器５４に電気的に接続され、
電気泳動チャンネル４２内のＤＮＡ断片バンドの存否を
示す導線５０Ａへの電気信号を開閉する。
泳動ゲル内バンドを検出するため、光学検出系４６はあ
る種の検視光学装置（ｖｉｅｗｉｎｇｏｐｔｉｃｓ ）
６０、フィルター６２、および光学検出系６４を有す
る。光学検出系６４は変調器５４に電気的に接続され、
電気泳動チャンネル４２内のＤＮＡ断片バンドの存否を
示す導線５０Ａへの電気信号を開閉する。
好適実施態様におけるフィルター６２は、螢光標識の高
放出スペクトルに対応する透過帯域の干渉フィルターを
有する。斯かるフィルターは当該技術分野で知られると
ころであシ、螢光標識の一般的放出帯域に対応する帯域
のフィルターは商業的に購入することができる。更には
、長波長透過性干渉フィルターおよび／または着色ガラ
スフィルターもある。別の実施態様では、フィルターの
代りにモノクロメータ−を使用する。
放出スペクトルに対応する透過帯域の干渉フィルターを
有する。斯かるフィルターは当該技術分野で知られると
ころであシ、螢光標識の一般的放出帯域に対応する帯域
のフィルターは商業的に購入することができる。更には
、長波長透過性干渉フィルターおよび／または着色ガラ
スフィルターもある。別の実施態様では、フィルターの
代りにモノクロメータ−を使用する。
検視光学装置６０は、フィルター６２と並列で配置され
、光学検出系６４に光の焦点を合せるだめのレンズ系か
ら構成される。これは通常の光学系のいずれでもよく、
光学検出系６４は半導体検出器または光電子増倍管を有
するものでなければならず、斯かる例にはＥＭＩジエン
コン社（ＥＭＩＧｅｎｃｏｎ 、 米国ニューヨーク、
プレインビュー）製のモデルＥＭＩ９７９８Ａがある。
、光学検出系６４に光の焦点を合せるだめのレンズ系か
ら構成される。これは通常の光学系のいずれでもよく、
光学検出系６４は半導体検出器または光電子増倍管を有
するものでなければならず、斯かる例にはＥＭＩジエン
コン社（ＥＭＩＧｅｎｃｏｎ 、 米国ニューヨーク、
プレインビュー）製のモデルＥＭＩ９７９８Ａがある。
第一の実施態様では、光電子増倍管または半導体の出力
は、変調器５４からの信号に応答して開閉され、断続レ
ーザー光源からの各パルスより一定の時間遅れで発生す
る。例えば、時間遅れは、電気信号を増幅器に加える前
、従って電気信号を導線５０Ａまたはその出力が導線５
０Ａに電気的に接続されている増幅器へ供する前に包含
される。
は、変調器５４からの信号に応答して開閉され、断続レ
ーザー光源からの各パルスより一定の時間遅れで発生す
る。例えば、時間遅れは、電気信号を増幅器に加える前
、従って電気信号を導線５０Ａまたはその出力が導線５
０Ａに電気的に接続されている増幅器へ供する前に包含
される。
好適実施態に於ける時間遅れは５０マイクロ秒であり、
ゲートまたは増幅器はモノステーブル（ｍｏｎｏｓｔａ
ｂｌｅ ）予調波発振器により約１５０ナノ秒間開放状
態に維持される。第二の実施態様では、変調器の方形波
出力を、ロックイン増幅器を用いて検出器からの信号と
比較する。第三の実施態様では、変調を行なわない。
ゲートまたは増幅器はモノステーブル（ｍｏｎｏｓｔａ
ｂｌｅ ）予調波発振器により約１５０ナノ秒間開放状
態に維持される。第二の実施態様では、変調器の方形波
出力を、ロックイン増幅器を用いて検出器からの信号と
比較する。第三の実施態様では、変調を行なわない。
図７は、標準チャンネルの入力回路７０８、ゲート系７
２、デコーダ７４、記憶系７６および読み出し系７８を
有する相関系３４のブロックダイヤグラムを示す図であ
る。標準チャンネルの入力回路７０８は、ＯＲゲート７
４Ｓに電気的に接続され、ＯＲケート７４Ｓはその他の
チャンネルＡ、Ｇ、ＣおよびＴ１ならびにチャンネル７
０Ｓと同様にチャンネルＡ、Ｇ、ＣおよびＴからの各チ
ャンネル入力信号を受けるゲート系７２に電気的に接続
されている。
２、デコーダ７４、記憶系７６および読み出し系７８を
有する相関系３４のブロックダイヤグラムを示す図であ
る。標準チャンネルの入力回路７０８は、ＯＲゲート７
４Ｓに電気的に接続され、ＯＲケート７４Ｓはその他の
チャンネルＡ、Ｇ、ＣおよびＴ１ならびにチャンネル７
０Ｓと同様にチャンネルＡ、Ｇ、ＣおよびＴからの各チ
ャンネル入力信号を受けるゲート系７２に電気的に接続
されている。
ゲート７４Ｓは記憶系７６に電気的に接続され、該記憶
系は核酸塩基の特定の１種を有するＤＮＡ断片または標
準チャンネルのＤＮＡ断片の存在を示す信号をゲート７
４ｓから受け取る。記憶系７６は、連鎖をプリントアウ
トするだめの読み出し系７８に電気的に接続されている
。
系は核酸塩基の特定の１種を有するＤＮＡ断片または標
準チャンネルのＤＮＡ断片の存在を示す信号をゲート７
４ｓから受け取る。記憶系７６は、連鎖をプリントアウ
トするだめの読み出し系７８に電気的に接続されている
。
標準チャンネルの入力回路７０Ｓは、パルスシェーバ−
（Ｐｕ１ｓｅ ５ｈａｐｅｒ ） ８２ Ａ 、二進計
数器８４Ｓ、クロック８０の時間遅延系９４８およびラ
ッチ（１ａｔｃｈ ） ８６ Ｓを有し、パルスシェー
バ−８２Ｓの入力は導線５０Ｓに電気的に接続されてお
り、その出力は二進計数器８４８ならびに時間遅延系９
