JPH0797987B2 - 新規なβ−アガラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物由来の新規なβ−アガラーゼ及びその
製造法に関する。さらに詳しくは、シュードモナス（Ps
eudomonas）属に属する細菌を培養して得られる新規な
β−アガラーゼ及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

アガロースは、テングサ，オゴノリなどの海藻（紅藻）
から得られれ多糖類で、古くから食品用に供されてきて
いる寒天の主成分である。その構造は第１図に示したよ
うに、Ｄ−ガラクトースと3,6−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースが交互にβ−1,4結合，α−1,3結合した多糖で
ある。また、寒天にはアガロースに硫酸やピルビン酸が
部分的にエステル結合したアガロペクチンも含まれてい
る。

アガロースを部分加水分解すると、オリゴ糖が得られる
が、加水分解方法によって異なったオリゴ糖が生成する
ことが知られている。今までの知見をまとめると、アガ
ロースの加水分解様式は第１図のようになる。すなわ
ち、希酸で弱く加水分解すると、α−1,3結合が比較的
選択的に分解されアガロビオース（酸（１），酸
（２），酸（３）の各位置で加水分解された２糖）をは
じめとするアガロオリゴ糖が得られる（C.Araki,Procee
dings of 4th Int.Congress of Biochemistry 1,15〜30
（1959）Pergamon Press Ltd.）。

また別にα−1,3結合を分解して、アガロテトラオース
（α−アガラーゼ（１），（２）を分解）を主として生
成するα−アガラーゼも知られている（K.S.Youngら,Ca
rbohydrate Research66 207〜212（1978））。

一方、β−1,4結合は酵素β−アガラーゼによってのみ
選択的に分解されて主としてネオアガロテトラオース
（β−アガラーゼ（１）と（２），ネオアガロヘキサオ
ース（β−アガラーゼ（１）と（３））を生ずる（L.M.
Morriceら,European Journal of Biochemistry 137,149
−154（1983）など）。

一般にβ−アガラーゼはネオアガロテトラオース以下の
オリゴ糖は加水分解できず、これらのオリゴ糖は別の酵
素で分解されることが知られている（H.J.van der Meul
enら、Antonie van Leeuwenhoek 42,81〜94（1976）な
ど）。

寒天の主要な用途は食品用であり、ゲル化剤，増粘剤と
して幅広く使われ、他にはゲル形成能を利用した試薬，
培地原料，クロマトグラフ用担体，電気泳動用担体、さ
らには歯科印象剤，芳香・消臭剤などの用途がある。一
方、酵素分解などによって得られるオリゴ糖類の用途は
未開発であたが、最近澱粉老化防止作用，静歯作用，難
消化性が明らかになり、（特開昭62−210955,同62−210
965,同62−210974）、新たな用途開発が期待されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

寒天のオリゴ糖を効率良く製造するためには、酵素によ
る部分加水分解法は酸による方法よりもオリゴ糖の収
率，脱色脱塩などの精製の容易性，作業性，製造装置の
簡易性等の点で明らかに優れている。しかし、今までに
知られている寒天分解酵素アガラーゼはその殆んどが、
海水，海藻，海辺の土壌など海由来の微生物から調製さ
れたものである。一般に海洋性微生物から得られる酵素
の耐熱性は低いことが知られており、アガラーゼもまた
その至適温度が高いもので40〜45℃で、多くは40℃以下
である。一方、寒天は高温（80℃以上）で水に溶解する
が、寒天溶液の温度を降下させると50〜40℃でゲル化し
てしまい、酵素による分解を非常に受けにくくなる。寒
天をゲル化させないためには基質である寒天の濃度を１
％以下にしなければならず、オリゴ糖の生産性を著しく
低めてしまうという課題がある。従って、これらの課題
を解決するために耐熱性の酵素が必要となってきてい
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは上記の課題を解決するための、耐熱性の向
上したアガラーゼを取得すべく鋭意検討を重ねた結果、
シュードモナス属に属する微生物によって産生される新
規なβ−アガラーゼが従来より優れた耐熱性を有するこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、このように微生物由来の優れた耐熱
性を有する新規なβ−アガラーゼを供給することにより
寒天オリゴ糖の製造を工業的に容易に実施可能とするも
のである。

