JPH0819391A - サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 - Google Patents
サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株Info
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- JPH0819391A JPH0819391A JP31382394A JP31382394A JPH0819391A JP H0819391 A JPH0819391 A JP H0819391A JP 31382394 A JP31382394 A JP 31382394A JP 31382394 A JP31382394 A JP 31382394A JP H0819391 A JPH0819391 A JP H0819391A
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- new strain
- galactosidase
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Abstract
(57)【要約】
【構成】75〜85℃の至適作用温度を有し、4.５〜6.５の
至適 pＨを有し、かつ50ミリモルのガラクトース及びグ
ルコースによって酵素活性が実質的に低下しない新規な
β−ガラクトシダーゼを産生することを特徴とするサー
マス属に属する新菌株。 【効果】 本発明によれば、耐熱性が高く、かつ作用 p
Ｈ域が広く、さらに反応生成物による阻害度の低いβ−
ガラクトシダーゼを産生することが可能な新菌株を提供
することができる。
至適 pＨを有し、かつ50ミリモルのガラクトース及びグ
ルコースによって酵素活性が実質的に低下しない新規な
β−ガラクトシダーゼを産生することを特徴とするサー
マス属に属する新菌株。 【効果】 本発明によれば、耐熱性が高く、かつ作用 p
Ｈ域が広く、さらに反応生成物による阻害度の低いβ−
ガラクトシダーゼを産生することが可能な新菌株を提供
することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なβ−ガラクトシダ
ーゼを産生するサーマス属に属する新菌株に関する。
ーゼを産生するサーマス属に属する新菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−ガラクトシダーゼは、ラクトース
（乳糖）をグルコースとガラクトースとに分解する酵素
であり、乳糖分解乳又は乳糖分解液などの食品の製造に
利用されている。このβ−ガラクトシダーゼは動植物を
はじめとして、かび、酵母、細菌などの微生物に至るま
で広く存在するが、現在、食品工業で使用されている酵
素は主としてかびあるいは酵母に由来する比較的耐熱性
の低いβ−ガラクトシダーゼである。これらのβ−ガラ
クトシダーゼについては特公昭53-24094号公報 (先例
１) 、特開昭52-44287号公報 (先例２) に開示されてい
る。
（乳糖）をグルコースとガラクトースとに分解する酵素
であり、乳糖分解乳又は乳糖分解液などの食品の製造に
利用されている。このβ−ガラクトシダーゼは動植物を
はじめとして、かび、酵母、細菌などの微生物に至るま
で広く存在するが、現在、食品工業で使用されている酵
素は主としてかびあるいは酵母に由来する比較的耐熱性
の低いβ−ガラクトシダーゼである。これらのβ−ガラ
クトシダーゼについては特公昭53-24094号公報 (先例
１) 、特開昭52-44287号公報 (先例２) に開示されてい
る。
【０００３】一方、耐熱性を有するβ−ガラクトシダー
ゼについては、バイオテクノロジー・アンド・バイオエ
ンジニアリング (Biotechnology and Bioengi-neerin
g), 26巻, 1141頁, 1984年 (先例３) 、ジャーナル・オ
ブ・アプライド・マイクロバイオロジー(Journal of Ap
plied Microbiology),２巻，390 頁, 1980年 (先例
４)、カナディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイ
オロジー (CanadianJournalof Microbiology), 22巻, 8
17 頁, 1976年 (先例５), 特開昭56-154991 号公報(先
例６）及びジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journ
al of Bacteriology), 110巻, 691 頁, 1972年 (先例
７) に開示されている。しかしながら後述するように
（第２表参照）、これら従来のβ−ガラクトシダーゼは
いずれもが、低い耐熱性、至適 pＨ域の狭小あるいは反
応生成物による酵素作用の阻害の１以上を有している。
従って実用に供されていないのが実情である。
ゼについては、バイオテクノロジー・アンド・バイオエ
ンジニアリング (Biotechnology and Bioengi-neerin
g), 26巻, 1141頁, 1984年 (先例３) 、ジャーナル・オ
ブ・アプライド・マイクロバイオロジー(Journal of Ap
plied Microbiology),２巻，390 頁, 1980年 (先例
４)、カナディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイ
オロジー (CanadianJournalof Microbiology), 22巻, 8
17 頁, 1976年 (先例５), 特開昭56-154991 号公報(先
例６）及びジャーナル・オブ・バクテリオロジー(Journ
al of Bacteriology), 110巻, 691 頁, 1972年 (先例
７) に開示されている。しかしながら後述するように
（第２表参照）、これら従来のβ−ガラクトシダーゼは
いずれもが、低い耐熱性、至適 pＨ域の狭小あるいは反
応生成物による酵素作用の阻害の１以上を有している。
従って実用に供されていないのが実情である。
【０００４】上述のように、現在工業的規模で食品の製
造に使用されているβ−ガラクトシダーゼは比較的耐熱
性が低い酵素である。このため乳糖分解処理工程は一般
に55℃以下で行なわれており、また、原料である牛乳又
は乳糖液が細菌の栄養源として良好なものであるため、