４８を経てＯＲゲート７４Ｓに接続されている。二進計
数器８４８はラッテ８６に接続されて時間増分信号をラ
ッチ８６に伝え、ランチ８６の出力は、ＯＲゲート７４
Ｓからの信号の引金がかかると、記憶系７６の入力部の
一つに印加される。導線５０Ｓは、それがアデニン、グ
アニン、シトシンまたはチミンの出力でなく、標準クロ
ックチャンネルの出力であることを除き、導線５０Ａ、
５０Ｇ、５０Ｃおよび５０Ｔ（図２）に対応するもので
ある。
（Ｐｕ１ｓｅ ５ｈａｐｅｒ ） ８２ Ａ 、二進計
数器８４Ｓ、クロック８０の時間遅延系９４８およびラ
ッチ（１ａｔｃｈ ） ８６ Ｓを有し、パルスシェー
バ−８２Ｓの入力は導線５０Ｓに電気的に接続されてお
り、その出力は二進計数器８４８ならびに時間遅延系９
４８を経てＯＲゲート７４Ｓに接続されている。二進計
数器８４８はラッテ８６に接続されて時間増分信号をラ
ッチ８６に伝え、ランチ８６の出力は、ＯＲゲート７４
Ｓからの信号の引金がかかると、記憶系７６の入力部の
一つに印加される。導線５０Ｓは、それがアデニン、グ
アニン、シトシンまたはチミンの出力でなく、標準クロ
ックチャンネルの出力であることを除き、導線５０Ａ、
５０Ｇ、５０Ｃおよび５０Ｔ（図２）に対応するもので
ある。
ラッチ８６およびデコーダ７４は、ゲート７４Ｓからの
パルス信号を受けて記憶系７６に書き込むが、それは特
定のＤＮＡ断片が検出系３２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび
３２Ｔ（図１）に受け取られ検出された時間を示すため
にあとでプリントされるクロック時限パルスを示す区別
された信号の記録である。二進計数器８４Ｓは、それに
接続されているクロック８０から刻時パルスを受けて、
ラッチ８６に伝達するだめの時間を表わす二進信号を内
有する。
パルス信号を受けて記憶系７６に書き込むが、それは特
定のＤＮＡ断片が検出系３２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび
３２Ｔ（図１）に受け取られ検出された時間を示すため
にあとでプリントされるクロック時限パルスを示す区別
された信号の記録である。二進計数器８４Ｓは、それに
接続されているクロック８０から刻時パルスを受けて、
ラッチ８６に伝達するだめの時間を表わす二進信号を内
有する。
スイッチ回路７２ば、デコーダ７４を有し、該デコーダ
は、Ａ、Ｇ％ＣおよびＴ型のＤＮＡ断片が入力導線５０
Ａ、５０Ｇ、５０Ｃおよび５０Ｔ（図１および図２）上
に出現した際にその存在を示す信号を受け取るため、夫
々チャンネル７０Ａ、７０Ｇ、７０Ｃおよび７０Ｔから
の４（＠の入力部に電気的に接続されている。導線５０
Ａ、５０Ｇ。
は、Ａ、Ｇ％ＣおよびＴ型のＤＮＡ断片が入力導線５０
Ａ、５０Ｇ、５０Ｃおよび５０Ｔ（図１および図２）上
に出現した際にその存在を示す信号を受け取るため、夫
々チャンネル７０Ａ、７０Ｇ、７０Ｃおよび７０Ｔから
の４（＠の入力部に電気的に接続されている。導線５０
Ａ、５０Ｇ。
５０Ｃおよび５０Ｔ上の各信号は、夫々のパルスソニー
パー８２Ａ１８２Ｇ１８２Ｃおよび８２Ｔに加えられ、
その出力は対応する導線９２Ａ、９２Ｇ、９２Ｃおよび
９２Ｔを経て、デコーダ７４の相異なる入力部およびＯ
Ｒゲート７４ｓの相異なる入力部に電気的に接続されて
おり、従ってデコーダ７４はＤＮＡ断片の存在を示す信
号を、ＯＲゲート７４８から導線９０Ｓを経た信号と共
に受け取り、記憶系７６に伝える。ＯＲゲート７４Ｓは
、チャンネル７０Ｓから較正信号を受け敗った際または
チャンネル７０Ａ、７０Ｇ、７０Ｃおよび７０Ｔのいず
れかから信号を受け取った際に斯かる信号を伝え、従っ
て記憶系９６は較正信号またはＤＮＡを示す信号を受け
取り、記憶系７６内での一定の遅延時間後に読み出し系
７８に伝えて読み出しに供する。
パー８２Ａ１８２Ｇ１８２Ｃおよび８２Ｔに加えられ、
その出力は対応する導線９２Ａ、９２Ｇ、９２Ｃおよび
９２Ｔを経て、デコーダ７４の相異なる入力部およびＯ
Ｒゲート７４ｓの相異なる入力部に電気的に接続されて
おり、従ってデコーダ７４はＤＮＡ断片の存在を示す信
号を、ＯＲゲート７４８から導線９０Ｓを経た信号と共
に受け取り、記憶系７６に伝える。ＯＲゲート７４Ｓは
、チャンネル７０Ｓから較正信号を受け敗った際または
チャンネル７０Ａ、７０Ｇ、７０Ｃおよび７０Ｔのいず
れかから信号を受け取った際に斯かる信号を伝え、従っ
て記憶系９６は較正信号またはＤＮＡを示す信号を受け
取り、記憶系７６内での一定の遅延時間後に読み出し系
７８に伝えて読み出しに供する。
ＯＲゲート７４Ｓは、遅延ライン９４’Ｓにて付与され
た一定の遅延時間後にチャンネル７０Ｓからの較正信号
を受け取るが、チャンネル７０Ａ１７０Ｇ、７０Ｃおよ
び７０Ｔには斯かる対応遅延はない。しかしながら、以
下で説明するように、同様な遅延がテコ−ダマ４内にも
あり、従ってＤＮＡ断片の出現は、チャンネル７０８か
らの較正信号の時間フレーム（ｆｒａｍｅ ）に対応す
る時間フレームで記憶系７６へ伝達される。デコーダ７
４の出力は、導線１００を介して記憶系７６に電気的に
接続されている。
た一定の遅延時間後にチャンネル７０Ｓからの較正信号
を受け取るが、チャンネル７０Ａ１７０Ｇ、７０Ｃおよ
