JPH07509121A - ｍＲＮＡの阻害／不安定領域の除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（ｂ）上述のポリペプチドの発現を起こすために宿主細胞を培養し；そして （Ｃ）上述のポリペプチドを回収する。 １４、上述の宿主細胞が原核生物である、請求項１３の方法。 １５、上述の宿主細胞が真核生物である、請求項１３の方法。 １６、上述の遺伝子がｃＤＮＡである請求項１３．１４または１５の方法。 １７　上述の遺伝子がゲノム遺伝子である請求項１３．１４または１５の方法。 １８、本来の遺伝子の発現が当該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ中の阻害 ／不安定配列の存在により妨げられるような遺伝子に、阻害／不安定配列の効果 を減少するような突然変異を導入したものからなる、人工的な核酸構築物。 １９　上述の突然変異を導入した遺伝子によりコードされたアミノ酸配列が本来 の遺伝子によりコードされたアミノ酸配列と同じである、請求項１８の構築物。 ２０　上述の本来の遺伝子がＨＩＶ−１ｇａｇである、請求項１９の構築物。 ２１、上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド４０２および４５２の間、 ５３６および５８３の開、５８５および６３４の間、および６５４および７０３ の開に多重点突然変異を導入することによって突然変異を起こした、請求項２０ の構築物。 ２２　上述の本来の遺伝子がＨ［Ｖ−１ｅｎｖである請求項１９の構築物。 ２３、下記の要素を含んてなる、ｍＲＮＡ中の阻害／不安定配列を同定するため の測定キット・ （ａ）請求項２０または２１の核酸構築物、および（ｂ）上述の核酸構築物中の 上述の遺伝子の発現レベルを検出するための検出系。 ２４　上述の検出系がＥＬＩＳＡである、請求項２３のキット。 ２５、請求項１または２の方法によって突然変異を導入した遺伝子を含む人工核 酸構築物。 ２６、請求項２５の核酸構築物を含むベクター。 ２７、請求項２５の人工核酸構築物を含む形質転換した宿生細胞。 ２８、請求項１８または１９の核酸構築物を含むベクター。 ２９、請求項１８または１９の人工核酸構築物を含む形質転換宿主細胞。 ３０、上述の細胞力慎核生物および原核生物かるなる群から選択された、請求項 ２９の形質転換宿主細胞。 ３１、上述の細胞がヒト細胞である請求項３０の宿主細胞。 ３２、上述の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項３ｏの宿主細 胞。 ３３、上述の細胞がＥ、ｃｏｌｉである請求項３ｏの宿主細胞。 ３４　上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子が、ヌクレオチド４０２および４５２の間 、５３６および５８３の間、５８５および６３４の間、６５４および７０３の間 、８７１および９１５の間、１１ｏ５および１１３９の間、１１４ｏおよび１１ ７５の間並びに１３２１および１３６４の間に多重点突然変異を導入することに よって突然変異を起こしたものである、請求項２ｏの構築物。 ３５、上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子がｐ３７Ｍ１−１０Ｄである、請求項３４ の構築物。 ３６、上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子が、ヌクレオチド４０２および４５２の間 、５３６および５８３の間、５８５および６３４の間、６５４および７０３の間 、８７１および９１５の間、１１ｏ５および１１３９の間、１１４ｏおよび１１ ７５の間、１３２１および１３６４の間、１４１６および１４６６の間、１４７ ０および１５２０の間、１５２７および１５７４の間、並びに１８２３および１ ８７９の間に多重点突然変異を導入することによって突然変異を起こしたもので ある、請求項２０の構築物。 ３７　上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子がｐ５５Ｍ１−１３ＰＯである、請求項３ ６の構築物。 ３８．薬剤的に受容できる基剤及びさらにｉｎ　ｖｉｖｏの細胞中でＨＩＶ調節 タンパク質が存在しなくてもＨＩｖｇａｇタンパク質を生産することができる核 酸構築物を治療に効果的な量含む、ＨＩＶ感染に対するは乳類の免疫を誘導する ワクチン組成物。 ３９、上述のは乳類がヒトである、請求項３８に記載のワクチン組成物。 ４０、上述の調節タンパク質がＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖである、請求項３８に記載の ワクチン組成物。 ４１、上述の構築物が請求項２ｏ、２１．３４．３５．３６、及び３７の構築物 からなる群から選択された、請求項３８に記載のワクチン組成物。 ４２．４ｎ　ｖｉｖｏの細胞中でＨＩＶ調節タンパク質が存在しなくてもＨＩＶ ｇａｇタンパク質を生産することができる核酸構築物を含むワクチン組成物セ治 療に効果的な量では乳類に与えることを含む、は乳類中のＨＩＶ感染に対する免 疫を誘導する方法。 ４３、上述のは乳類がヒトである、請求項４２に記載の方法。 ４４、上述の調節タンパク質がＨＩＶ−Ｉ　Ｒｅｖである請求項４２に記載の方 法。 ４５、上述の構築物が請求項２０，２１．３４．３５．３６、及び３７の構築物 からなる群から選択された、請求項４２に記載の方法。 明細書 ｍＲＮＡの阻害／不安定領域の除去方法本出願は１９９２年３月２７日に提出さ れた米国シリアルナンバー０７／８５８．７４７の一部継続出願である。 ■、技術分野 本発明は転写を阻害あるいは減衰させる遺伝子のコード領域中の調節あるいは阻 害／不安定配列（ＩＮＳ）に突然変異を導入した遺伝子により生産されるｍＲＮ Ａの安定性および／あるいは有用性の増加方法に関連する。本発明はまた本方法 に従って突然変異を導入した遺伝子を保持する発現ベクターを含む構築物および 当該構築物を含む宿主細胞に関連する。 本発明の方法はタンパク質をコードする能力を変化させずにｍＲＮＡの安定性お よび／あるいは有用性の増加に特に有効である。本方法は本来ｍＲＮＡ転写物中 のＩＮＳ領域の存在のために発現されないあるいは発現されても僅かである遺伝 子の発現を許容あるいは増加するのに有用である。このように本発明の方法、構 築物および宿主細胞は、ＩＮＳを含むｍＲＮＡ転写物をコードするいかなる遺伝 子によって生産されるタンパク質量の増加に有用である。 本発明の方法、構築物および宿主細胞は、たとえば増殖因子、インターフェロン 、インターロイキン、ｆｏｓ原癌原級遺伝子タンパク質よびＨＩＶ−１ｇａｇお よびｅｎｖをコードする遺伝子から生産されるタンパク質量の増加に有用である 。 本発明はまた、例えばワクチンのような免疫療法および免疫的予防措置、あるい は人体中で発現後の遺伝子療法における本発明の構築物の使用に関連する。この ような構築物はレトロウィルスあるいは他の発現ベクターを含んだり融合され、 あるいはまた構築物は組繊細胞に直接注入されてコードされたタンパク質あるい はタンパク質断片を効率的に発現することもできる。これらの構築物はまた、た とえばｉｎ　５ｉｔｕの標的遺伝子との相同的組換による１ｎ−ｖｉｖｏあるい は１ｎ−ｖｉｔｒｏの遺伝子置換に使用できる。 本発明はまたいかなるｍＲＮＡ中の阻害／不安定配列の境界を簡単にすぐに検出 および／あるいは限定するために使用できる例示した構築物、これらの構築物を 使用する方法、およびこれらの構築物を含む宿主細胞に関連する。一度ｍＲＮＡ のＩＮＳ領域が位置付けされおよび／あるいはさらに定義されると、これらのＩ ＮＳ領域をコードするヌクレオチド配列に、ｍＲＮＡの安定性および／あるいは 有用性を増加させうる本発明の方法に従って突然変異を導入し、それゆえ、突然 変異の導入されたｍＲＮＡをコードする発現ベクターより生産されるタンパク質 量が増加することになる。 ＩＩ　背景技術 転写制御機構の研究に多（の仕事が為されてきて、転写後修飾もまた、与えられ た遺伝子により生産されたＲＮＡの量及び有用性を変化させるということが次第 に明らかになってきた。これらの転写後修飾は細胞質内のＲＮＡ分解に加えて核 における転写後修飾（例えばスプライシング、ポリアデニル化、および輸送）を 含む。これらの修飾はすべて特定の転写物の最終定常状態レベルに貢献する。 これらの制御点は１つの過程が単独で生産するよりもより柔軟な制御体系を生み 出す。例えば多量に転写されて効率よく修飾されても短命のメソセンジャーは安 定したものよりも量が少ない。効率的な合成速度はメツセンジャーが細胞質に到 達し翻訳されることを保証するが、急速な分解速度はｍＲＮＡが高レベルに蓄積 しないことを保証する。例えば厚恩遺伝子であるｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓの ｍＲＮＡのような多くのＲＮＡは、非常に低レベルで発現され、急速に衰退し、 種々の条件下ですばやくそして一時的に修飾される点でこの種の制御を示すとい う研究がなされた。Ｌ／ビューとしてＭ、Ｈｅｎｔｚｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ 。 ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１０９０：２８１−２９２（１９９１）を参照。これらの ｍＲＮＡの多くの分解速度はｍ　ＲＮ　Ａそのものの中にある１つあるいはそれ 以上の不安定／抑制配列の存在に相関することが示された。 不安定あるいは短命のｍＲＮＡをコードする細胞内遺伝子の中には転写されたｍ ＲＮＡの３′非翻訳領域（３’　ＵＴＲ）内にＡおよびＵが豊富な（ＡＵ−リッ チ）ＩＮＳを含むものがあると示された。これらの細胞内遺伝子は、ＡＵ−リッ チ３’　ＵＴＲ配列（ＡＵＵＵＡ配列モチーフを８コピー含む）がマウスとヒト のあいだでタンパク質をコードする配列そのものよりもより高度に保存されてい る（６５％にたいして９３％）顆粒細胞−単細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３ Ｆ）（Ｇ、Ｓｈａｗ、およびＲ，Ｋａｍｅｎ、Ｃｅ１ｌ　４６：６５９−６６７ 　（１９８６））および進化を通じて非翻訳領域が保存されているｍｙＣ原癌遺 伝子（ｃ−ｍｙｃ）（例えばヒトとマウスで８１％）　（Ｍ、　Ｃｏ　Ｉ　ｅお よびＳ、Ｅ。 Ｍｏｎｇｏ、Ｅｎｚｙｍｅ　４４：１６７　１８０（１９９０））を含む。３゛ ＵＴＲ内にＡＵ−リッチ配列を含むことが示された他の不安定なあるいは短命な ｍＲＮＡはインターフェロン（アルファ、ベータ、およびガンマＩＦＮ）：イン ターロイキン（ＩＬＩ、ＩＬ２およびＩＬ３）：癌ネクローンス因子（ＴＮＦ） 、リンフオドキシ：／　（Ｌｙｍ）；　Ｉ　ｇＧ１誘導因子（ＩｇＧ　ＩＦ）： 顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）　、ｍｙｂ原癌遺伝子（ｃ−ｍｙｂ） およびｓｉＳ原癌遺伝子（ｃ−ｓｉｓ）（Ｇ、Ｓｈａｗ、およびＲ，Ｋａｍｅｎ 、Ｃｅ　］　１４６　：　６５９−６６７　（１９８６））を含む。Ｒ，Ｗｉｓ ｄｏｍおよびＷ、Ｌｅｅ、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５：２３２−２４３　（１９ ９１）（ｃ−ｍｙｃ）：Ａ、５ｈｙｕら、、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５：２２１ −２３１　（１９９１）（ｃ−ｆｏｓ）：Ｔ、Ｗｉ　１ｓｏｎおよびＲ，Ｔｒｅ ｉｓｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ３３６：３９６−３９９　（１９８８）（ｃ−ｆｏｓ ）；Ｔ、ＪｏｎｅｓおよびＭ、Ｃｏ１ｅ、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、７：４ ５１３−４５２１　（１９８７）　（ｃ−ｍｙｃ）：Ｖ、Ｋｒｕｙｓら、、、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８９：６７３−６７７　（１ ９９２）（ＴＮＦ）：Ｄ、Ｋｏｅｌｌｅｒら　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８ニア７７８−７７８２　（１９９１）（１−ランスフェ リン受容体（ＴｆＲ）およびＣ−ｆｏｓ）；１．Ｌａｉｒｄ−Ｏｆｆｒｉｎｇａ ら、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：２３８７−２３９４　（１ ９９１）（ｃ−ｍｙｃ）：Ｄ、ＷｒｅｓｃｈｎｅｒおよびＧ、Ｒｅｃｈａｖｉ、 Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７２：３３３−３４０　（１９８８）（遺伝子 の探索および比較安定性の概論を含む）；ＢｕｎｎｅＩ　ｌら、Ｓｏｍａｔｉｃ 　Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍｏ１．Ｇｅｎｅｔ、１６：１５１−１６２（１９９０） （ガラクトツルトランスフェラーゼ−関連タンパク質（ＧＴＡ）　、ヒト、マウ スおよびラット間で９８％の相同性のあるＡＵ−リッチ３°　ＵＴＲ領域を含む ）：およびＣａｐｕｔらＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３：１６ ７０−１６７４　（１９８６）（ＴＮＦ、　不ズミおよびヒトのＴＮＦ　ｍＲＮ Ａ中に全体として保存された３３ヌクレオチドのＡＵ−リッチ配列を含む）もま た参照。 ｍＲＮＡの３’　ＵＴＲ内にＩＮＳを含むと示されたこれらの細胞内遺伝子のう ちいくつかはコード領域内にもＩＮＳを含むことが示されている。例えばＲ，Ｗ ｉｓｄｏｍ、およびＷ、Ｌｅｅ、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５：２３２−２４３（ １９９１）　（ｃ−ｍｙｃ）；Ａ、５ｈｙｕら、、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５： ２２１−２３１　（１９９１）（ｃ−ｆｏｓ）参照。 細胞内ｍＲＮＡと同様に、い（っかのＨＩＶ−１ｍＲＮＡは、タンパク質コード 領域内にＩＮＳを含むことが示されていて、それはある例において高ＡＵ−含量 部分と一致する。例えばＨＩＶ−１ｇａｇをコードする配列中においてｇａｇ遺 伝子の５゛末端に存在する高ＡＵ含量（６１，５％）２１８ヌクレオチド領域は ｇａｇ発現の抑制と関連がある。Ｓ、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、、Ｊ、Ｖｉｒｏ　１ ．６６　：１５０−１５９　（１９９２）。さらなる実験によりウィルスゲノム のｇａｇタンパク質分解酵素遺伝子領域中に１つ以上のＩＮＳが存在することが 示された（下記参照）。高ＡＵ含量の領域はＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅ ｎｖのＩＮＳ領域中に見いだされた。ＡＵＵＵＡ配列はｇａｇコード配列中には 存在しないが、ｇａｇ／ｐａｌおよびｅｎｖコード領域中には多コピー存在する 。Ｓ、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６＋１５０−１５９　（１９ ９２）。例えばＭ、Ｅｍｅｒｍａｎ、Ｃｅ１ｌ　５７：１１５５　１１６５（１ ９８９）　（ｅ　ｎ　ｖ遺伝子は３°　ＵＴＲおよび内部阻害／不安定配列の両 方を含む）；Ｃ，Ｒｏｓｅｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ ＳＡ　８５：２０７１−２０７５　（１９８８）（ｅｎｖ）；Ｍ、Ｈａｄｚｏｐ ｏｕｌｏｕ−ＣＩａｄａｒａｓら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６３：１２６５−１２７ ４　（１９８９）（ｅｎｖ）；　Ｆ、Ｍａ　Ｉ　ｄａ　ｒｅ　ｌ　ｌ　ｉら、、 Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌ、６５：５７３２−５７４３　（１９９１）（ｇａｇ／ｐｏｌ ）＋Ａ、Ｃｏｃｈｒａｎｅら　、Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、６５：５３０３−５３１３　（１９９１）（ｐｏｌ）もまた参照。 Ｆ。 Ｍａｌｄａｒｅｌｌｉら、、（上述）は複製成分に関してＩＮＳ領域の機能を直 接分析し、ＨＩＶ−１プロウイルスの全長は遺伝子内ＩＮＳがウィルス構造タン パク質のコード配列中に位置するという事実により複雑であると言及している。 彼らはさらにこれらの遺伝子内ＩＮＳ配列中の変異は多くの場合たんぼ（質配列 にも影響を与え、このような突然変異体の複製にも影響を与えると言及している 。 ＩＮＳ領域はＡＵ−リッチである必要はない。例えばｃ−ｆｏｓのコード領域の ＩＮＳは構造的にＡＵ−リッチの３’　ＵＴＲＩＮＳとは関連がないしくＡ。 ５ｈｙｕら、、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５：２２１−２３１　（１９９１）、Ｉ ＮＳ要素を含むと見られるｅｎｖコード領域のある部分はＡＵ−リンチではない 。 さらに、安定な転写物の中にもその３’　ＵＴＲ中にＡＵＵＵＡモチーフを持つ ものがあり、この配列のみでは転写物を不安定にするのに十分である訳ではなく 、あるいはこれらのメツセンジャーが優性の安定化要素も含む（Ｍ、Ｃｏ１ｅお よびＳ、Ｅ、Ｍａｎｇｏ、Ｅｎｚｙｍｅ　４４：１６７−１８０　（１９９０） ）ということを示している。興味深いことに特定のｍＲＮＡに独特の要素がまた ｍＲＮＡ転写物を安定化できるとして見いだされている。１つの例はＲｅｖタン パク質存在中にてｍＲＮＡ転写物の輸送、安定性および有用性を促進するＲｅｖ 反応要素である（Ｂ、Ｆｅ１ｂｅｒら、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。 ＵＳＡ　８６：１４９５−１４９９（１９８９））。 ＡＵ配列そのもの、および特にＳｈａｗ−Ｋａｍｅｎ配列ＡＵＵＡが分解シグナ ルの一部あるいはすべてとして働くかどうかまだ知られていない。これが短命の メツセンジャーに関わる唯一の機構であるかどうか、あるいはＲＮＡにはさまざ まな階層があって各々独自の分解体系を持つのかどうか明かではない。レビュー としてＭ、Ｃｏ１ｅおよびＳ、Ｅ、Ｍｏｎｇｏ、Ｅｎｚｙｍｅ　４４：１６７− １８０　（１９９０）参照；Ｔ、ＪｏｎｅｓおよびＭ、Ｃｏ　Ｉ　ｅ、　Ｍｏ　 １．　ＣｅＩ　１．Ｂｉｏｌ、７：４５１３−４５２１　（１９８７）もまた参 照。Ｃ−ｍｙＣＲＮＡ　ＩＮＳ領域中の唯一のＡＵＵＵＡ配列に突然変異を導入 してもＲＮＡの半減期に影響はなく、それゆえ、抑制配列はＧＭ−Ｃ３Ｆのそれ とはまったく異なるのかも知れない（Ｍ、Ｃｏ１ｅおよびＳ、Ｅ、Ｍａｎｇｏ、 Ｅｎｚｙｍｅ４４　：１６７−１８０　（１９９０））　、あるいはｍＲＮＡの 不安定性はｍＲＮＡ中のさらなるＩＮＳ領域の存在によるためかも知れない。 上述の研究者たちは転写されたｍＲＮＡの３’　ＵＴＲ中のＡＵ−リッチ阻害／ 不安定配列をコードする遺伝子の中に突然変異を導入した。例えばＧ、Ｓｈａｗ およびＲ，Ｋａｍｅｎ、Ｃｅ　ｌ　］　４６　：　６５９−６６７　（１９８６ ）はウサギβ−グロビン遺伝子の３’　ＵＴＲの中にＧＭ　Ｃ３Ｆ由来の５１ヌ クレオチドのＡＴ−リッチ配列を導入した。この挿入によって本来安定なβ−グ ロビンｍＲＮＡがｉｎ　ｖｉｖｏで高度に不安定になり、野生型の対照と比較し てβ−グロビンの発現は劇的に減少する結果となった。配列中に１４個のＧおよ びＣを点在させた同じ長さの別の配列をウサギβ−グロビン遺伝子の３″　ＵＴ Ｒの同じ場所に導入したところ野生型βグロビンｍＲＮＡと同程度の蓄積が生じ た。この対照配列はＡＵ−リッチ配列に７回現れるＡＵＵＵＡモチーフを含まな かった。この結果はβ−グロビンｍＲＮＡ中のＡＵ−リッチ配列の存在が特に不 安定性に関与していることを示唆している。 Ａ、５ｈｙｕら、、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ１．５：２２１−２３１　（１９９１） はＵからＡへ単一の点突然変異を導入することによってその配列を変化させるが 要素のＡＵの豊富さは保持することにより、３つすべてのＡＵＵＵＡペンタヌク レオチドを破壊してｃ−ｆｏｓの３°　ＵＴＲ中のＡＵ−リッチＩＮＳを研究し た。 ３’　ＵＴＲＩＮＳ配列中のこの変化は、野生型のＩＮＳと比較してβグロビン ｍＲＮ／’１の３°　ＵＴＲに挿入したとき突然変異を導入した３’　ＵＴＲが βグロビンメソセンツヤ−を不安定化する能力を劇的に抑制した。ｃ−ｆｏｓタ ンパク質をコードする領域のＩＮＳ　（３’　ＵＴＲＩＮＳとは構造的に関連が ない）は、βグロビンのコート領域に読み枠を合わせて挿入し、ヘテロなｃ−ｆ ｏｓ−βグロビンｍＲＮＡの安定性の欠如の効果を観察することによって研究さ れた。 上述の研究者たちはまた、阻害／不安定配列をコードしている遺伝子の転写され たｍＲＮＡのコード領域の中に突然変異を導入した。例えばＰ、Ｃａｒｔｅｒ− ＭｕｅｎｃｈａｕおよびＲ，Ｗｏｌｆ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、、ＵＳＡ、８６：１１３８　１１４２　（１９８９）はＥ、ｃｏｌｉ　６−フ オスフオゲルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）遺伝子のコード配列中にある 負の制御領域の存在を実証した。この要素の境界は合成した”内部相補配列”　 （ＩＣ３）をクローニングして、ｇｎｄ遺伝子内部のいくつかの場所に位置させ るとこの内部相補要素の遺伝子発現への影響が観察されることによって決定され た。 ｇｎｄ−１ａｃＺ融合遺伝子の発現の制御に対する、部位特異的突然変異の導入 によって合成ＩＣ３要素中に導入した１つおよび２つの突然変異の効果は、リポ ソーム結合部位を隠すように各々のｍＲＮＡが２次構造を形成する能力と関連が あった。このように、ｇｎｄ遺伝子の内部制御要素はシスに働（アンチセンスＲ ＮＡとして機能すると見られる。 Ｍ、Ｌｕｎｄｉｇｒａｎら、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８８　：１４７９−１４８３　（１９９１）は、−６０から＋２５３（コード 領域は＋２４１から始まる）の領域に突然変異を導入し、それから読み枠を合わ せて１ａｃＺに融合することにより、ｂｔｕＢの適切な発現および転写制御に重 要な関連した配列を同定するための実験を行った。それから単一の塩基置換を含 む変異プラスミドからのβガラクトノダーゼ発現を分析した。突然変異は使用し た突然変異導入方法によるとすべてＧＣからＡＴへの変換であった。さまざまな 突然変異の中で、＋２５３位の単一塩基置換により抑制及び非抑制条件下で共に ｂｔｕＢ−１ａｃＺ融合遺伝子の発現が非常に増加した。 Ｒ，ＷｉｓｄｏｍおよびＷ、Ｌｅｅ、Ｇｅｎ、＆Ｄｅｖｅ　１．５　：　２３２ −２４３　（１９９１）は翻訳開始コドンがＡＴＧからＡＴＣに変異した全長の ハイブリッドＣ−ｍｙｃ遺伝子由来のｍＲＮＡは比較的安定であることを示す実 験を行い、ｃ−ｍｙｃコード領域の抑制配列は翻訳に依存した形で機能すること が示唆された。 Ｒ，ＰａｒｋｅｒおよびＡ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７：２７８０−２７８４　（１９９０）はＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＭＡＴαｌ　ｍＲＮＡのコード領域中に 見いだされた通常は低い安定性にかかわる４２ヌクレオチドの領域は、この４２ ヌクレオチド断片のすぐ上流に翻訳の停止コドンを導入することによって実験的 に不活性化し得ることが実証された。この実験によりＭＡＴαｌ　ｍＲＮＡの分 解はコード配列の特定の領域によるリポソームの転位（トランスロケーション） によって促進されることが示唆された。この４２ヌクレオチド断片は翻訳の伸長 を遅らせると思われる希なコドン（希なコドンは１０００酵母コドンにつき１３ 回以下しか現れないものとして定義される（Ｓ、Ａｏｔａら、　、　Ｎｕｃ　１ ．　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１６　：　ｒ３１５−ｒ４０２　（１９８８））を高 含量（１４中８）持つ。