JPH0783705B2

JPH0783705B2 - 醗酵食品中の尿素を分解する方法

Info

Publication number: JPH0783705B2
Application number: JP62026138A
Authority: JP
Inventors: 恭一小橋; 幸子竹部; 健文小林; 末広本田; 清草井; 秀夫三島
Original assignee: Nagase and Co Ltd; Hakutsuru Sake Brewing Co Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd; Hakutsuru Sake Brewing Co Ltd
Priority date: 1987-02-06
Filing date: 1987-02-06
Publication date: 1995-09-13
Anticipated expiration: 2010-09-13
Also published as: JPS63196261A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は醗酵食品中の尿素を分解することにより香味、
色沢等の品質の安定性および加熱殺菌や長期貯蔵後の食
品衛生面での安全性を向上させる醗酵食品の改良に係
る。

〔背景〕

微生物による醗酵工程を伴う醗酵食品中には微生物の代
謝副産物のひとつとして尿素が含有される。酒類につい
ては尿素はその含有量が多い場合には官能的に苦味を与
え、また加熱殺菌や長期貯蔵を行なうと着色増加ならび
に香味劣化を引き起す原因となり、嗜好性を低下させる
一因ともなり得る。

また酒類に限らずエチルアルコールと尿素が共存する多
くの醗酵食品中では両者がエステル結合したカルバミン
酸エチルエステルが生成し、特に過酷な加熱殺菌を行な
つたり、長期間の貯蔵の後には食品衛生面の安全性低下
をきたす怖れがある。

これらの問題を回避するには醗酵食品もしくはそれらの
製造工程中において尿素を分解もしくは選択的に除去す
ることが最も有効な技術手段として挙げられる。

〔従来の技術〕

尿素は陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂に吸着
可能であるが該樹脂を用いた尿素の完全な吸着除去は困
難である。また活性炭や酸化デンプンなどを用いても醗
酵食品中から尿素を有効に除去することは出来なかつ
た。

近年、臨床検査部門においては各種血清成分を酵素を用
いて定量する酵素分析法が広く採用されているが、その
ひとつにウレアーゼを利用した血清中の尿素の定量方法
がある。またウレアーゼは固定化品として人工腎臓にお
ける尿素の分解にも用いられている（特公昭60−36751
号、特公昭61−17467号）。これらの用途における公知
のウレアーゼはナタマメ等のマメ科植物種子あるいはオ
イバクテリウム・エアロフアシエンス（Eubacterium ae
rofaciens）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirab
ilis）等の微生物から生産される中性領域にて作用する
いわゆる中性ウレアーゼが使用されている。

醗酵食品中の尿素を分解する目的にこれらの中性ウレア
ーゼを利用した試みもなされてきたが醗酵食品の多くは
酸性を示すため中性ウレアーゼではその目的を達するこ
とができないか、もしくは中性ウレアーゼを非常に大量
に使用し、かつ処理温度を10〜20℃の比較的低温域に限
定する必要があることから（特公昭56−20830号）、工
業的実用化の面では経費がかかり過ぎて目的を達するに
は非現実的であるといわざるを得ない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

したがつて本発明は従来の技術、特に中性ウレアーゼを
利用する方法では極めて困難であつた醗酵食品中の尿素
を工業的にしかも安価に分解しうる方法を提供しようと
するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、概説すると、醗酵食品に対してその製造工程
中または製造後に微生物ラクトバチラス・フアーメンタ
ムTK1214（Lactobacillus fermentum TK1214）に属する
酸性ウレアーゼ生産菌の生産した酸性ウレアーゼを作用
させることにより該醗酵食品中の尿素を分解しようとす
るものである。

