JPH0751071B2 - Ｌ―カルニチンの微生物学的方法による断続的製造方法 - Google Patents
Ｌ―カルニチンの微生物学的方法による断続的製造方法Info
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- JPH0751071B2 JPH0751071B2 JP2196017A JP19601790A JPH0751071B2 JP H0751071 B2 JPH0751071 B2 JP H0751071B2 JP 2196017 A JP2196017 A JP 2196017A JP 19601790 A JP19601790 A JP 19601790A JP H0751071 B2 JPH0751071 B2 JP H0751071B2
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物を利用したＬ−カルニチンの新規な製
造方法に関する。
造方法に関する。
Ｌ−カルニチンは、人の物質代謝たとえば脂肪酸の分解
に不可欠の物質である。それゆえ、合成Ｌ−カルニチン
は対応するビタミン欠乏症への作用物質として、その医
薬製剤に使用されている。
に不可欠の物質である。それゆえ、合成Ｌ−カルニチン
は対応するビタミン欠乏症への作用物質として、その医
薬製剤に使用されている。
Ｌ−カルニチンをγ−ブチロベタインから製造すること
は知られている。これは、γ−ブチロベタインを、ナト
リウム−２−オキソグルタル酸、還元剤、鉄イオン源お
よびヒドロキシル基供与体としての空気中の酸素の存在
下で、アカバンカビ（Neurospora crassa）の胞子から
出るヒドロキシラーゼ酵素と接触させる（US−PS437161
8）ことによって行なう。しかし、この方法は多数の補
助因子を必要とし、それらを外部から補給しなければな
らない欠点がある。反応に際しては、化学量論量の２−
オキソグルタル酸が酸化脱炭酸されてコハク酸になる。
活性体としてのFe2+は、鉄イオンを還元形態に保持する
ためにアスコルビン酸を必要とし、また、わずかに生成
する有害なH2O2を分解するためにカタラーゼを必要とす
る。
は知られている。これは、γ−ブチロベタインを、ナト
リウム−２−オキソグルタル酸、還元剤、鉄イオン源お
よびヒドロキシル基供与体としての空気中の酸素の存在
下で、アカバンカビ（Neurospora crassa）の胞子から
出るヒドロキシラーゼ酵素と接触させる（US−PS437161
8）ことによって行なう。しかし、この方法は多数の補
助因子を必要とし、それらを外部から補給しなければな
らない欠点がある。反応に際しては、化学量論量の２−
オキソグルタル酸が酸化脱炭酸されてコハク酸になる。
活性体としてのFe2+は、鉄イオンを還元形態に保持する
ためにアスコルビン酸を必要とし、また、わずかに生成
する有害なH2O2を分解するためにカタラーゼを必要とす
る。
リンドシュテッドらは、γ−ブチロベタインを、Ｃ源お
よびＮ源として増殖するシュードモナス（Pseudomona
s）類の微生物を分離した〔Lind−sted et al,Biochemi
stry６,1262−1270（1967）“The Formation and Degr
a−dation of Carnitin in Pseudomonas"〕。分解過程
の最初の反応は、γ−ブチロベタインのＬ−カルニチン
への水酸化であるが、中間で生成するＬ−カルニチンは
完全にCO2,H2OおよびNH3に分解されてしまう。
よびＮ源として増殖するシュードモナス（Pseudomona
s）類の微生物を分離した〔Lind−sted et al,Biochemi
stry６,1262−1270（1967）“The Formation and Degr
a−dation of Carnitin in Pseudomonas"〕。分解過程
の最初の反応は、γ−ブチロベタインのＬ−カルニチン
への水酸化であるが、中間で生成するＬ−カルニチンは
完全にCO2,H2OおよびNH3に分解されてしまう。
また、バクテリアから得られたヒドロキシラーゼをＬ−
カルニチン生産に用いると、補助因子の欠乏をひき起こ
すという欠点がある（Lindsted et al,Biochemistry16,
2181−2188（1977）“Purification and Properties of
γ−Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudo−mona
s sp.AK1"）。
カルニチン生産に用いると、補助因子の欠乏をひき起こ
すという欠点がある（Lindsted et al,Biochemistry16,
2181−2188（1977）“Purification and Properties of
γ−Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudo−mona
s sp.AK1"）。
