JPH07503370A - 核酸含有溶液の電気化学的処理による変性方法、および、かかる変性方法を利用する増幅方法、複製方法、検出方法およびキット - Google Patents

核酸含有溶液の電気化学的処理による変性方法、および、かかる変性方法を利用する増幅方法、複製方法、検出方法およびキット

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸含有溶液の電気化学的処理 本発明は、核酸物質を処理して二本鎖形から一本鎖形への完全なまたは部分的な 変換を遂行するための方法に関するものであり、こうした変性方法を含む、核酸 の増幅または検出方法に関するものである。
よく知られた二重らせん配置中の二本鎖ＤＮＡ　（デオキシリボ核酸）及びＤＮ Ａ／ＲＮＡ　（リボ核酸）及びＲＮＡ／ＲＮＡ複合体Ｃよ、複合体性子であり、 インビトロで、核酸の相補鎖を分離させるためには、激しい条件を必要とする。
鎖を分離するの１÷通常採用されている既知の方法においては、少なくとも摂氏 ６０°及びしくｆＬｉｆｔＮ氏１００°もの高温を１０分間以上の長時間適用す ること力（必要であり、または、ｐＨ１１以上のアルカリ性を適用すること力（ 必要である。他の方法としては、未知の方法によってＤＮＡの巻き戻しを触媒し うる、Ｅ、Ｃｏ１１のＲｅｐタンノクク質のようなへりカーゼ酵素を使用したり 、ＤＮＡの一本鎖形を安定化するように働く、Ｅ。
Ｃｏ１１フアージＴ４の３２＝タンノくり質のような結合タン、＜り質を使用す ることが、挙げられる。こうした熱やアルカリの既知の方法によって製造した変 性−重鎖ＤＮＡは、〕）イブリ・ノド形成の研究のために通常使用されたり、増 幅サイクルに使用されｊこりしている。
米国特許第４６８３２０２号〔ケアリー　ビー　マリス（Ｋａｒｙ　ＢＭｕｌｌ ｌｓ　）等、セタス（Ｃｅｔｕｓ　）　コーポレーションに譲渡〕力（開示した 方法によれば、核酸またはその混合物に含有されている標的核酸配列を増幅して 検出するために、その核酸の相補鎖を分離し、特定のオリゴヌクレオチドプライ マーとハイブリッド形成させ、ポリメラーゼによってこのプライマーを伸長させ て相補プライマー伸長産物を生成させ、次いでこれらの伸長産物を使用して、前 記特定のオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリッド形成を再び生じさせる ことによって、更に所望の核酸配列を合成している。この方法を繰り返して実施 すれば、出発物質の単分子からさえも、必要な核酸配列を多量に生成させること ができる。この核酸の相補鎖の分離は、連続的なサイクル中の熱変性によって達 成することが好ましいが、こうした熱変性のみが、二本鎖核酸を改善するこの変 性プロセスについて、この増幅サイクルを継続させつるような、単純可逆性を提 供しているからである。しかし、この反応混合物に熱サイクルをかける必要があ るために、典型的な加熱および冷却装置の作動が遅いことから、この増殖プロセ スを実施できるスピードに限界がある。また、プライマー伸長工程において、も しも熱に不安定な酵素の連続的添加を避けるべきであるとするならば、好熱性微 生物からの特別な耐熱性ポリメラーゼ酵素を使用することが必要である。これに よって、この増幅プロセスを利用する新しい診断フォーマットの設計が制限され るが、診断機器の選択的領域に熱を加えることが難しいからであり、またＤＮＡ それ自体の構造に対して破壊的でありうるが、このホスホジエステル結合が高温 で分解して、分解した一本鎖の回収をもたらしうるからである。一般的に信じら れているところでは、今日使用されている好熱性ポリメラーゼは、信頼性が低く 、即ち、ＤＮＡをコピーする際に、中温生物からの酵素が間違いを犯すよりも、 より多くの間違いを犯す。また、ＴＡＱポリメラーゼのような好熱性酵素が、Ｅ 、Ｃｏ１ｔからのクレノーポリメラーゼのような熱に不安定な酵素よりも、低い ターンオーバー数を有している場合もある。更に、核酸を変性するためには、通 常摂氏９０°またはそれ以上の高温への加熱が必要であり、少ない用量を使用す る際には、その液体の蒸発を制御することが困難なために、複雑化をもたらす。
今までは、これらの制限によって、試薬を節約するために非常に少ない用量の試 薬を要する用途において、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおけるような大変 に正確な複製が必要な用途において、及び、試薬の節約、このアツセイフオーマ ・ノドの設計及びＤＮＡ変形、再生プロセスのスピードが重要である通常の診断 業界において、マリス等の方法を使用することに対して幾つかの制約があった。
また、変性／再生サイクルは、ＥＰ−Ａ−０３２０３０８号に記載されている、 いわゆるリガーゼ連鎖反応を実施するのに必要であり、この場合はプライマーを 伸長させることよりも、鋳型配列へとハイブリッド形成されたプライマーを連結 させることによって、増幅を行う。