本発明方法の実施にあたつて使用される酸性ウレアーゼ
の起源には、例えばビヒドバクテリウム・インフアンテ
イス・リベロラム（Bifidobacterium infants ss.liber
orum）、やラクトバチラス・フアーメンタム（Lactobac
illus Fermentum）に属する酸性ウレアーゼ生産菌、例
えばビヒドバクテリウム・インフアンテイス・リベロラ
ムATCC17930、ラクトバチラス・フアーメンタムIIb406
1、ラクトバチラス・フアーメンタムIFO3956、IFO395
9、IFO3071等の生産する酸性ウレアーゼを使用すること
ができる。しかし酸性ウレアーゼの生産能が高くしたが
つて工業的に安価に酸性ウレアーゼを製造しうる理由か
らラクトバチラス・フアーメンタムTK1214またはその変
異株を酸性ウレアーゼの生産起源として用いるのが好ま
しい。

ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214はラツト消化管
内容物より分離されたものであり、その菌学的性質は次
のとおりである。

（ａ）形態的性質顕微鏡的観察（肉汁培地で37℃にて培養）（１）細胞の形および大きさ：通常細胞の大きさ0.5〜1.0μｍ×3.0〜15.0μｍ短桿菌で菌列は柵状構造を示す。

（２）細胞の多形成の有無：有（３）運動性の有無：無（４）胞子の有無：無（５）グラム染色性：陽性（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養： 37℃、24時間の培養で直径0.5〜1mmのフラツト円形コロニーを形成する。表面は滑らかで白色。

（２）肉汁寒天斜面培養： 37℃の培養で糸状、周縁は滑らかで光沢が有り、生育は
普通。

（３）肉汁液体培養： 37℃の培養で24時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 37℃の培養で24時間で生育し、生育は普通。液化はしな
い。

（５）リトマスミルク培養： 37℃の培養で凝固せず色調変化なし。

（ｃ）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：還元せず（２）MRテスト：陽性（３）VPテスト：陰性（４）インドールの生成：生成せず（５）硫化水素の生成：陰性（６）澱粉の加水分解：陰性（７）栄養要求性：チアミン、パントテン酸カルシウ
ム、ナイアチン（８）クエン酸の利用：陰性（９）無機窒素源の利用：陽性（10）ウレアーゼ：陽性（11）オキシダーゼ：陰性（12）カタラーゼ：陰性（13）生育pH:4.5〜7.5 （14）生育温度:18〜45℃ （15）酸素に対する態度：嫌気的ないし微好気的（16）Ｏ−Ｆテスト：醗酵的（17）糖類からのガスの生成：陽性（18）糖類からの酸の生成陽性：リボース、グルコース、ガラクトー
ス、シユクロース、マルトース、ラクトース、メリビオ
ース、ラフイノース陰性：アラビノース、キシロース、ラムノー
ス、マンノース、フラクトース、セロビオース、トレハ
ロース、メレジトース、澱粉、マンニツト、ソルビツ
ト、エスクリン、サリシン、ソルボース以上の諸性質を「バージーズ・マニユアル・オブ・デタ
ミネイテイブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）よ
り検索すると、この菌はラクトバチラス・フアーメンタ
ムと類似していることが判つたが、糖類からの酸の生成
などにおいて異なつているのでラクトバチラス・フアー
メンタムTK1214と命名した。なお本菌株は工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第9136
号として寄託されている。

本菌は微生物の培養に通常用いられている栄養物例え
ば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、カザミノ酸、尿素、グルタミン酸
等に炭素源としてグルコース、シユクロース、マルトー
ス、ラクトース等、無機塩として、第１リン酸カリウ
ム、第２リン酸カリウム、その他硝酸アンモン、塩化ア
ンモン、硝酸ソーダ、クエン酸アンモン等、および、緩
衝作用を維持するため、酢酸ソーダを0.01〜10％、好ま
しくは１〜４％を加え、微量金属としてマグネシウム
塩、第一鉄塩、マンガン塩、ニツケル塩等を加えた培地
にて、18〜45℃好ましくは30〜40℃にて静置条件で良好
に増殖し、培養６〜48時間で酸性ウレアーゼを生産す
る。またウレアーゼ誘導のために尿素、各種ヒドロキサ
ム酸等も培地に添加しうる。