び７０Ｔには斯かる対応遅延はない。しかしながら、以
下で説明するように、同様な遅延がテコ−ダマ４内にも
あり、従ってＤＮＡ断片の出現は、チャンネル７０８か
らの較正信号の時間フレーム（ｆｒａｍｅ ）に対応す
る時間フレームで記憶系７６へ伝達される。デコーダ７
４の出力は、導線１００を介して記憶系７６に電気的に
接続されている。
図８は、遅延ライン９４、ＯＲゲート１０２ならびにア
デニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の末端を
有するＤＮＡ断片を夫々示す複数のコーティングチャン
ネル７４Ａ、７４Ｇ、７４Ｃおよび７４Ｔを有するテコ
−デフ４回路の概要ダイヤグラムを示す図である。
デニン、グアニン、シトシンおよびチミン塩基の末端を
有するＤＮＡ断片を夫々示す複数のコーティングチャン
ネル７４Ａ、７４Ｇ、７４Ｃおよび７４Ｔを有するテコ
−デフ４回路の概要ダイヤグラムを示す図である。
チャンネル７４Ａは、導線９２Ａおよび９０Ａに電気的
に接続された入力部を有するＡＮＤゲート１０６を内有
し、導線９０ＡにてＯＲゲート７４Ｓ（図７）からの刻
時信号を受け取り、導線９２Ａにてアデニン末端断片の
存在を示す信号をその別の入力部に受ける。
に接続された入力部を有するＡＮＤゲート１０６を内有
し、導線９０ＡにてＯＲゲート７４Ｓ（図７）からの刻
時信号を受け取り、導線９２Ａにてアデニン末端断片の
存在を示す信号をその別の入力部に受ける。
チャンネル７４ＧはＡＮＤゲート１０８、ＡＮＤケート
１１０および遅延ライン１１２を有する。
１１０および遅延ライン１１２を有する。
グアニン末端系を示す導線９２Ｇは、ＡＮＤゲート１０
８および１１０の入力部に電気的に接続されている。Ａ
ＮＤゲ゛−ト１０８の出力はＯＲゲート１０２０入力部
の一つに接続され、ＡＮＤゲート１１０の出力は遅延ラ
イン１１２を経てＯβゲ−）１０２の入力部に電気的に
接続され、継続する２個のパルスをゲート１０２に付与
する。すなわち、チャンネル７４ＡはＡＮＤゲート１０
６の出力部から１個の出力パルスをＯＲゲート１０２０
入力部の一つに加えるのに対し、チャンネル７４Ｇは２
［固のパルスを加えるのである。いずれの場合も、パル
ス連鎖がＤＮＡ断片ＡまたはＧタイプの特定の一方の存
在を示すのである。
８および１１０の入力部に電気的に接続されている。Ａ
ＮＤゲ゛−ト１０８の出力はＯＲゲート１０２０入力部
の一つに接続され、ＡＮＤゲート１１０の出力は遅延ラ
イン１１２を経てＯβゲ−）１０２の入力部に電気的に
接続され、継続する２個のパルスをゲート１０２に付与
する。すなわち、チャンネル７４ＡはＡＮＤゲート１０
６の出力部から１個の出力パルスをＯＲゲート１０２０
入力部の一つに加えるのに対し、チャンネル７４Ｇは２
［固のパルスを加えるのである。いずれの場合も、パル
ス連鎖がＤＮＡ断片ＡまたはＧタイプの特定の一方の存
在を示すのである。
同様に、チャンネル７４ＣはＡＮＤゲート１１４．１１
６および１１８を内有し各ゲートは導線９２Ｃおよび９
０Ｃに電気的に接続された２個の入力部を有する。また
チャンネル７４ＴはＡＮＤゲート１２０．１２２．１２
４および１２６を内有し、各ゲートは導線９２Ｔに′電
気的に接続された入力部の１つと９０Ｔに接続された他
の入力部の１つを有する。ＡＮＤゲート７４Ｃからの出
力はＯＲゲート１０２の一人力部に電気的に接続され、
ＡＮＤケート１１６の出力は遅延系１２８を経てＯＲケ
ート１０２の入力部に電気的に接続され、かつ、ＡＮＤ
ゲート１１８の出力は遅延系１２８より長い遅延系１３
０を経てＯＲゲート１０６の一人力部に電気的に接続さ
れている。この配列では、ントニン末端のＤＮＡ系が存
在すると、ＯＲゲート１０２に３個のパルスをもたらす
。
６および１１８を内有し各ゲートは導線９２Ｃおよび９
０Ｃに電気的に接続された２個の入力部を有する。また
チャンネル７４ＴはＡＮＤゲート１２０．１２２．１２
４および１２６を内有し、各ゲートは導線９２Ｔに′電
気的に接続された入力部の１つと９０Ｔに接続された他
の入力部の１つを有する。ＡＮＤゲート７４Ｃからの出
力はＯＲゲート１０２の一人力部に電気的に接続され、
ＡＮＤケート１１６の出力は遅延系１２８を経てＯＲケ
ート１０２の入力部に電気的に接続され、かつ、ＡＮＤ
ゲート１１８の出力は遅延系１２８より長い遅延系１３
０を経てＯＲゲート１０６の一人力部に電気的に接続さ
れている。この配列では、ントニン末端のＤＮＡ系が存
在すると、ＯＲゲート１０２に３個のパルスをもたらす
。
ＡＮＤゲート１２０の出力はＯＲゲート１０２の一人力
部に電気的に接続され、ＡＮＤゲート１２２の出力は遅
延系１３２を経てＯＲケート１０２の一人力部に電気的
に接続され、ＡＮＤゲート１２４の出口は遅延系１３２
よりも長い遅延系１３４を経てＯＲゲート１０２の一人
力部に電気的に接続され、かつ、ＡＮＤケート１２６の
出力は遅延系１３４よりも長い遅延系１３６を経てＯＲ
ゲートの一人力部に電気的に接続される。このようにす
ると、チミン末端断片が存在すれば、ＯＲゲート１０２
の入力部に一連の４個の信号をもたらす。ＯＲゲート１
０２の出力は、遅延系９４Ｓ（図７）と同じ時間遅れの
遅延系９４を経て出力部ａ１００に印加され、特定ＤＮ