処理中の雑菌汚染による腐敗及び固定化されたβ−ガラ
クトシダーゼにあっては、製造終了後充分な洗浄殺菌が
できない等、製造上の重大な問題となっている。こうし
た問題を解決するため、耐熱性β−ガラクトシダーゼを
用いて雑菌が増殖し難い高温での目的物の処理、あるい
は洗浄、殺菌が望まれており、工業的に使用しうる耐熱
性β−ガラクトシダーゼの開発が強く要望されている。
造に使用されているβ−ガラクトシダーゼは比較的耐熱
性が低い酵素である。このため乳糖分解処理工程は一般
に55℃以下で行なわれており、また、原料である牛乳又
は乳糖液が細菌の栄養源として良好なものであるため、
処理中の雑菌汚染による腐敗及び固定化されたβ−ガラ
クトシダーゼにあっては、製造終了後充分な洗浄殺菌が
できない等、製造上の重大な問題となっている。こうし
た問題を解決するため、耐熱性β−ガラクトシダーゼを
用いて雑菌が増殖し難い高温での目的物の処理、あるい
は洗浄、殺菌が望まれており、工業的に使用しうる耐熱
性β−ガラクトシダーゼの開発が強く要望されている。
【０００５】このような要望に対処するため、前記のよ
うに耐熱性のβ−ガラクトシダーゼを検索する試みがな
され、種々の耐熱性β−ガラクトシダーゼが発見され
た。しかしながら、従来得られた耐熱性β−ガラクトシ
ダーゼには工業的に使用する上で必要と考えられる次の
〜に記載する酵素学的性質をすべて備えたものは存
在せず、未だ実用化の域には達していない。 耐熱性が充分であること：牛乳および脱脂乳の熱凝
固は78〜80℃でおこるため、酵素処理はこの温度以下で
可及的に高温であることが望ましい。従って70〜75℃付
近での酵素の熱安定性が充分であることが要求される。 中性〜酸性に至適温度を有すること：β−ガラクト
シダーゼによる加工の対象となる原料としては、牛乳、
脱脂乳、チーズホエー、乳糖液等が想定される。これら
は中性(pＨ6.5)〜酸性(pＨ4.5)の原料であるから、その
範囲で充分な酵素活性を有することが要求される。 反応生成物による酵素活性の阻害度が低いこと：β
−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させたときの反応生成
物であるガラクトースおよびグルコースによる酵素活性
の低下が少ないことが要求される。
うに耐熱性のβ−ガラクトシダーゼを検索する試みがな
され、種々の耐熱性β−ガラクトシダーゼが発見され
た。しかしながら、従来得られた耐熱性β−ガラクトシ
ダーゼには工業的に使用する上で必要と考えられる次の
〜に記載する酵素学的性質をすべて備えたものは存
在せず、未だ実用化の域には達していない。 耐熱性が充分であること：牛乳および脱脂乳の熱凝
固は78〜80℃でおこるため、酵素処理はこの温度以下で
可及的に高温であることが望ましい。従って70〜75℃付
近での酵素の熱安定性が充分であることが要求される。 中性〜酸性に至適温度を有すること：β−ガラクト
シダーゼによる加工の対象となる原料としては、牛乳、
脱脂乳、チーズホエー、乳糖液等が想定される。これら
は中性(pＨ6.5)〜酸性(pＨ4.5)の原料であるから、その
範囲で充分な酵素活性を有することが要求される。 反応生成物による酵素活性の阻害度が低いこと：β
−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させたときの反応生成
物であるガラクトースおよびグルコースによる酵素活性
の低下が少ないことが要求される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、高い耐熱性
を有し、中性から酸性領域に至適 pＨを有し、かつ反応
生成物による酵素活性の低下が少ない新規なβ−ガラク
トシダーゼ (以下、本酵素と記載する) を産生する新規
な微生物を提供することを目的とする。
を有し、中性から酸性領域に至適 pＨを有し、かつ反応
生成物による酵素活性の低下が少ない新規なβ−ガラク
トシダーゼ (以下、本酵素と記載する) を産生する新規
な微生物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の性質
を有するβ−ガラクトシダーゼを創製することを目的と
し、そのようなβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物
を自然界から純粋に単離することを試みた。その結果、
多数のβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物の中から
高度好熱菌の一種であるサーマス属に属する微生物が上
記の性質を有するβ−ガラクトシダーゼを産生すること
を見出し、本発明を完成した。
を有するβ−ガラクトシダーゼを創製することを目的と
し、そのようなβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物
を自然界から純粋に単離することを試みた。その結果、
多数のβ−ガラクトシダーゼを産生する微生物の中から
高度好熱菌の一種であるサーマス属に属する微生物が上
記の性質を有するβ−ガラクトシダーゼを産生すること
を見出し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、75〜85℃の至適作用温度
を有し、4.５〜6.５の至適 pＨを有し、かつ50ミリモル
のガラクトース及びグルコースによって酵素活性が実質
的に低下しない新規なβ−ガラクトシダーゼを産生する
こと及び少なくとも次に記載する菌学的性質を有するこ
とを特徴とするサーマス属に属する新菌株である： (a) 形態学的性質 形 状 桿 菌 運動性 − グラム染色 − 鞭 毛 − 胞 子 − 抗酸性 − 大きさ 0.4〜0.6 ×２〜７μm (b) 各種培地での生育 寒天平面培地 円形ないしは周辺不規則、隆起状ない
しは偏平状、淡黄色〜橙色 寒天斜面培地 平滑、淡黄色〜橙色 液体培地 生育菌体の沈澱を生ず リトマスミルク 変化なし ５％ NaCl含有液体培地 − ２％ NaCl含有液体培地 ＋ (C) 生育の pＨと温度 生育 pＨ 5.5〜8.5 生育温度 40 〜 80℃ (d) 生化学的性質 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒反応 ± VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 − デンプンの加水分解 ± クエン酸の利用 − 無機窒素源の利用 ＋(NH4) 色素の生成 生成する（黄色，橙色） ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ Ｏ−Ｆテスト Ｏ 酸素要求性 嫌気条件下では生育せず (e) 糖の資化性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ マルトース ＋ シュクロース ＋ ラクトース ＋ トレハロース ＋ グリセリン − デンプン − 前記新菌株としては、微工研菌寄第９１８４号菌株、微