本発明で用いる菌の培養により生産された酸性ウレアー
ゼは菌体内に存在するためその採取に当つては菌体から
の抽出を行なう。抽出は公知の有機溶媒抽出法によるこ
ともできるが、ビーズや超音波を用いた細胞破砕法、界
面活性剤溶液による抽出法等を用いるのが好ましい。

例えば培養後の酸性ウレアーゼが内部に蓄積された菌体
を遠心分離等によつて集め緩衝液に分散させた液、また
は菌体を含んだ培養液に界面活性剤（例えばトリトンＸ
−100、スパン20、スパン80、トウイーン20等）を0.01
〜５％、好ましくは0.05〜２％加える。この時リゾチー
ムを0.001〜10mg/ml、好ましくは0.01〜1mg/ml加えると
抽出効果は向上する。処理後、添加量や菌体濃度によつ
ても異なるが、５〜120時間、好ましくは48〜72時間抽
出したのち凝集剤による凝集、遠心分離などにより菌体
残渣を除去すると粗酵素液をうることができる。所望に
より酸性ウレアーゼは有機溶媒沈殿、塩析、膜濃縮、ゲ
ル過、クロマトグラフイーなどの公知の方法で精製す
ることができる。

本発明において用いるのが好ましいラクトバチラス・フ
アーメンタムTK1214の培養により得られる酸性ウレアー
ゼの酵素化学的および理化学的性質は次のとおりであ
る。

（１）作用：尿素を基質として反応させた時ウレアーゼの反応生成物
であるアンモニアと二酸化炭素が確認された。

（２）基質特異性：基質相対活性（％）尿素 100 カプリヒドロキサム酸０ニコチノヒドロキサム酸０ヒドロキシルアミン０ベンゾヒドロキサム酸０アリル尿素０チオ尿素０ハイドロキシ尿素０メチル尿素０エチル尿素０（３）至適pHおよび安定pH範囲： pH2.8〜4.0付近に至適pHを示す（第１図参照） pH3.5〜7.8付近にて安定（第２図参照）（４）至適温度および熱安定性：至適温度は60℃付近である（第３図参照）熱安定性は60℃付近まで安定（第４図参照）（５）阻害および活性化：（６）安定化（65℃、10分処理）：（７）分子量：ゲル過法により約37,26,18,12万の４個の分子種（何
れも等電点4.2）が観察された。

（８）酵素活性測定法：尿素との反応により生成したアンモニアを比色定量す
る。

（ａ）反応液の組成： 5M尿素 0.05ml 0.1Mアセテートバツフアー（pH4.0） 0.6ml 酵素液 0.1ml （ｂ）反応条件： 37℃、10分間反応させ1.0N・H₂SO₄0.2mlを添加して反応
を停止し、反応液の１部をとりインドフエノール試薬に
より発色させ630nmの吸光度を測定し、生成したアンモ
ニア量を定量することにより分解された尿素量を測定す
る。

（ｃ）酵素活性：酸性ウレアーゼ１単位（IU）はpH4.0、37℃の条件で１
分間に尿素を１μmole分解する尿素量とする。

なおラクトバチラス・フアーメンタムTK1214を用いた酸
性ウレアーゼの製造の詳細は同一出願人による同日付特
許出願明細書に記載されている。

本発明の実施にあたつては、酸性ウレアーゼは任意適当
な形で使用することができる。例えば培養菌体あるいは
公知の菌体固定化法による固定化菌体、例えばアルギン
酸カルシウムゲル抱括法、ゼラチンとのグルタルアルデ
ヒド架橋法、DEAE−吸着体への固定化法、ヘキシルアミ
ン−吸着体への固定化法、ヒドロキサム酸誘導体−吸着
体への固定化法等にて固定した菌体をそのまま使用する
こともできる。また前述の如き菌体からの抽出液、その
濃縮物もしくは精製品、またはこれを上述のような固定
化手段で固定化した形態のもの等としても使用できる。