さらに、アメリカ特許第4708936号明細書によれば、Ｌ
−カルニチンを微生物学的方法で連続的に製造すること
ができる。しかし、この方法には、連続的製造に際し、
菌株安定性をかなり高く（1000時間以上）しなければな
らないうえに、培地中の製品濃度が比較的低いという欠
点がある。製品／中間体の比も同様に低い。
−カルニチンを微生物学的方法で連続的に製造すること
ができる。しかし、この方法には、連続的製造に際し、
菌株安定性をかなり高く（1000時間以上）しなければな
らないうえに、培地中の製品濃度が比較的低いという欠
点がある。製品／中間体の比も同様に低い。
本発明の課題は、従来方法に伴う欠点がなく、クロトノ
ベタインおよび（または）γ−ブチロベタインからＬ−
カルニチンを、対掌体選択的かつ微生物学的に高収率で
製造できる方法を提供することにある。
ベタインおよび（または）γ−ブチロベタインからＬ−
カルニチンを、対掌体選択的かつ微生物学的に高収率で
製造できる方法を提供することにある。
上記の課題は、請求項１に記載の方法により解決され
る。
る。
すなわち本発明は、リゾビウム（Rhizobium）属の微生
物を含む培地に、γ−ブチロベタインおよび（または）
クロトノベタインと炭素源および窒素源としてのベタイ
ンとを供給するとともに補助炭素源を加え、ベタインと
炭素源添加物とを、炭素と窒素のモル比（C:N）が1000
0:1ないし5:1となるように供給し、Ｌ−カルニチンの濃
度が最高になったときにＬ−カルニチンを分離すること
を特徴とする。
物を含む培地に、γ−ブチロベタインおよび（または）
クロトノベタインと炭素源および窒素源としてのベタイ
ンとを供給するとともに補助炭素源を加え、ベタインと
炭素源添加物とを、炭素と窒素のモル比（C:N）が1000
0:1ないし5:1となるように供給し、Ｌ−カルニチンの濃
度が最高になったときにＬ−カルニチンを分離すること
を特徴とする。
リゾビウム種の微生物としては、西ドイツ微生物寄託機
関（DSM）であるバイオテクノロジー研究所（グリーズ
バッハシュトラーセ 8,D−3400,ゲッチンゲン）に1985
年２月８日に寄託したNo.DSM3225の菌「HK1331b」およ
び1984年１月23日に同所に寄託したNo.DSM2903の菌「HK
13」を用いるのが好ましい。
関（DSM）であるバイオテクノロジー研究所（グリーズ
バッハシュトラーセ 8,D−3400,ゲッチンゲン）に1985
年２月８日に寄託したNo.DSM3225の菌「HK1331b」およ
び1984年１月23日に同所に寄託したNo.DSM2903の菌「HK
13」を用いるのが好ましい。
この方法には、遺伝子工学的に変化させた微生物を用い
ることもできる。
ることもできる。
既知のシステムによる技術の場合とは異なり、本発明に
よる微生物は、ヒドロキシル基供与体として、O2ではな
くH2Oを使用する。これは、H2 18Oと18O2を用いた独特の
試験により確認することができる。
よる微生物は、ヒドロキシル基供与体として、O2ではな
くH2Oを使用する。これは、H2 18Oと18O2を用いた独特の
試験により確認することができる。
この、とくにすぐれた微生物の選択と分類は、EP−Ａ−
0158194に開示されている。
0158194に開示されている。
本発明によるＬ−カルニチンの製造は、最初にいわゆる
バッチ相において、生産能力のあるバイオマスを生産す
ることにより開始するのがよい。そのためには、EP−Ａ
−0158194の記載に対応する既知の方法に従って、前記
の菌を、滅菌した、好ましくはビタミンを含有する無機
培地〔Kulla et al,Arch.Microbiol.135,1（1983）〕中
で、20〜40℃とくに30℃で、pH6〜８とくに７とし、５
〜80時間、好ましくは15〜40時間培養する。この培地に
は、成長基質として0.01〜10重量％，好ましくは0.01〜
５重量％のコリン、グルタミン酸塩、酢酸塩、ジメチル
グリシンまたはベタインを添加するのがよい。とくにベ
タインをグルタミン酸塩その他の炭酸源とともに0.02〜
５重量％用いることが好ましい。
バッチ相において、生産能力のあるバイオマスを生産す
ることにより開始するのがよい。そのためには、EP−Ａ
−0158194の記載に対応する既知の方法に従って、前記
の菌を、滅菌した、好ましくはビタミンを含有する無機
培地〔Kulla et al,Arch.Microbiol.135,1（1983）〕中
で、20〜40℃とくに30℃で、pH6〜８とくに７とし、５
〜80時間、好ましくは15〜40時間培養する。この培地に
は、成長基質として0.01〜10重量％，好ましくは0.01〜
５重量％のコリン、グルタミン酸塩、酢酸塩、ジメチル
グリシンまたはベタインを添加するのがよい。とくにベ
タインをグルタミン酸塩その他の炭酸源とともに0.02〜
５重量％用いることが好ましい。
さらに、バッチ相においては、転換すべき出発原料であ
るγ−ブチロベタイン、クロトノベタインまたはその混
合物を、反応媒体基準で0.01〜10重量％、好ましくは0.