この研究の著者であるＲ、ＰａｒｋｅｒおよびＡ、Ｊａ ｃｏｂｓｏｎは、不安定な酵母ｍＲＮＡ中にある稀なコドンの分布および翻訳の 一時停止を誘導する稀なコドンの既知の能力が共役した急速な衰退に必要な配列 中の希なコドンの量は、ｍＲＮＡの構造変化は一時停止したリポソームの特定の 位置によって影響されるというモデルを示唆すると提唱する。他の著者は翻訳伸 長における速度論的変化がｍＲＮＡの安定性に影響し得るかどうか（およびどの ように）を見いだすことは重要であると述べた（Ｍ、Ｈｅｎｔｚｅ、Ｂｉｏｃｈ 、ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ　１０９０：２８１−２９２　（１９９１））。しか し、Ｒ，ＰａｒｋｅｒおよびＡ、Ｊａｃｏｂｓｏｎは安定なＰＧＫＩ　ｍＲＮＡ を稀なコドンが最高４０％まで増加するよう変化させて、少なくとも定常状態の ｍＲＮＡＩノベルの３倍の効果を与えることができること、およびこの相違は実 際には転写速度の変化によるだろうと述べている。このようにこれらの著者はリ ポソーム一時停止そのものは急速なｍＲＮＡ衰退を促進するのに十分ではないと 見られると結論した。 上述の文献はいずれも、ｍＲＮＡのコード領域内に阻害／不安定配列の位置を見 つけ、そのｍＲＮＡをコードしている遺伝子を修飾して、遺伝子のコード能力を 変化させずに様々なヌクレオチド置換を作成することによってこれらの阻害／不 安定性配列を除去するという本発明について記述していないし、示唆していない 。 ＩＩｌ、発明の開示 本発明は、遺伝子コード領域中に存在して該遺伝子の発現を邪魔する若しくは減 らす調節もしくは阻害／不安定配列（ＩＮＳ）を変異させることによって、遺伝 子により生産されるｍＲＮＡの安定性および／もしくは有用性を増大させる方法 に関する。本発明はまた、発現ベクターを含めた、これらの方法に従い変異させ られた遺伝子を含むコンストラクト（構築物）、およびこれらのコンストラクト を含む宿主細胞にも関する。 本明細書中での定義として、転写産物の阻害／不安定配列は、ｍＲＮＡ転写産物 内にある調節配列であり、（１）そのｍＲＮＡの迅速なターンオーバーを担い、 第２のインジケーター／レポーターｍＲＮＡに融合させた場合に、そのインジケ ーター／レポーターｍＲＮＡを不安定化させつる、または（２）ｍＲＮＡの利用 を不十分にさせ、第２のインジケーター／レポーターｍＲＮＡに融合させた場合 に、そのインジケーター／レポーターｍＲＮＡからの蛋白質生産の減少をもたら しつる、あるいは（３）上述の両方をもたらすものである。遺伝子の阻害／不安 定配列は、転写産物の阻害／不安定配列をコードする遺伝子配列である。本明細 書中で使われるように、利用（性）　（ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）とは、ｍＲＮ Ａの翻訳の全体的な効率に関する。 本発明の方法は、ｍＲＮＡの蛋白質コード能を変えることなく、ｍＲＮＡの安定 性および／もしくは利用性を増大させることに特に有用である。しがし、コード される蛋白質のアミノ酸配列が保存的もしくは非保存的アミノ酸置換を含むよう に変えられるようなやり方で、阻害／不安定配列が変異される（但し、それでも 尚、本来コードされていた蛋白質の機能を保持している）本発明の別の態様も本 発明の一部である。 これらの方法は、ｍＲＮＡ転写産物のＩＮＳ領域の存在のために、本方法がなけ れば発現しない、もしくは僅かしか発現しない遺伝子の発現を可能にする、もし くは増加させるのに有用である。本発明は、阻害／不安定領域をコードする遺伝 子いずれかのヌクレオチド配列部分を変更することによって、阻害／不安定領域 を含むｍＲＮＡをコードする遺伝子によりコードされる蛋白質の生産を増加させ る方法を提供する。 本発明の方法、コンストラクトおよび宿生細胞は、ＩＮＳを含むｍＲＮＡ転写産 物をコードするいかなる遺伝子により産生される蛋白質の量を増加させるのにも 有用である。そのような遺伝子の例には、例えば、ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎ ｖ蛋白質をコードする遺伝子の他に、増殖因子、インターフェロン、インク−ロ イキン、およびｆｏｓ原癌遺伝子蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。 本発明の方法は、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子のコード領域内のＩＮＳを変異導入に より不活化して、ｇａｇの発現を増加させることにより、並びにヒト細胞におい てＲｅｖ非依非依存性２允２ の阻害／不安定配列の変異不活化は、ｇａｇ遺伝子のコード領域内のＡＵに富ん だ阻害配列への多重点変異導入（但し、ヌクレオチドコード配列の縮重により、 ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列には影響しない変異）を用いる。 本発明のコンストラクトは、本発明の方法に従い変異導入されたｇａｇ　ｅｎＶ およびｐｏｌ遺伝子を含むベクターにより例示され、宿主細胞はこれらのベクタ ーを含むヒトＨＬｔａｔ細胞により例示される。 本発明はまた、本発明のコンストラクトを、例えばワクチンとして、免疫療法お よび免疫予防に、またはヒトにおいて発現させた後の遺伝子治療に利用すること にも関する。そのようなフンストラクトは、レトロウィルスベクター若しくは他 の発現ベクターを含んだり、若しくはそうしたベクターに取り込まれてもよく、 または、それらは、コードされる蛋白質もしくは蛋白質断片が効率よ（発現する ように、組繊細胞に直接注入してもよい。これらのコンストラクトは、例えば、 標的遺伝子と１ｎ−３ｉｔｕに相同性組み換えさせることにより、１ｎ−ｖｉｖ Ｏもしくは１ｎ−ｖｉｔｒｏ遺伝子置換に用いることもできる。 本発明はまた、阻害／不安定領域を含むと知られている、若しくはそう思われる いかなるｍＲＮＡにおいても、阻害／不安定配列の限界を、ＩＮＳがコード領域 内にあるのか若しくは３−ＵＴＲにあるのかまたはその両方なのかを、簡単かつ 迅速に検出し、および／またはさらに細かく規定するのに使うことのできる、あ る例示されたコンストラクトにも関する。遺伝子のＩＮＳ領域がこれらのベクタ ーの利用を通じて位置決定され、および／もしくはさらに細かく規定されれば、 その同じベクターは、遺伝子のコード能に影響することなく同定されたＩＮＳを 排除する変異導入実験にも使うことができ、これによりこれらの変異遺伝子を含 む発現ベクターから生産される蛋白質の量を増加させることが可能となる。本発 明はまた、これらのコンストラクトの利用法、およびこれらのコンストラクトを 含む宿主細胞にも関する。 ｍＲＮＡ内の不安定／阻害領域を検出するのに用いることができる、本発明のコ ンストラクトは、ベクターｐ１９、ｐ１７Ｍ１２３４、ｐ３７Ｍ１２３４および ｐ３７Ｍ１−１０Ｄ　（図１（Ｂ）および図６に示されている）により例示され る。ｐ３７Ｍ１２３４およびｐ３７Ｍ１−１０Ｄは、ｇａｇインジケーター／レ ポーター蛋白質の発現量のいかなる変化も簡単かつ迅速に検出できる市販のＥＬ ＩＳＡ試験があることから、好ましいコンストラクトである。しかし、前記の図 １（Ｂ）および図６のコンストラクトでロングターミナルリピートに挟まれたエ レメントを含み、ｍＲＮＡ内の不安定／阻害領域を検出するのに用いることので きる、いかなるコンストラクトも本発明の一部である。 阻害／不安定配列の存在は、当該分野において既に知られているが、遺伝子のコ ード能を変えることなく多重ヌクレオチド置換を施すことにより、これらの配列 をコード領域内に含むｍＲＮＡをコードする遺伝子の発現を増大させる問題に対 する解決法は、今まで開示されていない。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１．　（Ａ）はＨＩＶ−１ゲノムの構造である。ボックスは異なるウィルス遺 伝子を示す。（Ｂ）はｇａｇ発現プラスミドの構造（下記参照）である。プラス ミドｐ１７は完全なＨＩＶ−１　５−ＬＴＲおよびヌクレオチド（ｎｔ）　２　 ５　７にあるＢｓ５ＨＩＩ制限部位までの配列を含む（ヌクレオチドの番号付け は、ＨＩＶ−１分子クローンｐＨＸＢ２の改訂ヌクレオチド配列に関する（Ｇ． マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）ら編、Ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎ ｄ　ＡＩＤＳ．　Ａ　ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ戟@ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｓ　（ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキンコ、１９９１）　 （本明細書中で参考事項に取り入れられている））。この配列の後ろには、ｎｔ ３３６−７３１に渡るｐ１７ｇａｇコード配列（白抜きボックスとして表されて いる）が続いており、さらにその直後には翻訳終止コドンおよびリンカ−配列が 続いている。リンカ−に隣接しているのは、Ｕ５領域のｎｔ８５６１から最後の ヌクレオチドまでのＨＩＶ−１　３−ＵＴＲである。 プラスミドｐ１７Ｒは、加えて、ＲＲＥを囲む３３０ｎｔ　５ｔｙｌ断片（Ｌソ ロミン（Ｓｏｌｏｍｉｎ）ら、Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．　６４：６０１０−６０１７　 （１９９０））　（斑点ボ’ノクスで示されている）をｐ１７ｇａｇコード配列 の３′側に含む。ＲＲＥの後ろには、３−ＵＴＲのＵ５領域のｎｔ８０２１から 最後のヌクレオチドまでのＨＩＭ−１配列が続く。プラスミドｐ１９およびｐ１ ９Ｒは、それぞれ、プラスミドｐ１７およびｐ１７ＲのＨＩＶ−１ｐ１７ｇａｇ コード配列をＲ３Ｖ　ｐ１９ｇａｇコード配列（黒ボックスで示されている）で 置き換えることにより作製された。ブラｘミｔ’ｐ１７Ｍ１２３４は％　ｇａｇ コード領域内に２８のサイレントヌクレオチド置換（ＸＸＸで示されている）が ある以外は、ｐ１７と同一である。波線はプラスミド配列を表す。プラスミドｐ １７Ｍ１２３４　（７３１−１４２４）およびプラスミドｐ３７Ｍ１２３４は、 すぐ後、およびその他の箇所において記載する。 これらのベクターは、特定のヌクレオチド配列がＩＮＳをコードするかを決定す るのに用いることのできるコンストラクトの例示である。この場合、インジケー ター遺伝子（ここではｐ１７ｇａｇ）を含むベクターｐ１７Ｍ１２３４はコント ロールベクターを表し、ベクターｐ１７Ｍ１２３４　（７３１−１４２４）およ びｐ３７Ｍ１２３４は、問題となるヌクレオチド配列（ここではｐ２４ｇａｇコ ード配列）がそれぞれ、インジケーター遺伝子の終止コドンの３′側のベクター に挿入されているか、若しくはインジケーター遺伝子のコード領域にインフレー ムで融合されているベクターを表す。（Ｃ）はｇａｇｌＮｓを同定、およびさら に変異導入するための発現ベクターの構築法である。ｐ１７Ｍ１２３４をベクタ ーとして用いて、改変ｐ１７ｇａｇ遺伝子のコード領域の下流に付加的なＨＩＶ −１ｇａｇ配列が挿入された。ヌクレオチド番号により示された３つの異なる断 片を、以下に記すようにベクターｐ１７Ｍ１２３４に挿入した。プラスミドｐ１ ７Ｍ１２３４　（７３１−１０８１）　、ｐ１７Ｍ１２３４　（７３１−１４２ ４）およびｐ１７Ｍ１２３４　（７３１−２１６５）を作製するために、示され た断片をｐ１７Ｍ１２３４のｐ１７ｇａｇコード配列の終止コドンの３′側に挿 入した。 発現アッセイ（データは示していない）において、ｐ１７Ｍ１２３４　（７３１ −１０８１）およびｐ１７Ｍ１２３４　（７３１−１４２４）が高レベルのｐ１ ７ｇａｇ蛋白質を発現した。対照的に、ｐ１７Ｍ１２３４　（７３１−２１６５ ）はｐ１７ｇａｇ蛋白質を発現せず、このＨＩＶ−１ｇａｇコード領域内に付加 的なＩＮＳが存在することを示している。プラスミドｐ１７Ｍ１２３４　（７３ １−１０８１）ＮＳ、ｐ３７Ｍ１２３４およびｐ５５Ｍ１２３４を作製するため に、改変ｐ１７ｇａｇ遺伝子の末端の終止コドンおよびｐ１７Ｍ１２３４の全て のリンカ−配列をオリゴヌクレオチド部位特異的変異導入により取り除き、得ら れたプラスミドは、ＨＩＶ−１と同様のｇａｇオーブンリーディングフレームを 回復した。発現アッセイ（データは示していない）において、ｐ　３７Ｍ１２３ ４は、ウェスタンプロットおよびＥＬＩＳＡアッセイにより決定したところ、高 いレベルの蛋白質を発現したが、ｐ５５Ｍ１２３４は検出可能なｇａｇ蛋白質を 発現しなかった。以上のことから、ｐ２４領域の３−側の配列の付加は蛋白質発 現の排除をもたらし、ヌクレオチド配列１４２４−２１６５にはＩＮＳが含まれ ることが示された。本実験は、ｐ３７Ｍ１２３４が付加的なＩＮＳを解析するの に適したベクターであることを示した。 図２　種々のベクターからのｇａｇ発現。（Ａ）Ｒｅｖの非存在下（−）若しく は存在下（＋）で、ＨＬ　ｔ　ａ　を細胞をプラスミドｐ１７、ｐ１７Ｒもしく はｐ１７Ｍ１２３４でトランスフェクトした（下記参照）。トランスフェクトし た細胞をヒトＨＩＶ−１患者血清を用いた免疫プロットにより分析した。（Ｂ） Ｒｅｖの非存在下（−）若しくは存在下（＋）で、プラスミドル１９若しくはｐ １９ＲをＨＬｔａｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を ウサギ抗Ｒ３Ｖ　ｐ１９ｇａｇ血清を用いた免疫プロットにより分析した。ＨＩ ＶもしくはＲ３Ｖ蛋白質群は同じゲルにおけるマーカーとして使った。ｐ１７ｇ ａｇおよびｐ１９ｇａｇの位置を右に示す。 図３　ノザンブロノトでのｍＲＮＡ分析。（Ａ）Ｒｅｖの非存在下（−）若しく は存在下（＋）で、ＨＬｔａｔ細胞を示されたプラスミドでトランスフェクトし た。トランスフェクトした細胞から調製した２０μｇの全ＲＮＡを分析した（下 記参照）。（Ｂ）ｐ１９若しくはｐ１９ＲがらのＲＮＡ産生を、Ｒｅｖの非存在 下（−）若しくは存在下（＋）で、同様に分析した。 図４．ＨＩＶ−１ｐ１７ｇａｇ領域のヌクレオチド配列。全ての変異を作製する のに用いられる４つのオリゴヌクレオチド（Ｍｌ−Ｍ４）の位置を下線で示す。 各変異導入オリゴヌクレオチドにより導入されたサイレントヌクレオチド置換を 、コード配列の下に示す。番号付けはウィルスｍＲＮＡのｎｔ　＋１から始まる 。 図５０種々の変異体によるｇａｇ発現。図の上部に示した様々なプラスミドで、 ＨＬｔａｔ細胞をトランスフェクトした。プラスミドｐ１７ＲはＲｅｖの非存在 下（−）若しくは存在下（十）でトランスフェクトしたが、他のプラスミドはＲ ｅＶ非存在下で分析した。ｐ１７ｇａｇ産生を図２に記したような免疫プロット によりアッセイした。 図６．ｇａｇ領域中の付加的なＩＮＳエレメントの同定および排除に使われる発 現ベクター。各ベクターに含まれるｇａｇおよびｐｏｌ領域のヌクレオチドを線 により示す。ｇａｇおよびｐｏｌオリゴヌクレオチドのいくつかの位置を図の上 部に示し、ｐ１７ｇａｇ、ｐ２４ｇａｇ、ｐ１５ｇａｇ、プロテアーゼおよびｐ ６６ｐｏ　ｌ蛋白質のコード領域に関しても同様である。種々のオリゴヌクレオ チドの組み合わせを用いてベクターｐ３７Ｍ１２３４をさらに変異導入した。得 られた変異体の一つは、発現後、高いレベルのｐ２４を与えた。これを配列決定 により分析し、４つの変異オリゴヌクレオチドＭ６ｇａｇ、Ｍ７ｇａｇ、Ｍ８ｇ ａｇおよびｋｉｌＱｇａｇを含むことが分かった。異なるオリゴの組み合わせを 含む他の変異体は、発現の増加を示さず、または部分的な発現増加しか示さなか った。 ｐ５５８Ｍｌ−１０およびｐ５５ＡＭ１−１０はｐ３７Ｍ１　１０Ｄに由来した 。 ｐ　５５　Ｍ　１−１３　Ｐ　Ｏは、オリゴヌクレオチドＭｌ１ｇａｇ、Ｍ１２ ｇａｇＳＭ１３ｇａｇおよびＭＯｐｏｌに含まれる、付加的な変異をｇａｇおよ びｐｏｌ領域に含む。斜線のボックスは変異オリゴヌクレオチドの位置を示し、 丸のついた斜線ボックスはＡＴＴＴＡ配列（ｍＲＮＡの不安定性および／もしく は阻害に寄与する可能性がある）を含む変異領域を示し、そして三角のついた白 抜きのボックスはＡ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ配列（ｍＲＮＡの不安定性および／も しくは阻害に寄与する可能性がある）を含む変異領域を示す。上記のトランスフ ェクンヨン後のヒト細胞におけるｐ２４ｇａｇの典型的な発現レベルは、右に示 す（ｐｇ／ｍｌ）。 図７．ｅｎｖ発現を研究するのに使われる真核細胞発現プラスミド。種々の発現 プラスミドはｐＮＬ１５Ｅ　（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、　６４：５４４８−５４５６（１９９０））に由来する。種々のコンスト ラクトの作製は本文に記載されている。番号付けは訂正されたＨＸＢ２配列（マ イヤーズら、１９９１、上記；ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）ら、ｔｌａｍａｔｏｌ 、Ｂｌｕｔｔｒａｎｓｆｕｓ、　３１：４０４−４０６　（１９８７）　；ラト ナーら、＾ＩＤＳ　Ｒｅｓ、　Ｈ浮香B Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　３：５７−６９　（１９８７）　；ソロミン（Ｓｏ ｌｏｍｉｎ）ら、ＪＪｉｒｏｌ、　６４：６０１０−６０１V （１９９０））に従い、Ｒの最初のヌクレオチドを＋１として始めた。５ｉＳは ５′スプライス部位；３’ＳＳは３′スプライス部位である。 図８．ｅｎｖ発現は機能的なスプライス部位がないとＲｅｖ依存性である。ｒｅ ｖ発現プラスミド（ｐＬ３ｃｒｅｖ）非存在下もしくは存在下で、プラスミドｐ １５ＥＳＤ−およびｐ１５ＥＤｓｓ　（Ｃ）をＨＬｔａｔ細胞にトランスフェク トした。１日後、細胞をＲＮＡおよび蛋白質の分析用に回収した。全ＲＮＡを抽 出しノザンブロノト分析した（Ｂ）。プロットはＨＸＢ２のＸｈｏｌ−８ａｃｌ （ｎｔ８４４３　９１１８）に渡るニックトランスレートプローブでハイブリダ イズした。蛋白質生産は、ウェスタンプロットにより測定し、ＨＩＶ−１患者血 清およびウサギ抗ｇｐ１２０抗体の混合物を用いて細胞関連性Ｅｎｖを検出した （Ａ）。 図９．ｇｐ１２０発現プラスミドからのＥｎｖ産生。示されたプラスミドを２つ のプレート内でＨＬｔａｔ細胞にトランスフェクトした。ｒｅｖ発現プラスミド （ｐＬ３ｓｒｅｖ）を示されたように共トランスフェクトした。１日後、ＲＮＡ および蛋白質の分析用に細胞を回収した。全ＲＮＡを抽出しノザンブロソト分析 した（Ａ）。プロットはｎ　ｔ６１５８−７９２４に渡る二ツクトランスレート プローブを用いてハイブリダイズした。蛋白質生産（Ｂ）は、２００ｍＣ１／ｍ ｌの３５８−ンステインで５時間ラベルした後、免疫沈降により測定し、分泌型 の加工（プロセシング）されたＥｎｖ　（ｇｐ１２０）を検出した。 図１０．ＰＩ９　（ＲＳＶ　ｇａｇ）試験系を用いたｇｐ１２０およびｇｐ４１ 内のＩＮＳエレメントの同定。ｅｎｖ　ＯＲＦを含むエクソン５Ｅの概略構造。 ２９４１部分の種々の断片（ＡからＧ）およびｖｐｕ／ｇｐ１２０部分の断片Ｈ をＰＣＲ増幅し、ＰＩ９のＲＳＶ　ｇａｇ遺伝子の下流に位置する唯一のＥｃｏ Ｒ１部位に挿入した。増幅された断片に含まれる配列の位置は、ＨＸＢ２Ｒ番号 付けの系を用いて右に示す。断片ＡおよびＢは、それぞれ、ｐＮＬ１５Ｅおよび ｐＮＬ１５ＥＤＳＳ　（スプライス受容部位７Ａ、７Ｂおよび７が欠失している ）から同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。それら長さはそれ ぞれ２７６および２３４ヌクレオチドである。断片ＣはｐＮＬ１５ＥＤｓｓがら ３２３ヌクレオチド断片として増幅された。断片Ｆは３６２ヌクレオチドのＨｐ ａ［−Ｋｐｎｌ制限断片である。断片ＥはｐＮＬ１５ＥＤｓｓから６６８ヌクレ オチド断片として増幅され、それ故、ＨＸＢ２のヌクレオチド５５９２にある主 要なスプライスドナーが欠失している。残りの断片は図に示されたようにｐＮＬ １５Ｅから増幅した。ＨＬｔａｔ細胞をこれらのコンストラクトでトランスフェ クトした。１日後、細胞を回収し、ｐ１９ｇａｇ産生を抗Ｒ５ＶＧａｇ抗体を用 いたウェスタンプロット分析により決定した。これらのプラスミドからのＧａｇ の発現をＰＩ９のＧａｇ産生と比較した。ＳＡはスプライス受容部位、ＢはＢａ ｍＨＩ、ＨはＨｐａｌ：ＸはＸｈｏｌ；にはＫｐｎｌである。種々の断片内に含 まれるＩＮＳの下降調節効果を右に示す。 図１１．ｐ３７Ｍ１　１０Ｄ　（変異ＩＮＳ　ｐ３７ｇａｇ発現系）試験系を用 いたｇ　ｐ　］、　２０およびｇｐ４１内のＩＮＳエレメントの同定。ｅｎｖ　 ＯＲＦの概略構造。ｅｎｖの種々の断片（１から７）を図に示されたようにして ＰＣＲ増幅し、ｐ３７Ｍ１−１０Ｄのｐ３７変異ｇａｇ遺伝子の下流に位置する ポリリンカーに挿入した。断片１から６は分子クローンｐＬＷ２．　４　（Ｍ、 ライフ（Ｒｅｉｔｚ）博士から贈られた、ＨＸＢ２Ｈに非常に似ている）から増 幅された。クローンｐＬＷ２．４は、同じＨＩＶ−１株１１１Ｂ　（ＨＸＢ２Ｒ 分子クローンはこれに由来する）に感染した個体からのものてあった。断片７は ｐＮＬ４３がらクローン化した。一貫性と明確性のため、番号付けはＨＸＢ２Ｒ の系に従う。これらのコンストラクトでＨＬｔａｔ細胞をトランスフェクトした 。１日後、細胞を回収し、ｐ２４ｇａｇ生産を抗原捕獲アッセイにより決定した 。これらのプラスミドからのＧａｇの発現を、ｐ３７Ｍ１−１０ＤのＧａｇ産生 と比較した。各断片の下降調節効果を右に示す。 図１２．ｐｏｌ領域のＣＲ３のネガティブ効果の排除。ＨＩＶ−１のヌクレオチ ド３７００−４１９４を示されるようにベクターｐ３７Ｍ１２３４に挿入した。 これによりｇａｇの発現が阻害された。変異オリゴヌクレオチドＭ９ｐｏｌ−Ｍ １２ｐｏｌ　（Ｐ９−ＰＩ３）を用いて、幾つかの変異ＣＲＳクローンを分離し 性格付けした。それらの内の一つ、ｐ３７Ｍ１２３４ＲｃＲ３Ｐ１０＋Ｐ１２ｐ は、図１３に示される変異を含む。本クローンは高いレベルのｇａｇを生産した 。それ故、ｐ３７Ｍ１２３４ＲｃＲ５Ｐ１０＋Ｐ１２ｐにおける変異の組み合わ せはＩＮＳを排除し、一方、ＰＬＯもしくはＰ１２領域のみの変異ではＩＮＳを 排除していなかった。 図１３．ｐｏ　Ｉ領域（ヌクレ：ｔ−１−）’３７００−４１９４）Ｕ７）ＣＲ ３のネガティブ効果を排除する点変異群。ＨＩＶ−１ｐｏｌ　（ヌクレオチド３ ７００−４１９４）のＣＲ３領域内の阻害／不安定エレメントを完全に不活化す ることのできる変異の組み合わせを、配列の下に小文字で示す。これらの変異は 、オリゴヌクレオチドＭ１０ｐｏｌおよびＭ１２ｐｏｌ内に含まれる（表２参照 ）ｏ　Ｍ１２ｐ。 １オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡンークエンスにより決定にたところ、９３７Ｍ １２３４ＲＣＲ３Ｐ１０＋Ｐ１２ｐ　（図１２参胆）には導入されなかった変異 がさらに含まれている。 図１４．効率のよいｇａｇ発現ベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄのプラスミドマツプ およびヌクレオチド配列。（Ａ）ベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄのプラスミドマツ プ。本プラスミドは、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＫｓ（）の骨組み、ｐＮＬ４３ゲ ノムクローンに見られるようなＨＩＶ−１配列の側部のヒトゲノム配列、ＨＩＶ −１ＬＴＲおよびｐ３７ｇａｇ領域（ＰＩ７およびｐ２４）を含む。本文に記載 されているように、ｐ１７領域はオリゴヌクレオチドＭ１からＭ４を用いて変異 導入され、ｐ２４領域はオリゴヌクレオチドＭ６、Ｍ７、Ｍ８およびＭＩＯを用 いて変異導入された。ｐ３７のコード領域の側部には、プロモーターおよびポリ アデニル化ノグナルを提供する５−および３−ＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲがある（矢印 で示されている）。３つの連続した矢印は、それぞれ、ＬＴＲのＵ５、Ｒおよび Ｕ３領域を示す。ＬＴＲの転写される部分は黒で示されている。ｐ２４コード領 域の終りに挿入された翻訳終止コドンは１８１８番に示されている。いくつかの 制限エンドヌクレアーゼ切断部位も示されている。（Ｂ−Ｄ）ｐ３７Ｍ１−ＩＯ Ｄの完全なヌクレオチド配列。ｐ３７ｇａｇ蛋白質のアミノ酸配列をコード領域 の下に示す。略号は上記の通りである。