工研菌寄第９１８５号菌株微工研菌寄第９１８６号菌株
が挙げられる。
を有し、4.５〜6.５の至適 pＨを有し、かつ50ミリモル
のガラクトース及びグルコースによって酵素活性が実質
的に低下しない新規なβ−ガラクトシダーゼを産生する
こと及び少なくとも次に記載する菌学的性質を有するこ
とを特徴とするサーマス属に属する新菌株である： (a) 形態学的性質 形 状 桿 菌 運動性 − グラム染色 − 鞭 毛 − 胞 子 − 抗酸性 − 大きさ 0.4〜0.6 ×２〜７μm (b) 各種培地での生育 寒天平面培地 円形ないしは周辺不規則、隆起状ない
しは偏平状、淡黄色〜橙色 寒天斜面培地 平滑、淡黄色〜橙色 液体培地 生育菌体の沈澱を生ず リトマスミルク 変化なし ５％ NaCl含有液体培地 − ２％ NaCl含有液体培地 ＋ (C) 生育の pＨと温度 生育 pＨ 5.5〜8.5 生育温度 40 〜 80℃ (d) 生化学的性質 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒反応 ± VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 − デンプンの加水分解 ± クエン酸の利用 − 無機窒素源の利用 ＋(NH4) 色素の生成 生成する（黄色，橙色） ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ Ｏ−Ｆテスト Ｏ 酸素要求性 嫌気条件下では生育せず (e) 糖の資化性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ マルトース ＋ シュクロース ＋ ラクトース ＋ トレハロース ＋ グリセリン − デンプン − 前記新菌株としては、微工研菌寄第９１８４号菌株、微
工研菌寄第９１８５号菌株微工研菌寄第９１８６号菌株
が挙げられる。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）微生物の取得 本発明者等は、全国各地の土壌からバージェズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー (Be
rgeys Manual of Systema-tic Bateriology)第１巻 (以
下マニュアルと記載する) に従ってβ−ガラクトシダー
ゼを産生することが知られている微生物を多数分離し
た。そして、それらの微生物を培養し、β−ガラクトシ
ダーゼを産生せしめ、培地からβ−ガラクトシダーゼを
単離し、その理化学的性質について検討した。その結
果、目的とするβ−ガラクトシダーゼを産生する３菌種
ZK-001, ZK-002及びZK-003を分離し、これらを前記マニ
ュアルに従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
で、運動性がなく、グラム染色陰性、カタラーゼ陽性で
あり、生育温度40〜80℃、生育適温65〜75℃、生育至適
pＨが中性付近であることから、サーマス属に属する微
生物であることは明らかであり、また２％ NaCl含有液
体培地での生育及び糖の資化性より公知のサーマス属に
属する微生物とは異なる新規な微生物と判定された。本
発明者等はこれらの微生物を工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託し、サーマス・エスピー（Thermus sp. ）
ZK-001について微工研菌寄第９１８４号、サーマス・エ
スピー（Thermus sp. ）ZK-002について微工研菌寄第９
１８５号及びサーマス・エスピー（Thermus sp. ） ZK-
003 について微工研菌寄第９１８６号なる寄託番号が付
された。これらの微生物の菌学的性質は第１表に示すと
おりである。
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー (Be
rgeys Manual of Systema-tic Bateriology)第１巻 (以
下マニュアルと記載する) に従ってβ−ガラクトシダー
ゼを産生することが知られている微生物を多数分離し
た。そして、それらの微生物を培養し、β−ガラクトシ
ダーゼを産生せしめ、培地からβ−ガラクトシダーゼを
単離し、その理化学的性質について検討した。その結
果、目的とするβ−ガラクトシダーゼを産生する３菌種
ZK-001, ZK-002及びZK-003を分離し、これらを前記マニ
ュアルに従って同定すると、いずれも好気性無胞子桿菌
で、運動性がなく、グラム染色陰性、カタラーゼ陽性で
あり、生育温度40〜80℃、生育適温65〜75℃、生育至適
pＨが中性付近であることから、サーマス属に属する微
生物であることは明らかであり、また２％ NaCl含有液
体培地での生育及び糖の資化性より公知のサーマス属に
属する微生物とは異なる新規な微生物と判定された。本
発明者等はこれらの微生物を工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託し、サーマス・エスピー（Thermus sp. ）
ZK-001について微工研菌寄第９１８４号、サーマス・エ
スピー（Thermus sp. ）ZK-002について微工研菌寄第９
１８５号及びサーマス・エスピー（Thermus sp. ） ZK-
003 について微工研菌寄第９１８６号なる寄託番号が付
された。これらの微生物の菌学的性質は第１表に示すと
おりである。
【００１０】
【表１】
【００１１】* ：リトマスミルクを除き、次の組成の培
地(pＨ 7.6) を基礎培地として使用した。0.１％酵母エ
キス、0.１％トリプトン、10.0％の無機塩液 (溶液１L
中に1.0gニトリロ三酢酸、 0.6g CaSO4・2H2O, 1.0g Mg
SO4・7H2O, 0.08g NaCl, 1.03g KNO3, 6.89g NaNO3, 1.