Ａ群の存在を示すコード化信号を、時間信号で調整した
記憶系７６（図７）に提供する。
部に電気的に接続され、ＡＮＤゲート１２２の出力は遅
延系１３２を経てＯＲケート１０２の一人力部に電気的
に接続され、ＡＮＤゲート１２４の出口は遅延系１３２
よりも長い遅延系１３４を経てＯＲゲート１０２の一人
力部に電気的に接続され、かつ、ＡＮＤケート１２６の
出力は遅延系１３４よりも長い遅延系１３６を経てＯＲ
ゲートの一人力部に電気的に接続される。このようにす
ると、チミン末端断片が存在すれば、ＯＲゲート１０２
の入力部に一連の４個の信号をもたらす。ＯＲゲート１
０２の出力は、遅延系９４Ｓ（図７）と同じ時間遅れの
遅延系９４を経て出力部ａ１００に印加され、特定ＤＮ
Ａ群の存在を示すコード化信号を、時間信号で調整した
記憶系７６（図７）に提供する。
ＤＮＡ配列決定操作では、１００以上の塩基を有するＤ
ＮＡを先ずビオチンで標識付与し、該断片の大きさに従
って分離し、続いて１種以上の螢光分子で標識付けされ
たアビジンで標識を付与する。次にこのバンドを光で検
出するが、放出スペクトルの読み出しは、雑音からの分
離のために、放出スペクトル励起後の十分な時間を経て
行なわれる。
ＮＡを先ずビオチンで標識付与し、該断片の大きさに従
って分離し、続いて１種以上の螢光分子で標識付けされ
たアビジンで標識を付与する。次にこのバンドを光で検
出するが、放出スペクトルの読み出しは、雑音からの分
離のために、放出スペクトル励起後の十分な時間を経て
行なわれる。
ＤＮＡ断片をビオチンで標識付けするには、クローン化
されたＤＮＡストランドを調製し、切断して幾つかの断
片となし、そのあと先ずビオチンで標識を付け、次にそ
れを４分割試料にする。同様にビオチンで標識付けされ
、電気泳動下で種々の移動速度を有する標準ＤＮＡスト
ランド源は、更なる較正バッチを形成する。この４個の
バッチは、夫々アデニン、クアニン、シトシンおよびチ
ミン塩基の相異なる１種に関する化学処理によりランダ
ムに切断されたものである。別法として、ＤＮＡストラ
ンドを分離し、ランダムに特定の塩基タイプに合成させ
るための鋳型として使用してもよい。いずれの場合も、
該ＤＮＡストランドは、ピオチンで標識を付与されるが
、ＤＮＡの逆向き相補連鎖で標識を付与されるが、放射
性標識で標識を付与されるか、または標識を付与されな
いままである。
されたＤＮＡストランドを調製し、切断して幾つかの断
片となし、そのあと先ずビオチンで標識を付け、次にそ
れを４分割試料にする。同様にビオチンで標識付けされ
、電気泳動下で種々の移動速度を有する標準ＤＮＡスト
ランド源は、更なる較正バッチを形成する。この４個の
バッチは、夫々アデニン、クアニン、シトシンおよびチ
ミン塩基の相異なる１種に関する化学処理によりランダ
ムに切断されたものである。別法として、ＤＮＡストラ
ンドを分離し、ランダムに特定の塩基タイプに合成させ
るための鋳型として使用してもよい。いずれの場合も、
該ＤＮＡストランドは、ピオチンで標識を付与されるが
、ＤＮＡの逆向き相補連鎖で標識を付与されるが、放射
性標識で標識を付与されるか、または標識を付与されな
いままである。
該ＤＮＡ断片を分離するため、標準ラタ−（１ａｄｄｅ
ｒ ）源を含有するビオチン標識付与断片を、夫々相異
なるチャンネルまたは相異なるカラム内のゲルを通して
電気泳動に付す。ゲルと電場は均一でなければならない
が、参照チャ、ンネルを用いると均一性に対する要求は
減少する。数種の相異なる試料を移動させるために単一
のスラブを使用する際には、チャンネルを分離し、がっ
、試料を移動させる電位が均一となるようにチャンネル
を電場の中心近くに集めねばならない。分離ゲルの好適
ｐＨは７５−８である。
ｒ ）源を含有するビオチン標識付与断片を、夫々相異
なるチャンネルまたは相異なるカラム内のゲルを通して
電気泳動に付す。ゲルと電場は均一でなければならない
が、参照チャ、ンネルを用いると均一性に対する要求は
減少する。数種の相異なる試料を移動させるために単一
のスラブを使用する際には、チャンネルを分離し、がっ
、試料を移動させる電位が均一となるようにチャンネル
を電場の中心近くに集めねばならない。分離ゲルの好適
ｐＨは７５−８である。
ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にその長さに従って分離す
る。すなわち、最も速い移動部分は、ＤＮＡストランド
の標識端部に最も近い最′初の塩基で切断または合成さ
れた断片である。チャンネルが分かれているので、チャ
ンネルからの断片中の最初の塩基がＡ、Ｇ、ＣまたはＴ
の何であるかが知られる。ケル内の時間的に次のバンド
は次の切断点であり、最初のものよりも一塩基長いもの
である。と云うのは、それがＤＮＡストランドのビオチ
ン化端部から最初の塩基と第二の塩基の両者を包含する
からである。同様にして、電気泳動時に第三のバンドを
形成する断片は、最初の３個の塩基単位を包含するであ
ろう、等々。
る。すなわち、最も速い移動部分は、ＤＮＡストランド
の標識端部に最も近い最′初の塩基で切断または合成さ
れた断片である。チャンネルが分かれているので、チャ
ンネルからの断片中の最初の塩基がＡ、Ｇ、ＣまたはＴ