本発明方法において酸性ウレアーゼを作用させる醗酵食
品としては清酒、ビール、ワインをはじめとする各種醸
造酒、ウイスキー、ブランデイーなどの各種蒸溜酒、味
噌、醤油などの醗酵調味料、パン生地、ヨーグルトなど
醗酵過程が製造工程に含まれる食品があげられる。

かかる醗酵食品に対して酸性ウレアーゼを作用させるに
は任意適当な手段によることができる。例えば酸性ウレ
アーゼの粉末または溶液を醗酵食品に直接添加して作用
させる方法、酸性ウレアーゼ含有菌体、該菌体の固定化
物、酸性ウレアーゼの固定化物等の固形状態物に醗酵食
品をバツチ式または連続的に接触させる方法などを採る
ことができる。またかかる酸性ウレアーゼは製造後の醗
酵食品のみならず、その製造工程においても作用させる
ことができる。

多くの醗酵食品は元来酸性を示す。すなわち酒類または
その醪工程を例にとればpH3.0〜5.0の範囲であり、酸性
ウレアーゼの作用pH域に十分包含される。従つて酸性ウ
レアーゼの活性が有効に作用するためその必要量が従来
の中性ウレアーゼを使用した試みに比較して極めて少量
で足りる。

このようにして醗酵食品またはその製造工程中の中間品
に対して本発明により酸性ウレアーゼを作用させると尿
素濃度は作用時間に対してほぼ対数的に減少し、検出限
界以下の濃度にまで低下させることができる。

またラクトバチラス・フアーメンタムTK1214起源の酸性
ウレアーゼのエタノールに対する阻害定数Ki値は約40％
と高く、ナタ豆の中性ウレアーゼのそれが約９％である
ことと比較すると酸性ウレアーゼは酒類中ですぐれた安
定性を有することが明らかである。

本発明を実施するにあたつての酸性ウレアーゼの使用
量、作用温度、作用時間等は被処理食品の種類、尿素含
量の如何、用いる酸性ウレアーゼの形態、処理方法等に
応じて広範囲にわたり変化しうるのでこれらを一概に規
定することができないが、具体的条件は個々の場合に対
応して容易に選定しうるものである。

なお醗酵食品中の尿素測定およびカルバミン酸エチルエ
ステルの測定は下記の方法によつた。

醗酵食品中の尿素測定法ベーリンガーマンハイム（社）尿素測定用Ｆキツト法に
よつた。この分析方法は、上記反応で減少するNADHを波長340nmで比色定量するこ
とにより尿素濃度を求めた。

カルバミン酸エチルエステル測定法公知のカルバミン酸エチルエステル測定法（Mitt.Gebie
t Lebensm.Hyg,Band 77p327〜332（1986））に従つて、
液体試料にあつてはそのまま、固体泥状試料にあつては
50℃程度の温水で抽出し、遠沈上澄液の一定量をエキス
トレルート（メルク社製）に吸収させた後ジクロルメタ
ンで抽出する。抽出液をクデルナダニツシユ濃縮装置で
濃縮後検出器としてFIDを装備したガスクロマトグラフ
イーにて定量した。

〔実施例〕

以下実施例について本発明を具体的に例示するが、本発
明はかかる特定の実施例の記載によつて限定されるもの
ではない。

実施例１清酒製成工程への適用例（１）清酒原酒（アルコール20％、pH4.3、尿素35ppm）
1000mlに対し、ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214
起源の酸性ウレアーゼ粉末5mg（20IU相当）を添加し
て、10,15,30,45℃の各温度にて作用させた。その結
果、45℃では８時間、30℃では14時間、15℃では２日
間、10℃では４日間の反応でそれぞれ尿素は不検出に至
つた。