ＤＮＡが電気化学的特性を備えていることが知られている。例えば、エフ。エル 、パラセフ（Ｐａｌａｃｅｋ　）が〔「バイオエレクトロケミストリー及びバイ オエナージエテイクスＪ　１５．１９８６年、２７５〜２９５頁の［生物巨大分 子の電気化学的挙動：　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｅａｔ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　 ｏｒ　ｒ３ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｉｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｊにおいて〕 開示したところでは、水銀電極の表面上で約−（マイナス）１．５Ｖで、熱変性 −重鎖ＤＮＡ中のアデニン及びシトシンが電気化学的に還元された。また、この 還元プロセスでは、予めプロトン化することが必要であり、従って７０未満のｐ Ｈて起こる。アデニン及びシトシンの一次還元部位は、ワトランークリ・ツク塩 基対中で水素結合の一部を形成している。バラセフは、生存中の天然の二本鎖Ｄ ＮＡにおいて、水銀電極ての、アデニン及びシトシンの還元を示すことはできな かった。更に、パラセフが示したところによれば、非常に限定された範囲ではあ るが、ＤＮＡ二重らせんが、この水銀電極の表面上で、−（マイナス）１，２Ｖ を中心とする狭い電位範囲内で、遅いプロセスで、このＤＮＡ分子の相当部分を 含み、開放された。
ＤＮＡのらせん構造におけるこうした変化は、ある電位に荷電された電極との長 時間の相互作用に起因するものと考えられ、ＤＮＡへの電子移動を含むプロセス であるとは考えられない。この作用電極中には一本鎖ＤＮＡの集積は見られなか ったし、この現象についての実際的用途も示唆されなかった。また、パラセフが 報告したところによれば、ＤＮＡ中のグアニン残渣は、−（マイ、ナス）　１． 　８Ｖでジヒドログアニンへと還元することができ、約−（マイナス）０゜３ｖ でジヒドログアニンをグアニンへと酸化し直すことができる。
この還元可能なグアニン二重結合は、ワトランーク１ルック塩基対における二重 結合の一部分ではなく、グアニンを含むこの電気化学プロセスは、ＤＮＡ二重ら せんの構造に対しては影響しない。
初期の文献において、エフ　ジエレン（Ｊｅｌｅｎ　）　及Ｃｊイー　ｔ＜ラセ クは［ｒＧｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ｒ３ｉｏｐｈｙｓ、Ｊ　１９８５年、４ ．２１９〜２３７頁の「荷電された表面における二本鎖ＤＮＡの、ヌクレオチド 配列に依存する開放：　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ−Ｄｅｐｅｎ ｄｅｎｔ　Ｏｐｅｎｉｎｇ　ｏｒＤｏｕｂｌｅ−３ｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ａ ｔ　ａｎ　ＥｌｅｃＬｒｌｃａｌｌｙ　Ｃｈａｒｇｅｄ　５ｕｒ４ａｃｅ　ｊ　 ｌこおいて〕、更に詳細に、ＤＮＡ分子の水銀電極の表面との長時間にわたる接 触によるＤＮＡ二重らせんの開放について記載している。
こうしたらせんの開放の機構について主張されているところでは、ポリヌクレオ チド鎖が疎水性塩基によってこの電極の表面へと固定され、この後ＤＮＡの負に 荷電された燐酸残渣が、−（マイナス）１．２ｖに近い印加電圧で電極表面から 強い反発を受け、陰極によって加えられたこの電界の結果として、鎖の分離がも たらされる。
ＤＮＡが溶液中に存在している間に（電極上へと吸着されているものではな（） 　、ＤＮＡ二重らせんの鎖を分離するという開示はなく、溶液中における有用な 量の一本鎖ＤＮＡの開示もない。更に、電極上のＤＮＡのヌクレオチド塩基配列 を、溶液から得ることができるという開示はない。これらの塩基自体は、水銀の 表面へと強く結合している。水銀電極は複雑な装置であり、この電極は、研究所 の実験室内で、訓練を受けた技術スタッフによってしか、操作することができな い。
エイチ　ダブリュー　ヌーンベルグ（ＩＩ　Ｗ　Ｎｕｒｎｂｅｒｇ）は〔「バイ オエレクトロケミストリー」ブレナム社にューヨーク）１９８３年、１８３〜２ ２５頁「電気化学における進歩した電量測定法の応用　二　＾ｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ　ｏｒ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＶｏｌｔａｍｉｅＬｒｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｌｅｃｔｒ。
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊにおいて〕開示するところでは、水銀電極の表面への天 然ＤＮＡの吸着領域が部分的にらせん開放し、いわゆるラダー構造を生成する。