の何であるかが知られる。ケル内の時間的に次のバンド
は次の切断点であり、最初のものよりも一塩基長いもの
である。と云うのは、それがＤＮＡストランドのビオチ
ン化端部から最初の塩基と第二の塩基の両者を包含する
からである。同様にして、電気泳動時に第三のバンドを
形成する断片は、最初の３個の塩基単位を包含するであ
ろう、等々。
多数の塩基を使用するので、多数の切断点があり、各バ
ンドの断片の密度は比較的低い。従って、ゲルと電場を
、検出のために十分な幅、十分な高密度を有しかつ適度
に分離されたバンドを与えるように選択せねばならない
。連続法でのゲルスラブの長さは、ゲル内を完全に移動
するはじめの数バンドが十分に分別され、一方路りのバ
ンドが未分別の−１までいるように十分長いものでなけ
ればならない。更に詳細には、少くとも１０パーセント
のバンドが分別されてゲル内を電気泳動し、−力量も動
きにくいハンドがゲルの入口端部近くで未分別のままで
いるようにするのである。
ンドの断片の密度は比較的低い。従って、ゲルと電場を
、検出のために十分な幅、十分な高密度を有しかつ適度
に分離されたバンドを与えるように選択せねばならない
。連続法でのゲルスラブの長さは、ゲル内を完全に移動
するはじめの数バンドが十分に分別され、一方路りのバ
ンドが未分別の−１までいるように十分長いものでなけ
ればならない。更に詳細には、少くとも１０パーセント
のバンドが分別されてゲル内を電気泳動し、−力量も動
きにくいハンドがゲルの入口端部近くで未分別のままで
いるようにするのである。
一実施態様として、低密度バンド測定のための光増幅を
行なうには、１種以上の螢光分子で標識′を付与された
アビジンが混合されている領域にそのバンドを電気泳動
させる。アビジンは大分子でありかつビオチンに強く引
かれているので、各バンド内のＤＮＡ断片が螢光標識ア
ビジン領域に移動してくると、アビジン標識が付与され
る。３２８１３２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔ（図
１）に示すようなアビジン標識が付与されたあと、それ
らは各々図２に示すような検出系に移動する。
行なうには、１種以上の螢光分子で標識′を付与された
アビジンが混合されている領域にそのバンドを電気泳動
させる。アビジンは大分子でありかつビオチンに強く引
かれているので、各バンド内のＤＮＡ断片が螢光標識ア
ビジン領域に移動してくると、アビジン標識が付与され
る。３２８１３２Ａ、３２Ｇ、３２Ｃおよび３２Ｔ（図
１）に示すようなアビジン標識が付与されたあと、それ
らは各々図２に示すような検出系に移動する。
アビジン分子は大分子なので、同一アビジン分子に多数
の螢光標識が付着し、従って適度の検出を可能とする。
の螢光標識が付着し、従って適度の検出を可能とする。
次に螢光標識を付与された断片を検出系内の試料室に移
動させる。検出系内でのそれらの相対的順序は維持され
ている。分離度が最小とならぬように、ゲル内での移動
速度は十分速いものでなければならない。
動させる。検出系内でのそれらの相対的順序は維持され
ている。分離度が最小とならぬように、ゲル内での移動
速度は十分速いものでなければならない。
バンドは試料室内に溶出され、そこで各光源が、螢光標
識または第二実施態様の臭化エチジウム標識の最適吸収
スペクトルのパルス光すなわち断続光を約３ナノ秒間照
射する。３ナノ秒パルス光の開始後約５０ナノ秒間にわ
たり光は検出器で検出され、その結果得られた電気信号
は増幅される。
識または第二実施態様の臭化エチジウム標識の最適吸収
スペクトルのパルス光すなわち断続光を約３ナノ秒間照
射する。３ナノ秒パルス光の開始後約５０ナノ秒間にわ
たり光は検出器で検出され、その結果得られた電気信号
は増幅される。
この光は検出され相関されて、各検出系の端部に′ある
検出器で示されるようなチャンネルに従って、ＤＮＡの
塩基配列を与える。
検出器で示されるようなチャンネルに従って、ＤＮＡの
塩基配列を与える。
前記の説明から判るように、本発明のＤＮＡ配列決定系
は連続的な配列決定を可能とするものであって、連続的
、自動的に多数の塩基を処理できる。これは、連続的電
気泳動法を、第一分離終期のアビジン付着による増幅と
組合せることにより達成される。
は連続的な配列決定を可能とするものであって、連続的
、自動的に多数の塩基を処理できる。これは、連続的電
気泳動法を、第一分離終期のアビジン付着による増幅と
組合せることにより達成される。
本発明の好適実施態様をある程度詳細に説明してきたが
、前記の説明に照らして、多数の修正および変法が可能
である。従って、前記の特定の説明側以外にも、特許請
求の範囲内で、本発明の実施は可能である。
、前記の説明に照らして、多数の修正および変法が可能
である。従って、前記の特定の説明側以外にも、特許請
求の範囲内で、本発明の実施は可能である。
第１図は、本発明の一実施態様のブロックダイヤグラム
である。 第２図は、本発明の別の実施態様のブロックダイヤグラ
ムである。 第３図は、第１図および第２図の実施態様の一部分の概
略図である。 第４図は、第３図の部分の別の実施態様である。 第５図は、第３図の部分の更に別の実施態様である。 第６図は、第１図および第２図の実施態様の一部のブロ