番号付けは５″ＬＴＲの最初のヌクレオ チドから始まる。 ■　発明の実施様式 上記の一般的な解説および下記の詳細な解説は共に、単なる例示および説明であ って、請求の範囲にあるもののみに本発明を制限するものではないことは、理解 されるべきである。本明細書の一部に取り入れられ、かつその一部をなす付属の 図面は、本発明の態様を例示し、解説と合わせて、本発明の詳細な説明するのに 役立っている。 本発明は、（ａ）遺伝子内の阻害／不安定領域を同定し、そして（ｂ）多重点変 異を施すことにより遺伝予肉阻害／不安定領域に変異を導入することによって、 ｍＲＮＡの遺伝予肉阻害／不安定領域を排除する方法を含む。これらの変異は密 集（クラスター）していてもよい。本方法はＩＮＳの正確な位置の同定も、ＩＮ Ｓの機能機構の知識も必要としない。それでも、本明細書中に示される結果から 、ｍＲＮＡ内の複数の領域が安定性および利用性の決定に参与し、これらのエレ メントの多（がＲＮＡ輸送、ターンオーバー、および／もしくは局在のレベルで 作用していると結論することができる。一般的に、変異はｍＲＮＡによりコード されるアミノ酸配列が変化しないようなものであるが、しかし、保存的および非 保存的アミノ酸置換（但し、変異遺伝子によりコードされる蛋白質は、非変異遺 伝子によりコードされる蛋白質と実質的に同様であるもの）も本発明の一部であ る。 改変されるべきヌクレオチドは無作為に選択することができ、唯一要求されるこ とは、蛋白質によりコードされるアミノ酸配列が不変のままであることで：また は、保存および非保存的アミノ酸置換がなされる場合、唯一要求されることは、 変異遺伝子によりコードされる蛋白質が非変異遺伝子によりコードされる蛋白質 と実質的に同様であることである。 ＩＮＳ領域がＡＴ豊富であるか若しくはＧＣ豊富である場合、ＧおよびＣの含量 が約５０％、並びにＡおよびＴの含量が約５０％となるようにＩＮＳを改変する のが望ましい。ＩＮＳ領域が使用頻度の低いコドンを含む場合、使用頻度の高い コドンにＩＮＳを改変するのが望ましい。しかし、場合によっては（例えば、Ａ およびＴの豊富な領域をＧおよびＣの豊富な領域にするために）、使用頻度の高 いコドンを使用頻度の低いコドンに改変することもできる。ＩＮＳ領域が保存さ れたヌクレオチドを含む場合、それらの保存されたヌクレオチドのいくつかを非 保存的なヌクレオチドに改変してもよい。ここで再び、唯一要求されることは、 蛋白質によりコードされるアミノ酸配列が不変のままであることで：または、保 存および非保存的アミノ酸置換がなされる場合、唯一要求されることは、変異遺 伝子によりコードされる蛋白質が非変異遺伝子によりコードされる蛋白質と実質 的に同様であることである。 本明細書中で使われる場合、保存されたヌクレオチドとは、それらのヌクレオチ ドが阻害／不安定決定に関わるシグナルの一部であるという事実を進化的保存が 反映し得るという理由から、ある遺伝子に関して進化的に保存されたヌクレオチ ドを意味する。保存されたヌクレオチドは一般的には、問題となる遺伝子に関し て発表された参考文献から、若しくは当該分野の実践者が利用可能な種々のコン ピュータープログラムを用いることにより決定することができる。 様々な生物に関する使用頻度の低いコドンおよび高いコドンは、Ｔ　マルヤマ（ Ｍａｒｕｙａｍａ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　１４：ｒ１５１−ｒ １９７　（１９８６）およびＳ　アオタ（八ｏｔａ）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ ｓ、　Ｒｅｓ、１６：ｒ３１５−ｒ４０２　（１９８８）に示されているような コドン利用表から、または１９９２年１月２１日に発行されたＧ、　Ｗ、　ｌ’ プツトィールド（Ｉｌａｔｆｉｅｌｄ）らによる”Ｃｏｄｏｎ　Ｐａ１ｒ　Ｕｔ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ”という名称の米国特許第５．　０８２．　７６７号に開示 されているようなコンピュータープログラム（本明細書中で参考事項に取り入れ られている）を用いることにより決定することができる。 一般的に、本発明の方法は以下のように実施する：１、ＩＮＳを含むｍＲＮＡの 同定 特定の蛋白質が作られる割合は、それをコードするｍＲＮＡの細胞質のレベルに 比例するのが普通である。従って、阻害／不安定配列を含むｍＲＮＡをコードす る候補は、そのｍＲＮＡもしくは蛋白質が検出できるほどには発現していないか 、または同じ、若しくは同様の強さのプロモーターの制御下にある対照ｍＲＮＡ もしくは蛋白質の発現レベルと比較して僅かしか発現しないものである。同じ若 しくは同様の強さのプロモーター制御下にある別の遺伝子からの定常状態レベル と比較した時の、見掛けの転写速度（例えば、核ランーオンアッセイにより決定 される）における変化では説明できない、特定のｍＲＮＡの定常状態レベル特表 千７−５０９１２１　（８） （例えばノザンブロツティングにより決定される）における相違は、その遺伝子 が不安定ｍＲＮＡをコードする候補であることを示す。不安定に加えて、若しく は不安定とは別に、細胞質で働く様々な阻害機構により細胞質ｍＲＮＡがあまり 利用されないこともある。これらの効果は、本明細書で「阻害配列」と名付けら れている特定のｍＲＮＡ配列により調節されている可能性がある。 阻害／不安定領域を含むｍＲＮＡ候補には、その発現が厳密に調節される遺伝子 からのｍＲＮＡ　（例えば多くの癌遺伝子、増殖因子遺伝子およびインターロイ キンなどの生物学的応答のモディファイヤーの遺伝子）が含まれる。これらの遺 伝子の多（は、発現が非常に低レベルで、速やかに分解され、そして状況が変化 すると素早（且つ一過的な調整を受ける。ｍＲＮＡ安定性および利用性のレベル における、負の発現調節は幾つかのケースで記録されており、他の多（のケース においてもその存在が提唱されている。ｍＲＮＡの阻害／不安定領域の存在によ る転写後調節に関する証拠がある遺伝子の例としては、顆粒球−単球コロニー刺 激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）　、厚恩遺伝子ｃ−ｍｙｃＳｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｓ　１ｓ Ｓｃ−ｆｏｓ　；インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマＩＦＮ）； インターロイキン（ＩＬＬ、ＩＬ２およびＩＬ３）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）； リンホトキンン（Ｌｙｍ）；　ＩｇＧ１誘導因子（ＩｇＧ　ＩＦ）：顆粒球コロ ニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）　：ｌ−ランスフェリン受容体（ＴｆＲ）；および ガラクトシルトランスフェラーゼ関連蛋白質（ＧＴＡ）をコードする細胞性遺伝 子；ｅｎｖ。 ｇａｇおよびｐｏｌをコードするＨＩＶ−１遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒ ドロゲナーゼ（ｇｎｄ）およびｂｔｕＢをコードする大腸菌遺伝子：並びにＭＡ Ｔα１をコードする酵母遺伝子（上記の“従来の技術”の章における考察を参照 ）が含まれる。ＭＡＴα１酵母遺伝子およびｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌのＨＩ 　Ｖ−１遺伝子の他に、細胞性厚恩遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｆｏｓをコード する遺伝子は、非コード領域内の阻害／不安定領域に関する証拠に加えて、コー ド領域内の阻害／不安定領域に関する証拠がある遺伝子である。コード領域内に 阻害／不安定領域を含むｍＲＮＡをコードする若しくはコードすると思われる遺 伝子は、本発明に特に関連性がある。 不安定な、もしくは殆ど利用されないｍＲＮＡ候補が同定されれば、パルス−チ ェイス実験（即ち、放射性前駆体で新しく合成されたＲＮＡを標識し、ラベルの ない状態で放射性標識されたｍＲＮＡの分解を追跡する）を行うことにより：ま たはｉｎ　ＶｉｔｒＯ転写されたｍＲＮＡを（マイクロインジェクション、リン 酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法もしくは当該分野で知られる他の方法によって ）標的細胞に導入し、その規定されたｍＲＮＡ集団のｉｎ　ｖｉｖｏでの半減期 を追跡することにより；または、誘導することができ、誘導後即座に転写を遮断 するプロモーターから研究対象のｍＲＮＡを発現させ、この短い転写バーストの 間に合成されたｍＲＮＡの半減期を評価することにより；または、薬剤（例、ア クチノマイノンＤ）で転写をブロックし、薬の添加後様々な時点でノザンブロッ ティングもしくはＲＮＡプロテクション（例、Ｓ１ヌクレアーゼ）アンセイによ って特定のｍＲＮＡの崩壊を追うことにより、ｍＲＮＡのｉｎ　ｖｉｖｏでの半 減期（もしくは安定性）を研究することができる。上記決定法の全てに関する方 法はよ（確立されている。例えば、Ｍ、Ｗ　ヘンッ（Ｈｅｎｔｚｅ）ら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ａｃｔａ　１０９０：２８１−２９２　（１９９１）およびそこに記されている 参考文献を参照していただきたい。また例えば、Ｓ　ンユワルツら、Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ、　６６：１５０−１５９　（１９９２）も参照していただきたい。最も 有用な測定法は、可能な全てのＩＮＳ機構を包含することから、蛋白質の生産量 を測ることである。ＩＮＳを含むことが示されている、もしくはＩＮＳを含むと 思われる様々なｍＲＮＡの例は、先に記載されている。これらのｍＲＮＡの中に は、ノザンブロノトによりそのｍＲＮＡレベルを測定すると、３０分未満の半減 期を持つことを示されているものもある（例えば、Ｄ、ウレノユナー（Ｗｒｅｓ ｃｈｎｅｒ）とＧ　レハビ（Ｒｅｃｈａｖｉ）　、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　１７２：３３３−３４０（１９８８）を参照）。 ２　不安定性決定要素の位置決定 不安定な、若しくはあまり利用されないｍＲＮＡが同定されると、次の工程は、 それを担う（ｃｉｓ作用性）ＲＮＡ配列エレメントを調べることである。ｃｉｓ 作用性阻害／不安定領域の位置決定に関する詳細な方法は、上記“従来の技術“ の章に記載されたン考事項の各々に示されており、以下にも考察される。本発明 の例示されたコンストラクトもＩＮＳの位置決定に利用することができる（下記 参照）。特定のｍ　ＲＮ　Ａターンオーバーを担うｃｉｓ作用性配列は、ｍＲＮ Ａ安定性の変化した自然に生じた変異体が時たま同定されることによる以外に、 欠失および点変異導入によって同定することができる。 短（述べると、推定調節配列がｍＲＮＡ安定性制御の賦与に十分であるかを評価 するために、ＩＮＳと思われる領域をコードするＤＮＡ配列をインジケーター（ 若しくはレポーター）遺伝子に融合させ、ハイブリッドｍＲＮＡをコードする遺 伝子を創作する。インジケーター（若しくはレポーター）遺伝子に融合されたＤ ＮＡ配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは合成りＮＡでもよい。“従来の技 術“の章で示された参考文献に記載されたインジケーター（若しくはレポーター ）遺伝子の例には、β−グロビン、ＰＧＫＩおよびＡＣＴＩの遺伝子と同様に、 ネオマイシン、β−ガラクトンダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼ（ＣＡＴ）　、およびルシフェラーゼの遺伝子が含まれる。サムプル ツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ窒奄■ ｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、　ニューヨーク、（１９８９）、１６．５６−１６D６ ７頁を参照していただきたい。インジケーター遺伝子として使うことのできる他 の遺伝子は、本明細書中に開示されている（即ち、ラウス肉腫ウィルスのｇａｇ 遺伝子（阻害／不安定領域を欠いている）並びに、コンストラクトｐ　１７Ｍ１ ２３４、ｐ３７Ｍ１２３４およびＤ３７Ｍ１−１０ＤのＲｅｖ非依存性ＨＩＶ− ＝１ｇａｇ遺伝子（変異導入により阻害／不安定領域を不活化してあり、本発明 の一つの側面を成している））。一般的に、安定な、若しくは比較的高レベルに 発現するｍＲＮＡをコードする、実質的にいかなる遺伝子（そのｍＲＮＡもしく は発現された蛋白質レベルに少しでも減少があれば標準的な方法により検出でき るほど、十分安定な、若しくは十分高レベルに発現されるものとして本明細書中 では定義される）も、インジケーターもしくはレポーター遺伝子として利用する ことができる。もっとも、本明細書中で例示されるコンストラクトｐ３７Ｍ１２ ３４およびｐ３７Ｍ１　１０Ｄが下記の理由から望ましい。これらのコンストラ クトを用いたハイブリッド遺伝子を創作し、これらのコンストラクトからのｍＲ ＮＡおよび蛋白質の発現を試験するのに好適な方法も、以下に示される。 一般的に、インジケーター遺伝子、およびＩＮＳ領域をコードすると思われる配 列に融合されたインジケーター遺伝子から成るハイブリッド遺伝子により生産さ れるｍＲＮＡの安定性および／もしくは利用性は、ｍＲＮＡをクローン化し発現 するのに使われる発現ベクターに適した宿主細胞にハイブリッド遺伝子をトラン スフェクトすることにより試験される。その結果得られるｍＲＮＡのレベルを、 ｍＲＮＡ安定性を決定する標準的な方法、例えばノザンプロット、Ｓ１マツピン グ若しくはＰＣＲ法によって決定し、結果として得られる蛋白質生産レベルを、 ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法および／もしくはウェスタンプロットなどの蛋白質測定 アッセイによって定量する。阻害／不安定領域（複数ある場合は、領域群）は、 コントロールインジケーターｍＲＮＡと比較した場合の蛋白質発現および／もし くはハイブリッドｍＲＮＡの安定性の減少により同定されるだろう。最終的な目 標がコードされる蛋白質の産生を増大させることである場合、蛋白質の産生に使 われるのと同じ宿主細胞においてＩＮＳの同定を実施するのが最も望ましい。 ＩＮＳ配列の同定に使われてきた幾つかの宿生細胞の例としては、哺乳動物体細 胞、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞、酵母および大腸菌が含まれる。例えば、β−グロ ビン遺伝子の３’ｔｌＴＲに推定阻害配列を挿入し、これをマウスもしくはヒト 宿主細胞にトランスフェクトした際に該配列がないと安定なβ−グロビンｍＲＮ Ａが不安定になることから、ＧＭ　Ｃ３Ｆの不安定配列の位置決定をしたＧ、ン ヨ−（Ｓｈａｗ）とＲカーメン（１’：ａｍｅｎ）　、Ｃｅ１ｌ　４６：６５９ −６６７　（１９８６）　（上記）を参照していただきたい。また、ラット繊維 芽細胞に導入されたハイブリッドｃ−ｍｙｃ−不オマインン耐性遺伝子を用いて ｃ−ｍｙｃの阻害／不安定配列の位置決定をした１、レアードーオフリンガ（Ｌ ａｉｒｄ−Ｏｆｆｒｉｎｇａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ９：２３８７−２３９４　（１９９１）　；および、大腸菌に導入されたハイブ リッドｂｔｕＢ−１ａｃＺ遺伝子を用いてｂｔｕＢ遺伝子の阻害／不安定配列の 位置決定をしたＭ、ランノブラン（ｌｕｎｄｉｇｒａｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾８８：１４７９−１４８３　（１９９ １）も参■■■ いただきたい。ＨＩＶ−１の特定の転写産物内の阻害／不安定配列の位置を、そ れがなければ長い寿命を持つようなインジケーター転写産物を不安定化すること によって決定した報告例としては、例えば、Ｍ　エマ−マン（Ｅｎｅｒｍａｎ） 　、Ｃｅ１ｌ　５７：１１５５−１１６５　（１９８９）　（ｅ　ｎ　ｖ遺伝子 の３−ＵＴＲをＨＢＶの一部で置き換え、ＣｏＳ−１細胞に導入した）：Ｓ　ツ ユワルツら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６＋１５０−１５９　（１９９２）（Ｒｅ ｖ非依存性ｔａｔレポーター遺伝子とのｇａｇ遺伝子融合体をＨｅＬａ細胞に導 入した）；Ｆ、フルダレ１バＭａｌｄａｒｅｌｌｉ）ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　 ６５：５７３２−５７４３　（１９９１）（Ｒｅｖ非依存性ｔａｔレポーター遺 伝子もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝 子とのｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子融合体をＨｅＬａおよび５Ｗ４８０細胞に導入した ）、並びにＡ、＝Ｉｙクレーン（Ｃｏｃｈｒａｎｅ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５ ：５３ｔ）３−５３１３（１９９１）　（ＣＡＴ遺伝子もしくはラット　プロイ ンシュリン遺伝子とのｐｏｌ遺伝子融合体をｃｏｓ−ｉおよびＣＨＯ細胞に導入 した）を参照していただきたい。 ｉｎ　ＶｉｔｒＯでｍＲＮＡターンオーバーをアッセイするｉｎ　ｖｉｔｒ。 ｍＲＮＡ分解系（例えば、細胞質粗抽出液）が、現行のｉｎ　ｖｉｖｏ分析を補 い、ｉｎ　ｖｉｖｏ系の制限のい（つかを回避するのに役立つことが予想される 。Ｍ、Ｗヘンツら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ　１０９０： ２８１−２９２　（１９９１）およびそこに示されている参考文献を参照してい ただきたい。また、赤血球ライセードの無細胞系で外来性ｍＲＮＡ安定性を解析 した、Ｄ、ウレシュナーとＧ、レハビ、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１ ７２：３３３−３４０　（１９８８）も参照していただきたい。 本発明の方法では、対象となる遺伝子全体をインジケーターもしくはレポーター 遺伝子に融合させ、その遺伝子が阻害／不安定領域（群）を含むかを決定するた めに、得られたハイブリッドｍＲＮＡに対する効果に関する試験をすることがで きる。対象の遺伝子内のＩＮＳをさらに詳細に位１決定するために、対象の遺伝 子を５′もしくは３′端または両方から逐次的に欠失することによって、対象の 遺伝子の断片を調製することができる。対象となる遺伝子は、当該分野で知られ ている方法（例えば、制限エンドヌクレアーゼなど）によってオーバーラツプす る断片に分離してもよい。例えば、Ｓ、ツユワルツら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６ ６：１５０−１５９（１９９２）を参照していただきたい。遺伝子は約３００か ら２０００ヌクレオチドの長さのオーバーラツプする断片に分離するのが望まし い。２つのタイプのベクターコンストラクトが作製できる。機能発現のために翻 訳される必要のない阻害／不安定領域の検出を可能とするために、対象の遺伝子 （もしくはその断片またはＩＮＳと思われる領域）をインジケーター若しくはレ ポーター遺伝子の終止コドンの下流の３−ＵＴＲに挿入することができるように 、ベクターを構築することができる。これによりＩＮＳを通じた翻訳は行われな い。いくつかの阻害／不安定配列がｍＲＮＡの翻訳後にしか作用しえないという 可能性を試験するために、対象の遺伝子（もしくはその断片またはＩＮＳと思わ れる領域）をインジケーター若しくはレポーター遺伝子のコード領域に挿入する ように、ベクターを構築することができる。本方法により、機能発現に翻訳を必 要とする阻害／不安定領域の検出が可能となるだろう。本ハイブリッドコンスト ラクトを宿主細胞にトランスフェクトし、その結果得られるｍＲＮＡレベルを、 上述のような、および“従来の技術”の章に示された参考文献の大部分に記載さ れているようなｍＲＮＡ安定性を決定する標準法（例えば、ノザンブロソト、Ｓ １７・ノビングもしくはＰＣＲ法）により決定する。また、実験法に関して、サ ムプルツクら、（１９８９）　（上記）も参照していただきたい。このような遺 伝子から生産される蛋白質も、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法およびウェスタンブロン ドなどの、現存のアッセイ（“従来の技術”の意に示された参考文献の大部分に も記載されている）ｔごよって容易に定量される。また、実験法に関して、サム プルツクら、（１９ｇ９）　（上記）も参照していただきたい。阻害／不安定領 域（複数ある場合は領域群）を含む／％イブリッドＤＮＡは、コントロールイン ジケーターｍＲＮＡと比較した際の、蛋白質発現および／もしくはハイブリッド ｍＲＮＡの安定性の減少によって同定されるだろう。 遺伝子の様々な断片を使うことにより、独立に機能する（もしあれば）複数の阻 害／不安定領域の同定が可能となる。一方、オーバーラツプする断片を使うこと により、例えば半分に切断された結果、阻害／不安定領域が同定されなくなる可 能性を低下させる。 本明細書中に記載された図１（Ｂ）および図６に示された例示試験ベクター、例 えば、ベクター１）１７Ｍ１２３４、ｐ３７Ｍ１２３４、ｐ３７Ｍ１−１０Ｄお よびｐ１９を用いて、様々なＲＮＡにおいて、コード領域内にあるＩＮＳを含め て、ＩＮＳの存在および局在に関してアッセイすることができる。これらのベク ターを用いて、まだ調べられていない問題の遺伝子が変異導入回復の候補となる ＩＮＳを持つかどうかを決定することもできる。これらのベクターは、同定され たＩＮＳをその遺伝子のコード能に影響することなく排除する、本発明の変異導 入工程（以下に記載）に同じベクターを使用することができる点で、従来の技術 よりも特に有利である。 これらのベクターを用いる方法は、遺伝子全体、ｃＤＮＡ全体もしくはおよそ３ ００ヌクレオチドからおよそ２キロベースの範囲の遺伝子断片を、唯一の制限酵 素部位（遺伝子工学的にベクターに導入された）を用いてｇａｇのコード領域に ３′側に導入することを伴う。ＨＬｔａｔ細胞のｇａｇ遺伝子発現を、ＲＮＡお よび蛋白質の両方のレベルで測定し、始めのベクターからの発現と比較する。 発現の減少は、変異導入により回復が可能なＩＮＳ候補の存在を示す。図１に例 示されたベクターを用いた方法は、対象となる遺伝子全体および遺伝子断片をベ クターｐ１７Ｍ１２３４、ｐ　３７Ｍ１２３４およびｐ１９に導入することを伴 う。 断片の大きさは３００−２０００ヌクレオチドの長さが望ましい。プラスミドＤ ＮＡは大腸菌内で調製し、ＣｓＣ１法により精製する。 機能発現に翻訳される必要のない阻害／不安定領域の検出を可能にするために、 問題の遺伝子全体および遺伝子断片をベクターｐ１７Ｍ１２３４、ｐ　３７Ｍ１ ２３４もしくはｐ１９のｐ１７ｇａｇコード領域の終止コドンの３′側に導入す る。 翻訳された時にのみ発現に影響を及ぼす阻害／不安定領域が検出できるように、 記載されたベクターを操作して、問題の遺伝子全体もしくは遺伝子断片のコード 領域を、発現されるｇａｇ蛋白質遺伝子に読み枠が合うように融合することがで きる。例えば、問題の遺伝子のコード領域の全て若しくは一部を含む断片を、ベ クターｐ３７Ｍ１２３４のｇａｇコード配列の終止コドンにすぐ３′に挿入する ことができ、ｇａｇの終止コドンおよびリンカ−配列をオリゴヌクレオチド変異 導入により取り除いて、ｇａｇの読み枠が問題の遺伝子の読み枠に融合するよう にすることができる。 次いで、２つの発現ベクター（例、ｇａｇコード領域終止コドンの３′直後に挿 入された問題の遺伝子断片を含むｐ３７Ｍ１２３４　（ｇａｇ終止コドンがその ままである）およびｇａｇコード領域にインフレームに挿入された問題の遺伝子 断片を含むｐ３７Ｍ１２３４　（ｇａｇ終止コドンは欠失されている））からの ＲＮＡおよび蛋白質生産を、精製されたＤＮＡをＨＬｔａｔ細胞にトランスフェ クトした後に比較する。 ヒト細胞へのトランスフェクション後のこれらのベクターの発現をＲＮＡおよび 蛋白質生産の両方のレベルでモニターする。ＲＮＡレベルは、例えば、ノザンプ ロット、Ｓ１マツピングもしくはＰＣＲ法により定量する。蛋白質レベルは、例 えば、ウェスタンプロットもしくはＥＬＩＳＡ法により定量する。