JPH08337531A - 新規抗生物質ｋｐ−３０５２及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 耐性菌や毒性の問題を解消し得る抗生物質Ｋ
Ｐ−３０５２およびその製造法を得るものである。 【構成】 放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を生産す
る能力を有する微生物を培地に培養し、その培養物中に
ＫＰ−３０５２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫＰ−
３０５２物質を採取して製造するものである。 【効果】 本物質は細菌または真菌感染症の治療剤や予
防剤として有効に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な抗生物質ＫＰ−３
０５２ならびに放線菌ＫＰ−３０５２株からの当該物質
を製造する製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物の生産する抗生物質としては、こ
れまでに数多く発見されており、医薬品、動物薬、農薬
の分野において既に実用化されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、その一
方において、耐性菌の出現や毒性が大きな問題となって
おり、これらの問題点を解消し得る新規な抗生物質の開
発が強く望まれているのが現状である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
抗菌活性を有する抗生物質について微生物培養物中から
の探索を続けた結果、放線菌ＫＰ−３０５２株の生産す
るＫＰ−３０５２物質がいくつかの微生物に対して生育
阻害活性を有することを見出した。本発明はこの知見に
基づいて本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は、下記の物理化学的性
質を有するＫＰ−３０５２物質である。そしてまた、本
発明は放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を生産する能
力を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＫＰ−３
０５２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫＰ−３０５２
物質を採取することを特徴する抗生物質ＫＰ−３０５２
の製造法である。さらにまた、本発明は放線菌に属する
ＫＰ−３０５２物質を生産する能力を有する微生物であ
る。

【０００６】（１）性状：白色粉末、 （２）分子量：３４４．１５７３（Ｍ＋Ｈ、高分解能高
速原子衝撃質量分析による）、 （３）分子式：Ｃ₁₃Ｈ₂₁Ｎ₅ Ｏ₆ （高分解能高速原子衝
撃質量分析による）、 （４）融点：２６０℃（分解）、 （５）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝−９゜（ｃ＝０．６５，
Ｈ₂ Ｏ）、

【０００７】（６）紫外部吸収極大（水溶液）：図１に
示すとおり、少なくとも２２０ｎｍ（ショルダー、ε＝
７５００）に極大吸収を有する、 （７）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：図に示すとおり、
３４５０，１６３０，１５９０，１４９０，１３７０，
１３５０ｃｍ^-1に極大吸収を有する、

【０００８】（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル（４
００ＭＨｚ）：重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）およ
びスピン結合定数Ｊ（Ｈｚ）は、次の通りである。８．
０４（１Ｈ，ｓ）、７．０２（１Ｈ，ｓ）、３．７２
（１Ｈ，ｔ，６）、３．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，
５）、３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，５）、３．０２
〜２．８２（６Ｈ，ｍ），２．０２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝
７，１５）、１．９８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７，１５）
（但し、ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｍ：多
重線を表す）、

【０００９】（９）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１０
０ＭＨｚ）：重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）は、次
の通りである、１０８．１ｓ、１７６．８ｓ、１７６．
５ｓ、１３７．３ｄ、１３３．８ｓ、１１９．５ｄ、６
５．３ｄ、６３．８ｄ、４９．８ｔ、４６．６ｔ、３
０．９ｔ、３０．７ｔ（但し、ｓ：一重線、ｄ：二重
線、ｔ：三重線を表す）、

【００１０】（１０）溶剤に対する溶解性：水に可溶、
メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルムに難
溶、 （１１）呈色反応：ニンヒドリン反応に陽性

【００１１】本ＫＰ−３０５２物質生産菌については、
放線菌で、ＫＰ−３０５２物質生産能を有するものであ
ればよく、特に制限されることはない。本発明のＫＰ−
３０５２物質を生産するために使用される菌株として
は、一例として本発明者らによって土壌より新たに分離
された放線菌ＫＰ−３０５２株が挙げられる。本菌株の
菌学的性状を示すと以下の通りである。