11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第二鉄溶液(溶液１
L中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む)、1.0％の微量元素液
(溶液１L 中に0.５ml H2SO4, 2.2g MnSO4・H2O, 0.5g
ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016g CuSO4・5H2O,0.02
5g Na2M0O4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2Oを含む)、0.001
％チアミン塩酸塩、0.001 ％ニコチン酸アミド、0.001
％ビオチン、0.001 ％パラアミノ安息香酸 （２）本酵素の取得 本酵素産生菌を後述する培地に接種し、50〜80℃より好
ましくは、65〜75℃にて12〜48時間好気的に培養する。
地(pＨ 7.6) を基礎培地として使用した。0.１％酵母エ
キス、0.１％トリプトン、10.0％の無機塩液 (溶液１L
中に1.0gニトリロ三酢酸、 0.6g CaSO4・2H2O, 1.0g Mg
SO4・7H2O, 0.08g NaCl, 1.03g KNO3, 6.89g NaNO3, 1.
11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第二鉄溶液(溶液１
L中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む)、1.0％の微量元素液
(溶液１L 中に0.５ml H2SO4, 2.2g MnSO4・H2O, 0.5g
ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016g CuSO4・5H2O,0.02
5g Na2M0O4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2Oを含む)、0.001
％チアミン塩酸塩、0.001 ％ニコチン酸アミド、0.001
％ビオチン、0.001 ％パラアミノ安息香酸 （２）本酵素の取得 本酵素産生菌を後述する培地に接種し、50〜80℃より好
ましくは、65〜75℃にて12〜48時間好気的に培養する。
【００１２】培地としては、炭素源、窒素源の他、必要
に応じて、無機塩、微量栄養素を含んでいる。炭素源と
しては、従来公知の各種材料を使用することができ、例
えば、グルコース、マルトース、シュクロースあるいは
可溶性澱粉などを典型例として例示できる。また窒素源
としても特に制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスティープリカー、アミノ酸液、大豆粕な
どの有機能窒素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウムなどの無機能窒素などが安価かつ
入手容易なものとして例示できる。尚有機態窒素源は炭
素源となることはいうまでもない。更にこのような炭素
源、窒素源の他、一般に使用されている各種の塩、例え
ば、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の
無機塩、ビタミンなどを添加することも可能である。好
適な培地を例示すれば0.２％のグルコース、0.２％の酵
母エキス、0.２％のトリプトン、10.0％の無機塩液 (溶
液１L 中に1.0gニトリロ三酢酸、 0.6g CaSO4・2H2O,
1.0g MgSO4・7H2O, 0.08g NaCl, 1.03g KNO3, 6.89g Na
NO3, 1.11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第二鉄溶液
(溶液１L 中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む) 、1.０％の微
量元素液 (溶液１L中に0.５ml H2SO4, 2.2g MnSO4・H
2O, 0.5g ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016gCuSO4・5H2
O，0.025g Na2MoO4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2Oを含む)
、0.001 ％のチアミン塩酸塩、0.001 ％のニコチン酸
アミド、 0.001％のビオチン、0.001％のパラアミノ安
息香酸を含有し、そのpＨをNaOHによりpＨ7.６に調整し
た液体培地である。本酵素の分離精製は例えば次のよう
にして実施することができる。まず培養液中の菌体を遠
心分離、濾過などで集菌し、得られた菌体を緩衝液 (例
えば、10mMリン酸緩衝液 pＨ7.0)中で常法により破砕し
て抽出処理する。その抽出液の上清をとり、常法のイオ
ン交換，ゲル濾過等のクロマトグラフィーにかければ、
本酵素が得られる。
に応じて、無機塩、微量栄養素を含んでいる。炭素源と
しては、従来公知の各種材料を使用することができ、例
えば、グルコース、マルトース、シュクロースあるいは
可溶性澱粉などを典型例として例示できる。また窒素源
としても特に制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスティープリカー、アミノ酸液、大豆粕な
どの有機能窒素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウムなどの無機能窒素などが安価かつ
入手容易なものとして例示できる。尚有機態窒素源は炭
素源となることはいうまでもない。更にこのような炭素
源、窒素源の他、一般に使用されている各種の塩、例え
ば、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の
無機塩、ビタミンなどを添加することも可能である。好
適な培地を例示すれば0.２％のグルコース、0.２％の酵
母エキス、0.２％のトリプトン、10.0％の無機塩液 (溶
液１L 中に1.0gニトリロ三酢酸、 0.6g CaSO4・2H2O,
1.0g MgSO4・7H2O, 0.08g NaCl, 1.03g KNO3, 6.89g Na
NO3, 1.11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第二鉄溶液
(溶液１L 中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む) 、1.０％の微
量元素液 (溶液１L中に0.５ml H2SO4, 2.2g MnSO4・H
2O, 0.5g ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016gCuSO4・5H2
O，0.025g Na2MoO4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2Oを含む)
、0.001 ％のチアミン塩酸塩、0.001 ％のニコチン酸
アミド、 0.001％のビオチン、0.001％のパラアミノ安
息香酸を含有し、そのpＨをNaOHによりpＨ7.６に調整し
た液体培地である。本酵素の分離精製は例えば次のよう
にして実施することができる。まず培養液中の菌体を遠
心分離、濾過などで集菌し、得られた菌体を緩衝液 (例
えば、10mMリン酸緩衝液 pＨ7.0)中で常法により破砕し