ｐ３７Ｍ１２ ３４およびｐ３７Ｍ１−１０Ｄは、ｇａｇ蛋白質の検出に迅速な非放射性ＥＬＩ ＳＡプロトコールが使える（デュポンもしくはコールタ−ｇａｇ抗原捕獲アッセ イ）ので、定量分析には理想的である。ｇａｇ抗原の発現レベルの減少は、対象 のクローン化遺伝子もしくは遺伝子断片内に阻害／不安定領域が存在することを 示す。 阻害／不安定領域が同定されれば、適当なＩＮＳ断片を含むベクターを用いて一 本鎖ＤＮＡを調製し、それから下記のクラスター変異導入プロトコールにおいて 特異的な化学合成オリゴヌクレオチドによる変異導入実験に用いることができる 。 ３　安定なｍＲＮＡを作製するための阻害／不安定領域の変異阻害／不安定配列 がｍＲＮＡのコード領域内に位置決定されると、その遺伝子を改変してこれらの 阻害／不安定配列を、該遺伝子のコード能を変えることな（排除する。また、遺 伝子を改変して阻害／不安定配列を除くと同時に、保存的もしくは非保存的なア ミノ酸置換をコードするように遺伝子のコード能を変える。 本発明の方法において、対象の遺伝子のコード領域にあるＩＮＳを排除するのに 最も一般的な方法は、該遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を変え ることなく、遺伝子もしくは遺伝子断片のＩＮＳ領域に複数の変異を作製するこ とによる。または、保存的および非保存的アミノ酸置換をすべき場合には、唯一 要求されることは、変異遺伝子によりコードされる蛋白質が非変異遺伝子により コードされる蛋白質と実質的に同様であることである。複数ある場合は、阻害／ 不安定領域と思われる部分全てを同時に変異させるのが望ましい。後に、望むな らば、安定なｍＲＮＡを作製するために変異させなければならない遺伝子の最小 領域を決定するために、各阻害／不安定領域を独立に変異導入することができる 。ＤＮＡの長い領域を一斉に変異導入できれば請求める安定および／もしくは発 現の高いｍＲＮＡ並びにその結果生じる蛋白質を生産するのに要する時間および 労力を削減することができる。これらの変異を含む改変された遺伝子もしくは遺 伝子断片を、それから、上記のように、例えば、改変された遺伝子もしくは遺伝 子断片をレポーター若しくはインジケーター遺伝子と融合させ、適当な宿主細胞 にトランスフェクトした後の改変遺伝子により生産されるｍＲＮＡおよび蛋白質 のレベルを分析することによって、通常通りに試験する。改変遺伝子もしくは遺 伝子断片を含むハイブリッド遺伝子により生産されるｍＲＮＡおよび蛋白質のレ ベルが、インジケーター遺伝子のみをコードするコントロールコンストラクトに より生産されるレベルとほぼ等しいならば、ＩＮＳに施された改変によって、阻 害／不安定領域が遺伝子もしくは遺伝子断片から効果的に除かれたことを意味す る。 本発明の方法において、３つ以上の点変異がＩＮＳ領域に導入されるだろう。 所望により、点変異は阻害／不安定領域の少な（とも約１０％のヌクレオチドに 導入されていもよい。これらの点変異は密集していてもよい。改変されるべきヌ クレオチドは無作為に選択することができる（即ち、ＡＴもしくはＧＣ含量、ま たは使用頻度の低い若しくは高いコドンの有無によって選択するのではない）が 、唯一要求されるのは、該蛋白質によりコードされるアミノ酸配列が変わらない ままであること、または、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換がなされる場合 、唯一要求されるのは変異遺伝子によりコードされる蛋白質が非変異遺伝子によ りコードされる蛋白質と実質的に同様であることである。 本発明の方法において、遺伝暗号が縮重している、即ち多くのアミノ酸が複数の コドンによりコードされ得るという事実から、コードされる遺伝子が同じままで あるように遺伝子配列を変異させることができる。セリンに対する塩基暗号は、 例えば、コドンＴＣＴ、ＴＣＧ、ＴＣＣＳＴＣＡ、ＡＧＴおよびＡＣＧ全てがセ リンをコードするように、６重に縮重している。同様に、スレオニンはコドンＡ ＣＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣおよびＡＣＧのいずれか一つによってコードされる。この ように、複数の異なるＤＮＡ配列を利用して特定のアミノ酸の組をコードさせる ことができる。他のアミノ酸をコードするコドンとしては、フェニルアラニンに はＴＴＴおよびＴＴＣ，ロイシンにはＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡ およびＣＴＧ、イソロイシンにはＡＴＴ、ＡＴＣおよびＡＴＡ、メチオニンには ＡＴＧ、バリンにはＧＴＴ、ＧＴＣ，ＧＴＡおよびＧＴＧニブロリンにはＣＣＴ 。 ＣＣＣ５ＣＣＡおよびＣＣＧ、アラニンにはＧＣＵ、ＧＣＣ，ＧＣＡおよびＧＣ Ｇ、チロシンにはＴＡＴおよびＴＡＣ，ヒスチジンにはＣＡＴおよびＣＡＣ；グ ルタミンにはＣＡＡおよびＣＡＧ；アスパラギンにはＡＡＴおよびＡＡＣ；リジ ンにはＡＡＡおよびＡＡＧ　、アスパラギン酸にはＧＡＴおよびＧＡＣ；グルタ ミン酸にはＧＡＡおよびＧＡＧ　ニジスティンにはＴＧＴおよびＴＧＣ；トリプ トファンにはＴＧＧ、アルギニンにはＣＧＴ、ＣＧＣ，ＣＧＡおよびＣＧＧ；並 びにグリノンにはＧＧＵ、ＧＧＣＳＧＧＡおよびＧＧＧがある。コドンを表した 図表（即ち遺伝暗号）は、様々な一般の生物学もしくは生化学の教科書に見るこ とができる。 本発明の方法において、遺伝子の阻害／不安定領域をコードする部分がＡＴに富 んでいる場合、阻害／不安定領域中の大部分もしくは全ての変異においてＡおよ びＴがＧおよびＣヌクレオチドに置き換えられる、即ちＧＣにより富んだ領域に し、一方それでもなお該遺伝子のコード能を維持しておくようにすることが望ま しいが、それが必要条件と考えられるわけではない。遺伝子の阻害／不安定領域 をコードする部分がＧＣに富んでいる場合、阻害／不安定領域中の大部分もしく は全ての変異においてＧおよびＣヌクレオチドがＡおよびＴヌクレオチドに置き 換えられる、即ちＧＣにあまり富まない領域にし、一方それでもなお該遺伝子の コード能を維持しておくようにすることが望ましいが、それが必要条件と考えら れるわけではない。ＩＮＳ領域がＡＴもしくはＧＣに富んでいる場合、該領域が 約５０％のＧＣ含量および約５０％のＡＴ含量を有するように改変されるのが最 も望ましい。阻害／不安定領域若しくは領域群のＡＴ（即ちＡＵ）含量（あるい はまた、ＧＣ含量）は、そのような計算を行うように考案されたコンピューター プログラムを用いることにより計算することができる。本明細書中に例示される 、ＨＩＶ−１ｇａｇの阻害／不安定領域群のＡＴ豊富性を決定するのに使われた 、そうしたプログラムの例は、ＶＡＸのＧＣＧ分析パッケージ（ＧＣＧ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ　Ｐａｃｋａｇｅ）　（ウイスコンンン大学）およびシーンワークパ ッケージ（Ｇｅｎｅ　Ｗｏｒｋｓ　Ｐａｃｋａｇｅ）　（インテリジエネティソ クス）である。 本発明の方法において、ＩＮＳ領域が使用頻度の低いコドンを含む場合、それら のコドンをより使用頻度の高いコドンに改変することが望ましい。しかし、望む なら、（例えばＡＴ−リッチ領域をもつとＧＣ−リッチにするため）使用頻度の 高いコドンをより使用頻度の低いものに改変してもよい。使用頻度の低い、もし くは殆ど使われないコドンをより使用頻度の高いコドンで１換することも望まし いが、それが必要条件と考えられるわけではない。所望により、最も使われない コドン（Ｔ、　フルヤマら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４（付録） ：ｒ１５１−１９７　（１９８６）などにあるような既刊のコドン利用表から同 定される）のみを使用頻度の高いコドンに置換してもよいし、あるいはまた、使 用頻度の低いコドンの大部分もしくは全てを使用頻度の高いコドンに置換しても よい。一般的に、使用するのに好適なコドンの選択は、改変遺伝子が発現される べき宿主細胞のコドン利用に依存する。しかし、より使用頻度の高いコドンから より使用頻度の低いコドンへの置換も、以下の実施例に示されるように、機能的 であることを注目していただきたい。 先に注意したように、コード配列は遺伝暗号をもとに、そして好適には、本発明 の変異遺伝子が発現されるべき宿主細胞もしくは生物における望ましいコドン利 用をもとに選択される。多くのケースにおいて、特定の宿主もしくは発現系に好 適なコドン利用は、利用可能な参考文献（例えば、Ｔ、マルヤマら、Ｎｕｃｌ、 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４（付録）：ｒ１５１−１９７　（１９８６）を参 照）から確かめることができ、または池の方法（例えば、１９９２年１月２１日 に０９児ハツトフィールドらにより発行された、”Ｃｏｄｏｎ　Ｐａ１ｒ　Ｕｔ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ”という名称の米国特許第５，０８２．７６７号（本明細書 に参考事項として取り入れられている）を参照）によって確かめてもよい。最終 的に生産される蛋白質量を増加させるために、ｍＲＮＡ安定性と同様に転写およ び翻訳を最適化するように配列を選択することが望ましい。コドン選択は、従っ て、例えば、宿主細胞の好適なコドン利用および／もしくはめる制限エンドヌク レアーゼ部位を提供する必要に応じてなされ、そして、コードされるｍＲＮＡ転 写産物中の潜在的な二次構造規制を避ける必要に応じても選択がなされる場合が ある。潜在的な二次構造規制は、Ｍ　ズノヵーら、Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓ　Ｒｅ ｓ。 ９・１３３　（１９８１）に記載されたようなコンピュータープログラムを利用 することによって同定することができる。選択された宿主細胞もしくは生物にお ける最適コドン利用に関してコドンの使用頻度が不明もしくは曖昧である状況で は、複数のコード配列を選択することができる。しかし、いずれのコドンの正し い組も、最適効率以下で翻訳されるとしても請求める蛋白質をコードすることに 変わりはない。 本発明の方法において、ＩＮＳ領域が保存されたヌクレオチドを含む場合、阻害 ／不安定領域中の保存ヌクレオチド配列を変異させることも望ましいが、それが 必要条件と考えられるわけではない。所望により、阻害／不安定領域中になされ る変異の最低約７５％が、保存ヌクレオチドの変異を伴うこともある。保存ヌク レオチドは、当該分野の実践者に利用可能な様々なコンピュータープログラムを 用いることにより決定することができる。 本発明の方法において、コードされるアミノ酸が１つ若しくは複数の保存もしく は非保存アミノ酸を含むように変えられるが、それでも機能的に等価な蛋白質を 提供するように、阻害／不安定配列を変異させることが可能であることも予想さ れる。例えば、該配列内の１つもしくは複数のアミノ酸残基を類似の極性を持つ 別のアミノ酸（機能的に等価に働（）で置換し、アミノ酸配列において中立的な 置換をもたらすようにすることができる。該配列内のアミノ酸に対する置換基は 、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば 、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン 、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。 極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン 、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正電荷を持つ（塩基性）アミノ 酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷を持つ（酸性 ）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。 例示の本発明の方法において、約３００ヌクレオチドの領域に渡る４つの異なる オリゴヌクレオチドでのクラスタ一部位特異的変異導入を用いて、安定なｍＲＮ Ａをコードするコンストラクトｐ１７Ｍ１２３４　（下記）を作製することによ り、阻害／不安定活性を持つと思われるＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子中の全ての領域 を、先ず、約２７０ヌクレオチドの長さの部分全体を一度に変異させた。 ４つのオリゴヌクレオチド（図４に示されている）は、Ｍ　ｌ　：　ｃｃａｇｇ ｇｇｇａａａｇａａｇａａｇｔａｃａａｇｃｔａａａｇｃａｃａｔｃｇｔａｔｇ ｇｇｃａａｇｃａｇｇ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）； Ｍ　２　：　ｃｃｔｔｃａｇａｃａｇｇａｔｃａｇａｇｇａｇｃｔｔｃｇａｔｃ ａｃｔａｔａｃａａｃａｃａｇｔａｇｃ　（ＳＥＱ　ＩＤ　mＯニア）　； Ｍ　３　：　ａｃｃｃｔｃｔａｔｔｇｔｇｔｇｃａｃｃａｇｃｇｇａｔｃｇａｇ ａｔｃａａｇｇａｃａｃｃａａｇｇａａｇｃ　（ＳＥＱ　Ｉc　ＮＯ：８）　； および Ｍ４°ｇａｇｃａａａａｃａａｇｔｃｃａａｇａａｇａａｇｇｃｃｃａｇｃａｇ ｇｃａｇｃａｇｃｔｇａｃａｃａｇｇ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎn：９） である。これらのオリゴヌクレオチドは、５１　（ＭＬ）　、４８　（Ｍ２）　 、５０（Ｍ３）および５０（Ｍ４）ヌクレオチドの長さである。各オリゴヌクレ オチドは、１９−２２ヌクレオチドの部分に渡り、いくつかの点変異を導入した く下記参照）。最初の変異ヌクレオチドの５−側にあるヌクレオチド数は、１４ （Ｍｌ）、１８　（Ｍ２）、１７　（Ｍ３）および１１（Ｍ４）であり；最後の 変異ヌクレオチドの３−側にあるヌクレオチド数は、１５　（Ｍｌ）　、８　（ Ｍ２）　、１４　（Ｍ３）および１７（Ｍ４）である。これらの領域の各々に変 異前にあったＡＴ／ＧＣヌクレオチド比は、３３ＡＴ／１８ＧＣ（Ｍｌ）　、３ ０ＡＴ／１８ＧＣ（Ｍ２）、２９ＡＴ／２１ＧＣ（Ｍ３）および２７ＡＴ／２３ ＧＣ（Ｍ４）であった。これらの領域の各々に変異後にあったＡＴ／ＧＣヌクレ オチド比は、２ＳＡＴ／２６０Ｃ（Ｍｌ）　、２４ＡＴ／２４０Ｃ（Ｍ２）　、 ２３ＡＴ／２７０Ｃ（Ｍ３）および２２ＡＴ／２８ＧＣ（Ｍ４）であった。合計 ２６コドンが変えられた。該コドンがヒト遺伝子１０００コドンあたりに出現す る回数は（Ｔ、マルヤマら、Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４（付録）：ｒ１５１−１９７　（１９８６）から） 、コドンの隣の括弧に挙げられている。例えば、リジン（Ｌｙｓ）をコードする ８コドンはａａａ　（２２，０）からａａｇ　（３５，８）に、チロシン（Ｔｙ ｒ）をコードする２コドンはｔａｔ　（１２，４）からｔａｃ　（１８，４）に 、ロイシン（Ｌｅｕ）をコードする２コドンはｔｔａ（５゜９）からｃｔａ（６ ，１）に：ヒスチジン（ｔｌｉｓ）をコードする２コドンはｃａｔ（９８）から ｃａｃ　（１４，３）に、イソロイシン（Ｉｌｅ）をコードする３コドンはａｔ ａ　（５，１）からａｔｃ　（２４，０）に：グルタミン酸（Ｇｌｕ）をコード する２コドンはｇａａ　（２６，８）からｇａｇ　（４１，６）に、アルギニン （Ａｒｇ）をコードする１コドンはａｇａ　（１０，８）からｃｇａ　（５，２ ）に、およびアルギニン（Ａｒｇ）をコードする１コドンはａｇｇ　（１１，４ ）からｃｇｇ（７７）に、アスパラキン（Ａｓｎ）をコードする１コドンはａａ ｔ　（１６，９）からａａｃ　（２３，６）に、グルタミン（Ｇｌｎ）をコード する２コドンはｃａａ（１１゜５）からｃａｇ　（３２，７）に、セリン（Ｓｅ ｔ）をコードする１コドンはａｇｔ（８７）からｔｃｃ　（１８，７）に、そし てアラニン（＾ｌａ）をコードする１コドンはｇｃａ　（１２，７）からｇｃｃ 　（２９，８）に変えられた。 ＤＮＡ分子の構造もしくは配列の改変を起こすのに使われる、オリゴヌクレオチ ドによる部位特異的変異導入の技術は、当該分野の知識を有するものに知られて いる。変異させるべき標的Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくは 合成りＮＡ配列でもよい。一般的に、これらのＤＮＡ配列を適当なベクター、例 えば、バクテリオファー７Ｍ１３ベクターにクローン化し、組み換えバクテリオ ファー７により生じたプラークから１本鎖鋳型ＤＮＡを調製する。１本鎖ＤＮＡ を合成オリゴヌクレオチドにアニールさせ、変異導入および以降の工程を当該分 野でよ（知られた方法により遂行する。例えば、Ｍ、スミス（Ｓｍｉｔｈ）とＳ 、ギルアム（Ｇｉｌｌａｍ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：　Ｐ ｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｒｕｎ　Ｐｒｅ唐刀@３ ：１−３ ２　（１９８１）　（レビュー）およびＴ、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８２：４８ｇ−４９２（１９８ ５）を参照していただきたい。また、サムプルツクら、（１９８９）　（上記） も参照していただきたい。合成オリゴヌクレオチドはＤＮＡ合成機（例、アブラ イドバイオシステムズ：＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成でき、 当該分野で知られている方法により電気泳動により精製できる。本方法に使われ る選択された若しくは調製されたオリゴヌクレオチドの長さは、様々に変えるこ とができる。絶対的なサイズ制限は存在しない。都合の良さから言えば、本発明 のプロセスに利用されるにあたっては、オリゴヌクレオチドの最も短い長さは一 般的には約２０ヌクレオチドで、最も長いものの長さは一般的には約６０から１ ００ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマーのサイズは、変異が導 入されるべき遺伝子の領域へのプライマーの安定なハイブリダイゼーションに対 する必要性、およびオリゴヌクレオチドの合成に関して現在利用可能な方法の限 界によって決定される。オリゴヌクレオチドによる変異導入に使われるオリゴヌ クレオチドを設計するのに考慮される因子（例えば、全体のサイズ、変異の隣接 部のサイズ）は、Ｍ、スミスとＳ、ギルアム、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅ ｒｉｎｇ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ　３：１−３２　（１９８１）に記載されている。一般的に、オリゴ ヌクレオチドの全体の長さは、変異部位での安定かつユニークなハイブリダイゼ ーションを最適化するよう、変異部位から５′および３−側の余剰部分がＤＮＡ ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による変異の修正がなされないほど十分 なサイズを持つようになっているだろう。本発明の変異導入に使われるオリゴヌ クレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、通常約４０から６０ヌクレオチ ドの長さであることが一般的であり、長さにして約１００ヌクレオチドを超えな いのが普通であろう。オリゴヌクレオチドは改変されるコドンの３′側に最低約 ５塩基を含むのが普通であろう。 本発明の好適な変異導入プロトコールにおいて、ＩＮＳを含む発現ベクターには 骨組みとしてＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミドベクターが含まれる。これによリ 、１本鎖ＤＮＡの池に２本鎖も調製が可能となる。ウラシルを含む１本鎖ＤＮＡ は以下の標準プロトコールに従って調製される：該プラスミドをＦ゛細菌株（例 、ＤＨ５αＦ−）に形質転換する。コロニーを繁殖させ、ヘルパーファージＭ１ ３−ＶＣ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　＃２００２５；ｌＸｌ０”ｐｆｕ／ｍｌ） に感染させる。このファージを用いて大腸菌株ＣＪ２３６の培養物に感染させ、 標準的な方法に従って１本鎖ＤＮＡを分離する。Ｑ、２５ｕｇの１本鎖ＤＮＡを 合成オリゴヌクレオチド（各オリゴは５０Ｄ２６゜／ｍｌの濃度に溶解させ、５ ｕｌを用いる）とアニールさせる。合成オリゴヌクレオチドは普通、約４０から ６０ヌクレオチドの長さで、５′および３′の各末端に約１０ヌクレオチドの完 全な塩基マツチを含むように設計される。それらは残りの２０−４０ヌクレオチ ドの中にめるだけの数の変更を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、問題 の領域をカバーするよう設計され、それらは互いに隣り合っていてもよいし、ま たはそれらの間にギャップがあってもよい。１度に６つまで異なるオリゴヌクレ オチドが使われたことがあるが、同時に６つ以上のオリゴヌクレオチドを使用す ることも本発明の方法で実行され得ることが考えられる。アニーリングの後、Ｔ ４ポリメラーゼによる伸長反応により、ウラシルを含まない第２鎖が作られる。 遊離末端はりガーゼにより連結する。これにより、大腸菌株ＨＢＩＯＩに形質転 換するのに使うことのできる２本鎖ＤＮＡが生じる。ウラシルを含まない変異鎖 が２本鎖ＤＮＡを生産し、これに導入された変異が含まれる。個々のコロニーを 取り、配列解析により変異を素早く証明する。別の方法として若しくはさらに、 異なる変異表現型を生じる異なるオリゴヌクレオチドの組み合わせに関する選択 に対して、この変異導入法を用いることができる（実際、用いられた）。これに より、機能に重要な領域の解析が容易になり、ＩＮＳに関与する正確な配列解析 が可能となるので、以下の実験の手助けとなる。本明細書中に記載されたＨＩＶ −１のｌＮ５−１領域の例示された変異導入に加え、本発明は、並んで編成され た３つのオリゴヌクレオチド（合計３５の変異を導入する）を用いて、一工程で １５０ヌクレオチドの領域を変異させるのにも用いられている。変更の上限は明 確ではないが、およそ５００ヌクレオチドの領域を、本プロトコールを用いて一 工程でその２０％のヌクレオチドを変更することができると計算されている。 オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異導入を用いることにより変異させる例 示された方法は、当該分野で知られた他の方法を用いることにより変化させるこ とができる。例えば、重なり合う合成デオキシヌクレオチドを直接用いて（例え ば、エツジ（Ｅｄｇｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９２ニア５６　（１９８１）　； ナンベア（Ｎａｗｂａｉｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：１２９９　（１９８ ４）　；ジエイ（Ｊａｙ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５９：６３１１　（ １９８４）　；またはポリメラーゼ連鎖反応で作製されたＤＮＡもしくはｃＤＮ Ａおよび合成オリゴヌクレオチドを組み合わせて用いることにより、変異遺伝子 を合成することができる ４、変異ｍＲＮＡの安定性の決定 得られた変異ｍＲＮＡの定常状態レベルおよび／もしくは安定性を、阻害／不安 定領域を含む非改変ｍＲＮＡの定常状態レベルおよび／もしくは安定性を試験す るのと同様にして（上記第１章に考察されているように、例えばノザンブロソテ ィングにより）、試験することができる。阻害／不安定領域（群）を含む非改変 ｍＲＮＡおよび望みによっては非改変インジケーターｍＲＮＡと共に（従ってこ れらと比較して）、変異ｍＲＮＡを解析することができる。例示されるように、 トランスフェクション実験において、ノザンプロット分析によって以降のｍＲＮ Ａ解析を行うことにより、ＨＩＶ−１ｐ１７ｇａｇ変異体を非変異ＨＩＶ−１ｐ １７ｇａｇと比較する。これらのｍＲＮＡにより生産される蛋白質は、ＥＬＩＳ Ａなど、当該分野で知られた免疫プロッティングおよび他の方法によって測定す る。下記参照。 Ｖｌ　工業的応用性 本発明の方法により変異導入が可能な遺伝子には、そのｍＲＮＡがその中にＩＮ Ｓ領域を含むことが知られている、若しくは含むと思われるものが含まれている 。