ックダイヤクラムである。 第７図は、第１図および第２図のブロックダイヤグラム
の一部の論理回路ダイヤクラムである。 第８図は、第１図および第２図の実施態様の一部の回路
の概略ダイヤグラムである。 ＦＩＧ、８ 手 続 補 正 書 昭和６０年６月、２ｚ日 ２、発明の名称 ＤＮＡ塩基配列の決定方法およびその装置ろ、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住所 ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕の欄 （別紙） （１）特許請求の範囲を下記のとおり補正する６［（１
）少なくとも１個のチャンネル（例えば第１図の２６Ａ
、、２５Ｇ、２６Ｃ，２６Ｔまたは第２図のＡ２６ＡＳ
Ａ２６ＣＳＡ２６Ｇ１Ａ２６Ｔ）を有する第一分離装置
（第１図の２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ１２６Ｔ）、並びに
４種の核酸分子、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの相異なる１種で
終結するＤＮＡ断片の夫々を受け入れるに適した少なく
とも１個の分離したチャンネル導入部（例えば２０Ａ、
２０Ｇ、２０Ｃ，２０Ｔ）を有し、がっ、最後に導入さ
れるバンドを分別する前に前記の分離装置の端部（３１
Ａ）から断片を移動させるための前進装置（４７Ａ、５
３）および該バンドを終結塩基に従って検出および表示
する検出回路（１６）を有することにて特徴ずけられる
、ゲル電気泳動装置（第３図の２７）、毛細管電気泳動
装置（２６Ａ）または液体クロマトグラフ装置を使用す
るＤＮＡの塩基配列を決定するための装置（例えば第１
図または第２図）。 （２）分離装置が４個の同一チャンネルを有し、該チャ
ンネルの各々は相当する塩基でＶ！−結する相異なる断
片のバッチのためのものであり、且つ前記のＤＮＡ断片
が電気泳動装置に入る前にそれらをビオチンで標識付け
する手ＪＩｆｆｉ（１１）、蛍光性標識をアビジンに付
着させる手段（３ＯＡ、３０Ｇ。 ３０Ｃ１３０Ｔ）、前記のＤＮＡ断片を蛍光化アビジン
で標識付けする手段（ｔｔＳ４図）、前記標識に選択的
に光を断続照射する手段（第６図の５２）、背景蛍光が
減少する時間にまたがって前記標識の蛍光を検出する手
段（６４）を更に有し、該検出手段は前記の蛍光を、相
異なる核酸塩基部で切断した各Ｄ Ｎ Ａ断片に対応す
る蛍光の標識を付けたＤＮＡバンドの時間系列を示す電
気信号に変換する手段を含むことにて更に特徴ずけられ
る特許請求の範囲＄１項に記載の装置。 （３） クローン化されたＤＮＡストランドを調製し、
該クローン化されたＤＮＡストランドがら、Ａ、ＧＳＣ
およびＴ塩基で終結する複数の塩基を有するランダム長
の断片を調製し、各塩基で終結した後の該断片を分離装
置（２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ，２６Ｔ）の少なくとも一
つのチャンネルに導入することよりなるＤＮＡの塩基配
列決定法において、少なくとも１０パーセントのバンド
が分別されてチャンネル内を移動しかつ一方では最も動
きｌこくいバンドがチャンネルの入日付近で未分別のま
まであるように、連続法に於いてチャンネルを完全に移
動するはじめのバンドが十分に分別されかつ終わりのバ
ンドが未分別であるように、チャンネル内のＤＮＡスト
ランドを分離することを特徴とし、チャンネルの各バン
ドの時間系列を同定し記録することからなる方法。 （４）分離工程がゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは毛細管
電気泳動によるＤＮＡストランドの分離工程を包含し、
４個の対応するチャンネルに付すための終結処理は、該
ストランドをアデニン、グアニン、シトシンおよびチミ
ンのうちの対応塩基部でランダム艮の片に切断すること
により行なわれ、種々の塩基部で終結させたＤＮＡスト
ランドをそれらの終結塩基で同定することを特徴とする
特許請求の範１！ｌ！１３項に記載の方法。 （５）ＤＮＡストランドの一端部を分離前にビオチンで
標識付けし、そして各断片の分離状態を各チャンネル内
で維持しながら、前記バンドをデルから蛍光標識アビジ
ンで標識付けする手段（該手段は蛍光性アビジンをビオ
チン末端標識に結合させることよりなる）に逐次移動さ
せて、蛍光性標識をアビノンに付着させることを特徴と
する特許請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。 （６）バンドを媒体を通して逐次移動させ、蛍光性標識
の最適吸収スペクトルに実質的に一致する狭い帯域幅を
有するレーザー光で前記のバンドを走査し、その際３ナ
ノ秒間よりも短い持続時間のパルスでレーザー光を断続
照射し、該標識からの放出蛍光を、該標識の最適放出ス
ペクトルに実質的に一致する狭い選択帯域幅で、第二時
間期の間に検出しく但し前記の第二時間期は、レーザー
光の対応パルスの開始から少なくとも５０ナノ秒で始ま
り、該レーザー光パルスの開始から１５０ナノ秒を越え
ない時間で終了する）そして、ＤＮＡ断片の塩基配列を
示すように、各チャンネルの時間系列を同定し記録する