1〜５重量％加えておく。
るγ−ブチロベタイン、クロトノベタインまたはその混
合物を、反応媒体基準で0.01〜10重量％、好ましくは0.
1〜５重量％加えておく。
γ−ブチロベタインおよびクロトノベタインは、一部は
塩酸塩として、残りは遊離の分子内塩として使用するこ
とができる。
塩酸塩として、残りは遊離の分子内塩として使用するこ
とができる。
バッチ相で培養したバイオマスは、さらに次の培養に移
す。この培養は、前の培養と同一の組成で行なうのがよ
い。
す。この培養は、前の培養と同一の組成で行なうのがよ
い。
本発明方法によれば、バッチ相で培養したバイオマス
は、いわゆる「フェッド・バッチ相」におけるＬ−カル
ニチン製造の原料となる。
は、いわゆる「フェッド・バッチ相」におけるＬ−カル
ニチン製造の原料となる。
「フェッド・バッチ相」の培養培地は、バッチ相のそれ
とほとんど同じである。
とほとんど同じである。
この「フェッド・バッチ相」の特徴は、培養液に未加工
物であるクロトノベタインおよび（または）γ−ブチロ
ベタイン、ベタインおよび補助炭素源を投入することで
ある。
物であるクロトノベタインおよび（または）γ−ブチロ
ベタイン、ベタインおよび補助炭素源を投入することで
ある。
炭素源としては、当該分野において通常用いられ、また
たとえばリゾビウム菌用として文献に記載された化合物
（The prokaryotes,Chapter67,The genus Rhizobium,S
pringer Verlag1981,p825）を使用することができる。
たとえばリゾビウム菌用として文献に記載された化合物
（The prokaryotes,Chapter67,The genus Rhizobium,S
pringer Verlag1981,p825）を使用することができる。
このような炭素源としては、グルコース、フラクトース
などの糖、グリセリンなどのシュガーアルコール、酢酸
などの有機酸が例示される。
などの糖、グリセリンなどのシュガーアルコール、酢酸
などの有機酸が例示される。
とくに、グルコースまたはグリセリンを用いるのが好ま
しい。
しい。
炭素と窒素とのモル比（C:N）は、5:1〜10,000:1の範囲
とする。とくに10:1〜100:1の範囲が好ましい。
とする。とくに10:1〜100:1の範囲が好ましい。
ベタインを窒素源として用いるときは、C/Nをとくに高
くすることが必要である。他の窒素源としては、通常の
もの、アンモニウムのような既知の前駆体を使用するこ
とができる。このほかに、イオウ源、リン源、トレーサ
元素、ビタミンなどの補助栄養素や、肉エキス、酵母エ
キスまたは麦芽汁、メイズなどの複合栄養素を添加して
もよい。
くすることが必要である。他の窒素源としては、通常の
もの、アンモニウムのような既知の前駆体を使用するこ
とができる。このほかに、イオウ源、リン源、トレーサ
元素、ビタミンなどの補助栄養素や、肉エキス、酵母エ
キスまたは麦芽汁、メイズなどの複合栄養素を添加して
もよい。
未加工物のγ−ブチロベタインまたはクロトノベタイン
は、培地中の濃度が0.005〜５％、好ましくは0.02〜２
％となるように供給する。
は、培地中の濃度が0.005〜５％、好ましくは0.02〜２
％となるように供給する。
Ｃ源/N源の供給速度は、バイオ反応器におけるバイオマ
スの量に依存する。バイオマス濃度の測定方法は、培養
液の乾燥重量を測定することである。この乾燥重量およ
び所望の炭素／窒素比に合わせて、炭素源およびベタイ
ンを、乾燥培地1Kgあたり１時間に0.01〜100モル、好ま
しくは0.1〜10モルの炭素となるように供給する。
スの量に依存する。バイオマス濃度の測定方法は、培養
液の乾燥重量を測定することである。この乾燥重量およ
び所望の炭素／窒素比に合わせて、炭素源およびベタイ
ンを、乾燥培地1Kgあたり１時間に0.01〜100モル、好ま
しくは0.1〜10モルの炭素となるように供給する。
温度20〜40℃、pH6〜８の条件で行なうのが有利であ