また同じ清酒原酒に同量の酸性ウレアーゼ粉末を添加し
た後、65℃、30分間の火入れを行ない、冷却後15℃にて
保存したところ４日後には尿素が不検出に至つた。

（２）常法に従い実施例１（１）の酸性ウレアーゼを２
％アルギン酸カルシウムゲルにより抱括固定化した固定
化酸性ウレアーゼを調製した。このビーズ状の固定化酸
性ウレアーゼ50ml（50IU相当）をガラスカラムに充填
し、上向流SV17にて上と同じ清酒原酒500mlを循環し
た。反応系全体を10℃に保つた場合、３日後には清酒中
の尿素は不検出に至つた。この固定化酸性ウレアーゼ使
用、カラム型反応器は10℃、２カ月間の連続運転後も活
性の低下がほとんど認められず極めて安定であつた。

（３）同じく２％アルギン酸カルシウムゲルにより固定
化した固定化酸性ウレアーゼ50ml（250IU相当）をナイ
ロン網袋中に入れて同じ清酒原酒5000ml中につるし、ゆ
るやかに撹拌しながら12℃にて反応させたところ10日後
には尿素濃度が不検出に至つた。

（４）酸性ウレアーゼ生産菌、ラクトバチラス・フアー
メンタムTK1214（Lactobacillus Fermentum TK1214）の
培養菌体を同じく２％アルギン酸カルシウムゲルにより
固定化したビーズ状の固定化菌体50ml（100Iu相当）を
ガラスカラムに充填し、上向流SV17、作用温度15℃にて
同じ清酒原酒500mlを循環した。４日後には尿素は不検
出に至つた。

（５）また酸性ウレアーゼ生産菌、ビフイドバクテリウ
ム・インフアンテイス・リベロラムATCC17930（Bifidob
acterium infantis ss.liberorum ATCC17930）を起源と
する精製酸性ウレアーゼ粉末50mg（20IU相当）を同じ清
酒原酒1000mlに添加して15℃、３日間作用させたところ
尿素は不検出に至つた。

以上いずれの場合も酸性ウレアーゼの作用による異味異
臭の発生は認められなかつた。

実施例２清酒醪工程への適用例総米1kgの小仕込みを行なつた。酒母は日本醸造協会頒
布第701号酵母による普通速醸▲もと▼、汲水歩合135
％、３段仕込みで醪品温は15℃恒温とした。留添時にラ
クトバチラス・フアーメンタムTK1214起源の酸性ウレア
ーゼ粉末15mg（60IU相当）を添加した試験醪と無添加の
対照醪における炭酸ガス発生量と尿素濃度の変化を第５
図に示した。なお第５図において▲印は酸性ウレアーゼ
使用醪における発生炭酸ガス量、△印は対照醪における
発生炭酸ガス量、●印は酸性ウレアーゼ使用醪中の尿素
濃度、○印は対照醪中の尿素濃度をそれぞれ示す。第５
図から明らかなように対照醪と試験醪の間には炭酸ガス
の発生量で示される醗酵速度に関しては全く差が認めら
れなかつた。

一方尿素濃度については対照醪では留添後４日目から漸
次増加し、上槽直前の熟成醪中では約30ppmに達したの
に対し、酸性ウレアーゼを添加した試験醪においては留
添後２日目から４日目までの間に急速に減少し、以後漸
次減少を続け、上槽時には1ppm以下の濃度に至らしめる
ことができた。

両者を上槽した清酒は官能的に全く差が認められなかつ
た。

実施例３果実酒への適用例市販白ブドウ酒（アルコール12％、pH3.5、尿素3.0pp
m）500mlにラクトバチラス・フアーメンタムTK1214起源
の酸性ウレアーゼ粉末1mg（4IU相当）を添加し、室温に
て作用させたところ24時間後には尿素は検出されなかつ
た。また官能的には全く変化が認められなかつた。

実施例４醤油への適用例（１）醤油は17％もの食塩を含有する特異な醗酵食品で
あり、高濃度のナトリウムやマグネシウム等の金属イオ
ンが酸性ウレアーゼの活性発現に影響をおよぼすことも
考えられたが、以下の実験結果から醤油中においても酸
性ウレアーゼは順調に作用することが確認され本発明が
適用できることが明らかになつた。