て抽出処理する。その抽出液の上清をとり、常法のイオ
ン交換，ゲル濾過等のクロマトグラフィーにかければ、
本酵素が得られる。
【００１３】本酵素の好ましい取得法を例示すれば、次
の通りである。サーマス・エスピー(Thermus sp.) ZK-0
01を例えば上記のような培地５L に植菌し、70℃にて24
時間好気的に培養して得られる培養液を12,000g, 20 ℃
にて30分間遠心分離し、菌体を集菌し、55gの菌体を得
た。この菌体に約300mlの抽出用リン酸緩衝液(10mM, p
Ｈ7.0)を加え、ミルにより磨砕し、酵素を抽出した。抽
出液を40,000g, 60分間遠心し、上清を採取した。沈澱
に更に200ml の上記抽出用リン酸緩衝液を加え、再度抽
出した後、同様に遠心し、上清を採取した。これを最初
の上清に合わせ、粗酵素抽出液480ml を得た。この粗酵
素液に硫酸アンモニウム187gを加え60％飽和とし、１晩
静置し、沈澱を生成せしめた。沈澱を30,000g, 60分間
の遠心分離により集め、約200ml の10mMリン酸緩衝液(p
Ｈ7.0)に溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析した
酵素液中の沈澱を40,000g, 60分間の遠心により除去し
たのち、この酵素液を10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡
化したDEAE-TOYOPEARLカラムに吸着させた。次いで０〜
0.5Mの NaCl を含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)の濃度勾
配法によって酵素を溶出した。溶出した活性画分を集
め、限外濾過膜を用いて濃縮した後、0.1Mの NaClを含
む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析した。こ
の酵素液を0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)
で平衡化したセファクリルS-300 のゲル濾過カラムにか
け３つの活性画分を分離した。集めた３つの活性画分を
それぞれ10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析し
たのち、同緩衝液で平衡化したパラアミノフェニルベー
ターディチオガラクトピラノシド(p-amino phenyl-β-D
-thiogalactopyranoside) を共有結合させたセファロー
ズ４Ｂカラムに吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩
衝液(pＨ7.0)で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液(pＨ
10.0) を流し酵素を溶出し、活性画分を分離した。かく
して得られた３つの活性画分はポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動 (ゲル濃度7.5 ％， pＨ9.5)において
それぞれ単一であった。得られた酵素標品は３つの酵素
合計で3.４mgであり、活性収率は12％であった。尚他の
２菌株についても培養条件を種々変更して上記と同様に
して本酵素を取得することが可能である。 (3) 本酵素の性質 本発明の方法により製造した本酵素の酵素化学的性質は
次のとおりである。 (a) 作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに分
解する。 (b) 基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロー
ス、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲン
チオビオースは分解しない。 (c) 至適 pＨ及び安定 pＨ範囲：至適 pＨは4.５〜6.５
であり、55℃で24時間保持の条件では pＨ4.０〜8.０の
範囲内で安定である（第１図の本酵素の作用 pＨ曲線参
照）。 (d) 温度に対する安定性： pＨ7.０において80℃で１時
間加熱後100 ％の活性が残存し、85℃で１時間加熱後、
85％の活性が残存する。 (e) 作用適温の範囲：75〜85℃に至適作用温度を有する
（第２図の本酵素の作用温度曲線参照）。 (f) 無機塩の作用：１ミリモルの塩化第二鉄、塩化マン
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。 (g) 反応生成物による阻害：50ミリモルのガラクトース
及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％以
下である（第３図の本酵素の反応生成物による阻害に関
する図参照）。 (h) 分子量：本酵素についてセファクリルS-300 カラム
クロマトグラフィー(1.6×100 cm) を使用し、ゲル濾過
法により分子量を測定したところ、55,000±5,000 ダル
トン、11,000±10,000ダルトン及び44,000±50,000ダル
トンに相当した。
の通りである。サーマス・エスピー(Thermus sp.) ZK-0
01を例えば上記のような培地５L に植菌し、70℃にて24
時間好気的に培養して得られる培養液を12,000g, 20 ℃
にて30分間遠心分離し、菌体を集菌し、55gの菌体を得
た。この菌体に約300mlの抽出用リン酸緩衝液(10mM, p
Ｈ7.0)を加え、ミルにより磨砕し、酵素を抽出した。抽
出液を40,000g, 60分間遠心し、上清を採取した。沈澱
に更に200ml の上記抽出用リン酸緩衝液を加え、再度抽
出した後、同様に遠心し、上清を採取した。これを最初
の上清に合わせ、粗酵素抽出液480ml を得た。この粗酵
素液に硫酸アンモニウム187gを加え60％飽和とし、１晩
静置し、沈澱を生成せしめた。沈澱を30,000g, 60分間
の遠心分離により集め、約200ml の10mMリン酸緩衝液(p
Ｈ7.0)に溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析した
酵素液中の沈澱を40,000g, 60分間の遠心により除去し
たのち、この酵素液を10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡
化したDEAE-TOYOPEARLカラムに吸着させた。次いで０〜
0.5Mの NaCl を含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)の濃度勾
配法によって酵素を溶出した。溶出した活性画分を集
め、限外濾過膜を用いて濃縮した後、0.1Mの NaClを含
む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析した。こ
の酵素液を0.1MのNaClを含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)
で平衡化したセファクリルS-300 のゲル濾過カラムにか
け３つの活性画分を分離した。集めた３つの活性画分を
それぞれ10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析し
たのち、同緩衝液で平衡化したパラアミノフェニルベー
ターディチオガラクトピラノシド(p-amino phenyl-β-D