る。
る。
この「フェッド・バッチ相」で通常25〜250時間の培養
を行なうと、培養液中のＬ−カルニチンの濃度が６％以
上になる。
を行なうと、培養液中のＬ−カルニチンの濃度が６％以
上になる。
この方法の実施態様として、発酵が終了したら培養液を
一部抜き出し、残りの部分に新しい培養媒体を加えて
「フェッド・バッチ」培養を新たに行なうこともでき
る。このいわゆる「繰り返しフェッド・バッチ」法を行
なうと、発酵の容量生産性を高めることができる。
一部抜き出し、残りの部分に新しい培養媒体を加えて
「フェッド・バッチ」培養を新たに行なうこともでき
る。このいわゆる「繰り返しフェッド・バッチ」法を行
なうと、発酵の容量生産性を高めることができる。
培養を終えたら、用いたγ−ブチロベタインおよび／ま
たはクロトノベタインを、イオン交換または電気透析に
より脱塩精製する。
たはクロトノベタインを、イオン交換または電気透析に
より脱塩精製する。
培養液からＬ−カルニチンを分離する方法は、たとえば
EP−Ａ−195944により知られているから、これに従って
行なえばよい。すなわち、バイオマスをたとえば遠心分
離、限外濾過または精密濾過により分離した後、溶液を
電気透析装置にかけて負荷部分（カチオンおよびアニオ
ン）を除く。脱塩の終点は、電導度測定により確認す
る。これにより、塩は濃縮循環液に残り、Ｌ−カルニチ
ンは内部塩（ベタイン）として希釈循環液中に残る。こ
のようにして、希釈液中のＬ−カルニチンの収率は、脱
塩後95％以上になる。
EP−Ａ−195944により知られているから、これに従って
行なえばよい。すなわち、バイオマスをたとえば遠心分
離、限外濾過または精密濾過により分離した後、溶液を
電気透析装置にかけて負荷部分（カチオンおよびアニオ
ン）を除く。脱塩の終点は、電導度測定により確認す
る。これにより、塩は濃縮循環液に残り、Ｌ−カルニチ
ンは内部塩（ベタイン）として希釈循環液中に残る。こ
のようにして、希釈液中のＬ−カルニチンの収率は、脱
塩後95％以上になる。
電気透析の代りに、H+型の強酸性イオン交換樹脂を使っ
てＬ−カルニチンを脱塩することができる〔J.P.Vandec
asteele,Appl.Environ.Microbiol.39,327（1980）参
照〕。イオン交換塔に溶液を供給し、イオン交換体が使
い尽されてＬ−カルニチンが流出してくるまで続ける。
アニオンは遊離塩として流出液中に出てくる。カチオン
はイオン交換樹脂に吸着される。
てＬ−カルニチンを脱塩することができる〔J.P.Vandec
asteele,Appl.Environ.Microbiol.39,327（1980）参
照〕。イオン交換塔に溶液を供給し、イオン交換体が使
い尽されてＬ−カルニチンが流出してくるまで続ける。
アニオンは遊離塩として流出液中に出てくる。カチオン
はイオン交換樹脂に吸着される。
イオン交換樹脂を水で中和洗浄したのち、アンモニア水
でＬ−カルニチンを溶出する。このようにして、アンモ
ニア性アルカリ溶出液中のＬ−カルニチンの収率は95％
以上になる。
でＬ−カルニチンを溶出する。このようにして、アンモ
ニア性アルカリ溶出液中のＬ−カルニチンの収率は95％
以上になる。
電気透析またはイオン交換によって得られたＬ−カルチ
ニンの希釈溶液は、蒸発または逆滲透法により濃縮し、
共沸蒸留により水を除去する。次いで、このようにして
得られたＬ−カルニチンを、イソブタノール／アセト
ン、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノールまたはＬ
−カルニチンがあまり溶解しない溶媒、たとえばアセト
ン、エチル酢酸、γ−ブチル酢酸、イソブチルメチルケ
トン、アセトニトリルと組合わせたものから再結晶させ
る。とくに好ましいのはイソブタノールであり、同時に
活性炭で処理すると、白色の精製Ｌ−カルニチンが得ら
れる。この方法により、比旋光度〔α▲〕25 D▼が−30.