本発明は第１に以下に示す理化学的性質を有する新規な
β−アガラーゼに関する。

作用 アガロースのβ−1,4結合を加水分解して急速にアガロ
ース溶液の粘度を低下させ、主としてネオアガロテトラ
オースとネオアガロヘキサオースを生成する。

基質特異性 β−1,4ガラクトシド結合を有するアガロース，アガロ
ペクチン，寒天などのガラクタン系の多糖類ならびにネ
オアガロオクタオース以上の少糖類に作用する。ネオア
ガロヘキサオース，ネオアガロテトラオース，ネオアガ
ロビオースには作用しにくく、乳糖には作用しない。

至適pH及びpH安定性 寒天を基質としたとき至適pHは7.0であり、45℃,30分，
基質非存在の条件下ではpH5〜９で安定である。

至適温度及び熱安定性 寒天を基質としたとき至適温度は50℃であり、pH6.0,30
分，基質非存在の条件下では45℃では安定、50℃で約75
％、55℃で約35％の活性が残存している。

失活の条件 pH6.0,65℃,30分以上又はpH6.0,100℃,10分でほぼ完全
に失活する。

分子量 360,000（ゲル濾過クロマト法） 等電点 4.9（等電点電気泳動法） 金属塩の影響 pH6.0,45℃,1mMの金属塩濃度下、３時間の処理でFe⁺⁺⁺,
Hg⁺⁺,Ag⁺⁺,Al⁺⁺⁺が10％以下、Cu⁺⁺,Zn⁺⁺が約50〜80％の
残存活性を示し、Na⁺,K⁺,Mg⁺⁺,Co⁺⁺,Mn⁺⁺,Pb⁺⁺では安定
である。また、Ca⁺⁺によって活性化されたEDTA（5mM）
で残存活性が10％以下となる。

本発明のβ−アガラーゼの至適pH（基質:0.5％,0.5ml、
温度:45℃、反応時間10分）を第２図に、pH安定性（45
℃,30分静置、45℃,pH6,10分にて活性測定）を第３図
に、至適温度（基質:0.5％,0.5ml、pH6、リン酸緩衝
液、反応時間10分）を第４図に、熱安定性（pH6,30分静
置、45℃,pH6,10分にて活性測定）を第５図にそれぞれ
示す。

本発明のβ−アガラーゼは分子量，至適温度，耐熱性が
高いことにおいて従来のアガラーゼとは全く異なるが、
その他の性質、たとえば等電点，至適pH,基質特異性に
ついては近似するアガラーゼがある。

第２に本発明は、シュードモナス（Pseudomonas）属に
属し、上記の性質を有する新規なβ−アガラーゼの産生
する微生物を培養し、培養液中に該酵素を蓄積させて分
離、採取することを特徴とするβ−アガラーゼの製造法
に関する。本発明の新規なβ−アガラーゼは微生物を用
いて生産されるが、その生産菌としてはシュードモナス
（Pseudomonas）属に属し、上記性質をする酵素を生産
する能力を有する微生物であればよく、例えば本発明者
らによって新たに土壌から分離されたシュードモナス・
エスピー Ｎ−７（Pseudomonas sp.N−７）が挙げられ
る。本菌株は微工研菌寄第9884号として微生物工業技術
研究所に寄託されており、その菌学的性質は以下の通り
である。

（１） 形態 細胞の形および大きさ 桿菌 0.2〜0.4μｍ×1.0〜2.0μｍ 多形性 なし 運動性 あり 鞭毛 極鞭毛１本を有する 胞子形成 なし グラム染色 陰性 抗酸性 なし （２） 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培地 生育は微弱である。