-thiogalactopyranoside) を共有結合させたセファロー
ズ４Ｂカラムに吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩
衝液(pＨ7.0)で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液(pＨ
10.0) を流し酵素を溶出し、活性画分を分離した。かく
して得られた３つの活性画分はポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動 (ゲル濃度7.5 ％， pＨ9.5)において
それぞれ単一であった。得られた酵素標品は３つの酵素
合計で3.４mgであり、活性収率は12％であった。尚他の
２菌株についても培養条件を種々変更して上記と同様に
して本酵素を取得することが可能である。 (3) 本酵素の性質 本発明の方法により製造した本酵素の酵素化学的性質は
次のとおりである。 (a) 作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに分
解する。 (b) 基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロー
ス、メリビオース、ラフィノース、マルトース及びゲン
チオビオースは分解しない。 (c) 至適 pＨ及び安定 pＨ範囲：至適 pＨは4.５〜6.５
であり、55℃で24時間保持の条件では pＨ4.０〜8.０の
範囲内で安定である（第１図の本酵素の作用 pＨ曲線参
照）。 (d) 温度に対する安定性： pＨ7.０において80℃で１時
間加熱後100 ％の活性が残存し、85℃で１時間加熱後、
85％の活性が残存する。 (e) 作用適温の範囲：75〜85℃に至適作用温度を有する
（第２図の本酵素の作用温度曲線参照）。 (f) 無機塩の作用：１ミリモルの塩化第二鉄、塩化マン
ガン、塩化カルシウム及び硫酸マグネシウムにより酵素
活性は変化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫酸銅
によりそれぞれ10％及び30％の酵素活性が低下する。 (g) 反応生成物による阻害：50ミリモルのガラクトース
及びグルコースによる酵素活性の低下はいずれも10％以
下である（第３図の本酵素の反応生成物による阻害に関
する図参照）。 (h) 分子量：本酵素についてセファクリルS-300 カラム
クロマトグラフィー(1.6×100 cm) を使用し、ゲル濾過
法により分子量を測定したところ、55,000±5,000 ダル
トン、11,000±10,000ダルトン及び44,000±50,000ダル
トンに相当した。
【００１４】本酵素及び従来公知の微生物由来のβ−ガ
ラクトシダーゼ (前記先例１〜６の酵素) の理化学的性
質並びに酵素化学的性質を比較して第２表に示す。尚、
β−ガラクトシダーゼの活性測定法並びに活性表示法は
次のとおりである。すなわち、1.50％のＯ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド (以下ONPGと記載す
る）を含有する0.1Mリン酸緩衝液(pＨ6.5)2.４mlに本酵
素液0.１mlを加え、70℃, 10分間反応させた後、10％ N
a2CO3 液2.５mlを加え反応を停止する。生成したＯ−ニ
トロフェノールの量を420nm における吸光度より求め、
１分間に１μmol のＯ−ニトロフェノールを遊離する酵
素量を１単位とした。
ラクトシダーゼ (前記先例１〜６の酵素) の理化学的性
質並びに酵素化学的性質を比較して第２表に示す。尚、
β−ガラクトシダーゼの活性測定法並びに活性表示法は
次のとおりである。すなわち、1.50％のＯ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド (以下ONPGと記載す
る）を含有する0.1Mリン酸緩衝液(pＨ6.5)2.４mlに本酵
素液0.１mlを加え、70℃, 10分間反応させた後、10％ N
a2CO3 液2.５mlを加え反応を停止する。生成したＯ−ニ
トロフェノールの量を420nm における吸光度より求め、
１分間に１μmol のＯ−ニトロフェノールを遊離する酵
素量を１単位とした。
【００１５】
【表２】
【００１６】第２表に示す如く、本酵素の酵素化学的及
び理化学的性質は、公知の何れのβ−ガラクトシダーゼ
とも異なっており、特に高い熱安定性、広範な至適 pＨ
の範囲及び低い反応生成物による阻害度の特性を兼ね備
えており、従来の酵素にない優れた特性を有している。
従って本酵素は牛乳、脱脂乳、チーズホエーあるいは乳
糖液等の多くの乳糖含有食品を高温で処理することに適
しており、工業的に有用なβ−ガラクトシダーゼであ
る。
び理化学的性質は、公知の何れのβ−ガラクトシダーゼ
とも異なっており、特に高い熱安定性、広範な至適 pＨ
の範囲及び低い反応生成物による阻害度の特性を兼ね備
えており、従来の酵素にない優れた特性を有している。
従って本酵素は牛乳、脱脂乳、チーズホエーあるいは乳
糖液等の多くの乳糖含有食品を高温で処理することに適
しており、工業的に有用なβ−ガラクトシダーゼであ
る。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。但し、本発明は以下の実施例によって何等制限
されるものではない。 〔実施例１〕サーマス・エスピーZK-001(Thermus sp.ZK
-001: 微工研菌寄第９１８４号) を、0.２％グルコー
ス、0.２％酵母エキス、0.２％トリプトン、10.0％の無
機塩液(溶液１L 中に1.0gニトリロ三酢酸、0.６g CaSO4
・2H2O, 1.0g MgSO4・７H2O,0.08gNaCl，1.03g KNO3,
6.89g NaNO3, 1.11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第
二鉄溶液（溶液１L 中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む)、1.
０％の微量元素液(溶液１L 中に0.５ml H2SO4, 2.2g Mn
SO4・H2O, 0.5g ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016g CuS
O4・5H2O, 0.025g Na2MoO4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2O
を含む)、0.001 ％のチアミン塩酸塩、0.001 ％のニコ
チン酸アミド、 0.001％のビオチン、0.001 ％のパラア
ミノ安息香酸を含有し、NaOHにより pＨ7.６に調整した
液体培地10L に植菌し、20L 容のジャーファーメンター
内で70℃で24時間通気培養した。培養液の酵素活性は、
培養液１ml当たり0.84単位であった。
明する。但し、本発明は以下の実施例によって何等制限
されるものではない。 〔実施例１〕サーマス・エスピーZK-001(Thermus sp.ZK
-001: 微工研菌寄第９１８４号) を、0.２％グルコー
ス、0.２％酵母エキス、0.２％トリプトン、10.0％の無
機塩液(溶液１L 中に1.0gニトリロ三酢酸、0.６g CaSO4
・2H2O, 1.0g MgSO4・７H2O,0.08gNaCl，1.03g KNO3,
6.89g NaNO3, 1.11g Na2HPO4を含む) 、1.０％の塩化第
二鉄溶液（溶液１L 中に0.28g FeCl3・6H2Oを含む)、1.