しかし、このＤＮＡは、電極表面へと有効に分離不可能に結合しており、または 電極表面上へと吸着している。この条件下では、変性されたＤＮＡが、増幅や分 析についてのいかなる次のプロセスにも利用することがてきないと思われる。変 性されたＤＮＡを何らかの役に立たせるためには、続くプロセスにおいて利用可 能でなければならないが、もし−重鎖ＤＮＡが遊離溶液中で利用可能であるか、 または電極と何らかの形で会合してはいるが次のプロセスに利用可能なままであ れば、これを有利に実現することができる。ヌーンベルグは、水銀電極が有効量 の一本鎖ＤＮＡを供給する能力については、開示していない。
ブイ　プレイベック（Ｖ、　Ｂｒａｂｅｃ　）及びケイ　ナイキ（Ｋ、　Ｎ１ｋ ｌ　）は〔「バイオフィジカル　ケミストリー」誌１９８５年、２３．６３〜７ ０頁の「銀電極に吸着された核酸がらのラマン散乱：　ＲａｍａｎｓｃａＬｔｅ ｒｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｎｕｃｌｅｌｃ　ａｃｉｄｓ　ａｄｓｏｒｂｅｄ　ａｔ　 ａ　５ｉｌｖｅｒ　ｅｌｅｃｔｒｏｄｅＪにおいて〕、負の電位に荷電された水 銀及びグラファイト電極の双方の表面におけるＤＮＡ変性に関する、焼入かの研 究者の異なる意見の、役に立つ要約を提供した。この分野の研究者の間で意見の 一致が明らかになったように、この変性プロセスが、電極表面に強く吸着された ＤＮＡ中でのみ発生し、適切な負電圧による長時間の処理によってのみ発生し、 正電荷は二重らせんに対−でまったく作用しない。
プレイベック及びバラセフが（ｒＪ、　Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、 　Ｊ誌、８８．１９７８年、３７３〜３８５頁において〕開示したところでは、 ガンマ線放射によって損傷した音波処理ＤＮＡが、水銀プール電極の表面上で一 時的、部分的に変性されており、この−重鎖産物をホルムアルデヒドと反応させ て、メチル化されたＤＮＡ産物を溶液中に集積させることによって、このプロセ スを検出することができる。生存ＤＮＡは、いかなる観察可能な変性をも示して ぃながった。
我々ノ出願であるＰＣＴ／ＧＢ９１１０１５６３が開示する、二本鎖核酸の変性 方法は、核酸含有溶液に対して、電極を、この核酸の相当部分を完全にまたは部 分的に一本鎖形へと変換できるような条件下で作用させることを含んでいる。
この方法は、損傷していない（即ち、照射していない）ＤＮＡが存在している溶 液に対して、適当な条件下に適当な電圧を印加することによって、常温で、この ＤＮＡの変性を生じさせることができるという発見に基づいている。
この方法の機構は、未だ完全には明らかではない。我々が信するところでは、こ の方法は、電極の表面における電界が二重らせんに変性を生じさせる方法の１つ である。
ポリメラーゼ連鎖反応プロセスにおいて示されてきたところでは、この変性方法 によって生じた変性ＤＮＡは、プライマ−ノ＼イブＩルノド形成及び伸長に対し て直ちに適した状態にある。１大規模な場合において発見されたところでは、負 電圧電極または熱変性のいずれかによって生じた変性ＤＮＡの試料を、高温で培 養することによって、または正の電圧を適用することによって、リアニールを生 じさせるかまたは促進することができる。
ＰＣＴ出願／ＧＢ９１１０１５６３のプロセスは、適当な緩衝液を含有する水中 に溶解された核酸及び電極のみを含む溶液中で生じつるけれども、この方法は、 核酸を含有する溶液中でプロモーター化合物を存在させることによって、促進す ることができる。メチルビオローゲン及びその塩が、好ましいプロモーター化合 物として開示されている。
正に荷電したビオローゲン分子が、負に荷電したＤＮＡと負に荷電した陰極との 間で）０互作用し、これらの間の静電反発を減少させ、これによって電界が最も 強い電極表面へのＤＮＡの接近を促進しているものと考えられる。従って、我々 は、ＰＣＴ出願／ＧＢ９１１０１５６３において、離れた正荷電中心を有するプ ロモーター化合物として、例えば双極性正荷電化合物を採用することを、好まし いと述べた。好ましくは、これらの正荷電中心の間隔は、ビオローゲンのそれに 近似しているべきであった。
ここで、我々は、多価の無機陽イオン、好ましくはＭｇ”ｂ、こうした系内にお いて、メチルビオローゲンとほぼ同じ効率でプロモーターとして作用しうろこと を発見した。
Ｍ　ｇ　”１７）ような大きな陽イオンは、負電極と、二本鎖ＤＮＡの負荷電領 域との間で、架橋として作用しうるちのと考えられる。
従って、本発明が提供する、二本鎖核酸の変性方法は、この核酸を含有する溶液 に対して、電極を、この核酸の相当部分を完全にまたは部分的に一本鎖形へと変 換できるような条件下で作用させることを含んでおり、ここで前記溶液が、前記 変性を促進するプロモーターとして作用する有効濃度の多価の無機陽イオンを含 有している。
このプロモーターとして使用する陽イオンには、無機または有機の配位子と錯化 している無機の陽イオン、例えば、前記プロモーター陽イオンの濃度は、１ｍＭ から２５０ｍＭまでが好ましく、７０ｍＭからが、例えば約１００ｍＭが、更に 好ましい。
好ましくは、本発明によれば、生成した一本鎖核酸は、電極から遊離しており、 例えば溶液中に遊離している。しかし、この核酸は、電位を印加するのに先立っ て、二本鎖または一本鎖形で電極上に固定化することができ、例えば、核酸鎖の 末端または末端の小部分中間体によって付着させ、この核酸分子の大部分のセグ メントを変性の前後に電極の表面から自由にぶら下がったままで残すことができ る。