肉汁液体培養（人工海水使用） 普通の生育、着脱色なし、表面生育なし、沈渣を生じ
る。

マリンアガー平板培地（ディフコ社） 生育は良好、形状は円形であるが、寒天を穿孔し孔の表
面に付着して生育する。コロニー周辺の寒天の濁りは透
明となる。色調は黄白色。

（３） 生理学的性質 硝酸塩の還元：陽性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 デンプンの加水分解：陽性 無機窒素源の利用： 硝酸塩，アンモニウム塩を窒素源として利用する。

色素生成：黄白色の非水溶性色素を生成する。

オキシダーゼ：陰性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲： 温度10〜45℃で生育し、28〜37℃が至適である。生育の
pHは中性付近が適している。

酸素に体する態度：好気的にのみ生育する。

Ｏ−Ｆテスト:O型 糖からの酸の生成 糖 類 酸生成 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース − 麦芽糖 ＋ ショ糖 − 乳 糖 ＋ トレハロース ＋ Ｄ−トルビトール − Ｄ−マンニトール − イノシトール − グリセリン − デンプン ＋ アドニトール − ネオアガロテトラロース ＋ ネオアガロヘキサオース ＋ アガロース ＋ 寒 天 ＋ （４） その他の諸性質 DNアーゼの生産：陰性 ゼラチン分解テスト：陰性 アルギニン分解テスト：陰性 エスクリンの分解性：陽性 好塩性試験： 好塩性（人工海水と水道水を用いた同一培地で比較） 以上の菌学的性質を有する本菌株について、バージェイ
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriolog
y）（1986年），海洋微生物研究法（学会出版センター,
1985年）に基づき検索した結果、シュードモナス（Pseu
domonas）属に属する菌株と同定した。また、本菌株を
詳細に比較すると、本菌株はシュードモナス属に属する
新菌株の可能性が大と認め、シュードモナス・エスピー
Ｎ−７（Pseudomonas sp.N−７）と命名した。

本発明に用いる微生物としては、本菌株とその変種，変
異体に限定されるものでなく、新規なβ−アガラーゼ生
産能を有するものであれば良い。

本発明の新規なβ−アガラーゼの生産菌は、公知の常法
によって培養することができる。使用する培地としては
炭素源，窒素源，無機化合物及びその他の栄養素を適当
量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいず
れも使用可能であり、液体または固体の培地を用いて培
養することができる。具体的には炭素源としては、アガ
ラーゼが誘導酵素であるので、寒天，アガロース，アガ
ロペクチン，寒天の部分加水分解物，さらには寒天の原
料であるテングサ，オゴノリなどの紅藻類を単独あるい
は併用して用いることが出来る。なお、グルコースなど
他の炭素源を併用することも可能である。

また、窒素源としては肉エキス，ペプトン，酵母エキ
ス，乾燥酵母，大豆粉，アゼイン，カザミノ酸，各種ア
ミノ酸，コーンスティープリカー，フィッシュミール，
尿素など動物，植物，微生物由来の蛋白質、その加水分
解物のような有機窒素源や各種無機アンモニウム塩，硝
酸塩などの無機窒素化合物を使用微生物の資化性を考慮
して１種または２種以上を適宜選択して用いる。

無機塩としてナトリム，マグネシウム，カルシウム，
鉄，亜鉛，マンガン，銅などのリン酸塩，塩酸塩，硫酸
塩，炭酸塩，酢酸塩などの１種または２種以上を適宜添
加するか、好塩性の菌を使用する場合には、人工海水を
使用する食塩濃度を海水濃度程度までの適当な範囲で設
定して用いることができる。また、必要に応じて植物
油，界面活性剤などの消泡剤を添加しても良い。