これらの遺伝子には、例えば、増殖因子、インターフェロン、インターロイキ ン、ｆｏｓ原癌遺伝子蛋白質、並びに、本明細書中に例示されたものに加え、他 のウィルスｍＲＮＡ以外に、ＨＩＶ−１ｇａｇＳｅｎｖおよびｐｏｌをコードす る遺伝子が含まれる。本発明の方法により変異導入される遺伝子は、天然の宿主 細胞もしくは生物、または異なる細胞若しくは生物において発現させることがで きる。変異遺伝子は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルスもしくはミニ 染色体などのベクターに導入することができ、当該分野でよく知られた方法によ り宿主細胞もしくは生物に挿入することができる。一般的に、変異遺伝子もしく はこれらの変異遺伝子を含むフンストラクトは、哺乳動物細胞（例、ヒト（例、 ＨｅＬａ）、サル（例、Ｃｏ５）、ウサギ（例、ウサギ赤血球）、ラット、ハム スター（例、ＣＨＯおよびベビーハムスター腎細胞）もしくはマウス細胞（例、 Ｌ細胞））、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞（例、大腸菌）を含 め、真核細胞または原核細胞のいずれの細胞にも利用することができる。これら の変異遺伝子のクローン化および／もしくは発現に利用することのできるベクタ ーは、該変異遺伝子が複製され、そして／もしくは発現されて欲しい宿主細胞に おいて、変異遺伝子を複製および／もしくは発現させる能力を持つベクターであ る。様々なタイプの宿生細胞に適したベクターの例としては、例えば、Ｆアウス ベル（＾ｕｓｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ■ ｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−４ｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ　（１９９２）およびサムプルツクら（１９８９）を参照していただき たい。そのような遺伝子の本来のプロモーターを、該遺伝子が挿入される宿主と 両立し得る強力なプロモーターに置き換えることができる。これらのプロモータ ーは誘導性であってもよい。これらの変異遺伝子を含む宿主細胞を用いて、酵素 調製品、医薬品、診断薬、ワクチンおよび治療学に有用な蛋白質を大量に発現さ せることができる。 本発明の方法により改変された遺伝子もしくは該遺伝子を含むコンストラクトは ｉｎ　ｖｉｖｏもしくはｉｎ　ｖｉｔｒｏ遺伝子置換に利用することもてきる。 例えば、阻害／不安定領域を有すｍＲＮＡを生産する遺伝子を、本発明の方法に より改変された遺伝子にそのまま（ｉｎ　５ｉｔｕ）置き換えて、最終的に発現 される生産量を増加させることができる。そのような遺伝子にはウィルス遺伝子 および／もしくは細胞性遺伝子が含まれる。そのような遺伝子置換は、例えば、 ワクチンおよび／もしくは遺伝子治療の開発に有用であろう。 例示された改変ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ遺伝子をコードするコンストラクト を用いることにより作られたコンストラクトおよび／もしくは蛋白質は、例えば 、ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連疾患に対する診断薬、ワクチンおよび治療薬の生 産に利用することができよう。例示されたＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子中の阻害／不 安定エレメントは、宿主における低レベルなウィルス生産状態の確立にも関与し 得る。ＨＩＶ−１および他のレンチウィルス（１ｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、免疫 系により一掃されない慢性的な能動感染を引き起こす。レンチウィルスゲノムか ら阻害／不安定配列エレメントを完全に除（ことにより、構成的な発現がもたら されるであろう。これにより、ウィルスが潜伏感染を確立し免疫系の監視を逃れ るのを防ぐことができる。阻害配列エレメントの排除によりｐ１７ｇａｇの発現 増加に成功することは、いかなるネガティブエレメントも持たないレンチウィル スを生産することができることを示唆する。そのようなレンチウィルスは、弱毒 化されたワクチンに対する新規のアプローチ法を提供し得るだろう。 例えば、高レベルのＧａｇを発現するベクターは、ヒトで発現させた後の免疫療 法および免疫予防に使用することができる。そのようなベクターはレトロウィル スベクターを含み、並びに、例えば、ウォルフら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７＋１ ４６５−１４６８　（１９９０）、ウォルフら、Ｉｌｕｍａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１（６）：３６３−３６９　（１９９２）およびウル ７−（Ｕｌｍｅｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５−１７４９　（１９ ９３）に記載された技術を用いた、ＤＮＡの筋細胞もしくは他の受容細胞への直 接的な注入（ｇａｇの効率的な発現をもたらす）も含む。さらに、ｇａｇコンス トラクトは、ヒトに導入された後のトランス優性なＨＩＶ発現阻害に利用するこ ともできよう。本出願に関して、例えば、高レベルのｐ５５ｇａｇもしくはｐ３ ７ｇａｇを発現する適当なベクターもしくはＤＮＡ分子を改変して、例えば、ツ ロノ（Ｔｒｏｎｏ）ら、Ｃｅ１ｌ　５９：１１３−１２０　（１９８９）に記載 されているような、トランス優性なｇａｇ変異体が作製されるだろう。 該ベクターはヒトに導入され、ｇａｇトランス優性阻害および生産されたｇａｇ 蛋白質による免疫刺激を組み合わせた機構によって、ＨＩＶ産生の阻害をもたら すだろう。加えて、本発明のｇａｇコンストラクトは、レンチウィルスｇａｇ蛋 白質の発現に基づいた、新しいレトロウィルスベクターの作製に利用できよう。 レンチウィルスは、分裂していない細胞を標的とし、効率よく感染することがで きるという独特の性質を持つ。高レベルのｅｎｖを発現するベクターに関して、 同様の応用が予想される。 ＳＩＶ中の同様の阻害／不安定エレメントの同定は、このウィルスがこれらの仮 説の検証に便利なモデルを提供し得ることを示唆する。 例示されたコンストラクトはまた、阻害／不安定領域を含むことが知られている 、もしくはそう思われるいかなるｍＲＮＡ、例えば、本明細書中に例示されたモ ノｌＪ１工ｆｔｈ（７）ウィルスｍＲＮＡ並びに、様々な増殖因子、インターフ ェロンもしくはインターロイキンをコードするｍＲＮＡにおいて、該配列の境界 を簡単かつ迅速に検出および／もしくは更に規定するのにも利用することができ る。 以下の実施例は本発明のある態様を例示するが、しかし、いかなる点においても 本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。ある種の改変およ び多様性は、以前の開示からの教訓および以下の実施例より当該分野の知識を有 するものには明らかであろう。そしてこれらは、本発明の精神および範囲内にあ るものと意図される。 実施例１ ■ＩＶ−Ｉ　ＧＡＧ　遺伝子 ヒト免疫不全症候群ウィルス１型（ＨＩＶ−１）のＲｅｖ制御タンパク質と、Ｒ ｅｖ一応答エレメント（ＲＲＥ）と命名されたそのＲＮ＾標的との相互作用は、 ウィルス構造タンパク質の発現に必要である（レビューとしてＧ、バブラキスと Ｂ、フェルバー（Ｇ、ＰＲＥを含むｍＲＮＡの核からの移行を促進し、その安定 性を増加させることによって作用する。最近の結果ではＲＥＶがこれらのａ＋Ｒ Ｎ＾のポリソームへの効率的な会合に役割を果たすことも示されている（ｓ、ア リゴと工、チェン（ｓ、＾ｒｒｉｇｏ　ａｎｄ　１．　Ｃｈｅｎ）Ｇｅｎｅ　Ｄ ｅｖ、　５：８０８−８１９（１９９１）、　Ｄ、ダゴスティーノら（Ｄ、　Ｄ ’＾ｇｏｓｔｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｍ。 １、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１２：１３７５−１３８６（１９９２））　、　Ｒ ＲＥを含んだＨＩＶ−１のｍＲＮＡは、Ｒｅｖの非存在下ではタンパク質を効率 良く産生できないことから、これらのｍＲＮＡには欠損があり、ＩＮＳ、　ＣＲ ３，またはＩＲと様々な表記がされている阻害／不安定配列が含ま２０７５　（ １９８８）：　Ｍ、　ハッッポロータラダラスら（Ｍ、　Ｈａｄｚｏｐｏｕｌｏ ｕ−Ｃ１ａｄａｒａｓ　ｅｔ　ａｌ、　）Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：　１２６ ５−１２７４（１９８９）；　Ｆ、フルダレリら（ＦｌＭａｌｄａｒｅｌｌｉ　 ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、６５：　５７３２−５７４３（１９８９）：＾ｆ、コクランら（＾ 、　１．　Ｃｏｃｈｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５：　 ５３０５−５３１３（１９９１））　。これらの阻害／不安定配列の性質と機能 に関して、詳細な記述はなされていない。不要のスプライス部位がＲｅｖの機能 に必要ではないかと予想されており（Ｄ、チャンとＰ、シャープ（Ｄ、　Ｃｈａ ｎｇ　ａｎｄ　Ｐ、　５ｈａｒｐ）　Ｃｅ１ｌ　５９ニア８９−７９５（１９８ ９））　、こうしたスプライス部位の存在が、）ＩＩＶ−１ｍＲＮＡをＲｅｖ依 存性としているのかもしれない。 ＨＩＶ−１のハイブリッド構築の解析から、ＩＩＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌ 領域内のある種の阻害／不安定配列について最初の記述がなされた（Ｓ、シュワ ルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａｔ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５：５７３２−５７ ４３（１９９１）＋　Ａ、Ｗ、コクランら（＾、　Ｗ、　Ｃｏｃｈｒａｎｅ　ｅ ｔａ戟A） Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５＋５３０５−５３１３（１９９１））　。ＨＩＶ−１ のｐ１７…マトリックスタンパク質のコーディング領域に位置する阻害／不安定 性ＲＮＡエレメントの同定についても、報告がなされている（Ｓンユワルツら（ Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６＋１５０ −１５９（１９９２））　。この配列をｔａｔ　ｃＤＮ＾に挿入すると、ｃｉｓ に作用してＨＩＶ−１のｔａｔの発現を阻害することが示されている。この阻害 がＲｅｖ−ＲＲＥで抑えられることは、このエレメントがＲｅｖによる制御にお いて役割を果たしていることを示している。 １、　ｐ１７”家発現プラスミド ｐ１７１°１中の阻害／不安定性エレメントをさらに研究するため、ｐ１７０″ 発現プラスミド（ｐ１７図１）を構築した。ｐ１７’″ｇ配列はコーディング配 列の直後に翻訳終止コドンを含むように設計し、そうしてｐ１７ｔ−ｔだけを産 生ずるようにした（このプラスミドの構築は後に記載する）。ＩＩＩＶ−１上の ｇａｇ　ＡＵＧの上流にある主要な５゛スプライス位は、このベクターから欠失 しである（Ｂ、フェルバーら（Ｂ。 Ｆｅ１ｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８飢１４９５−１４９９（１９８９））　。ｐ１Vブラ スミドがＲｅｖとＲＲＥの非存在下でｐ１７１°１を産生できるかどうかを調べ るため、ｐ１７をＨＬｔａｔ細胞に導入した（Ｓシュワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗ ａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、）　１．　Ｖｉｒｏｌ、　６４−２５１９−２５２９（ １９９０））　（以下参照）。コれう（７）細胞１：！Ｈ工ｖ−Ｉ　ＬＴＲブロ モ−９−４７）ｔｒａｎｓの活性化に必要な、ＨＩＶ−Ｉ　Ｔａｔタンパク質を 構成的に産生ずる。ｐ１７ブラスミドをＲｅｖの非存在下または存在下で導入し 、ｐ１７１″ｇの産生をウェスタン免疫プロッティングにより解析した。その結 果、非常に低いレベルのｐ１７ｇ′ｇタンパク質が産生されていることがわかっ た（図２Ａ）。ｇａｇ　ｍＲＮＡにはＲＲＥが含まれないことから予想されると おり、Ｒｅｖの存在はｇａｇの発現を増加させなかった。次にｐ１７’″１コー ディング配列とＲＲＥの両者を含むプラスミド（ｐ１７Ｒ図１）を構築した。ｐ １７と同様にこのプラスミドは、Ｒｅｖの非存在下で非常に低いレベルのｐ１７ 「°１を産生した。だが高レベルのｐ１７ｔ′ｇが、Ｒｅｖの存在下でのみ産生 された（図２＾）。これらの実験は、阻害／不安定性エレメントがｐｌｌｔ−ｔ コーディング配列の中に位置することを示唆した。 様々な真核生物ベクターを用いた発現実験は、いくつかの他のレトロウィルスで は、こうした阻害／不安定配列がそのコーディング配列中に含まれないことをた 結果を確かめるため、ｐ１７ブラスミド上のＨＩＶ−１のｐ１７”’　（マトリ ックス）遺伝子を、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ　５ＳＲ−Ａ系統）の相同タン パク質であるｐｔ９’°１（マトリックス）のコーディング配列と置換した。得 られたプラスミドであるｐ１９（図１）は、ｇａｇコーディング配列以外ｐ１７ ブラスミドと同一であった。ｐ１９プラスミドからのｐ１９１°１の産生をウェ スタン免疫プロッティングにより解析した結果、このプラスミドは高レベルのｐ Ｉｇｔ−ｔタンパク質を産生ずることがわかった（図２Ａ）　。これらの実験は 、ＲＳＶ　（７）Ｉ）１９”″コーディング配列がＨＩＭ−１７７）ｌ）１７” ”とは対照的にこのベクターで効率良く発現されることを明らかにし、ＲＳＶの ｇａｇ領域が阻害／不安定性エレメントを含まないことを示している。ｐ１９プ ラスミドの誘導体としてＲＲＥを含むものも構築し、ｌ＋１９Ｒと命名した（図 １）。興味深いことにＲｅｖの非存在下では、ＲＲＥを含むプラスミドｐ１９Ｒ からは非常に低レベルのｐ１９１１１タンパク質しか産生されなかった。この観 察結果は、導入したＲＲＥと３′■ＩＶ−１配列が働いてｐ１９Ｒプラスミドか らのｐＩｇｔ−ｔの発現に阻害的な効果を及ぼすことを示すものであり、Ｒｅｖ の非存在下でＲＩＩＥを含むウィルスの３′末端のより長い領域が、阻害／不安 定性エレメントとして作用することを示した最近のデータと一致する（Ｇ、ナシ オラス、Ｇバブラキス、Ｂフェルバー（Ｇ、　Ｎａ５ｉｏｕｌａｓ、　Ｇ、　Ｐ ａｖｌａｋｉｓ、　Ｂ、　Ｆｅ１ｂｅｒ）論文準備中）。結論として、同じベク ターでＲＳＶ　ｐ１９”’の高レベルでの発現が見られたことは、ＨＩＶ−１ｐ １７’°１コ　ディング領域内の阻害／不安定配列が極めて低レベルでの発現の 要因であるという結果を支持していると言える。 次にｐ１７１°１のコーディング配列の阻害／不安定性効果が、ｍＲＮＡのレベ ルでも検出されるかどうかを決定した。ｐ１７で形質転換した、またはｐ１７Ｒ で形質転換したＨＬｔａｔ細胞から抽出したＲＮＡのノザンプロット解析の結果 、ｐ１７ＲからはＲｅｖの非存在下ではより低いｍＲＮＡレベルしか産生されな いことが明らかとなった（図３Ａ）（実施例３参照）。Ｒｅｖの共発現後には、 ｐ１７ＲのｍＲＮＡレベルは２から８倍の増加が観察された。ｐ１７ブラスミド の産生するｍＲＮＡレベルは、Ｒｅｖの非存在下でｐ１７Ｒから産生されるｍＲ ＮＡレベルと同じであった。特にＲｅｖは１ｉｌｉＥを含まないＩＩＩＲＮ八と 、そうしたｍＲＮＡから産生されるタンパク質のレベルを減少させた。共発現実 験におけるＲｅｖのこうした阻害効果は、ルシフェラーゼやＣＡＴといった他の ＲＲＥを含まないａ＋ｌｌＮ＾についても観察されている（Ｌ、ソロミンら（Ｌ 、　Ｓｏｌｏｍｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ−旺６０１０−６０１ ７　（１９９０）；Ｄ、Ｍ、ベンフら（１）、　Ｍ、　Ｂｅｎｋｏ　ｅｔ　ａｌ 、　）　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ　２F１ １１１−１１２２　（１９９０））。これらの結果はｇａｇの中の阻害エレメン トがｍＲＮＡレベルにも影響を及ぼすことを確定したものであり、先の知見と一 致するものである（Ｓ。 シュワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｔ、）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　 ６虹１５０−１５９（１９９２））　、　Ｒｅｖの非存在下または存在下でのｐ １７Ｒがら産生されるｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの定量を、試料を適当 に段階希釈して走査型密度測定装置を用いて行い、その結果相違はｍＲＮＡレベ ル（２から８倍）よりもタンパク質のレベル（６０がら１００倍）で顕著である ことが示された。この結果はｇａｇとｅｎｖの両ｍＲＮ＾の局在とポリソームへ の取り込みにＲｅｖが及ぼす効果に関する先の知見と矛盾しない。（Ｓ　アリゴ ら（Ｓ、　入ｒｒｉｇｏ）　Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ、　５三８０８−８１９（１９９ １）；　Ｄ、ダゴスティーノら（Ｄ、　Ｄ’＾ｇｏｓｔｉｎ。 ｅｔ　ａｌ、）　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１２：１３７５−１３８６（ １９９２）；　Ｍ、ｘマー７ンら（Ｍ、　Ｅｍｅｒｍａｎ　■■ ａｌ、）Ｃｅ１１５７：１１５５−１１６５　（１９８９）；　Ｂフェルバーら （Ｂ、　Ｆｅ１ｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　８飢１４９５−１４９９（１９８９）：　１１．７リムら （Ｍ、　Ｍａｌｉｍ　ｅｔ　ａｌ、）　mａｔ ｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３３８：２５４−２５７　（１９８９））　、　Ｒ３ Ｖ　ｇａｇ発現プラスミドがら産生される０ＩＲＮＡのノザンプロット解析の結 果、ｐｌ９は高レベルのｍＲＮＡを産生ずることがわかった（図３Ｂ）。この結 果はさらに、Ｒ３Ｖの９１９ｇ−ｔコーディング配列が阻害エレメントを含まな いことを示している。ｐ１９ＲプラスミドにはＲＲＥと３°Ｉ（ＩＶ−１配列が 存在する結果、Ｒｅｖの非存在下でｍＲＮＡのレベルが低下しているが、このこ とはこの配列中に阻害エレメントが存在することを示唆する。以上を考えあわせ ればこれらの結果は、Ｈｒｖ−１のｇａｇの発現はＲ５Ｖの場合と根本的に異な るということを証明している。Ｒ３Ｖのｐｌｇｇ−＊コーディング配列が阻害配 列を含まないのに対し、Ｈｒｖ−１のｐ１７…コーディング配列は強い阻害エレ メントを含んでいる。興味深いことにプラスミドｐ１９はＲ３Ｖ　ｅｎｖ　ｍＲ ＮＡの生成に用いられる５′スプライス部位を含み、これはｇａｇ　ＡＵＧの下 流に位置する。この５°スプライス部位は、記載された発現ベクターでは利用さ れていない（図３Ｂ）。この５゛スプライス位の不可変のＧＴジヌクレオチドを ３丁に変異させても、ｐ１９ｆ″の発現に顕著な影響を与えなかった（データは 示していない）。一方、［１ＩＶ−Ｌ　ｐ１７発現プラスミドは既知のスプライ ス部位は含んでいないが、Ｒｅｖの非存在下で発現されない。これらの結果はさ らに、不要のスプライス部位以外の配列が、ｇａｇの発現阻害の要因であること を示している。 ２、　変異を導入したｐ１７’−ベクターＨＩＶ−１ｇａｇ中の阻害配列の正確 な性質を調べるため、図４に示すように４種の異なるオリゴヌクレオチドを用い て、り１７’”１　のコーディング配列に部位特異的変異導入を行った。それぞ れのオリゴヌクレオチドは、１９から２２ヌクレオチドの範囲に数箇所の点突然 変異を導入した。これらの変異は沈黙コドン変化（ｓｉｌｅｎｔ　ｃｏｄｏｎ　 ｃｈａｎｇｅｓ）を導入するので、１１７ｇ−ｔタンパク質のアミノ酸配列には 影響しなかった。最初に４種のオリゴヌクレオチドを同時に用いて、記載のとお り一本鎖１）ＮＡを鋳型とした変異導入を行った（Ｔ、クンケル（Ｔ、　Ｋｕｎ ｋｅｌ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：４ ８ｇ−４９２（１９８５）；　Ｓ、シュワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅ ｔ　ａｔ、j Ｍｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　旦２０７−２１９　（１９９２））　、この 結果ｐ１７ベクター中の２７０ヌクレオチドの広い領域にわたって、多数の点変 異を同時に導入することができた。 ４種のオリゴヌクレオチド全ての変異を含んだ変異体を単離し、９１７Ｍ１２３ ４と命名した。ｐｌ７と比較した場合、このプラスミドは高い＾Ｕ含有率の領域 に特に集中する、総数２８個の点変異を含んでいる。ＨＬｔａｔ細胞に形質転換 させた後、ｐｌ７１”（の発現を免疫プロッティングで解析することにより変異 の表現型を評価した。興味深いことに９１７Ｍ１２３４は高レベルのｐ１７１° １タンパク質を産生じ、そのレベルはＲｅｖの存在下でｐｌ？Ｒが産生ずる場合 よりも高かった（図２八）。この結果はプラスミドｐ１７Ｍ１２３４ではｐｌ７ ”’ｍＲＮ＾の阻害／不安定性シグナルが不活化されているがことを示している 。予想されたとおり、Ｒｅｖタンパク質の存在は９１７Ｍ１２３４からの発現を 増加させず、ｇａｇの発現にわずかに阻害効果を及ぼした。このように９１７Ｍ １２３４変異からのｐｌｌｔ−ｔの発現は、Ｒ３Ｖのｐ１９ｔｍｇと同じ一般的 特性、すなわちＲｅｖに依存しない高い構成的レベルのｇａｇの発現を示した。 ノザンプロット解析の結果、９１７Ｍ１２３４から産生されるｍＲＮＡのレベル は、ｐｌ７から産生される場合に比べて増大していることが明らかとなった（図 ３＾）。 最小の阻害／不安定配列の性質と正確な局在をさらに調べるために、ｐｌ？プラ スミド内のｐ１７１′″″コーディング配列への変異導入を、４種の変異オリゴ ヌクレオチドのうちの１つだけを用いて行った。この実験操作の結果４種の変異 プラスミドが作られ、それぞれが含むオリゴヌクレオチドによりｐ１７Ｍ１．　 ｐ１７Ｍ２．　ｐ１７Ｍ３．　ｐ１７Ｍ４と命名した。これらの変異体のいずれ もｐ１７ブラスミドと比較して、顕著に高いレベルのｐ１７１°１タンパク質を 産生ずることはなく（図５）、阻害／不安定性エレメントには影響がないことが 示された。次にｐ１７コーデイング配列に同時に２種のオリゴヌクレオチドで変 異を導入した。この結果得られた変異体をｐ１７Ｍ１２゜ｐ１７Ｍ１３．　ｐ１ ７Ｍ］、４．　ｐ１７Ｍ２３．　ｐ１７Ｍ２４．　ｐ１７Ｍ３４と命名した。こ れらの変異体からのタンパク質産生はｐｌ７からの場合に比べて僅かに増大した が、９１７Ｍ１２３４からの場合よりもかなり低かった（図５）。また３つのオ リゴヌクレオチドを用いた変異であるｐ１７！ｊ１２３も、高レベルのｐ１’ｐ −ｇを発現することはなかった（データは示していない）。これらの知見はｐｌ ７”のコーディング配列に、複合的な阻害／不安定性ノブナルが存在することを 示唆するのかもしれない。あるいは単一の阻害／不安定性エレメントが広い領域 に広がっていて、その不活化には２種以上のオリゴヌクレオチドでの変異導入が 必要なのかもしれない。この可能性はｐｌ７１“１コーディング配列中の２１８ ヌクレオチドの阻害／不安定性エレメントがｇａｇの発現の強い阻害に必要であ るとする先のデータと矛盾しない。この配列をさらに欠失させると徐々に阻害効 果が失われる（Ｓ、ンユワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　） 　ＪＶｉｒｏｌ、　６６：ｌ５Ｏ−１５９（１９９２））　。阻害／不安定性エ レメントはｍＲＮＡ上の特異的な二次構造と一致するのかもしれない。現在特異 的な構造が阻害／不安定性エレメントの機能に重要なのかどうかを調べている。 