前記の電極及び対極に加えて、基準電極を前記溶液と接触させることができ、前 記電極と前記対極との間に電圧を印加して、前記電極と前記基準電極との間で電 圧を所望値に制御することができる。
これらの各電極を、電気化学分野において知られているポテンシオスタット回路 によって接続することができる。　１好ましくは、前記基＄電極に対して−０， ５〜−１，５Ｖの電位を前記作用電極に印加し、更に好ましくは−０，８〜１， １■、例えば約−１，ＯＶである。
作用電極の電圧は、カロメル基準電極に対して、あたかも測定したようにまたは 実際に測定したように、終始与える（ＢＤＨ番号３０９．１０３０．０２）。
前記溶液のイオン強度は、好ましくは２５０ｍＭ以下であり、更に好ましくは１ ００ｍＭ以下である。このイオン強度が減少するのにつれて、変性の速度か増大 することを発見したので、このイオン強度は、５０ｍＭ以下、例えば２５ｍＭ以 下または更には５Ｍｍ以下とすることか更に一層好ましい。一般に、このイオン 強度が低いほど、この変性が急速である。しかし、これらの目的のためにイオン 強度を算出する際には、上記したプロモーターとして作用するあらゆる成分のイ オン強度への寄与をも、無視することが好ましい。
本方法は、シー　ジエイ　スタンシー（Ｓｔａｎｌｅｙ　）　、Ｍ、カルドッチ （Ｃａｒｄｏｓｌ　）及びニー　ピー　エフ　ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）がＣｒ Ｊ、　ｉｏ＋ａｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　Ｊ誌、１９８８年、１１２．１５３〜 １６１頁ｒｉＩｔ流測定酵素増幅イムノアッセイ：＾ｍｐｅｒｏｍｅｔｒｌｃ　 ＥＩＩｚｙｍｅ　ＡｓｐＨｆｉｅｄ　Ｉ＋＋ｎｕｎｏａｓｓａｙｓＪ　〕に記載 した型の電気化学セル内で実施することができ、このセル内には作用電極、対極 及び必要に応じて基準電極がある。この核酸の変性を実施する作用電極は、あら ゆる好適な物質、例えば、金または白金のような貴金属であってよく、またはガ ラス質カーボン電極であってよい。
この電極は、いわゆる「修飾電極」であって良く、ここでは、変性を促進する化 合物を、さもなければ不活性ではあるが導電性の物質からなる電極の上に被覆し 、または電極へと吸着させ、または電極の構造中に含有させる。他の電気化学セ ル装置においては、作用電極、対極及び基準電極を、１つの表面、例えば平坦面 の上に、厚膜スクリーン印刷、インクジェット印刷のようなあらゆる印刷方法に よって、またはホトレジストに続いてエツチング法を適用することによって、形 成することかできる。また、対極及び基準電極を、平坦面の上で一体化して２電 極配置をもたらすことも可能である。
また、これらの電極を、液体を保持するのに適合したウェルの内側面上に形成す ることができる。こうしたウェルは、良く知られた９６ウエルまたは微量定量プ レートであって良く、また試験管または他の容器であって良い。微量定量プレー トまたは他の成形または熱成形プラスチック材料中に、多重核酸変性実験のため に、電極アレーを設けることができる。
鎖の分離を、水性媒体中で、またはジメチルホルムアミドのような有機溶媒と水 との混合物中で、実施することができる。また、水量外の極性溶媒または非極性 溶媒を使用することは、許容されるが、好ましくはない。本方法は、常温で実施 することができ、または望むならば、最高で、核酸の予備溶解温度に近い温度で 実施することができる。本方法は、３〜１０のｐＨで実施することができ、約７ が便利である。一般的には、ｐＨを低くすると、一層急速に変性できる。従って 、幾つかの目的のためには、中性よりは幾らか下のｐＨ１例えば、約ｐＨ５，５ が好ましい。この核酸は、その性質及びイオン強度がこの鎖分離プロセスを阻害 しないよう、な緩衝液を含有する水溶液中に、溶解させることができる。
本発明による変性方法は、多数の一層複雑な方法、例えば核酸の分析および／ま たは増幅を含む方法の中に、１つの工程として含めることかできる。こうした応 用例のうぢの幾つかを下に述べる。
本発明は、試料における所定の核酸配列の存在または不存在を検出する方法を含 んでおり、溶液中の二本鎖核酸試料に対して電極によって電圧を印加することに よって、この試料を変性し、こうして変性した核酸を、その配列のためのオリゴ ヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ、および前記ハイブリッド形成が 起こったかどうかを測定し、ここで変性の間、前記溶液が、前記変性を促進する プロモーターとし７て作用する有効濃度の多価の無機陽イオンを含有している。