すなわち食塩17％、塩化マグネシウム0.3％を含有する1
/50Mクエン酸緩衝液中で酸性ウレアーゼは順調に作用
し、かかる高塩濃度下においても尿素を速やかに分解し
た。また醤油は見掛けの色が濃いばかりでなく紫外部に
おける吸光度も非常に大きいため、原液を直接尿素測定
に供することは困難である。そこで醤油500mlに対し尿
素2000ppm、ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214起
源の酸性ウレアーゼ50mg（200IU相当）を添加して30
℃、４時間反応させた後、100倍に希釈して尿素を測定
した。その結果この条件下で原醤油に換算して約600ppm
尿素濃度が低下したことが明らかになり、酸性ウレアー
ゼは何ら問題なく作用することがわかつた。

（２）生揚げ醤油1000mlに上記と同じ酸性ウレアーゼ粉
末5mg（20IU相当）を添加して、30℃にて２日間作用さ
せた試験区と、未処理の対照区とをそれぞれpH4.0に調
整後に80℃、４時間の加熱を行なつた。両者のカルバミ
ン酸エチルエステルを分析したところ対照区では66ppb
含有されていたのに対し試験区では7ppbとほぼ1/10の含
有量に抑えることができた。

醤油中の尿素は微量であり、また前述した理由により直
接測定が困難であるが、尿素がカルバミン酸エチルの主
たる前駆物質であることと、この結果から試験区では対
照区に比較して尿素も1/10程度の濃度にまで分解・消去
されたことは明白である。

〔効果〕

本発明によれば醗酵食品中の尿素を分解することが可能
になつた。しかも酸性ウレアーゼが低pH域でも良好に作
用し、かつ耐アルコール性に優れるために、処理に係る
経費を大幅に低減することができ、工業的実施が可能に
なつた。

さらに本発明における酸性ウレアーゼが清酒のような低
pH、高アルコール含有食品中において優れた耐熱性を有
し、またアルギン酸カルシウムゲルによる簡易な抱括固
定化品においてさえも長期にわたり安定した活性を維持
したこと、さらには高塩濃度下においても順調に作用し
得たことは工業的規模での醗酵食品中の尿素の分解を実
施するに当り、工程の操作・管理を極めて容易ならしめ
るものであり、その意義は大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いうるラクトバチラス・フアーメン
タムTK1214起源の酸性ウレアーゼの各pHにおける活性を
表わすグラフ、第２図は各pHにおける30℃、30分間処理
によるpH安定性を表わすグラフ、第３図は各温度におけ
る活性を表わすグラフ、第４図は各温度における10分間
処理による熱安定性を示すグラフである。第５図は清酒
醪工程に酸性ウレアーゼを作用させた場合の醗酵速度な
らびに尿素濃度を対照と比較したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｇ 3/08 Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者小橋恭一富山県富山市千原崎２の４ (72)発明者竹部幸子富山県富山市新庄町117の１ (72)発明者小林健文兵庫県宝塚市安倉南１丁目1361−２ (72)発明者本田末広兵庫県宝塚市光ガ丘１丁目18番19号 (72)発明者草井清大阪府豊中市紫原町１丁目６番７号 (72)発明者三島秀夫兵庫県神戸市東灘区住吉東町３丁目11番９号 (56)参考文献特開平１−104155（ＪＰ，Ａ) 特公昭56−20830（ＪＰ，Ｂ２) Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．37，Ｎｏ．３，Ｐ. 379−382（1979)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】醗酵食品に対してその製造工程中または製
造後に微生物ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214
（Lactobacillus fermentum TK1214）に属する酸性ウレ
アーゼ生産菌の生産した酸性ウレアーゼを作用させるこ
とを特徴とする醗酵食品中の尿素を分解する方法。