ことを特徴とする特許請求の範囲＠３項乃至第５項のい
ずれかに記載の方法。」 以 上
である。 第２図は、本発明の別の実施態様のブロックダイヤグラ
ムである。 第３図は、第１図および第２図の実施態様の一部分の概
略図である。 第４図は、第３図の部分の別の実施態様である。 第５図は、第３図の部分の更に別の実施態様である。 第６図は、第１図および第２図の実施態様の一部のブロ
ックダイヤクラムである。 第７図は、第１図および第２図のブロックダイヤグラム
の一部の論理回路ダイヤクラムである。 第８図は、第１図および第２図の実施態様の一部の回路
の概略ダイヤグラムである。 ＦＩＧ、８ 手 続 補 正 書 昭和６０年６月、２ｚ日 ２、発明の名称 ＤＮＡ塩基配列の決定方法およびその装置ろ、補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 住所 ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕の欄 （別紙） （１）特許請求の範囲を下記のとおり補正する６［（１
）少なくとも１個のチャンネル（例えば第１図の２６Ａ
、、２５Ｇ、２６Ｃ，２６Ｔまたは第２図のＡ２６ＡＳ
Ａ２６ＣＳＡ２６Ｇ１Ａ２６Ｔ）を有する第一分離装置
（第１図の２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ１２６Ｔ）、並びに
４種の核酸分子、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの相異なる１種で
終結するＤＮＡ断片の夫々を受け入れるに適した少なく
とも１個の分離したチャンネル導入部（例えば２０Ａ、
２０Ｇ、２０Ｃ，２０Ｔ）を有し、がっ、最後に導入さ
れるバンドを分別する前に前記の分離装置の端部（３１
Ａ）から断片を移動させるための前進装置（４７Ａ、５
３）および該バンドを終結塩基に従って検出および表示
する検出回路（１６）を有することにて特徴ずけられる
、ゲル電気泳動装置（第３図の２７）、毛細管電気泳動
装置（２６Ａ）または液体クロマトグラフ装置を使用す
るＤＮＡの塩基配列を決定するための装置（例えば第１
図または第２図）。 （２）分離装置が４個の同一チャンネルを有し、該チャ
ンネルの各々は相当する塩基でＶ！−結する相異なる断
片のバッチのためのものであり、且つ前記のＤＮＡ断片
が電気泳動装置に入る前にそれらをビオチンで標識付け
する手ＪＩｆｆｉ（１１）、蛍光性標識をアビジンに付
着させる手段（３ＯＡ、３０Ｇ。 ３０Ｃ１３０Ｔ）、前記のＤＮＡ断片を蛍光化アビジン
で標識付けする手段（ｔｔＳ４図）、前記標識に選択的
に光を断続照射する手段（第６図の５２）、背景蛍光が
減少する時間にまたがって前記標識の蛍光を検出する手
段（６４）を更に有し、該検出手段は前記の蛍光を、相
異なる核酸塩基部で切断した各Ｄ Ｎ Ａ断片に対応す
る蛍光の標識を付けたＤＮＡバンドの時間系列を示す電
気信号に変換する手段を含むことにて更に特徴ずけられ
る特許請求の範囲＄１項に記載の装置。 （３） クローン化されたＤＮＡストランドを調製し、
該クローン化されたＤＮＡストランドがら、Ａ、ＧＳＣ
およびＴ塩基で終結する複数の塩基を有するランダム長
の断片を調製し、各塩基で終結した後の該断片を分離装
置（２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ，２６Ｔ）の少なくとも一
つのチャンネルに導入することよりなるＤＮＡの塩基配
列決定法において、少なくとも１０パーセントのバンド
が分別されてチャンネル内を移動しかつ一方では最も動
きｌこくいバンドがチャンネルの入日付近で未分別のま
まであるように、連続法に於いてチャンネルを完全に移
動するはじめのバンドが十分に分別されかつ終わりのバ
ンドが未分別であるように、チャンネル内のＤＮＡスト
ランドを分離することを特徴とし、チャンネルの各バン
ドの時間系列を同定し記録することからなる方法。 （４）分離工程がゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは毛細管
電気泳動によるＤＮＡストランドの分離工程を包含し、
４個の対応するチャンネルに付すための終結処理は、該
ストランドをアデニン、グアニン、シトシンおよびチミ
ンのうちの対応塩基部でランダム艮の片に切断すること
により行なわれ、種々の塩基部で終結させたＤＮＡスト
ランドをそれらの終結塩基で同定することを特徴とする
特許請求の範１！ｌ！１３項に記載の方法。 （５）ＤＮＡストランドの一端部を分離前にビオチンで
標識付けし、そして各断片の分離状態を各チャンネル内
で維持しながら、前記バンドをデルから蛍光標識アビジ
ンで標識付けする手段（該手段は蛍光性アビジンをビオ
チン末端標識に結合させることよりなる）に逐次移動さ
せて、蛍光性標識をアビノンに付着させることを特徴と
する特許請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。 （６）バンドを媒体を通して逐次移動させ、蛍光性標識
の最適吸収スペクトルに実質的に一致する狭い帯域幅を
有するレーザー光で前記のバンドを走査し、その際３ナ