ｐｌ、７ｔ＝ｔコーディング配列は、Ｒ５Ｖのｐ１９ｆ′ｇコーディング配列と 異なり、高い含有率でＡおよびＵヌクレオチドを含む（Ｓンユワルツら（Ｓ、　 ５ｃｈｖａｒｔｚｅｔ　ａｌ、）ｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　１９９２）　１−３ ７頁）　ａ　ｐ１７＝　コーディング配列には４つの高いＡＵ含有率の領域が存 在し、ｇａｇの発現阻害に関与している（Ｓ、シュワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａ ｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６＋１５０−１５９（１９９ ２））、レンチウィルスは哺乳類のゲノムに比べて、高いＡＵ含有率を持つ。多 様にスプライスされるｍＲＮＡが低い＾Ｕ含有率を持つのに対し、高いＡＵ含有 率の領域がｇａｇ／ｐａｌおよびｅｎｖ領域に見出されること（Ｇ、マイヤース と６．バブラキス（Ｇ、　Ｍｙｅｒｓ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｐａｖｌａｋｉｓ）　Ｊ 、レビー（Ｊ、　Ｌｅｖｙ）編集　Ｔｈｅ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ所収（Ｐ ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、　１９９２）　１−３７ 頁））はA 阻害／不安定性エレメントが高い＾Ｕ含有率のｍＲＮＡ領域と関連しているとい う可能性を支持している。特異的なオリゴヌクレオチド配列であるＡＵＵＵＡは 、いくつかの不安定なｍＲＮＡのＡＵに富んだ３′非翻訳領域に見出されるが、 この配列がＲＮＡを不安定化させることが示されている（ＧシャーとＲ，カメラ （Ｇ、　５ｈａｖ　ａｎｄ　Ｒ，Ｋａｍｅｎ）Ｃｅｌｌ　４凱６５９−６６７（ １９８６））、この配列はｐ１’ｐ−ｇ配列中には存在しないが、ｇａｇ／ｐｏ １およびｅｎｖ領域内に多コピーで見出されている。しかし我々のベクターで強 い阻害／不安定性活性を示したＲＲＥと３°ＨＩＶ配列はＡＵに富んでいないの で、不安定配列とＡＵに富んだ領域との関連は普遍的なものとはいえない。これ らの観察結果は２種以上の型の阻害／不安定配列が存在することを示唆する。Ａ Ｕ含有率を減少させるのに加えて、ｐ１７ブラスミドにいくつか変異を導入して 、ヒト細胞で使用頻度の低いコドンをより頻度の高いコドンに変化させた。頻度 の低いコドンの使用は、ＨＩＶ　ｇａｇの低い発現のもう一つの説明になるが、 Ｒｅｖの存在によりｇａｇの発現の欠損が是正されるので、これらの結果からこ うした型の翻訳制御は考えにくい。さらに非翻訳配列の存在がｇａｇの発現を減 少させた観察結果（たとえばｐ１７Ｒ上のＲＲＥ配列）は、阻害／不安定性領域 の翻訳が阻害に必要ではないことを示唆している。９１７Ｍ１２３４へのＲＩＩ Ｅと３’　ＨＩＶ配列の導入によりｇａｇの発現を減少させることが可能であり 、翻訳と共役して作用するのではない独立した負の因子が、発現の低下の要因と なっていることが確められた。 ３、ｇａｇ遺伝子のｐ２４とｐ１５領域の付加的なＩＮＳ配列の同定と欠失ｐ１ ’ｐ−ｇコーディング領域内のＩＮＳ　（ｐｌ７“′コーディング領域は図１（ Ｂ）上の記載に記されているとおりヌクレオチド３３６−７３１に広がり、図１ （Ａ）と（Ｂ）に示すとおりｇａｇコーディング領域の３つの部分（すなわちｐ ｌ、７．　ｐ２４．　ｐｌ５）のうち最初の部分を含む）の除去が完全なｇａｇ 遺伝子の発現に与える影響を調べるため、ベクターｐ１７Ｍ１２３４上の、変異 により変化させたｐＩ’ｐ−ｇコーディング領域の３′側すなわち終止コドンの 下流にｇａｇ遺伝子の付加的な配列を挿入した発現ベクターを構築した。ｇａｇ の配列を徐々に伸ばした長さで含んだベクター、すなわち図１（Ｃ）に示したｐ １７Ｍ１２３４（７３１−１０８１）、　ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−１４２４ ）、　ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−２１６５）の解■■ 行った。ｐ１７１°１の発現レベルを測定した結果、ｇａｇタンパク質の２番目 の部分をコードする＋！ＲＮ＾領域（すなわち７３１−１４２４ヌクレオチドに 広がるｐ２４　ｇ　−１タンパク質をコードする部分）が弱いＩＮＳのみを含む ことが、ｐ１７Ｍ１２３４により発現されるＩ）１７’°１タンパク質量がｐ１ ７Ｍ１２３４（７３１−１４２４）により発現されるｐｌｌｔ−＊タンパク質量 と比較して少し減少していることから決定されたのに対し、ｇａｇタンパク質の ３番目の部分をコードするｍＲＮＡ領域（すなわちヌクレオチド１４２５−２１ ６５に広がる９１５ｇ−ｇタンパク質をコードする部分）が強いＩＮＳを含むこ とが、ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−２１６５）により発現されるｇａｇタンパク 質量がｐｌ、７Ｍ１２３４とｐ１７Ｍ１２３４（７３１−１４２４）により発現 されるタンパク質量と比較し大きく減少していることから決定された。 ４、　ｐ３７Ｍ１２３４ベクター 上記の解析により、高レベルのｐ３７ｔ−ｇ前駆タンパク質（ｐｌ７””とｐ２ ４　ｇ　−ｇタンパク質領域の両方を含む）を発現するｐ３７Ｍ１２３４ベクタ ーの構築が可能となった。 ベクターｐ３７Ｍ１２３４の構築は、変化させたｐｌ７に−Ｍタンパク質をコー ドする遺伝子の末端の停止コドンを除去し、ｐ２４　ｚ　−ｔタンパク質をコー ドするヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチド変異導入で正しい読み枠に融合し て行った。これによりヌクレオチド配列が回復され、ＨＩＶ−１にコードされて いた時と同様に、融合したｐｌ７””とｐ２４　ｇ　’　＃タンパク質（すなわ ち９３１１ｍタンパク質）をコードするようになった。ｐ３７Ｍａ′または９２ ４ｍタンパク質の存在は、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットにより容易に定 量可能なので、ベクターｐ３７Ｍ１２３４を用いればＩＮＳを含むと疑われる付 加的な配列を挿入し検定することができる。そうした用法の実施例を以下に示す 。 ５、　ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−１０８１）ＮＳおよびｐ５５ＢＭ１２３４ベ クターｐ３７Ｍ１２３４の構築と同様の方法で構築された他のベクターは、ｐ１ ７Ｍ１２３４（７３１−１０８１）ＮＳとｐ５５ＢＭ１２３４　（図１（Ｃ）） である。これら３種のベクターはいずれもｐ１７コーデイング領域の下流の領域 （３°側）の翻訳を可能とするが、それぞれからのｇａｇの発現レベルは、終止 コドンから３°側のヌクレオチド配列を含んだベクター（すなわち上に記載した ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−１０８１）、　ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−１４２ ４）、　ｐ１７Ｍ１２３４（７３１−２１６５））それぞれからのｇａｇの発現 レベルと同じであった。これらの結果はまたｇａｇ遺伝子内のＩＮＳ領域は、翻 訳またはＩＮＳ領域でのその欠失による影響を受けないことを示している。これ らの結果はＨＩＶ−１ｇａｇコーディング領域内（すなわちＨＩＶ−１ｇａｇの １４２４−２１６５をコードする領域の中）の付加的なＩＮＳ配列を検出するた めのｐ１７Ｍ１２３４の用法を示す。したがってこれらの結果はまた、一種また はそれ以上の阻害／不安定性領域を含む遺伝子に変異を導入して、一つの阻害／ 不安定性領域を除去した後、まだその遺伝子内に存在するかもしれない付加的な 阻害／不安定性領域の位置を決定するにはどうすればよいかを示している。 ６、　ｐ３７Ｍ１−１００およびｐｓｓｉｕ−ｔｏベクター上に記載したように 、いくつかの実験からＨＩＶ−１の９１７ｇ−ｇ領域に同定され除去されている ＩＮＳに加えて、ＨＩＭ−１のｐ２４とｐ１５領域の中にＩＮＳの存在が示され ている。これはシュワルツら（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　）　のＪ、　 Ｖｉｒｏｌ、　６６：７１７６−７１８２（１９９２）の７１８０ページの図６ に模式的に描かれている。この図においてｃｇａｇＭ１２３４はｐ５５ＢＭ１２ ３４と同一である。 付加的なｇａｇおよびｐｏｌ配列を含むｐ２４””タンパク質をコードするベク ターでの、ｐ２４　ｆ　−ｇタンパク質の発現の研究から、完全なｇａｇ遺伝子 と部分的なｐｏｌ遺伝子を含んだベクター（たとえばベクター９５５８Ｍ１２３ ４図６参照）は、上に記載のｐｌ７”’中のｌＮ５−１を除去しても高レベルで 発現されないことが見出された。 本発明者らは、これが互いに独立に作用しつる複合的なＩＮＳ領域の存在による ものと仮定した。付加的なＩＮＳを除去するため、数種の変異ＨＩＶ−１オリゴ ヌクレオチドを構築しく表２参照）、様々なｇａｇ発現ベクターに組み込んだ。 たとえばＭ６ｇａｇ、　Ｍ７ｇａｇ、　Ｍ８ｇａｇ、　Ｍｌｏｇａｇの各オリゴ ヌクレオチドをｐ３７Ｍ１２３４に導入してｐ３７Ｍｌ−１００を作製し、また 同じオリゴヌクレオチドをｐ５５ＢＭ１２３４に導入してｐ５５ＢＭ１−１０を 作製した。これらの実験によりｐ３７”’　（ｐ１７’”１とｐ２４　ｇ　−ｉ 前駆タンパク質にあたる）とｐ５５”’　（ＨＩＶ−１により産生されるインタ クトなｇａｇ前駆分子にあたる）の発現は、Ｍ６ｇａｇ、　Ｍ７ｇａｇ、　Ｍ８ ｇａｇ、　Ｍ１０ｇａｇオリゴヌクレオチド（表２に記載）に含まれる付加的な 変異をｐ３７Ｍ１２３４とｐ５５ＢＭ１２３４発現ベクターに導入することで、 劇的に改善されることが明らかとなった。図６は付加的な変異の導入後、発現が 劇的に改善されることを示している。 特に興味深いのは、きわめて高レベルのｇａｇを産生ずるｐ３７Ｍ１−１０Ｄで ある。 これはこれまでにもっとも高レベルのｇａｇ産生構築である（図６参照）。面白 いことに、ｐ５５ＢＭｌ−１０とｐ５５八Ｍへ−１０ベクター（図６）のように ｇａｇおよびｐａｌ配列を付加すると、ｇａｇの発現レベルは減少した。さらに 変異を導入するにつれ、この領域のベクターｐ５５Ｍ１−１３ＰＯに対する阻害 効果は、図６に示すように部分的に消失した。ｇａｇ領域ヌクレオチドであるＭ ｌｏｇａｇ、　Ｍｌｌｇａｇ、　Ｍ１２ｇａｇ、　Ｍ１３ｇａｇとｐａｌ領域ヌ クレオチドであるＭＯｐｏｌにより決定される変異を導入すると、ｇａｇの発現 レベルはｐ５５８Ｍ１−１０などのベクターに対しおよそ６倍に増大する。 ｐ３７Ｍ１−］Ｏｏとｐ５５Ｍｌ−１３ＰＯノＨＩＶ−１プロモ一ターヲヒトサ イトメカロウイルス早Ｍ１ａモーター　（ＣＭＶ）Ｉ：ｆｆｉ換Ｌテしソレソれ ｐｃＭＶ３７Ｍ１−１０ＤとｐｃＭＶ５５Ｍ１−１３ＰＯを作製した。このため ＣＭＶプロモーターを含む断片（＋１を転写開始点としてヌクレオチド−６７０ から＋７３．ホノヤートら（Ｂｏｓｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｃｅ１１．４１ ．５２１　（１９８５）を参照）をＰＣＲ１，より増幅した。コノ断片をｇａｇ ベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄとｐ５５Ｍ１−１３ＰＯの５ｔｕＩ〜Ｂｓ５ＨＩＩ 断片と交換し、ＩＩＩＶ−１プロモーターをＣ１１ｖプロモーターに置換した。 この結果得られたプラスミドでヒト細胞を形質転換後、ＨＩＶ−１プロモーター を含もプラスミドと比較したところ、同様にｇａｇの高発現が得られた。したが ってｇａｇは、他のウィルスタンパク質が全く存在しなくても、高発現すること が可能である。ＨＩＶ−１を他のプロモーターと交換することは、構成的発現が 望ましい際に有利であり、またマウス細胞などのようにＩＩＩＶ−１プロモータ ーが弱い他の哺乳類細胞での発現にも有利である。 構築されたベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄとｐ５５ＢＭ１−１０を用いて、それぞ れｐ３７１“”　、ｐ５５１“１タンパク質をＲｅｖ非依存的に産生させた。ま たこれらのベクターを有用なレポーターとして用いて、異なるＲＮ＾分子の付加 的なＩＮＳの同定と除去を行った。 本明細書に記載された実験操作を用いて、ｇｐ４１　（ＨＩＶ−１ｅｎｖの膜貫 通部分）コーディング領域内とＩ（ＩＶ−１のｅｎｖよりも３゛側に、ＩＮＳを 含む領域を同定した。ＩＮＳをｇａｇ、　ｐａｌ、　ｅｎｖの領域から除去する と、Ｉ（ＩＶ−１のＲｅｖ制御因子の非存在下で本来のＩ（ＩＶ−１構造タンパ ク質の高レベルの発現が可能となる。変異をもったコーディング配列を適当な遺 伝子発現ベクターに組み込むことで、特定の細胞の遺伝子ターゲツティングおよ び／あるいはより効率的な遺伝子発現が可能となる。あるいは変異をもったコー ディング配列を用いて、ｉｌ　ｖｉｔｒｏ　またはｉｎ　ｖｉｖｏのヒトまたは 池の細胞で直接発現させ、高いタンパク質レベルで産生させたり強い免疫応答を 引き起こすことを目指すことができる。いずれの場合にも究極的に目指す点は、 それによりＩＩＩＶの感染と病気から守ることである。 記載された実験は、阻害／不安定配列がＩ（ＩＶ−１の発現を防ぐのに必要であ ることを示している。このウィルス構造タンパク質の発現障害は、Ｒｅｖ−ＲＲ Ｅ相互作用により抑圧することができる。ＩＮＳの非存在下では■ＩＶ−１の発 現はより単純なレトロウィルスに似て、Ｒｅｖを必要としないであろう。したが ってＩＮＳはＲｅｖによる制御に必要な因子である。配列の比較は、実験により 確認されている訳ではないが、ここで同定されたＩＮＳ因子がこれまでに単離さ れた全てのＨＩＶ−１で保存されていることを示唆している。ｇａｇの変異され たヌクレオチドの大部分（２８のうち２２）は、これまでに単離された全てのＦ ＩＩＶ−１で保存されているが、２８のうち２２はＨＩＶ−２でも保存されてい る（Ｇ、　？イヤースら（Ｇ、　Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ）編Ｈｕｍａｎ　ｒｅ ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ＾ＩＤＳ、＾ｃｏｍｐｉｌａｔｊｏｎ　ａｎｄ　 ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ@ａｍｉｎ。 ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｌｏｓ＾ｌａｍｏｓ、　Ｎｅｗ　lｅｘｉｃｏ。 １９９１）を本明細書に参考文献として取り入れた）。何通りかの証拠から、レ ンチウィルスとＨＴＬＶグループなどの池の複合レトロウィルスの全てが、同様 のＩＮＳ制御エレメントを含むことが示されている。強いＩＮＳエレメントがＨ ＴＬＶ−ＩとＳＩＶのｇａｇ領域に同定されている（投稿準備中）。このことは ＩＮＳが重要な制御エレメントであり、複合レトロウィルスの何らかの生物学的 特性の要因であることを示唆する。ＳＩＶとＨＴＬＶ−４にＩＮＳが存在するこ とは、これらの因子が複合レトロウイホス間で保存されていることを示唆する。 ＩＮＳが発現を阻害することから、その存在はウィルスに有利に働くと結論され るはずである。さもなければこうした配列は突然変異で迅速に除去されていたで あろう。 阻害／不安定配列が他のウィルスタンパク質の非存在下で作用し、突然変異の導 入で不活化されうるという観察結果は、これらの因子が、ｍＲＮＡと作用し遺伝 子発現を転写後の段階で阻害するような細胞内因子の結合標的であることを示唆 する。ＨＩＶ−１ｍＲＮＡとそうした因子の相互作用の結果、核に保持されて、 ｍＲＮＡはさらにスプライシングされたり迅速に分解されるのかもしれない。ス プライシング装置の構成要素がＨＩＶ−１＋０ＲＮＡ上のスプライス部位と作用 して、ｍＲＮＡの発現を調節するということが提唱されている（＾、コクランら （＾、　Ｃｏｃｈｒａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。 ６５＋５３０５−５３］３　（１９９１）：　Ｄ、　チャンとＰ、シャープ（Ｄ 、　Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｐ、　５ｈａｒｐ）　Ｃｅ１１５９ニア８９−７９５ 　（１９８９）：　Ｘ　ルら（Ｘ、　Ｌｕ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ`　８７ ：７５９８−７６０２　（１９９０））。しかし本明細書に記載した阻害／不安 定性エレメントが５゛または３′のスプライス部位として機能するとは考えにく い。ＨＩＶ−１のスプライス部位の完全なマツピングが、いくつかの研究室で逆 転写酵素−ＰＣＲ法を用いて行われているが、ｇａｇの中にはいかなるスプライ ス部位も検出されていない（Ｓ、ンユていないｍＲＮＡをスブライスソームから 遊離させる際に作用する（Ｄ、チャンとＰ、シャ９１））という推測は、いかな るレトロウィルスも不要のスプライス部位を含んだｍＲＮＡからしか構造タンパ ク質を産生じない、という知見と容易には一致しない。Ｒｅｖ非存在下でのＨＩ Ｖ−１ｍＲＮＡも含めて、レトロウィルスのｍＲＮＡのスプライシングはすべて 、細胞性のｍＲＮＡのスプライシングと比較して効率が悪い（Ｊ、ケムスら（Ｊ 、　Ｋｊｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃｅ１ｌ　６７：１６９−１７８　（１９ ９１）；＾クライナーら（＾、　Ｋｒａｉｎｅｒ　ｅｔ@ａ トロウィルスの大多数はＲｅｖ様のタンパク質を産生じないが、部分的にスプラ イシングされたｍＲＮＡから効率良くタンパク質を発現することから、不要のス プライス部位による発現阻害はレトロウィルス全般の特性ではないと推測される 。変異を導入して、機能するスプライス部位を欠失させたＨＩＶ−１ｇａｇとｅ ｎｖ　ｍＲＮＡを発現する構築を用いた実験は、Ｒｅｖの非存在下ではこれらの ｍＲＮＡが低レベルでしか蓄積せず、これらの発現がＲｅｖ依存的であることを 示している（Ｍ、エマ−マンらライジングとは独立に作用するという結論（Ｂフ ェルバーら（Ｂ、　Ｆｅ１ｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）以外の阻害／不安定性エレメ ントが存在するという提唱（Ｃ，ローゼンら（Ｃ，Ｒｏｓ９５−１４９９　（１ ９８９））が導かれる。 ｇａｇ発現プラスミドの構築 プラスミドｐ１７ＲはｐＮＬ１７Ｒと記載されてきた（Ｓ、シュワルツら（Ｓ、 　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、）ＪＪｉｒｏｌ、　６６：１５０−１５９（ １９９２））　、プラスミドｐ１７はｐ１７Ｒを制限酵素Ａｓｐ７１８で消化し 、再度ライゲーションすることにより作製した。この操作により３’　ＬＴＲの 上流にあたるヌクレオチド８０２１−８５６１に広がるＲＲＥとＨＩＶ−１配列 が欠失した。ｐ１７１−１の変異体を作製するため、ｐ１７１°１コーディング 配列を修飾したｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に サブクローニングし、ウラシルを含んだ一本鎖ＤＮＡを産生じた。部位特異的変 異導入を記載されたとおり行った（Ｔ、クン変異を含んだクローンは、二重鎖Ｄ ＮＡの塩基配列決定により選択した。ｐ１９Ｒを作製するには、まずプラスミド Ｉ）１７ＲをＢｓ５ＨＩＩとＥｃｏＲＩで消化することによりｐ１７１゜渡のコ ーディング配列全体、すなわちｐ１７１“”　ＡＵＧの６ヌクレオチド上流がら １）１７′“′の終止コドンの３°側のリンカ−配列９ヌクレオチドまでを除い た。ｐ１７Ｒのｐ１７１°１コーディング配列を、ＰＣＲ増幅したＲ３Ｖ　ｐ１ ９”’コーディング配列を含んだＤＮＡ断片で置換した（Ｒワイスら（Ｒ，Ｗｅ ｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ、　）　ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　bｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９３５））　。この断片はＲ５ Ｖ　ｇａｇのＡＵＧの上流８ヌクレオチドとｐｌｐｐ−１コーディング配列およ びそれにすぐに続く翻訳終止コドンを含んでいる。Ｒ８ｖｇａｇ断片は感染性Ｒ ３ＶプロウィルスクローンＳ−Ｒ＾（Ｒ，ワイスら（Ｒｌｅｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ 、　）　ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉ窒浮唐■刀@（Ｃ。 Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８T））に由来 する。ｐ１９はｐ１９Ｒからヌクレオチド８０２１−８５６１１．１広がルＲＲ Ｅ　ト３°ＩＩＩＶ−１配列ヲ含むようなＡｓｐ７１８断片を削除することによ り作製した。 ｇａｇ発現プラスミドによるＩ化ｔａｔ細胞の形質転換ＨＬｔａｔ細胞（Ｓシュ ワルツら（Ｓ、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６ ４：２５１９−２５２９（１９９０））の形質転換は、カルシウム共沈法（Ｆグ ラハムらとＡ、ファンデルニブ１４９５−１４９９　（１９８９））のとおり行 い、５μｇのｐ１７．　ｐ１７Ｒ，ｐ１７Ｍ１２３４．　ｐ１９またはｐ１９Ｒ を２μｇのＲｅｖ発現プラスミドｐＬ３ｃｒｅｖ　（Ｂフェルバーら（Ｂ、　Ｆ ｅ１ｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８６：１４９５−１４９９　（１９８９））の非存在下（−）または存 在下（＋）で用いた。形質転換時のＤＮＡ総量は、ｐＵｃ１９キャリアＤＮＡを 用いて６０ｍｍプレートあたり０５ｍ１中に１７Ｒｇの沈澱物となるよう調整し た。形質転換の２０時間後細胞を集め、細胞抽出物を１２．５％変性ポリアクリ ルアミドゲルで電気泳動にかけ、ヒトＨＩＶ−１患者血清（Ｓｃｒｉｐｐｓ社） またはウサギ抗ｐ１９１°１血清を用いた免疫プロッティングにより解析した。 ｐＲ３ｌｌ−ルンフエラーゼ（Ｊ、デウエットら（Ｊ、　ｄｅ　ｌｅｔ　ｅｔ　 ａｌ、）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７＋７２５−７３７　（１９８ ７））はホタルのルノフエラーゼ遺伝子をＲ３Ｖ　ＬＴＲプロモーターにつない だものを含んでいるが、これを形質転換の効率の対照実験の内部標準として用い 、記載（Ｌ、ソロミンら（Ｌ。 図２に示した。 ノザンブロソト解析 ＨＬｔａｔ細胞を上述の記載どおり形質転換し、形質転換の２０時間後に集めた 。総ＲＮＡをヘパリン／ＤＮａｓｅ法（Ｚ、クラウチソクとＣ０つ（Ｚ、　Ｋｒ ａｖｃｚｙｋ　ａｎｄ　Ｃ，Ｗｕ）＾ｎａ１、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、胆５：２０− ２７　（１９８７））により調製し、総ＲＮ＾の２０Ｒｇについて記載されたと おり（Ｍハソツポロークラグラスら（Ｍ、　ｔｌａｄｚｏｐｏ耐ｏｕ−Ｃ１ａｄ ａｒａｓ　ｅｔ　ａｌ、　）Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、　６３：１２６５−１２７４（１９８９））ノザンプロット解析を 行った。フィルターは、ＩＩＩＶ−１３’　ＬＴＲ６Ｄヌクレ：ｔチ）’８３０ ４−９００８１．４カ６ＤＮＡ　断片ヲＰＣＲ増幅Ｌ、−１−ツク翻訳したもの に対しハイブリダイゼーションさせた。結果は図３に示した。 実施例２ ＨＩＶ−ＩＥＮＶ遺伝子 ｅｎｖ遺伝子断片をベクターｐ１９あるいはｐ３７Ｍ１２３４に挿入し、得られ たプラスミドの発現をＨＬｔａｔ細胞に形質転換することによって分析した。 い（？かの断片はたんばく質発現を阻害することが見いだされた。同定された強 力なＩＮＳのうち１つはヌクレオチド８２０６−８５６１（”断片［８２０６− ８５６１１”）を含んでいる断片中にある。このＩＮＳを除去するために以下の オリゴヌクレオチドが合成され、上述に特定したような突然変異導入実験に使用 した。断片はＨＸＢ２とほとんど同一の分子クローンｐＮＬ４３由来である。