０％の微量元素液(溶液１L 中に0.５ml H2SO4, 2.2g Mn
SO4・H2O, 0.5g ZnSO4・7H2O, 0.5g H3BO3, 0.016g CuS
O4・5H2O, 0.025g Na2MoO4・2H2O, 0.046g CoCl2・6H2O
を含む)、0.001 ％のチアミン塩酸塩、0.001 ％のニコ
チン酸アミド、 0.001％のビオチン、0.001 ％のパラア
ミノ安息香酸を含有し、NaOHにより pＨ7.６に調整した
液体培地10L に植菌し、20L 容のジャーファーメンター
内で70℃で24時間通気培養した。培養液の酵素活性は、
培養液１ml当たり0.84単位であった。
【００１８】この培養液を、20℃にて12,000ｇ, 30分間
遠心分離し、菌体を集菌し、107gの菌体を得た。この菌
体に約600ml の抽出用リン酸緩衝液 (10mM，pH7.0)を加
え、ミルにより磨砕し酵素を抽出した。抽出液を40,000
g, 60分間遠心し上清を採取した。沈澱に更に400ml の
上記抽出用リン酸緩衝液を加え再度抽出した後、同様に
遠心し上清を採取した。これを最初の上清に合わせ粗酵
素抽出液975 mlをえた。この粗酵素液に硫酸アンモニウ
ム380gを加え60％飽和とし、一晩静置し沈澱を生成せし
めた。次に沈澱を30,000g, 60分間の遠心分離により集
め、約30mlの10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)に溶解したの
ち、同緩衝液で透析した。透析した酵素液中の沈澱を4
0,000g, 60分間の遠心により除去したのち、酵素液を1
0mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡化したDEAE-TOYOPEARL
カラム（５×45cm)に吸着させた。次いで０〜0.５M のN
aClを含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)の濃度勾配法によ
って酵素を抽出した。溶出した活性画分48.0mlを限外濾
過膜 (アミコン社製 PM-10) を用いて約10mlに濃縮した
後、0.1Mの NaCl を含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.０) を
用いて一夜透析した。この酵素液を0.1MのNaClを含む10
mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡化したセファクリルS-30
0 のゲル濾過カラム(2.6×95cm) に通液し、３つの活性
画分を分離した。３つの活性画分を合わせ、10mMリン酸
緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析したのち、同緩衝液で
平衡化したパラアミノフェニルベーダーディチオガラク
トピラノシド (p-amino phenyl−β−D-thiogalactopyr
anoside)を共有結合させたセファローズ４Ｂカラム(1.0
×15.0cm) に吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩衝
液(pＨ7.0)で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液(pＨ1
0.0)を流し、酵素を溶出し、活性画分を分離した。かく
して本酵素約8.５mgを得た。
遠心分離し、菌体を集菌し、107gの菌体を得た。この菌
体に約600ml の抽出用リン酸緩衝液 (10mM，pH7.0)を加
え、ミルにより磨砕し酵素を抽出した。抽出液を40,000
g, 60分間遠心し上清を採取した。沈澱に更に400ml の
上記抽出用リン酸緩衝液を加え再度抽出した後、同様に
遠心し上清を採取した。これを最初の上清に合わせ粗酵
素抽出液975 mlをえた。この粗酵素液に硫酸アンモニウ
ム380gを加え60％飽和とし、一晩静置し沈澱を生成せし
めた。次に沈澱を30,000g, 60分間の遠心分離により集
め、約30mlの10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)に溶解したの
ち、同緩衝液で透析した。透析した酵素液中の沈澱を4
0,000g, 60分間の遠心により除去したのち、酵素液を1
0mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡化したDEAE-TOYOPEARL
カラム（５×45cm)に吸着させた。次いで０〜0.５M のN
aClを含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)の濃度勾配法によ
って酵素を抽出した。溶出した活性画分48.0mlを限外濾
過膜 (アミコン社製 PM-10) を用いて約10mlに濃縮した
後、0.1Mの NaCl を含む10mMリン酸緩衝液(pＨ7.０) を
用いて一夜透析した。この酵素液を0.1MのNaClを含む10
mMリン酸緩衝液(pＨ7.0)で平衡化したセファクリルS-30
0 のゲル濾過カラム(2.6×95cm) に通液し、３つの活性
画分を分離した。３つの活性画分を合わせ、10mMリン酸
緩衝液(pＨ7.0)を用いて一夜透析したのち、同緩衝液で
平衡化したパラアミノフェニルベーダーディチオガラク
トピラノシド (p-amino phenyl−β−D-thiogalactopyr
anoside)を共有結合させたセファローズ４Ｂカラム(1.0
×15.0cm) に吸着させた。このカラムを10mMリン酸緩衝
液(pＨ7.0)で充分に洗った後、0.1Mホウ酸緩衝液(pＨ1
0.0)を流し、酵素を溶出し、活性画分を分離した。かく
して本酵素約8.５mgを得た。
【００１９】〔実施例２〕サーマス・エスピーZK-002(T
hermus sp.ZK-002: 微工研菌寄第９１８５号) を実施例
１の培地のグルコースを0.２％の可溶性デンプンに変え
た培地に10L に植菌し、実施例１と同一条件で培養し、
0.64単位／mlの培養液を得た。以下実施例１と同様の方
法で精製し、本酵素約6.８mgを得た。
hermus sp.ZK-002: 微工研菌寄第９１８５号) を実施例
１の培地のグルコースを0.２％の可溶性デンプンに変え
た培地に10L に植菌し、実施例１と同一条件で培養し、
0.64単位／mlの培養液を得た。以下実施例１と同様の方
法で精製し、本酵素約6.８mgを得た。
【００２０】〔実施例３〕サーマス・エスピーZK-003(T
hermus sp.ZK-003: 微工研菌寄第９１８６号) を実施例
１で述べた組成の培地10L に植菌し、実施例１と同一条
件で培養し、0.68単位の培養液を得た。以下実施例１と