培養は、前記培地成分を含む液体培地中で振とう培養，
通気撹拌培養，連続培養など通常の培養法を用いて実施
できる。培養条件は培地の種類，培養法により適宜選択
すれば良く、アガラーゼ生産菌が増殖しβ−アガラーゼ
を産生できる条件であれば特段の制限はない。通常、培
養初発pH6.5〜8.5,25〜37℃で通気撹拌して培養するの
が好ましい。培養日数は通常１〜２日が適当である。

以上のようにして培養中に産生されたβ−アガラーゼは
次のような方法で分離、回収できる。本β−アガラーゼ
は主に菌体外に蓄積されるので、培養終了後、菌体を濾
過，遠心分離等の方法で除去して培養濾液を得る。菌体
酵素については通常用いられる手段により菌体を破砕し
てβ−アガラーゼを抽出し、用いることができる。

得られた酵素を含む液をそのまま真空濃縮又は限外濾過
膜を用いて濃縮して液状酵素として、あるいは凍結乾燥
法，噴霧乾燥法により粉末化して用いることができる。
別な方法としては通常用いられる精製方法、例えば硫安
塩析，溶媒沈澱法によりβ−アガラーゼを沈澱させ精製
する方法、あるいはイオン交換クロマト，ゲル濾過クロ
マト，さらにはアガロースアフィニティ吸着法，クロマ
トフォーカシング，等電点電気泳動などの精製方法を１
種あるいは２種以上組合わせて高純度に精製する方法を
用いることもできる。

本発明でのβ−アガラーゼの活性測定法は以下の通りで
ある。pH6.0,0.1M酢酸緩衝液に希釈溶解した酵素0.5ml
を45℃に保温しておき、これに0.5％寒天溶液（45℃に
予熱）0.5mlを添加して反応を開始させる。反応は45℃
で10分間行ない、反応停止はソモギー液を添加すること
で行ない、ソモギー・ネルソン法で還元糖を定量する。
活性は１μm moleのガラクトースに相当する還元力を生
成する酵素量を１単位として表示する。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ シュードモナス・エスピー Ｎ−７（Pseudomonas sp.N
−７）（微工研菌寄第9884号）を天草裁断物1.5％，ポ
リペプトン0.5％，酵母エキス0.5％を人工海水に懸濁溶
解し、pH6.5に調整し殺菌した培地40ml（200ml三角フラ
スコ）に１白金耳植菌し、25℃で45時間振とう培養し
た。培養終了後、菌体と天草残渣を遠心分離で除去し、
酵素活性を測定したところ、β−アガラーゼが0.19単位
/ml生産されていた。

実施例２ ジュードモナス・エスピー Ｎ−７（微工研菌寄第9884
号）を粉末寒天0.7％，グルコース0.1％，硝酸ナトリウ
ム0.5％，酵母エキス0.5％，硫酸マグネシウム0.2％，
塩化カルシウム0.2％，塩化ナトリウム2.0％を含むpH8.
5の培地40ml（200ml三角フラスコ）に１白金耳植菌し、
37℃で１日振とうして前培養した後、この前培養液を同
じ培地1.5を含む３ジャーファーメンターに植菌し
た。37℃で24時間、通気量1.5/min撹拌速度400rpmの
条件で培養した。

培養終了後、菌体を遠心分離で除去して培養濾液1.4
を得た。培養濾液中のアガラーゼ活性は1.0単位/mlであ
った。この培養濾液を分画分子量１万の限外濾過膜で約
20培に濃縮したところ、21.3単位/mlの酵素液60mlを得
た。

実施例３ シュードモナス・エスピー Ｎ−７（微工研菌寄第9884
号）をアガロース0.5％，硝酸ナトリウム0.5％，酵母エ
キス0.5％を人工海水に溶解したpH7.5の培地で前培養し
た。前培養液を同組成の培地15を入れた30ジャーフ
ァーメンターに植菌し、30℃で30時間培養した。培養
中、通気量は15/minとし、200rpmの撹拌を行なった。