ノ秒間よりも短い持続時間のパルスでレーザー光を断続
照射し、該標識からの放出蛍光を、該標識の最適放出ス
ペクトルに実質的に一致する狭い選択帯域幅で、第二時
間期の間に検出しく但し前記の第二時間期は、レーザー
光の対応パルスの開始から少なくとも５０ナノ秒で始ま
り、該レーザー光パルスの開始から１５０ナノ秒を越え
ない時間で終了する）そして、ＤＮＡ断片の塩基配列を
示すように、各チャンネルの時間系列を同定し記録する
ことを特徴とする特許請求の範囲＠３項乃至第５項のい
ずれかに記載の方法。」 以 上
Claims (6)
- （１）少くとも４個の同一チャンネル（第１図の２６Ａ
、２６Ｇ、２６Ｃ、２６Ｔまたは第２図のＡ２６Ａ、Ａ
２６Ｃ、Ａ２６Ｇ、Ａ２６Ｔ）を有する第一分離装置（
第１図の２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ、２６Ｔ）、ならびに
４種の核酸分子、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴの相異なる１種で
終結するＤＮＡ断片の夫々を受け入れるに適した少くと
も４個の分離したチャンネル導入部（２０Ａ、２０Ｇ、
２０Ｃ、２０Ｔ）を有し、かつ、終結塩基に従つてＤＮ
Ａ断片を別々の４群に維持しながら、最後に導入される
バンドを分別する前に前記の分離装置の端部（３１Ａ）
から断片を移動させるための前進装置（４７Ａ、５３）
を有することにて特徴ずけられる、ゲル（第３図の２７
）または毛細管電気泳動装置（２６Ａ）を使用するＤＮ
Ａの塩基配列を決定するための装置（例えば第１図また
は第２図）。 - （２）前記のＤＮＡ断片が電気泳動装置に入る前にそれ
らをビオチンで標識付けする手段（１１）、螢光性標識
をアビジンに付着させる手段（３０Ａ、３０Ｇ、３０Ｃ
、３０Ｔ）、前記のＤＮＡ断片を螢光化アビジンで標識
付けする手段（第４図）、前記標識に選択的に光を断続
照射する手段（第６図の５２）、背景螢光が減少する時
間にまたがつて前記標識の螢光を検出する手段（６４）
を更に有し、該検出手段は前記の螢光を、相異なる核酸
塩基部で切断した各ＤＮＡ断片に対応する螢光の標識を
付けたＤＮＡバンドの時間系列を示す電気信号に変換す
る手段を含むことにて更に特徴ずけられる特許請求の範
囲第１項に記載の装置。 - （３）クローン化されたＤＮＡストランドを調製して断
片当り多種の塩基を有する断片に切断するＤＮＡの塩基
配列決定方法に於て、断片化したＤＮＡストランドを、
各塩基部で終結させたランダム長の断片化された少くと
も４個のバッチに分割し、各塩基部で終結させた後の４
個のバッチの各試料を４個の同一チャンネルの分離装置
（２６Ａ、２６Ｇ、２６Ｃ、２６Ｔ）にかけ、該分離装
置が、少くとも１０パーセントのバンドが分別されてチ
ャンネル内を移動しかつ一方では最も動きにくいバンド
がチャンネルの入口付近で末分別のままであるように、
連続法に於てチャンネルを完全に移動するはじめのバン
ドが十分に分別されかつ終りのバンドが末分別であるよ
うに、チャンネル内のＤＮＡストランドを分離すること
を特徴とし、チャンネルの各バンドの時間系列を同定し
記録することからなる方法。 - （４）分離工程がゲル電気泳動、ＨＰＬＣまたは毛細管
電気泳動によるＤＮＡストランドの分離工程を包含し、
４個の対応するチャンネルに付すための終結処理は、該
ストランドをアデニン、グアニン、シトシンおよびチミ
ンのうちの対応塩基部でランダム長の片に切断すること
により行なわれ、種々の塩基部で終結させたＤＮＡスト
ランドを終結塩基で同定することを特徴とする特許請求
の範囲第３項に記載の方法。 - （５）ＤＮＡストランドの一端部を分離前にビオチンで
標識付けし、そして各断片の分 離状態を各チャンネル内で維持しながら、前記バンドを
ゲルから螢光標識アビジンで標識付けする手段（該手段
は螢光性アビジンをビオチン末端標識に結合させること
よりなる）に遂次移動させて、螢光性標識をアビジンに
付着させることを特徴とする特許請求の範囲第３項また
は第４項に記載の方法。 - （６）バンドを媒体を通して遂次移動させ、螢光性標識
の最適吸収スペクトルに実質的に一致する狭い帯域幅を
有するレーザー光で前記のバンドを走査し、その際３ナ
ノ秒間よりも短かい持続時間のパルスでレーザー光を断
続照射し、該標識からの放出螢光を、該標識の最適放出
スペクトルに実質的に一致する狭い選択帯域幅で、第二
時間期の間に検出し（但し前記の第二時間期は、レーザ
ー光の対応パルスの開始から少くとも５０ナノ秒で始ま
り、該レーザー光パルスの開始から１５０ナノ秒を超え
ない時間で終了する）そして、ＤＮＡ断片の塩基配列を
示すように、各チャンネルの時間系列を同定し記録する
ことを特徴とする特許請求の範囲第３項乃至第５項のい
ずれかに記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/594,676 US4729947A (en) | 1984-03-29 | 1984-03-29 | DNA sequencing |
| US594676 | 1984-03-29 |
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