5〜31.0゜（ｃ＝1,H2O）〔文献値−30.9゜;Strack et a
l,Hoppe−Seyler′s Z.f.physiolog.Chem.,318（196
0）,129〕で、純度が99％（HPLC）以上のＬ−カルニチ
ンが得られる。
ニンの希釈溶液は、蒸発または逆滲透法により濃縮し、
共沸蒸留により水を除去する。次いで、このようにして
得られたＬ−カルニチンを、イソブタノール／アセト
ン、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノールまたはＬ
−カルニチンがあまり溶解しない溶媒、たとえばアセト
ン、エチル酢酸、γ−ブチル酢酸、イソブチルメチルケ
トン、アセトニトリルと組合わせたものから再結晶させ
る。とくに好ましいのはイソブタノールであり、同時に
活性炭で処理すると、白色の精製Ｌ−カルニチンが得ら
れる。この方法により、比旋光度〔α▲〕25 D▼が−30.
5〜31.0゜（ｃ＝1,H2O）〔文献値−30.9゜;Strack et a
l,Hoppe−Seyler′s Z.f.physiolog.Chem.,318（196
0）,129〕で、純度が99％（HPLC）以上のＬ−カルニチ
ンが得られる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ 菌HK1331bを含む0.3の前培養物を、次に示す栄養媒体
中で30℃、pH7.0で24時間培養した。
中で30℃、pH7.0で24時間培養した。
（栄養媒体の組成） Ｌ−グルタミン酸塩 2g ベタイン 2g γ−ブチロベタイン 2g 緩衝溶液 100ml Mg−Ca−Fe溶液 25ml トレーサー元素溶液 1ml ビタミン溶液 1ml 水 １ （上記緩衝溶液の組成） Na2SO4 １ g Na2HPO4・2H2O 25.08g KH2PO4 10 g NaCl 30 g 水 １ （上記Mg−Ca−Fe溶液の組成） MgCl2・6H2O 16 ｇ CaCl2・2H2O 0.58 g FeCl3・6H2O 0.032g 水 １ （上記トレーサー元素溶液の組成） ZnSO4・7H2O 100mg MnCl2・4H2O 30mg H3BO3 300mg CoCl2・6H2O 200mg CuCl2・2H2O 10mg NiCl2・6H2O 22mg Na2MoO4・2H2O 30mg 水 １ （上記ビタミン溶液の組成） ピリドキサール.HCl 10mg リボフラビン 5mg ニコチンアミド 5mg チアミン.HCl 5mg ビオチン 2mg パントテン酸ナトリウム 5mg ｐ−アミノ安息香酸 5mg フォル酸 2mg ビタミンB12 5mg 水 １ この前培養物を同一組成の培養媒体中において、30℃、
pH7で24時間培養した。pHは、８％のリン酸水溶液を添
加して7.0に保った。
pH7で24時間培養した。pHは、８％のリン酸水溶液を添
加して7.0に保った。
ａ） 次いで「フェッド・バッチ」操作を開始した。次
の組成の２種の溶液を連続的に供給した。
の組成の２種の溶液を連続的に供給した。
（炭素−窒素源溶液） ベタイン 100g グルコース 135g 水 １ 炭素：窒素（モル比） 10.3:1 （γ−ブチロベタイン溶液） γ−ブチロベタイン 300g 水 １ 炭素および窒素源溶液は、4.5ml/hの供給速度で投入し
た。これは、「フェッド・バッチ」相の最初に、比供給
速度を４モルC/kg乾燥重量/hとしたことに相当する。乾
燥重量は、常法に従って測定した〔たとえば、Appl.Mic
robiol.Biotechnol 28（1988）109f.〕。γ−ブチロベ
タインとＬ−カルニチンの濃度はHPLCにより測定した。
γ−ブチロベタイン溶液は、培地中0.05〜0.5重量％と
なるように投入した。培養時間150時間で、Ｌ−カルニ
チンの濃度は6.4％、未転化γ−ブチロベタインの濃度
は0.29％となった。これはγ−ブチロベタインの転化率