本 付けに従う。合成オリゴヌクレオチドはｐＮＬ４３配列に従う。 断片［８２０６−８５６１］への突然変異導入に使用し、ヌクレオチド８２１゜ −８５５５間のｅｎｖコード領域中に変異を加えたオリゴヌクレオチド（小文字 は突然変異を導入したヌクレオチドを示す）は：＃１： ＃２ ＃３ ＃４ ＃５ ＃６ ＧＣＴＡＧＡＡＧＣＡＣＡｇＧＡａＧＡａＧＡｇＧＡａＧＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣ ＣＧＴｔＡＣＣα：ＴＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴｒＡＡＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： 　１ｓ＋ｍＲＮＡおよびタンパク質両方の分析によって決定されたように、断片 ［８２０６−８５６１］中のＩＮＳを除去することによってｅｎｖの発現が増加 した。 ＨＩＶ−１ｅｎｖ中のＩＮＳをさらに詳細に特徴付けるために、ｅｎｖコード領 域を適切な合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＨによって作成した異なる断片 に分離して、ベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄにクローン化した。このベクターは上 述したようにさらに突然変異を導入することによってＩ）　３７Ｍ１２３４より 作成した。ヒト細胞に導入した後、ベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄは高レベルでｐ ３７１°１タンパク質を生産した。どんな強力なＩＮＳ要素をこのベクターに組 換えてもｇａｇ発現を阻害しない。使用したｅｎｖ断片のまとめは図１１に示す 。この実験の結果は、ＨＩＶ−１ｇａｇのように、ＨＩＶ−１ｅｎｖ中に発現を 抑制する多くの領域が存在し、このような領域が組合さることで相加的あるいは 合成的な抑制が生じる。例えば、断片１．２、あるいは３は個々には発現を２− ６倍抑制するが、これらの断片を組み合わせると発現を３０倍抑制する。これら の結果に基づいてさらなる突然変異を導入したオリゴヌクレオチドがｅｎｖ　Ｉ ＮＳの抑制のために合成された。これらのオリゴヌクレオチドは以下に詳細に記 述するように、Ｒｅｖ非依存性ＨＩＶ−１ｅｎｖ発現プラスミドの改良のために ＨＩｖ−１ｅｎｖのための発現ベクターｐ１２０ｐＡおよびｐ１２０Ｒ２７０（ 図７参照）に導入された。 １、ｇｐ１６０および細胞外領域（ｇｐ１２０）に対するｍＲＮＡが欠如してい て、その発現はンスにＲＲＥ、トランスにＲｅｖの存在に依存するＬ　Ｉ　ＨＩ ＶのｅｎｖｍＲＮＡ発現の正及び負の決定因子ｅｎｖを発現するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ の同定及び特徴付けのこれまでの実験によりＥｎｖはエキソン４ＡＥ、、４８Ｅ 、あるいは５Ｅを含むｍＲＮＡより生産されることが実証された（Ｓｃｈｗａｒ ｔｚら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：５４４８　５４５６　（１９９０）；Ｓｃｈ ｗａｒｔｚら　、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１２：２０７−２１９　（１９ ９２））。ｅ　ｎ　ｖの発現を決定するために作成したすべての構築物はｐＮＬ １５Ｅ由来である。このプラスミドはＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲプロそ一夕一、全長の ｅｎｖ　ｃＤＮＡ１５Ｅおよびポリアデニル化シグナルのあるＨ１〜ｒ３’　Ｌ ＴＲを含む（Ｓｃｈｗａ　ｒ　ｔ　ｚ、ら　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：５４４８− ５４５６　（１９９０））（図７）。ｐＮＬ１５Ｅは分子クローンｐＮＬ４−３ 由来で（ｐＮＬ４−３は本明細書中のｐＮＬ４３と同一である）（Ａｄａｃｈｉ ら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５９＋２８４−２９１　（１９８６）、ｔｅｖ　ｍＲＮ Ａを生じるのに使用されるエキソン６Ｄのスプライス受容部位を欠いている（Ｂ ｅｎｋｏら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：２５０５−２５１８　（１９９０））。 Ｅｎｖ発現プラスミドをＲｅｖ発現プラスミドｐＬ３ｃｒｅｖ　（Ｆｅｌｂｅｒ ら。 、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：３７３４−３７４１　（１９９１））の存在下あるい は非存在下にて構成的にＴａｔを発現している（Ｔａｔｌエキソン）ＨＬｔａｔ 細胞（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：２５１９−２５２９　（ １９９０））に形質転換した。１日後、細胞をＲＮＡおよびタンパク質を分析す るために集菌した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンプロット分析した。タンパク質 産物は細胞と結合したＥｎｖを検出するためにウェスタンプロットによって測定 した。 Ｒｅｖが存在しないと、ＮＬ１５Ｅ　ｍＲＮＡは効率的にスプライスされて、Ｎ ｅｆを産生し；Ｒｅｖが存在すると、はとんどのＲＮＡはスプライスされないま まで、前駆体の分泌部分であるｇｐ１２０およびｇｐ４１に加工されるＥｎｖ前 駆体ｇｐ１６０を生産する。 ＩＮＳの効果をスプライシングと区別して別々に研究するために、使用したいく つかの断片内に存在する既知のスプライス部位を以下に論じたように除去した。 生産されるｍＲＮＡの大きさの決定を含めた生じた発現ベクターの分析により、 スプライシングはデータの解釈に影響を与えないということが実証された。 １．２Ｅｎｖ発現は機能的なスプライス部位がなくてもＲｅｖ依存性である ｅｎｖ発現におけるスプライシングの影響を研究するために、ｎｔ５５９２のス プライス供与体を部位特異的突然変異導入によって（ＧＣＡＧＴＡをＧａＡｔＴ ｃに変化させ、ＥｃｏＲＩ部位を導入した）除去し、その結果プラスミド１５Ｅ ＳＤを作成した（図７）。この構築物からのｍＲＮＡは効率的にスプライスされ て、Ｎｅｆをコードする小さなｍＲＮＡを生産した（図８）。配列分析によって スプライスされたｍＲＮＡはｎｔ５６０５　（ＴＡＣＡＴｇｔａａｔｇ）に位置 する別のスプライス供与体およびｎｔ７９２５の共通のスプライス受容位の利用 によって生じたということが明らかになった。発表された仕事とは反して（Ｌｕ ら、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ８７　：　７５９ ８−７６０２（１９９０））　、この変異体からのＥｎｖ発現はＲｅｖに依存し た。次に、スプライス受容位をｎｔ７９２５に突然変異を導入した。先のｃＤＮ Ａクローニングによりｎｔ７９２５のスプライス受容位に加えて、ｎｔ７８９７ およびｎｔ７９０１　（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６４：２５１ ９−２５２９（１９９０））の２つのさらなるスプライス受容位があることが明 らかにされたので、ｎ　ｔ　７８８４からｎｔ７９２６に広がる４３ｂｐの領域 を除去した。これでｐ１５ＥＤＳＳが生じた（図７）。この構築物で形質転換し たＨＬｔａｔ細胞からのｍＲＮＡをノーザンプロット分析したところ、１５ＥＤ ＳＳｍＲＮＡはスプライスされないことが確証された（図８Ｂ）。すべての機能 的なスプライス部位をｐ１５ＥＤｓｓから除去したにもがかわらず、ＲｅｖはＥ ｎｖ産物にいまだ必要である（図８Ａ）。ｇａｇ発現の研究により得られたデー タと併せると、これらの結果は非効率的に使用されるスプライス部位の存在はＲ ｅｖ依存的Ｅｎｖ発現の第一決定因子ではないことが示唆される。少なくとも２ つの使用されないスプライス部位がこのｍＲＮＡ中に存在することが知られてい る（ｎｔ５６０５の選択的スプライス供与体およびｎｔ６２６９エキソン６Ｄの スプライス受容位）。それゆえ、スプライソングを遂行しない初期のスブライリ ゾーム形成がおこりつる可能性は除外できない。これはｍＲＮＡが核の中にとど まるのに十分で、スプライソングが起こらないためｍＲＮＡの分解を導（可能性 がある。あるいは、ｇａｇ／ｐｏｌ領域内の同定されたちの（ＩＮＳ）と同様の スプライス部位非依存性ＲＮＡ要素がＲｅｖ依存性に重要である可能性がある（ Ｓｃｈｗａ　ｒ　ｔ　ｚら、。 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６６：７１７６−７１８２（１９９２）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら 　。 Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．６６　：１５０−１５９（１９９２））。 １．３　ｇｐ１２ｏｍＲＮＡ内の負因子の同定これらの可能性を区別するために 、このようなＩＮＳ要素の位置を決定できるように様々な構築物を設計した。ま ず始めにＮｒｕ　ＩおよびＭｌ　ｕ　Ｉの制限酵素部位を伴う停止コドンをプラ スミドＮＬ１５ＥＤＳＳ上のｎｔ７３０１の細胞外ｇｐ１２０および膜貫通タン パク質ｇｐ４１のあいだの切断部位に導入し、ｐ１２０ＤＳＳ　（図７）を作成 した。ｐ１２０Ｄｓｓで形質転換した細胞の培地からのｇｐ１２０の免疫沈降に よりＲｅｖ存在下でのみｇｐ１２０が高レベルで生産されることを確証した（図 ９Ｂ）。細胞に付着して残っている量はごくわずかに検出できる程度なので、ｇ ｐ１２０の放出はとても効率的である（データは示さない）。この発見により、 ｅｎｖ　ｃＤＮＡのｇｐ４１部分の翻訳はｅｎｖ発現の失陥に関与する可能性が 否定される。次に、ｇｐ１２０の３′領域の終止コドン（ＲＲＥおよび３°　Ｌ ＴＲを含むｇｐ４１を含む）をＳＶ４０ポリアデニル化シグナルで（図７）置き 換えた。この構築物ｐ１２０ｐＡは、Ｒｅｖ非存在下でｇｐ１２０をとても低い レベルで生産した（図９Ｂ）。Ｅｎｖの背景のレベルはＲＲＥを含むｇｐ４１の ５°部分（Ｍｌｕｌからｎｔ８２００のＨｐａｌ）（図９Ｂ）を除去することに よってｐＢｓ１２０Ｄｓｓから作成したｐ１２０ＤＲ（図７）より測定した。こ れらの結果はｇｐ１２０部位内に主要なＩＮＳ様配列が存在することを示す。こ のｍＲＮＡに対するＲｅｖの効果を研究するために、異なるＲＲＥ　（ＲＲＥ３ ３０．ＲＲＥ２７０．およびＲＲＥＤ３４５　（Ｓｏｌ’。 ｍｉ　ｎら、、Ｊ、Ｖｉ　ｒ　ｉ　１．６４　＋　６０１０−６０１７（１９９ ０））をｐ１２０ｐＡのｇｐ１２０終止コドンの下流に挿入してそれぞれｐ１２ ０Ｒ３３０，ｐ１２ＯＲ２７０，およびｐ１２０ＲＤ３４５を作成した（図７） 。免疫沈降により、トランスにＲｅｖおよびンスにＲＲＥが存在するとｇｐ１２ ０を発現するプラスミドの欠損を補うことができることが示された。高レベルの ｇｐ１２０がＲｅｖ存在下でｐ１２０Ｒ３３０（データは示さない）　、ｐ１２ ０Ｒ２７０，およびｐ１２０ＲＤ３４５　（図９Ｂ）より生産された。 ノーザンブロソト解析により（図８Ａ）タンパク質におけるデータが確証された 。Ｒｅｖが存在するとｐＢｓ１２０Ｄｓｓ、ｐ１２０Ｒ２７０，およびｐ１２０ ＲＤ３４５によって生産された高レベルのｍＲＮＡが蓄積した。低いが検出でき る程度のＲＮＡはｐ１２０ＤｐＡおよびｐ１２０ＤＲより生産された。 ２．２つの戦略を用いたｅｎｖｍＲＮＡ領域内に位置するＩＮＳ要素の同定ｉｎ 　ｖｉｖｏで抑制制御効果を持つ要素を同定するために、ｅｎｖ　ｃＤＮＡ断片 を２つの異なる試験発現ベクターｐ１９およびｐ３７Ｍ１−１０Ｄに挿入した。 これらのベクターは、遺伝子産物の迅速な検出のための強力なプロモーター（例 えば、Ｔａｔ存在下のＨＩＶ−ＩＬＴＲ）および高レベルで発現して、測定が容 易である指標遺伝子（例えば、どちらも既知のＩＮＳ様要素を含んでいないＲＳ Ｖのｐ１９１°１あるいはＨＩＶ−１（ｐ３７Ｍ１−１０Ｄ）の突然変異の入っ たｐ３７”’遺伝子）を含む。発現ベクターｐ１９はＨｌｖ−ＩＬＴＲプロモー ター、Ｒ３Ｖｐ１９”’基質遺伝子、および完全な３’　ＬＴＲを含むＫｐｎＩ （ｎｔ８５６１）で始まるＨＩＶ−１配列（Ｓ　ｃ　ｈｗａ　ｒ　ｔ　ｚ、ら、 、Ｊ、Ｖｉｒｏｔ、６６：７１７６−７１８２（１９９２））を含む。ＨＬｔａ ｔ細胞に形質転換すると高レベルのｐ１９ｇａｇが構成的に生産され、ウェスタ ンプロットで視覚化された。発現ベクターｐ３７Ｍ１−１０ＤはＨＩＶ−ＩＬＴ Ｒプロモーター、突然変異の入ったｐ３７ｇａｇ　（Ｍｌ　１０）　、およびＫ ｐｎＩ　（ｎｔ８５６１）で始まるウィルスの３°部分を含む。ＨＬｔａｔ細胞 に形質転換するとこのプラスミドはＨＩＶ−１ｐ２４’°１抗原捕捉測定によっ て定量できるｐ３７１°１を構成的に生産する。 ２、Ｉ　ＲＳＶ　ｇａｇ発現ベクターを用いたＩＮＳ要素の同定ｇｐ４１および ｇｐ１２０部分内のＩＮＳ要素が同定された。この末端にベクターｐ１９が使用 され、以下の断片（図１０）が挿入された　（Ａ）ｎｔ７６８．４から７９５９ ：　（Ｂ）ｎｔ７６８４から７８８４およびｎｔ７９２７から７９５９、これは 断片Ａと同様であるがスプライス受容部位７Ａ、７Ｂおよび７の領域が欠失して いる；　（Ｃ）ｎｔ７５９５から７８８４およびｎｔ７９２７から７９５９でＢ のようにスプライス部位が欠失している；　（Ｄ）ｎｔ７９３９から８０６６： 　（Ｅ）ｎｔ７９３９から８４１６　；　（Ｆ）ｎｔ８２００から８５６１（Ｈ ｐａ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ）：　（Ｇ）もとのままのＲＲＥを含むｎｔ７２６６から ７５９５　；　（Ｈ）　スプライス供与部位ＳＤ５が欠失しているｎｔ５５２３ から６１断片Ａ、Ｂ、およびＤはＧａｇ発現に影響をおよぼさなかったが、断片 Ｇ（ＲＲＥ）はｇａｇ発現が約５倍減少した。断片Ｃ，Ｅ、およびＨはＧａｇ発 現を約１０−２０倍下げ、ＩＮＳ要素の存在を示唆した。 興味深いことに、プラスミドル１９中の３５０ｂｐにおよぶ断片Ｆの挿入はＧａ ｇ生産を阻害することが観察され、この要素内の強力なＩＮＳの存在を示唆した 。ンスにＲＲＥおよびトランスにＲｅｖが存在することはＲＳＶｐ１９””の高 レベルの生産を生じる。断片ＦはまたＨＩＶ−１（ｐ１７Ｍ１２３４）のＩＮＳ を修正した（ＩＮＳ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ｐ１７”’の発現にわずかに抑制制 御効果を持つ。これらの実験によりｐ１９””発現を阻害するｅｎｖ　ｍＲＮＡ 内に位置する多くの要素の存在が明らかになった。 ２．２　断片Ｆ内のＩＮＳの除去 Ｅｎｖのアミノ酸組成に影響を与えずにこの３３０ｎｔ領域内に１０３の点突然 変異を導入した６つの合成オリゴヌクレオチド（表３）を作成した。ＩＮＳ要素 が破壊されたことを証明するために、変異を導入した断片Ｆをｐ１９で試験した 。オリゴ＃１内への変異の導入はｐ１９”１発現に影響を与えるには不十分だっ た一方、すべてのオリゴ（＃１から＃６）が存在すると断片ＦのＩＮＳ効果を完 全に不活性化した。これは、ＩＮＳ効果を除去するためにはＩＮＳ要素内の１つ 以上の領域を突然変異を導入する必要があるという別の例である。 このＩＮＳ要素がｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆのような多重にスプライスされた Ｒｅｖ非依存性ｍＲＮＡすべてに存在することは注目に値する。ｔａｔｃＤＮＡ からこの断片を除去することによって小さなｍＲＮＡ内の断片Ｆの機能を決定す るための実験を行った。このｍＲＮＡに関連して、この要素は弱いＩＮＳ効果（ ３−５倍の阻害）しか与えないことから、ｅｎｖ　ｍＲＮＡ中の発現阻害は少な （とも２つの離れた要素の存在が必要であることが示唆される。これらの結果は ｅｎｖ内のＩＮＳ効果は多くの相互作用する成分に基づくということが示唆され る。あるいは、多様なＩＮＳ成分間の相対的な位置および相互作用がＩＮＳ効果 の大きさに重要であるかも知れない。それゆえ、異なるベクター中の１つ以上の 型の解析がＩＮＳの同定及び除去に必要であるかも知れない。 ２．３　ｐ３７Ｍ１−１０Ｄ発現ベクターを用いたＩＮＳ要素の同定ｅｎｖコー ド領域を異なる連続した断片に分離した。これらの断片およびそれらの組合せを 図１１に示したようなオリゴを用いてＰＣＲで増幅し、ｐ３７Ｍ１−１０Ｄ中の 突然変異の導入されたｐ３７　”’遺伝子の下流に挿入した。プラスミドをＨＬ 　ｔ　ａ　を細胞に形質転換し、翌日に集菌してｐ２４１°１発現を解析した。 図１１は、１＋２＋３の組合せおよび断片２．３．５の存在は実質的にｇａｇ発 現を低下させることを示す。Ｅｎｖのアミノ酸組成を変化させずにヌクレオチド を変化させることによってｅｎｖコード領域内に位置する３つのＡＡＴＡＡＡ要 素を含むＡＴリッチなドメインを変化させる異なるオリゴ（表４）を合成した。 第一のアプローチで、これらのオリゴ１−１９を停止点とともにプラスミドル１ ２ＯＲ２フ０中に導入し、あるいはＲｅｖ非依存的な方法でｇｐ１２０を生産す る。それからオリゴ２０−２６のようなオリゴヌクレオチドを２つのｅｎｖ部位 が結合したｇｐ４１部位に導入し、完全なｇｐ１６０はＲｅｖ非依存的な方法で 発現する。 実施例３ 厚恩遺伝子Ｃ−ＦＯＳ ｆｏｓ遺伝子断片をｐ１９ベクターに挿入して、作成したプラスミドの発現をＨ Ｌｔａｔ細胞中に形質転換して解析した。いくつかの断片がタンパク質発現を阻 害することが見いだされた。強力なＩＮＳがヌクレオチド３３２８−３４５０（ “断片［３３２８−３４５０］”）を含む断片中に同定された（ｆｏｓ遺伝子の ヌクレオチドはＧｅｎｅｂａｎｋシーケンスエントリーＨＵＭＣＦＯＴ、ＡＣＣ ＥＳＳ　ＩＯＮ＃ＶＯ１５１２に従って数えられている）。さらに、少し弱い要 素がコード領域中に同定された。 これらのＩＮＳを除去するために以下のオリゴヌクレオチドを合成し、上述に特 定したような突然変異を導入する実験に使用した。 ｆｏｓをコードしない領域中のＩＮＳを除去するために、ヌクレオチド［３３２ ８−３４５０］間のｆｏｓをコードしない領域中を変化させた以下のオリゴヌク レオチド（小文字は突然変異の入ったヌクレオチドを示す）を合成し、断片［３ ３２８−３４５０］に突然変異を導入するために使用した・突然変異を導入する 実験は上述に特定する・ ＃１： ＃２： これらのオリゴヌクレオチドはベクターｐ１９．ｐ１７Ｍ１２３４あるいは９３ ７Ｍ１２３４中に挿入されたｆｏｓ断片［３３２８−３４５０コに突然変異を導 入するために使用され、作成したプラスミドの発現はＨＬ　ｔ　ａ　を細胞に形 質転換した後に解析する。 ｆｏｓ発現はこのＩＮＳ領域の除去によって増加することが期待される。 コード領域中のＩＮＳ要素をさらに特定し除去するために、ｆｏｓのさらに長い 領域をベクターｐ３７Ｍ１２３４中に導入する。コード領域中のＩＮＳ要素はこ の発現ベクターを使用してまずより正確に位置づけされ、それから以下のオリゴ ヌクレオチドを用いて訂正する： ＧＣＣＣＴＧＴＧＡＧｅａＧＧＣＡｃｃＧＡＡＧＧａｃＡＧｃＣＡｅａＣＧｅａ ＡＣａｍＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡ　ｔｓＥＱ　よりＮｏ：　１１１１ ＃２ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡａＣＣＴａｇｃａｇｃＧＡｃａｇｃＣＴｇＡＧＣ ａｇｃＣＣｔＡＣＧＣＴＧＣＴＧ　（ＳＥＱより　Ｎｏ：　１９１ ＃３ ＡＣＣＣＣＧＡＧＧＣａＧＡｃａｇＣＴＴ＋：ＣＣａ：ｃｃＴＧｃＧＣ：ＧＣｃ ＧＣ：ＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＧＣ！！ｌ；ＥＱ　よりＮｏ・　２０） ２５０２−２５Ｇ２ ＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧａ　ａ　（ＪＣＣＴＣＧＧ　ａＡＴＧＧＧ　ＣＣＣｔ　 ＡＴ羽Ｃｔ　ＡＣＣＧＡａ　ＣＴＧＧＡａ　ＣＣａＣＴＧＴf　ＣＡ ＣＴＣｔｓＥＱ　より　Ｎｏ：　２１１ｆｏｓ発現はこのＩＮＳ領域の除去によ って増加することが期待された。 実施例４ ＨＩＶ−Ｉ　ＰＯＬ遺伝子 ＡＷ　Ｃｏｃｈｒａｎｅら１．”ヒト免疫不全ウィルス構造遺伝子発現を抑制す る遺伝子円配列の同定および特徴付け”、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６５：５３０５−５ ３１３　（１９９１）によって特徴付けられたＨＩＶ−１のｐｏｌ遺伝子から阻 害／不安定配列を除去するためにベクターｐ３７Ｍ１２３４が使用された。これ らの研究者はＣＲ８と名付けたｐｏｌ中の領域（ＨＩＶヌクレオチド３７９２− ４０５２）が阻害に重要であるということを示唆した。ヌクレオチド３７００− ４１９４を含むこの領域よりも大きい断片をベクターｐ３７Ｍ１２３４中に挿入 し、作成したプラスミド（プラスミドｐ３７Ｍ１２３４ＲＣＲ３）（図１２参照 ）からのｐ３７ｇａｇ発現の効果をＨＬｔａｔ細胞に形質転換した後に分析した 。 ｇａｇ発現の強い阻害（１０倍、図１３を参照）が観察された。 このＩＮＳを除去するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成しく小文字は変 異を導入したヌクレオチドを示す）、突然変異を導入する実験に使用した。 まず、１つのＡＵＵＵＡ潜在的不安定要素がＩＮＳ領域内にあることが観察され た。これをオリゴヌクレオチドＭ１０ｐｏｌを用いて変異を導入することによっ て除去し、プラスミドｐ３７Ｍ１２３４ＲｃＲ３Ｐ１０を作成した。このプラス ミドからのｇａｇ発現は増加せず、ＡＵＵＵＡ要素の除去のみではＩＮＳを除去 したことにならないことを示した。図１２参照。それゆえ、さらなる変異導入が 行われ、ＣＲ３を欠くプラスミドと同様のプラスミドｐ３７Ｍ１２３４ＲｃＲ３ 中に導入された変異の組合せがｇａｇタンパク質の高レベルの生産に必要で十分 であることが示された。ＩＮＳの除去に必要な変異は図１３に示す。 上述の結果によりＨＩＶ−１ｐｏｌは記述した技術で検出及び除去可能なＩＮＳ 要素を含むことが示された。 これらの結果はまたＡ、’ｖＶ、Ｃｏｃｈｒａｎｅら、、上述、によって定義さ れたＣＲ３中の最小阻害領域の外側の領域が発現レベルに影響を及ぼすことを示 唆する。これらの結果は領域のＲＮＡ構造が発現阻害に重要であることを示唆す る。 １　ヌクレオチド　３３６−７３１ ２　ヌクレオチド　４０２−４５２ ３　ヌクレオチド　５３６−５８３　上のライン４　ヌクレオチド　５８５−６ ３４　上のライン５　ヌクレオチド　６５４−７０３　上のライン６　ヌクレオ チド　４０２−４５２　下のライン（Ｍｌ）７　ヌクレオチド　５３６−５８３ 　下のライン（Ｍ２）８　ヌクレオチド　５８５−６３４　下のライン（Ｍ３） ９　ヌクレオチド　６５４−７０３　下のライン（Ｍ４）表ヱ ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｐｏｌ領域の 突然変異導入に使用した合成オリゴヌクレオチド上方の配列はＨＩ　ＶＨＸＢ２ Ｒ中に見いだされる野生型ＨＩＶ−１であり、下方は突然変異の入ったオリゴヌ クレオチド配列である。配列の位置は括弧内に示した。 ＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡｇＡＴｃＴＡｃＡＡＧＡＧｇＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧ　 （ＳＥＱ　より　Ｎｏ：　２７１ＧＧＡＴｒｇＡＡｃＡＡｇＡＴｃＧＴｇＡＧｇ ＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣｆｓＥＱ　ＸＤ　Ｎｏ：　２９）ＡＣＣＧＧＴ ＴＣＴＡｃＡＡｇＡＣｃＣＴｇｃＧｇＧＣｅＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧ　 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３１）Ｍ１２ｐｏｌ−ｐ　＋４０９７−４１．