同様の方法で精製し、本酵素約7.３mgを得た。
hermus sp.ZK-003: 微工研菌寄第９１８６号) を実施例
１で述べた組成の培地10L に植菌し、実施例１と同一条
件で培養し、0.68単位の培養液を得た。以下実施例１と
同様の方法で精製し、本酵素約7.３mgを得た。
【００２１】
【発明の効果】本発明によれば、耐熱性が高く、かつ作
用 pＨ域が広く、さらに反応生成物による阻害度の低い
β−ガラクトシダーゼ及び該β−ガラクトシダーゼを産
生することが可能な新菌株を提供することができる。本
酵素は牛乳、脱脂乳、チーズホエーおよび乳糖液などの
乳糖含有食品を雑菌が腐敗し難い高温で処理することを
可能にする。このことは、これらの食品の加工時におけ
る製造工程管理をより簡便にせしめるものであり、食品
工業において極めて有意義なものである。
用 pＨ域が広く、さらに反応生成物による阻害度の低い
β−ガラクトシダーゼ及び該β−ガラクトシダーゼを産
生することが可能な新菌株を提供することができる。本
酵素は牛乳、脱脂乳、チーズホエーおよび乳糖液などの
乳糖含有食品を雑菌が腐敗し難い高温で処理することを
可能にする。このことは、これらの食品の加工時におけ
る製造工程管理をより簡便にせしめるものであり、食品
工業において極めて有意義なものである。
【図１】第１図は本酵素の作用 pＨ曲線を示す図であ
る。
る。
【図２】第２図は本酵素の作用温度曲線を示す図であ
る。
る。
【図３】第３図は本酵素の反応生成物による阻害に関す
る図である。
る図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】75〜85℃の至適作用温度を有し、4.５〜6.
５の至適 pＨを有し、かつ50ミリモルのガラクトース及
びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しない新
規なβ−ガラクトシダーゼを産生すること及び少なくと
も次に記載する菌学的性質を有することを特徴とするサ
ーマス属に属する新菌株： (a) 形態学的性質 形 状 桿 菌 運動性 − グラム染色 − 鞭 毛 − 胞 子 − 抗酸性 − 大きさ 0.4〜0.6 ×２〜７μm (b) 各種培地での生育 寒天平面培地 円形ないしは周辺不規則、隆起状ない
しは偏平状、淡黄色〜橙色 寒天斜面培地 平滑、淡黄色〜橙色 液体培地 生育菌体の沈澱を生ず リトマスミルク 変化なし ５％ NaCl含有液体培地 − ２％ NaCl含有液体培地 ＋ (c) 生育の pＨと温度 生育 pＨ 5.5〜8.5 生育温度 40 〜 80℃ (d) 生化学的性質 硝酸塩の還元 ＋ 脱窒反応 ± VPテスト − インドールの生成 − 硫化水素の生成 − デンプンの加水分解 ± クエン酸の利用 − 無機窒素源の利用 ＋(NH4) 色素の生成 生成する（黄色，橙色） ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ Ｏ−Ｆテスト Ｏ 酸素要求性 嫌気条件下では生育せず (e) 糖の資化性 Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ マルトース ＋ シュクロース ＋ ラクトース ＋ トレハロース ＋ グリセリン − デンプン − - 【請求項２】前記新菌株が微工研菌寄第９１８４号菌株
であることを特徴とする請求項１記載のサーマス属に属
する新菌株。 - 【請求項３】前記新菌株が微工研菌寄第９１８５号菌株
であることを特徴とする請求項１記載のサーマス属に属
する新菌株。 - 【請求項４】前記新菌株が微工研菌寄第９１８６号菌株
であることを特徴とする請求項１記載のサーマス属に属
する新菌株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31382394A JP2530998B2 (ja) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | サ―マス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31382394A JP2530998B2 (ja) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | サ―マス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62026216A Division JPH0761265B2 (ja) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0819391A true JPH0819391A (ja) | 1996-01-23 |
| JP2530998B2 JP2530998B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=18045949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31382394A Expired - Lifetime JP2530998B2 (ja) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | サ―マス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する新菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2530998B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927099A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-07 | 江苏大学 | 一株产柠檬酸的栖热菌及其应用 |
-
1994
- 1994-12-16 JP JP31382394A patent/JP2530998B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927099A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-04-07 | 江苏大学 | 一株产柠檬酸的栖热菌及其应用 |
| CN115927099B (zh) * | 2022-11-30 | 2024-03-19 | 江苏大学 | 一株产柠檬酸的栖热菌及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2530998B2 (ja) | 1996-09-04 |
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