培養終了後、菌体を濾過により除き培養濾液を得た。培
養濾液中のアガラーゼ活性は1.1単位1mlであった。培養
濾液をCL−セファロース6B（ファルマシア社）50mlのカ
ラムに500ml/hrの流速で通液しアフィニティー吸着さ
せ、水洗浄後、２％ネオアガロオリゴ糖溶液500mlで溶
出しアガラーゼを溶出した。その後、常法として用いら
れているDEAEトヨパール（東ソー社），トヨパールHW55
S,クロマトフォーカシングで精製してほぼ鈍品に近い精
製酵素を得た（22単位/mg蛋白質）。なお、活性収率は
約15％であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ジュードモナス属に属する細菌を培養
することにより新規なβ−アガラーゼが得られる。この
酵素は優れた耐熱性を有しているため、寒天オリゴ糖の
工業的製造に利用することができる。寒天オリゴ糖は澱
粉老化防止作用，静菌作用，難消化性などの性質を有し
ており、様々な分野での利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図はアガロースの構造と加水分解様式を示すもので
ある。 第２図は本発明のβ−アガラーゼの至適pHを示すもので
ある。 第３図は本発明のβ−アガラーゼのpH安定性を示すもの
である。 第４図は本発明のβ−アガラーゼの至適温度を示すもの
である。 第５図は本発明のβ−アガラーゼの熱安定性を示すもの
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北川 広進 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気化 学工業株式会社中央研究所内 (72)発明者 平賀 哲男 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株式 会社島津製作所中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有する新規なβ−ア
   ガラーゼ。 作用 アガロースのβ−1,4結合を加水分解して急速にアガロ
   ース溶液の粘度を低下させ、主としてネオアガロテトラ
   オースとネオアガロヘキサオースを生成する。 基質特異性 β−1,4ガラクトシド結合を有するアガロース，アガロ
   ペクチン，寒天などのガラクタン系の多糖類ならびにネ
   オアガロオクタオース以上の少糖類に作用する。ネオア
   ガロヘキサオース，ネオアガロテトラオース，ネオアガ
   ロビオースには作用しにくく、乳糖には作用しない。 至適pH及びpH安定性 寒天を基質としたとき至適pHは7.0であり、45℃,30分，
   基質非存在の条件下ではpH5〜９で安定である。 至適温度及び熱安定性 寒天を基質としたとき至適温度は50℃であり、pH6.0,30
   分，基質非存在の条件下では45℃では安定、50℃で約75
   ％、55℃で約35％の活性が残存している。 失活の条件 pH6.0,65℃,30分以上又はpH6.0,100℃,10分でほぼ完全
   に失活する。 分子量 360,000（ゲル濾過クロマト法） 等電点 4.9（等電点電気泳動法） 金属塩の影響 pH6.0,45℃,1mMの金属塩濃度下、３時間の処理でFe⁺⁺⁺,
   Hg⁺⁺,Ag⁺,Al⁺⁺⁺が10％以下、Cu⁺⁺,Zn⁺⁺が約50〜80％の
   残存活性を示し、Na⁺,K⁺,Mg⁺⁺,Co⁺⁺,Mn⁺⁺,Pb⁺⁺では安定
   であるまた、Ca⁺⁺によって活性化され,EDTA（5mM）で残
   存活性が10％以下となる。
2. 【請求項２】シュードモナス（Pseudomonas）属に属す
   る請求項１記載の理化学的性質を有する新規なβ−アガ
   ラーゼ生産菌を培養し、培養物から該β−アガラーゼを
   採取することを特徴とする新規なβ−アガラーゼの製造
   法。
3. 【請求項３】シュードモナス（Pseudomonas）属に属す
   る新規なβ−アガラーゼ生産菌がシュードモナス・エス
   ピー Ｎ−７（Pseudomonas sp.N−７）（微工研菌寄第
   9884号）である請求項２記載の製造法。