５１１ 　（ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｅｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎｐ３７ Ｍ１２３４ＲｃＲ５Ｐ１０＋Ｐ１２ｐＴＧＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＡＡＴＡＣ ＡＣＡＣｑＧＡＣＡＡＣＧＧａＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣｅＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧ ＩＳＥＱ　よりＮｏ：　７４） 断片ＦのＩＮＳ効果を除去するために作成した変異オリゴの配列断片ＦのＩＮＳ 効果を除去するために使用した６つのオリゴヌクレオチド（オリゴ＃１から＃６ ）は実施例２に既に記載した（配列番号１Ｏ−１５）。 表４ ｅｎｖコード領域内のＩＮＳ要素を破壊するために作成した変異オリゴの配列２ ６の異なる領域の野生型（上）および変異オリゴ（下）を示す。 ＨＩＶ−１のｅｎｖのための変異オリゴ：問Ｇ　［６１３５−６１７９１４６− ｍａｒＡＴＣＡＧＣＡＣｃＡＧＣＡＴｃｃＧｃＧＧｃＡＡＧＧＴＧＣＡＧ　［Ｓ ＥＱ　より　Ｎｏ：　８Ｂ）ＧＡＡＴＡＴＧＣｃＴｒご−ｃＴＡｃＡＡｇｃＴｇ ＧＡＴＡＴＡＡＴＡ　（ＳＥＱよりＮｏ：９０）ＣＣＡＡＴＡＧｃＴＡＡｃｒＧ ＡｃＡＣｃＡＣＣＡＧＣＴＡＴ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　９２１ＴＣＴＧＣＣ ＡＡｃＴＴＣＡＣｃＧＡＣＡＡｃＧＣｃＡＡｇＡＣＣＡＴＡＡＴ　（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ：　９８１ＣＴＧＡＡＣＣＡｇＴＣｃＧＴｇＧＡｇＡＴｃＡＡｃＴＧＴ ＡＣＡＡＧ　ｆｓＥＱよりＮｏ：　１００）オリゴヌクレオチドの大部分はＨＸ Ｂ２配列に従ったが、いくつか例外があるオリゴＭ１５ではｎｔ６８０７はｐＮ Ｌ４３配列に従う。（具体的には、ｎｔ６８０７はＮＬ４３ではＣであるが、Ｈ ＸＢ２てはＡである。）オリゴＭ２６はｐＮＬ４３由来のヌクレオチド配列を持 つ。 実施例５ 免疫予防措置あるいは免疫治療におけるＰ３７Ｍ１−１０ＤあるいはＰ５５Ｍ１ −１３ＰＯの使用出生後の遺伝子治療において、身体から標的細胞を除去して、 それらに新しい遺伝情報を持ったウィルスのベクターを感染し、それからそれら を身体中に再び移植するといった間接的な方法で；あるいはリポソーム中に処方 したＤＮＡをカプセル化する；ウィルス外殻受容タンパク質を含むプロテオリポ ソームにＤＮＡを封入する。ＤＮＡをリン酸カルシウム共沈する。およびポリリ ジン糖タンパク質担体複合体にＤＮＡを結合させるといった直接的な方法で新し い遺伝情報が組織中に導入されている。さらに、リン酸カルシウム共沈の形成い かんにがかゎらず、直接的な肝臓的注入後のクローン化したＤＮＡ配列のｉｎ　 ｖｉｖｏにおける感染性についても記述されている。安定性を増強する要素を含 むｍＲＮＡもまた正に荷電した脂肪小胞の使用でアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏ ｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）筋中で効率的に転写されることが示された。例えば、Ｊ 、Ａ、　Ｗｏ　ｌ　ｆｆ、ら、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８ （１９９０）およびその文献中に引用された参考文献を参照。 最近、純粋なＲＮＡあるいはＤＮＡを骨格筋に直接注入すると、筋細胞内で著し い遺伝子発現がおこることが示された。Ｊ、　Ａ、　Ｗｏ　Ｉ　ｆ　ｆ、ら、、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４７　：１４６５　１４６８　（１９９０）、粒子加速法（ ｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｃｅｅｌｅｒａｔｉｏｎ）　（Ｎ、Ｓ、Ｙａｎｇ、ら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　８７　：　９５６８−９５７２（１９９０）；　Ｓ、Ｒ，Ｗｉ　ｌ　ｌ 　ｊａｍｓら、。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：２７２６−２７３０（ １９９１））あるいはウィルス形質転換のような他の手段によって筋細胞にＲＮ ＡあるいはＤＮＡを強制的に導入してもまたＤＮＡあるいはＲＮＡは安定に保持 され、発現される。Ｗｏｌｆｆらで報告された実験中では、ＲＮＡあるいはＤＮ Ａベクターがマウス骨格筋細胞中、特に大腿回頭訪中でレポーター遺伝子を発現 するために使用された。タンパク質発現が容易に検出され、特別な輸送体系はこ れらの効果に必要なかった。記述した手順の注入液体の組成および量並びに注入 方法を改変した場合にもポリヌクレオチドの発現が得られた。例えば、レポータ ー酵素活性は１０から１００μｌの低張、等張、および高張ショ糖溶液、Ｏｐｔ ｉ−ＭＥＭ、あるいは２ｍＭ　ＣａＣｌ□を含むンヨ糖溶液で観察され、また、 １０−から１００−μｍ注入を１分以内ではな（圧縮器で２０分以上かけて注入 を行ったときに観察された。 レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性はまたＲＮＡある いはＤＮＡベクターを注入した腹筋中にも検出されたことから、他の筋もポリヌ クレオチドを取り込み、発現できることを示唆された。ＲＮＡおよびＤＮＡベク ターを注入した他の組織中（肝臓、すい臓、皮膚、肺、脳および血液）にも低い 量のレポーター酵素が検出された。訪中に注入されたプラスミドＤＮＡはヒト以 外の霊長類の訪中でも安定に発現されることが示された。Ｓ、Ｊｉａｏら、。 Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：２ｌ−３３（１９９２）。 ヒト筋肉ｉｎ　５ｉｔｕに直接遺伝子を送り込めることは、臨床への適用の可能 性が有ることを示唆する。筋は、筋が病気に生に関与している場合に加え、そう でない場合にも病気の状態を変化しうる外来遺伝子のへテロな発現に適切な可能 性を有する組織である。例えば、筋組織は免疫可能で血液中に分泌され、あるい は循環する毒物代謝物をきれいにするヘテロなタンパク質の発現に使用すること が可能であろう。繰り返しアクセスできるＲＮＡおよび組織の使用は、従来の薬 剤的処置のように与えられて可逆な型の遺伝子転位に有用であるかもしれない。 Ｊ、　Ａ、　Ｗｏ　］　ｆｆｆ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５−１４ ６８（１９９０）およびＳ、Ｊｉａｏら　、）ｌｕｍ、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐ ｙ　３：２ｌ−３３（１９９２）。 Ｊ、Ａ、Ｗｏｌｆｆら　、上述、によって、抗原をコードする遺伝子の細胞内発 現はワクチン改良発への新たなアプローチを供給しうろことが提唱された。この 仮定はインフルエンザＡ核タンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡをＢ、 へＬＢ／ｃ　マウス大腿回頭筋肉に注入すると、インフルエンザＡ核タンパク質 特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が生じてウィルス肺力価の減少、体重減 少の阻害、および生存上昇によってによって示されたように、続いておきるイン フルエンザＡウィルスのヘテロな株の攻撃から保護される結果となるという最近 ：１７４５−１７４９　（１９９３）。 従って、抗原を細胞内発現して自己複製試薬またはアジュバントの必要なしに免 疫系への提示のためのウィルス抗原を生産するために、ウィルス抗原をコードし ているＲＮＡまたはＤＮＡベクターの直接的な注入を使用することができ、その 結果、抗原特異的なＣＴＬが生産され、そして、続いて起こるウィルスのホモあ るいはヘテロな株の攻撃から防御される。 マウスおよびヒトの両ＣＴＬは保存された内部ウィルスタンパク質由来のエピト ープを認識することができ、ウィルスに対する免疫反応に重要であると思われて いる。保存されたウィルスのタンパク質のエピトープを認識することによって、 ＣＴＬは林間の防御を提供するかもしれない。保存されたウィルス抗原に特異的 なＣＴＬは、一般に株特異的な抗体とは逆に、異なるウィルス株にも反応するこ とができる。 このように、ウィルス抗原をコードするＲＮＡあるいはＤＮＡの直接注入は、直 接のペプチド移入あるいはウィルスベクターに関する制限がないという利点があ る。（Ｊ、Ａ、Ｕｌｍｅｒら、、上述、および該文献中の「考察」の項及び参考 文献を参照。）さらに、ＤＮＡ注入後発現されるタンパク質に対し高力価の抗体 が生産されることは、保存された抗原を標的としたＣＴＬワクチンと別々あるい は一緒に、保存されたあるいは保存されていない抗原を標的とした抗体ベースの ワクチンを作成する容易で効率的な手段である可能性を示唆する。これらはまた 伝統的なペプチドワクチンと共に使用して、組合せワクチンの生成に使用できる かもしれない。さらに、ＤＮＡ注入後タンパク質発現が維持されることから、Ｂ およびＴ細胞の記憶維持は強化されており、それによって長期的な体液性および 細胞性免疫を引き起こす。 １、ＨＩＶ−１に対する免疫予防措置あるいは免疫療法のためのベクターベクタ ーｐ３７Ｍ１−１０Ｄあるいはｐ５５Ｍ１−ＩＰＯ（図６）中の突然変異を導入 したｇａｇゲノム配列をＣＭＶあるいはＲ８Ｖのような強力な構成的プロモータ ーあるいはＨＩＶ−１のような誘導可能なプロモーターを用いた発現ベクター中 に挿入する。 ベクターはヒト組織への直接的なりＮＡの注入、ヒトの初代培養細胞へのＤＮへ のエレクトロポレーションあるいは形質転換（■　ｖｉｖｏ）、望ましい形質の 細胞の選別、およびそのような細胞の身体への再導入（上述の選別はあらかじめ 選別した適切なゲノム領域への導入したＤＮＡの相同的組換えでよい）１ｇａｇ 遺伝子を含む感染性できる小胞の生成、■　ｖｉｖｏでの細胞への感染およびそ のような細胞の身体への再導入、あるいは上述の小胞によるｉｎ　ｖｉｖＯの直 接の感染のようないくつかの技術の一つを使用して薬剤的に受容可能なキャリヤ ーを用いて動物あるいはヒト中に導入する。 免疫系−・の有効な刺激を生じる、実質的なレベルのタンパク質が生成されるで あろう。 発明の別の態様では、記述した構築物を修飾し、ウィルス小胞形成に参与できな いように突然変異を導入したｇａｇタンパク質を発現させる。このようなｇａｇ タンパク質は野生型のｇａｇタンパク質と同定度免疫体系を刺激するが、ＨＩｖ −１生産の増加には関与できないと期待される。この修飾は免疫療法および免疫 予防措置において安全なベクターとなる。 実施例６ トランス優性（ＴＤ）−ＴＤ−ＧＡＧ−ＴＤまたはＴＤ　ＧＡＧ−ＰＲＯ−ＴＤ 　ＲＥＶ遺伝子を用いたＨＩＶ−１発現の阻害ＤＮＡの直接注入あるいはレトロ ウィルスベクター以外のベクターの使用は細胞中でトランスに優性なｇａｇ　（ ＴＤｇａｇ）を構成的に高レベルに保つ。さらに、Ｂ、に、Ｆｅ１ｂｅｒら　、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１８４−１８７（１、９８８）によって採用されたア プローチによって例えばレトロウィルスベクターによるヒト細胞への感染を干渉 しないＨＩＶ−ＩＴＤｇａｇをコードしたマウス由来のレトロウィルスベクター のようなレトロウィルスベクターの作成が可能になった。Ｆｅ　ｌ　ｂｅ　ｒら 、、上述、のアプローチにおいて、プロモーターおよびポリＡシグナルの一部を 含むＨＩＶ−ＩＬＴＲ断片はマウスレトロウィルスベクター内で有害な効果無し に組み込まれ、転写されないままでいることが示された。 Ｔａｔタンパク質の存在によりＨＩＶ−ＬＬ’ｒＲからの転写が刺激され、ＨＩ Ｖ−ＩＬＴＲに結合した遺伝子の高レベルでの発現が生じた。 ハイブリッドＴＤ　ｇ　ａ　ｇ−ＴＤＲｅ　ｖあるいはＴＤｇａｇ−ｐｒｏ−Ｔ ＤＲｅＶ遺伝子の作成及びヒト細胞への発現ベクターの導入によってＨＩＶ−１ 発現を阻害する２つのタンパク質の効率的な生産が可能になる。同一のベクター 中に２つのＴＤ部分を組み込むとウィルス複製において各々の効果が増幅される と期待される。Ｂ、に、Ｆｅ１ｂｅｒら８．上述、中に記載されたうちの１つと 同様の方法によるＨＩＶ−１プロモーターの使用によって、感染細胞中の高レベ ルのｇａｇおよびｒｅｖ発現が可能になる。感染させないと、発現は実質的に低 くなる。 または、他の強力なプロモーターの使用によってこのようなタンパク質の構成的 な発現が可能になる。このアプローチは感染可能なウィルスの生産にかかわるこ とができないが、実際にこのような生産に対して反対に作用する、高度に免疫原 となるｇａｇの生産のため非常に有用である。これはＡＩＤＳに対する効率的な 免疫予防措置あるいは免疫療法的なアプローチとして使用可能である。 トランス優性突然変異の例はＴｒｏｎｏら、、Ｃｅ１ｌ　５９：１１２−１２９ 　（１９８９）中に記載されている。 １、トランス優性ｇａｇ突然変異タンパク質をコードする構築物の作成例えばＴ ｒｏｎｏら、、上述、中に記載されたようなトランス優性として作用するｇａｇ 突然変異タンパク質は、トランス優性ｇａｇタンパク質を高度に構成的レベルで 生産する修飾したベクターｐ３７Ｍ１−１０Ｄあるいは９５５Ｍ１−１３ＰＯに よって作成する。 トランス優性ｇａｇタンパク質は免疫体系を刺激し、感染性ウィルスの生産を阻 害するが、感染性ウィルスの生産に貢献しない。 このアプローチのさらなる安全性によってヒトへの応用がより可能になるであろ う。 当業者は阻害／不安定配列を含むｍＲＮＡをコードしているいかなる遺伝子も本 発明に例示した方法あるいは機能的に等価なものに従って改変できることを認識 するだろう。 本発明を行うための上記に記載した方法の改変は、遺伝子工学、タンパク化学、 薬学、および関連分野の当業者にとって明白であり、以下の請求項の範囲内で行 われる。 本明細書中に記載された参考文献はいずれも本明細書中に完全に参考文献として 組み入れられた。 浄７：（内容に変更なし） Ｆｌ、３ ｒ＋５．　Ｌｌ 日、Ｓ 「、゛り、７ Ａ　Ｂ 浄書（内容に変更なし） ｐ１９ベクターを用いたｅｎｖ　ｍＲＮＡ内のＩＮＳ領域の同定 Ａ　２７Ｂ　１８１１１１　７６１４−７１１５９　なし巳　２３４　−璽７ｕ ４−７＆８４，７１１が−）９　なしＣ３２３■ｌ　７５勢７Ｂ６４．７９２７ ’７９５９　１０ＸＤ１２８　１７ｇ３）ｆｉｇ　なし ！：４７８膳■■■ｍ庫＋６　ｊＱ　ＸＦ　３５２　１１１１１１１１２００− ａ５８１　＞１ｏｏｘＧ３３０　■■　７２６６−７５１１５　３−５ＸＥ　Ｓ ６８■■■■対１９ｏ１ｏＸ ＦＣら・（Ｏ −６１Ｈ八 Ｆ５．ＮＩ　Ｂ ｆ７５．Ｉ′ｉｐ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年　９月２７日団

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の工程からなる、ｍＲＮＡコード領域内の阻害／不安定配列の効果を減 衰させる方法： （ａ）上述のｍＲＮＡをコードする遺伝子屯提供し；（ｂ）上述のｍＲＮＡコー ド領域内の上述の阻害／不安定配列をコードする上述の遺伝子内の阻害／不安定 配列を同定し；（ｃ）多重点突然変異の作成により上述の遺伝子内の上述の阻害 ／不安定配列へ突然変異を導入し； （ｄ）上述の突然変異を導入した遺伝子を細胞へ形質転換し；（ｅ）上述の突然 変異を導入した遺伝子の発現を起こすように上述の細胞を培養し； （ｆ）ｍＲＮＡコード領域内の上述の阻害／不安定配列の効果が減衰したか決定 するためのに上述の遺伝子の発現レベルを検出する。
2. ２．上述の形質転換工程及び上述のレポーター遺伝子の発現レベルの検出の遂行 による上述の検出工程に先だって、上述の突然変異を導入した遺伝子をレポータ ー遺伝子へ融合させる工程をさらに含む請求項１の方法。
3. ３．工程（ｂ）内にさらに下記の工程を含む請求項１の方法：（ａ）融合遺伝子 を作成するための上述の遺伝子あるいは上述の遺伝子の断片をレポーター遺伝子 へ融合させ； （ｂ）上述の融合遺伝子を細胞中へ形質転換し；（ｃ）上述の融合遺伝子の発現 を起こすように上述の細胞を培養し；（ｄ）上述の融合遺伝子の発現が上述のレ ポーター遺伝子の発現に比較して減衰するかどうかを決定するために上述の融合 遺伝子の発現レベルを検出する。
4. ４．工程（ａ）が上述のレポーター遺伝子の終止コドンの３′に上述の遺伝子あ るいは上述の遺伝子の断片を融合させることを含む、請求項３の方法。
5. ５．工程（ａ）が上述のレポーター遺伝子のコード領域の３′末端に読み枠を合 わせて上述の遺伝子あるいは上述の遺伝子の断片を融合させることを含む、請求 項３の方法。
6. ６．上述の突然変異導入工程がｍＲＮＡにコードされるアミノ酸配列は変化させ ずにコドンを変化させる請求項１または２の方法。
7. ７．上述の阻害／不安定配列がＡＴリッチであり、および上述の突然変異導入工 程がＧあるいはＣをＡあるいはＴへ置換することを含み、および上述の突然変異 を導入した阻害配列の最終ヌクレオチド組成が約５０％ＡおよびＴおよび約５０ ％ＧおよびＣである、請求項６の方法。
8. ８．点突然変異の少なくとも７５％は保存されたヌクレオチドを非保存ヌクレオ チドに置換する、請求項６の方法。
9. ９．上述の突然変異導入工程があまり好まれないコドンをよく好まれるコドンへ 置換することを含む、請求項６の方法。
10. １０．上述のｍＲＮＡがＲｅｖ依存性レトロウイルス複合体のＧＡＧタンパク質 をコードする、請求項１または２の方法。
11. １１．Ｒｅｖ依存性レトロウイルス複合体がヒト免疫不全性ウイルスー１である 、請求項１０の方法。
12. １２．下記の工程からなる、１つあるいはそれ以上の阻害／不安定配列を含むｍ ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの生産を増加する方法：（ａ）上述の ｍＲＮＡをコードする遺伝子を提供し；（ｂ）上述のｍＲＮＡコード領域内に上 述の阻害／不安定配列をコードする上述の遺伝子内の阻害／不安定配列を同定し ；（ｃ）多重点突然変異の作成により上述の遺伝子内の上述の阻害／不安定配列 へ突然変異を導入し； （ｄ）上述の突然変異を導入した遺伝子を細胞へ形質転換し；（ｅ）上述の突然 変異を導入した遺伝子の発現を起こすように上述の細胞を培養し； （ｆ）ｍＲＮＡコード領域内の上述の阻害／不安定配列の効果が減衰したかを決 定するために上述の遺伝子の発現レベルを検出し；（ｇ）上述の突然変異を導入 した遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供し； （ｈ）上述のポリペプチドの発現を起こすために上述の宿主細胞を培養し；そし て （ｉ）上述のポリペプチを回収する。
13. １３．下記の工程よりなる、本来の生産が阻害／不安定配列の存在によって妨げ られているポリペプチドを生産する方法：（ａ）上述のポリペプチドをコードす る遺伝子に阻害／不安定配列の効果を減少させるように突然変異を導入したもの を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を提供し； （ｂ）上述のポリペプチドの発現を起こすために宿主細胞を培養し；そして （ｃ）上述のポリペプチドを回収する。
14. １４．上述の宿主細胞が原核生物である、請求項１３の方法。
15. １５．上述の宿主細胞が真核生物である、請求項１３の方法。
16. １６．上述の遺伝子がｃＤＮＡである請求項１３、１４または１５の方法。
17. １７．上述の遺伝子がゲノム遺伝子である請求項１３、１４または１５の方法。
18. １８．本来の遺伝子の発現が当該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ中の阻害 ／不安定配列の存在により妨げられるような遺伝子に、阻害／不安定配列の効果 を減少するような突然変異を導入したものからなる、人工的な核酸構築物。
19. １９．上述の突然変異を導入した遺伝子によりコードされたアミノ酸配列が本来 の遺伝子によりコードされたアミノ酸配列と同じである、請求項１８の構築物。
20. ２０．上述の本来の遺伝子がＨＩＶ−１ｇａｇである、請求項１９の構築物。
21. ２１．上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド４０２および４５２の間、 ５３６および５８３の間、５８５および６３４の間、および６５４および７０３ の間に多重点突然変異を導入することによって突然変異を起こした、請求項２０ の構築物。
22. ２２．上述の本来の遺伝子がＨＩＶ−１ｅｎｖである請求項１９の構築物。
23. ２３．下記の要素を含んでなる、ｍＲＮＡ中の阻害／不安定配列を同定するため の測定キット： （ａ）請求項２０または２１の核酸構築物；および（ｂ）上述の核酸構築物中の 上述の遺伝子の発現レベルを検出するための検出系。
24. ２４．上述の検出系がＥＬＩＳＡである、請求項２３のキット。
25. ２５．請求項１または２の方法によって突然変異を導入した遺伝子を含む人工核 酸構築物。
26. ２６．請求項２５の核酸構築物を含むベクター。
27. ２７．請求項２５の人工核酸構築物を含む形質転換した宿主細胞。
28. ２８．請求項１８または１９の核酸構築物を含むベクター。
29. ２９．請求項１８または１９の人工核酸構築物を含む形質転換宿主細胞。
30. ３０．上述の細胞が真核生物および原核生物かるなる群から選択された、請求項 ２９の形質転換宿主細胞。
31. ３１．上述の細胞がヒト細胞である請求項３０の宿主細胞。
32. ３２．上述の細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項３０の宿主細 胞。
33. ３３．上述の細胞がＥ．ｃｏｌｉである請求項３０の宿主細胞。
34. ３４．上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子が、ヌクレオチド４０２および４５２の間 、５３６および５８３の間、５８５および６３４の間、６５４および７０３の間 、８７１および９１５の間、１１０５および１１３９の間、１１４０および１１ ７５の間並びに１３２１および１３６４の間に多重点突然変異を導入することに よって突然変異を起こしたものである、請求項２０の構築物。
35. ３５．上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子がｐ３７Ｍ１−１０Ｄである、請求項３４ の構築物。
36. ３６．上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子が、ヌクレオチド４０２および４５２の間 、５３６および５８３の間、５８５および６３４の間、６５４および７０３の間 、８７１および９１５の間、１１０５および１１３９の間、１１４０および１１ ７５の間、１３２１および１３６４の間、１４１６および１４６６の間、１４７ ０および１５２０の間、１５２７および１５７４の間、並びに１８２３および１ ８７９の間に多重点突然変異を導入することによって突然変異を起こしたもので ある、請求項２０の構築物。
37. ３７．上述のＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子がｐ５５Ｍ１−１３ＰＯである、請求項３ ６の構築物。
38. ３８．薬剤的に受容できる基剤及びさらにｉｎ　ｖｉｖｏの細胞中でＨＩＶ調節 タンパク質が存在しなくてもＨＩＶｇａｇタンパク質を生産することができる核 酸構築物を治療に効果的な量含む、ＨＩＶ感染に対するほ乳類の免疫を誘導する ワクチン組成物。
39. ３９．上述のほ乳類がヒトである、請求項３８に記載のワクチン組成物。
40. ４０．上述の興節タンパク質がＨＩＶ−１Ｒｅｖである、請求項３８に記載のワ クチン組成物。
41. ４１．上述の構築物が請求項２０、２１、３４、３５、３６、及び３７の構築物 からなる群から選択された、請求項３８に記載のワクチン組成物。
42. ４２．ｉｎ　ｖｉｖｏの細胞中でＨＩＶ調節タンパク質が存在しなくてもＨＩＶ ｇａｇタンパク質を生産することができる核酸構築物を含むワクチン組成物を治 療に効果的な量でほ乳類に与えることを含む、ほ乳類中のＨＩＶ感染に対する免 疫を誘導する方法。
43. ４３．上述のほ乳類がヒトである、請求項４２に記載の方法。
44. ４４．上述の調節タンパク質がＨＩＶ−１Ｒｅｖである請求項４２に記載の方法 。
45. ４５．上述の構築物が請求項２０、２１、３４、３５、３６、及び３７の構築物 からなる群から選択された、請求項４２に記載の方法。