従って、本発明の方法は、例えば特定の微生物に対して特異的な、または鎌型赤 血球貧血症を例とする特定の遺伝病に対して特異的な、特異的遺伝子配列を同定 すべきであるような、ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリッド形成に用途を有している 。特異的配列を同定するためには、まずＤＮＡの試料、好ましくは精製ＤＮＡの 試料を調製することが必要であるが、このための方法は既知であり、これは天然 の二本鎖型である。次いで、このＤＮＡ試料の相補配列を有する標識ヌクレオチ ドプローブとのハイブリッド形成工程を実施する前に、この二本鎖ＤＮＡを一本 鎖型へと変換することが必要である。本発明の変性方法は、この目的のために、 下記の工程を実施することによって、好適な態様で適用することができるニー　 溶液中で前記プロモーターと共にＤＮＡ試料に対して電極で電圧を印加すること によって、ＤＮＡ試料を変性し、；−この変性ＤＮＡを、目的とする配列に相補 的な直接標識または間接標識ヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ；お よび−このハイブリッド形成が生じたかどうかを測定し、このδＦ１定は、プロ ーブの存在を検出することによることができ、このプローブは直接に放射標識、 蛍光標識、化学発光標識または酵素標識することがてき、または、例えば標識ア ビジンまたはアビジン型分子が後に結合できるようなビオチンを担持する間接標 識プローブである。
典型的なりＮＡプローブアッセイにおいては、試料ＤＮＡを膜の表面に対して固 定化することが通常であり、膜表面は中性または荷電されたナイロンまたはニト ロセルロースからなっていてよい。この固定化は、荷電相互作用によって、また はＤＮＡを含有する膜をオーブン中で焼くことによって、達成できる。この試料 ＤＮＡは、膜に対して結合させる前に、高温に加熱することで膜に対する一本鏡 型への変換を確実にすることができ、または膜上でアルカリによって一度処理す ることでこの一本鎖型への変換を確実にすることができる。この方法の不利な点 はニ ー　高温に加熱することで一本鎖ＤＮＡを生じさせるので、試料ＤＮＡそれ自体 に損傷を与えつる。
−アルカリを使用すると、標識プローブとのハイブリッド形成を生じさせる前に 、更なる中和工程が必要になる。
ＤＮＡプローブハイブリッド形成アッセイを実施するための改善法の１つは、い わゆる「サンドイッチ」技術であり、特定のオリゴヌクレオチドを表面上に固定 化する。次いで、特定のオリゴヌクレオチドをその上に有する表面を、−重鎖型 の標的ＤＮＡを含有する溶液とハイブリッド形成させ、この後に第二の標識オリ ゴヌクレオチドを添加し、これも標的ＤＮＡとハイブリッド形成する。次いで、 この表面を洗浄して、結合していない標識オリゴヌクレオチドを除去し、この後 に表面上で標的ＤＮＡに結合しはじめたあらゆる標識を、後で検出することがで きる。
二本鎖ＤＮＡを必要な一本鎖ＤＮＡへと変性させるために、本発明の変性方法を 適用することによって、この方法を単純化することができる。作用電極、対極お よび必要に応じて基準電極および／またはプロモーターを、その内部でＤＮＡプ ローブアッセイを実施すべき試験管またはウェル中へと、収容することができる 。次いで、ＤＮＡ試料、もし既に存在していない場合にはプロモーター、および オリゴヌクレオチドプローブを添加することができ、電圧を印加してこのＤＮＡ を変性する。こうして得られた一本鎖ＤＮＡを、表面上に固定化された特異的オ リゴヌクレオチドとハイブリッド形成させ、この後にサンドイッチアッセイの残 りの工程を実施する。上記のすべての工程は、従来の方法におけるような、高温 やアルカリ性試薬を添加する必要なしに、実施することができる。
このＤＮＡの電気化学的変性を、例えばポリメラーゼ連鎖反応やりガーゼ連鎖反 応の増幅手順におけるように、核酸を増幅する際に、適用することができる。即 ち、本発明が提供する核酸の複製方法は：溶液中の二本鎖核酸試料の鎖を、無機 多価陽イオンプロモーターおよび電極から溶液へと印加された電圧の影響下に分 離し；変性された核酸鎖の少なくとも１種とハイブリッド形成する少なくとも１ 種のオリゴヌクレオチドブライマーと、核酸の分離された鎖とをハイブリッド形 成させ：これとハイブリッド形成した核酸の６鎮に対して十分に相補的な各プラ イマーの伸長産物を合成し、；および各伸長産物を、これがハイブリッド形成し ている核酸鎖がら分離して、伸長産物を得ることを含んでいる。
こうしたポリメラーゼを媒介とする複製方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応方法 においては、核酸の一本鎖分子を完全に製造するところまで変性を実施すること は、すべての場合において必要なわけではない。プライマーハイブリッド形成部 位中の二重らせんを、局部的におよび／または一時的に十分に弱化または分離さ せて、このプライマーのその標的への結合を可能にできれば、十分でありうる。
一旦このプライマーが最初の標的鏡上の位置にあるときには、このプライマー領 域内の標的鎖の再ハイブリッド形成は防止されるであろうし、この他の標的鎖は 、プライマーを伸長させることによって、または更なる一時的な弱化または分離 プロセスによって、置換を促進することができる。
更に、好ましくは、前記した増幅方法は、上記した方法をサイクリックに繰り返 すこと、例えば１０回以上繰り返すこと、例えば最大２０または３０回繰り返す ことを含む。この増幅方法においては、ハイブリッド形成工程は、核酸の相異な る鎖に対して相補的な２つのプライマーを使用して、実施することが好ましい。