が95％であることを示す。
た。これは、「フェッド・バッチ」相の最初に、比供給
速度を４モルC/kg乾燥重量/hとしたことに相当する。乾
燥重量は、常法に従って測定した〔たとえば、Appl.Mic
robiol.Biotechnol 28（1988）109f.〕。γ−ブチロベ
タインとＬ−カルニチンの濃度はHPLCにより測定した。
γ−ブチロベタイン溶液は、培地中0.05〜0.5重量％と
なるように投入した。培養時間150時間で、Ｌ−カルニ
チンの濃度は6.4％、未転化γ−ブチロベタインの濃度
は0.29％となった。これはγ−ブチロベタインの転化率
が95％であることを示す。
ｂ） ａ）に対応して、同一組成の炭素／窒素源溶液お
よびγ−ブチロベタイン溶液を用いて、「フェッド・バ
ッチ」操作を続けた。
よびγ−ブチロベタイン溶液を用いて、「フェッド・バ
ッチ」操作を続けた。
炭素および窒素源溶液を、4.5ml/hの供給速度で投入し
た。これは、「フェッド・バッチ」相の最初に比供給速
度を４モルC/kg乾燥重量/hとしたことに相当する。乾燥
重量は常法に従って測定した〔たとえば、Appl.Microbi
ol.Biotechnol 28（1988）109f.〕。γ−ブチロベタイ
ンとＬ−カルニチンの濃度は、HPLCにより測定した。γ
−ブチロベタイン溶液は、培養培体中0.05〜0.15重量％
となるように投入した。培養時間155時間で、Ｌ−カル
ニチンの濃度は6.3％、未転化γ−ブチロベタインの濃
度は0.13％となった。これはγ−ブチロベタインの転化
率98％に対応する。
た。これは、「フェッド・バッチ」相の最初に比供給速
度を４モルC/kg乾燥重量/hとしたことに相当する。乾燥
重量は常法に従って測定した〔たとえば、Appl.Microbi
ol.Biotechnol 28（1988）109f.〕。γ−ブチロベタイ
ンとＬ−カルニチンの濃度は、HPLCにより測定した。γ
−ブチロベタイン溶液は、培養培体中0.05〜0.15重量％
となるように投入した。培養時間155時間で、Ｌ−カル
ニチンの濃度は6.3％、未転化γ−ブチロベタインの濃
度は0.13％となった。これはγ−ブチロベタインの転化
率98％に対応する。
Ｌ−カルニチンの分離 Ｌ−カルニチン64g/、γ−ブチロベタイン2.9g/お
よび無機塩を含む溶液をEP−Ａ−195944に記載の方法に
従って処理し、Ｌ−カルニチンの精製品を得ることがで
きた。
よび無機塩を含む溶液をEP−Ａ−195944に記載の方法に
従って処理し、Ｌ−カルニチンの精製品を得ることがで
きた。
再結晶により精製して、純度99％以上（HPLC）、比旋光
度〔α▲〕25 D▼＝−30.9゜（ｃ＝1,H2O）の白色のＬ−
カルニチン56.3g（88％）が得られた。
度〔α▲〕25 D▼＝−30.9゜（ｃ＝1,H2O）の白色のＬ−
カルニチン56.3g（88％）が得られた。
実施例２ 実施例１においてγ−ブチロベタインの代りに2g/の
クロトノベタインを含む栄養媒体300mlに菌「HK1331b」
を接種して、30℃、pH7で24時間培養した。
クロトノベタインを含む栄養媒体300mlに菌「HK1331b」
を接種して、30℃、pH7で24時間培養した。
この前培養体を実施例１記載の栄養媒体中で、30℃、pH
7.0、24時間培養した。８％リン酸水溶液を用いてpH7.0
に保った。次いで、「フェッド・バッチ」操作に移っ
た。実施例１の記載と同様に、炭素および窒素源と次に
示す組成の溶液を連続的に投入した。
7.0、24時間培養した。８％リン酸水溶液を用いてpH7.0
に保った。次いで、「フェッド・バッチ」操作に移っ
た。実施例１の記載と同様に、炭素および窒素源と次に
示す組成の溶液を連続的に投入した。
（クロトノベタイン溶液の組成） クロトノベタイン 300g 水 １ この溶液を、炭素および窒素源とともに4.5ml/hの供給
速度で投入した。これは、「フェッド・バッチ」相の最
初に、比供給速度を約４モルC/kg乾燥重量/hとしたこと
に相当する。その他は実施例１に記載の方法と同様に処
理し、分析にかけた。クロトノベタイン溶液は、培地中
の濃度が0.05〜0.5重量％となるように投入した。培養
時間150時間で、Ｌ−カルニチンの濃度が6.1％、未転化
クロトノベタインの濃度が0.17％になった。これはクロ
トノベタインが95％転化したことに相当する。
速度で投入した。これは、「フェッド・バッチ」相の最
初に、比供給速度を約４モルC/kg乾燥重量/hとしたこと
に相当する。その他は実施例１に記載の方法と同様に処
理し、分析にかけた。クロトノベタイン溶液は、培地中
の濃度が0.05〜0.5重量％となるように投入した。培養
時間150時間で、Ｌ−カルニチンの濃度が6.1％、未転化
クロトノベタインの濃度が0.17％になった。これはクロ
トノベタインが95％転化したことに相当する。
Ｌ−カルニチンの分離 Ｌ−カルニチン61g/、クロトノベタイン1.7g/およ
び無機塩を含む溶液を、前記と同様にEP−Ａ−195944号
に記載の方法に従って処理し、精製Ｌ−カルニチンを得
た。
び無機塩を含む溶液を、前記と同様にEP−Ａ−195944号
に記載の方法に従って処理し、精製Ｌ−カルニチンを得
た。
再結晶により白色のＬ−カルニチン52g（86％）が得ら
れた。比旋光度などの物性は、実施例１に記載したとこ
ろと同一であった。
れた。比旋光度などの物性は、実施例１に記載したとこ
ろと同一であった。
Claims (5)
- 【請求項１】クロトノベタインおよび（または）γ−ブ
チロベタインを微生物学的に利用してＬ−カルニチンを
断続的に製造する方法であって、リゾビウム属の微生物
を含む培地に、γ−ブチロベタインおよび（または）ク
ロトノベタインと、炭素源および窒素源としてのベタイ
ンとを供給するとともに補助炭素源を加え、ベタインと
炭素源添加物とを、炭素と窒素のモル比が10000:1ない
し5:1となるように供給し、Ｌ−カルニチンの濃度が最
高になったときにＬ−カルニチンを分離することを特徴
とする製造方法。 - 【請求項２】クロトノベタインおよび（または）γ−ブ
チロベタインの培地中の濃度を0.005〜５％とすること
を特徴とする請求項１の製造方法。 - 【請求項３】炭素源添加物として、シュガーアルコール
または有機酸を用いることを特徴とする請求項１の製造
方法。 - 【請求項４】炭素源添加物としてグルコースまたはグリ
セリンを用いることを特徴とする請求項３の製造方法。 - 【請求項５】ベタインと炭素源添加物の供給速度を、乾
燥培地1kg当り0.01〜100モル／時とすることを特徴とす
る請求項１の製造方法。
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| CH281389 | 1989-07-28 | ||
| CH2813-89-9 | 1989-07-28 |
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|---|---|
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JPH0751071B2 (ja) |
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| RU2133773C1 (ru) * | 1993-10-08 | 1999-07-27 | Лонца Аг | Гены бутиробетаин/кротонобетаин-l-карнитин-метаболизма и их применение для микробиологического получения l-карнитина |
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