この伸長産物を得るための変性だけでなく、もとの標的核酸の変性も、電極から の電圧を核酸溶液に対して印加することによって、実施することが好ましく、こ の溶液が、本明細書に記載したようにプロモーターを含有する。
本方法は、一種の核酸または核酸の混合物中に含有されている少なくとも１種の 特異的核酸配列を増幅するための、１標準的または古典的ＰＣＲ方法であってよ く、ここで各核酸は、等しいまたは等しくない長さを有する、２つの別個の相補 的鎖からなり、この方法が：（ａ）　適用される相異なる各特定配列について、 ２種のオリゴヌクレオチドプライマーによって各鎮を処理し、増幅される相異な る各配列について、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸長産物が合成されるよ うな条件下に処理し、ここで前記プライマーを、各特異的配列の相異なる鎖に対 して実質的に相補的であるように選択し、これによって１つのプライマーから合 成された伸長産物が、その補体から分離されたときには、他のプライマーからの 伸長産物を合成するための鋳型として働くことができ；（ｂ）　反応混合物へと 電極から電圧を印加することによって、前記のプロモーターの存在下に、プライ マー伸長産物がその上で合成された鋳型からプロモーター伸長産物を分離して一 本鎖分子を製造し；および （ｃ）　工程（ｂ）から生じた一本鎖分子を、工程（ａ）のプライマーと、工程 （ｂ）で製造した一本鎖の各々を鋳型として使用することでプライマー伸長産物 が合成されるような条件下に、処理することを含んでいる。
また、この方法は、古典的または標準的なＰＣＲ法のあらゆる変形法であってよ く、例えば、いわゆる「逆位」または「逆行ＪＰＣＲ法または「固定（ａｎｃｈ ｏｒｅｄ）　Ｊ　ＰＣＲ法であってよい。
従って、本発明は、上記した増幅方法を含んでおり、ここでプライマーを環状核 酸に対してハイブリッド形成させ、伸長させて二重らせんを生成させ、二重らせ んを本発明の変性方法によって変性し、この増幅方法は、必要に応じて更に１回 以上のサイクルを繰り返す。
更に一般的には、本発明は、核酸のハイブリッド形成、増幅および変性（例えば 、ハイブリッド形成および増幅の複数のサイクル）を含む、核酸の標的配列を増 幅する方法を含んでおり、ここで無機多価陽イオンプロモーターの存在下に電極 を、前記核酸を含有する溶液に対して作用させることによって、前記の変性を生 じさせる。
本発明の方法は、リガーゼ連鎖反応に対して適用することができる。即ち、本発 明は： （ａ）　試料の核酸を一本鎖核酸として与え：（ｂ）　この試料中で少なくとも ４種の核酸プローブを与え、ここで：　（ｉ）第一および第二の前記プローブが 一次ブローブであり、第三および第四の前記プローブが二次核酸プローブであり ；（ｔｉ）第−のプローブが、標的核酸の一欠航の第一のセグメントに対してハ イブリッド形成しうる一本鎖であり；（ｉｉｉ）第二のプローブが、標的核酸の 前記−次鎖の第二のセグメントに対してハイブリッド形成しうる一本鎖であり； （ｉｖ）前記標的の前記−次鎖の第一のセグメントの５′末端が、ごの標的の前 記−次鎖の第二のセグメントの３′末端に対して配置されており、第一のプロー ブの３゛末端の第二のプローブの５′末端への結合を可能にしており、ここで前 記プローブを前記標的核酸の前記−次鎖へとハイブリッド形成させ；　（■）第 三のプローブが第一のプローブとハイブリッド形成する能力を有しており；およ び（ｉｖ）第四のプローブが第二のプローブとハイブリッド形成する能力を有し ており；および（Ｃ）　反復して、または連続して：　（ｉ）前記各プローブを 前記試料中の核酸とハイブリッド形成させ；（ｆｉ）ハイブリッド形成したプロ ーブを結合させて、再組織化された融合プローブ配列を生成させ：および（ｉ　 ｉ　ｉ）前記プロモーターの存在下に、反応混合物へと電極からの電圧を印加す ることによって、前記試料中のＤＮＡを変性する各工程を有する、標的核酸の増 幅方法を含んでいる。
上記したすべての増幅方法において、続くプライマーとのハイブリッド形成を可 能とするＤＮＡの変性は、電極へと適当な電圧を印加することによって、実施す ることができる。この方法は、ＰＣＲおよびＬＣＲの現存する熱的方法における ように変性および再生の連続的サイクルを含んで、段階的に実施することができ るが、またこれを継続的に実施することもできる。なぜなら、酵素による鎖の伸 長および結合プロセスと、続く電気化学的方法による鎖の分離プロセスとは、同 し反応中で継続しうるからであり、これは−重鎖型の核酸分子が、電極による変 性の影響をいったん離れれば、プライマーと自由にハイブリッド形成しうるがら である。即ち、このプライマーがＤＮＡとハイブリッド形成するとすれば、伸長 または結合産物が合成されるであろう。この電気化学的ＤＮＡ増幅技術を分析に 適用することで、非常に少量のＤＮＡ試料、例えば動物細胞中の単一複製遺伝子 または微生物の単細胞を、検出し、分析することができる。
本発明は、試料中の所定の核酸配列の存在または不在を検出する方法に使用する キットを含んでおり、このキットは、電極、対極および必要に応じて基準電極、 前記配列用のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記電極で核酸鎖分離をすると きにプロモーターとして使用する無機多価陽イオンの源を備えている。このプロ ーブは、上記したあらゆる方法で標識化することができる。　。
また、本発明は、核酸を増幅する方法のためのキットを含んでおり、このキット は、電極、対極および必要に応じて基準電極、および前記電極で核酸鎖分離をす るときにプロモーターとして使用する無機多価陽イオンの源、およびＰＣＲ法に おいて使用する少なくとも］種のプライマー、またはＬＣＲ法において使用する 少なくとも１種のプライマー、および／またはポリメラーゼまたはりガーゼ、お よび／またはＰＣＲ法において使用するのに適したヌクレオチドを備えている。
好ましくは、このキットは、この電極を備えたセルを含んでいる。
好ましくは、このキットは、検出または増幅方法において使用するのに適した緩 衝液を含む。
ここで、本発明を、次の図面および実施例を参照しつつ、説明する。
図１は、ＤＮＡの変性に使用する電気化学的セルの図面である。
図１において示すセル構造体１０は、内部にＤＮＡ含有溶液の本体がある作用室 １２、作用電極１４、対極１６、ＦｉＶａｃシール１９、Ｋ　ｗ　ｉ　ｋフィツ トアダプター２１および磁気攪拌子１８を備えている。別体のサイドアーム中の 基準電極２０は、ラギン毛管２３を通して、作用室１２内の溶液へと結合されて いる。この作用電極、対極および基準電極は、ポテンシオスタット装置内で互い に結合されており、これによって作用電極１４と基準電極２ｏとの間で一定の電 圧が維持される。こうしたボテンシオス名ツト装置は、良く知られている（例え ば、［電気化学における機器分析法：　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　［ＥｌｅｃｔｒｉｃｈｅｉｉｓｔｒｙＪサザンブトン　エレクトロ ケミストリー　グループ：１９８５年、ジョン　ウィリー　アンドサンズ社　第 １９頁を参照）。
電極１４は、直径０．５ｃｍで、１０ｍＭの高さで０．２５ｃｍへと狭くなって いる環状のガラス質カーボンロッドであり、外径０゜８ｃｍのテフロンスリーブ の内側で９ｃｍの全長を有しており（オクラン、アビントン、アレクサンダー　 ブレイス１８のオックスフォード　エレクトローズ社か供給）、基準電極１６は 、２ｍｍピンカロメルである（ＢＤＨ番号３０９／１０３０１０２によって供給 ）。対極は、アダプターの上方で真鍮スリーブ２５へとはんだ付けされたワイヤ ーによって支持されており、テフロンスリーブを通って下り、作用電極の基部か ら２０ｍｍでテフロンスリーブを出ている。このワイヤーは、オックスフォード 　エレクトローズ社によって供給された円筒状の白金メツシュ対極に取り付けら れており、対極が作用電極を環状に包囲している。
次の実施例においてこのセルを使用した。
実施例１ 図１に示すセルの作用チャンバーへと、９００μｍの蒸留水と、４０μｇ／口１ １の子ウシ胸腺ＤＮＡとを、下の図１に示すプロモーターと共に加えた。このセ ルの内容物を、−１，ＯＶに最大４時間供した。
試料を、開始から０分、３０分、１時間および２１時間後に採取し、１％寒天ゲ ル上で分析し、変性の度合いを観察した。結果を表１に示す。
表１ 従って、理解できるように、この系において、プロモーターとしてのＭｇ２＋の 最小有効量は、３０ｍＭと１００ｍＭとの間にあり、プロモーターとしてＭｇ２ ＋はメチルビオローゲンとほぼ同様に有用である。
フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、ＧＡ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　Ｍ Ｌ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。
ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。
ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。
、　ＮＺ、　ＰＬ、　ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＫ。
ＵＡ、　ＵＳ （７２）発明者　アーシャー、バトリシア、リーンイギリス国、シイ−ビイ−４ ３ニービイ−、ケンブリッジシイアー、ケンブリッジ、ミナーヴア　ウェイ　１ ６４

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. １．二本鎖核酸を変性する方法であって、この核酸の相当部分を完全にまたは部 分的に一本鎖形へと変換できるような条件下で、この核酸を含有する溶液に対し て電極を作用させる工程を備え、前記溶液が、前記変性を促進するプロモーター として作用する有効濃度の多価の無機陽イオンを含有している、二本鎖核酸を変 性する方法。
  2. ２．前記溶液に対して前記作用電極へと−０．５〜−１．５Ｖの電位を印加する 、請求項１記載の方法。
  3. ３．前記作用電極、基準電極および対極が前記溶液と接触しており、前記作用電 極と前記基準電極との間の電圧を所望値に制御できるように、前記作用電極と前 記対極との間に電圧を印加する、請求項１または２記載の方法。
  4. ４．前記イオン強度を１００ｍＭ以下とする、請求項１〜３のいずれか一項に記 載の方法。
  5. ５．前記イオン強度を２５ｍＭ以下とする請求項４記載の方法。
  6. ６．前記プロモーターをマグネシウムイオンとする請求項１〜５のいずれか一項 に記載の方法。
  7. ７．前記プロモーター陽イオンの濃度を１ｍＭ〜２５０ｍＭとする請求項１〜６ のいずれか一項に記載の方法。
  8. ８．核酸のハイブリッド形成、増幅および変性を含む、核酸の標的配列を増幅す る方法であって、前記核酸を含有する溶液に対して電極を作用させることによっ て前記の変性を生じさせ、この溶液が、前記変性を促進するプロモーターとして 作用する有効濃度の多価の無機陽イオンを含有している、核酸の標的配列を増幅 する方法。
  9. ９．（ａ）試料の核酸を一本鎖核酸として与え；（ｂ）この試料中で少なくとも ４種の核酸プローブを与え、ここで：（ｉ）第一および第二の前記プローブが一 次プローブであり、第三および第四の前記プローブが二次核酸プローブであり； （ｉｉ）第一のプローブが、標的核酸の一次鎖の第一のセグメントに対してハイ ブリッド形成しうる一本鎖であり；（ｉｉｉ）第二のプローブが、標的核酸の前 記一次鎖の第二のセグメントに対してハイブリッド形成しうる一本鎖であり；（ ｉｖ）前記標的の前記一次鎖の第一のセグメントの５′末端が、この標的の前記 一次鎖の第二のセグメントの３′末端に対して配置されており、第一のプローブ の３′末端の第二のプローブの５′末端への結合を可能にしており、ここで前記 プローブを前記榛的核酸の前記一次鎖へとハイブリッド形成させ；（ｖ）第三の プローブが第一のプローブとハイブリッド形成する能力を有しており；および（ ｉｖ）第四のプローブが第二のプローブとハイブリッド形成する能力を有してお り；および （ｃ）反復して、または連続して：（ｉ）前記各プローブを前記試料中の核酸と ハイブリッド形成させ；（ｉｉ）ハイブリッド形成したプローブを結合させて、 再組織化された融合プローブ配列を少成させ；および（ｉｉｉ）反応混合物へと 電極からの電圧を印加することによって、前記試料中のＤＮＡを変性し、ここで この反応混合物が、前記分離のプロモーターとして作用する有効濃度の多価の無 機陽イオン機場イオンを含有している； 各工程を有する、標的核酸を増幅するための、請求項８記載の方法。
  10. １０．核酸を複製する方法であって：溶液中の二本鎖核酸試料の鎖を、電極から 溶液へと印加された電圧の影響下に分離し；変性された核酸鎖の少なくとも１種 とハイブリッド形成する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーと、核 酸の分離された鎖とをハイブリッド形成させ；これとハイブリッド形成した核酸 の各鎖に対して十分に相補的な各プライマーの伸長産物を合成し；および各伸長 産物を、これがハイブリッド形成している核酸鎖から分離して伸長産物を得るこ とを含み、ここで前記溶液が、前記変性を促進するプロモーターとして作用する 有効濃度の多価の無機陽イオンを含有している、核酸を複製する方法。
  11. １１．試料中の所定の核酸配列の存在または不存在を検出する方法であって、溶 液中の二本鎖核酸試料に対して電極によって電圧を印加することによって、この 試料を変性し、ここでこの溶液が、前記変性を促進するプロモーターとして作用 する有効濃度の多価の無機陽イオンを含有しており；こうして変性した核酸を、 その配列のためのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ；および 前記ハイブリッド形成が起こったかどうかを測定する、検出方法。
  12. １２．試料中の所定の核酸配列の存在または不在を検出する方法に使用するキッ トであって、このキットが、電極、対極および必要に応じて基準電極、前記配列 用のオリゴヌクレオチドプローブ、および前記電極で核酸鎖を分離する際にプロ モーターとして使用する、無機多価陽イオンの源を備えている、キット。
  13. １３．核酸増幅方法に使用するキットであって、電極、対極および必要に応じて 基準電極、および前記電極で核酸鎖分離をする際にプロモーターとして使用する 無機多価陽イオンの源、およびＰＣＲ法において使用する少なくとも１種のプラ イマー、またはＬＣＲ法において使用する少なくとも１種のプライマー、および ／またはポリメラーゼまたはりガーゼ、および／またはＰＣＲ法において使用す るのに適したヌクレオチドを備えている、キット。
  14. １４．二つの互いに相補的な核酸鎖をアニル化する方法であって、これらの鎖を 含有する溶液を正に荷電した電極に供して前記アニル化を生じさせるかまたは促 進する、核酸鎖をアニル化する方法。
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