【００１２】Ｉ．形態的性質 栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断が観察さ
れた。気菌糸はスターチ・無機塩寒天培地、グルコース
・アスパラギン寒天培地等で豊富に着生し、白色を呈す
る。顕微鏡下の観察では、気菌糸は直線状を呈し、２０
ケ以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の大きさは２．
５×０．８μｍである。胞子の表面は平滑である。菌
核、胞子嚢および遊走子は見出されない。

【００１３】II．培養性状 イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎ
ｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の
方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システ
マティック・バクテリオロジー、第１６巻、第３１３
頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を
表１および表２に示す。

【００１４】色調は標準色として、カラー・ハーモニー
・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・
オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定
し、色標名とともに括弧内にそのコードを併せて記し
た。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地
における観察の結果である。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】III ．生理学的諸性質 （１）メラニン色素の生成 （イ）チロシン寒天培地 陰性 （ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陰性 （ハ）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地 陰性 （ニ）トリプトン・イースト液 陰性

【００１８】 （２）チロシナーゼ反応 陰性 （３）硫化水素の生産 陰性 （４）硝酸塩の還元 陰性 （５）ゼラチンの液化（２１〜２３℃） 陽性 （グルコース・ペプトン・ゼラチン培地） （６）スターチの加水分解 陽性 （７）脱脂乳の凝固（２７℃） 陽性

【００１９】 （８）脱脂乳のペプトン化（２７℃） 陽性 （９）生育温度範囲 ８〜３８℃ （１０）炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地） グルコース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、メリビオース、マ ンニトール、フルクトース、ラムノース、イノシトール、シュークロースを 利用する。 （１１）セルロースの分解 陰性

【００２０】ＩＶ．細胞壁組成 細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。以上に述
べた本菌の菌学的性状を要約すると次の通りである。細
胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。栄養菌糸
は各種寒天培地上でよく発達し、分断が観察された。気
菌糸の形態は直線状で長い胞子鎖を形成する。胞子の表
面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は
ベージュからイエローの色調を呈し、気菌糸はホワイト
系の色調を呈する。可溶性色素は生産しない。以上のよ
うな菌学的性状を示す本菌は、放線菌に属する一菌株で
あると決定した。

【００２１】以上のような菌学的性状の本菌株は、Ｓｔ
ｒａｉｎ ＫＰ−３０５２（ストレイン ＫＰ−３０５
２）として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れている。寄託日は平成７年３月３１日で、寄託番号は
ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７５である。

【００２２】本発明のＫＰ−３０５２物質を製造するに
当たっては、先ず放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を
生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から
分離・精製すればよい。本発明に用いることのできる菌
株は上記菌株、その変異株をはじめ、放線菌の属するＫ
Ｐ−３０５２物質生産菌のすべてが使用できる。

【００２３】上記ＫＰ−３０５２物質生産に適した栄養
源としては放線菌の栄養源としては、放線菌の栄養源と
して使用し得るものが使用される。例えば市販のペプト
ン、肉エキス、コーン・スチープ・リカー、綿実粉、落
花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼイン
の水和物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム等の窒素源、グリセリン、澱粉、グルコース、ガ
ラクトース、マンノース等の炭水化物、あるいは脂肪等
の炭素源、及び食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸
マグネシウム等の無機塩を単独あるいは組み合わせて使
用できる。

【００２４】その他必要に応じて微量の金属塩、消泡剤
として動・植・鉱物油等を添加することもできる。これ
らのものは生産菌を利用しＫＰ−３０５２物質の生産に
役だつものであればよく、公知の放線菌の培養材料はす
べて用いることができる。ＫＰ−３０５２物質の大量培
養には液体培養が好ましい。培養温度は２０〜３７℃で
も行い得るが、通常は２０〜３０℃、好ましくは２７℃
付近に保つのがよい。培養時間は、液体培養の場合、通
常２〜７日培養を行うと、本物質が生成蓄積される。好
ましくは培養中のＫＰ−３０５２物質の蓄積量が最大に
達したときに培養を終了すればよい。

【００２５】これらの培養組成、培地の液性、培養温
度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の
種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られる
ように適宜調節、選択されることはいうまでもない。

【００２６】このようにして得られた培養物中に蓄積さ
れたＫＰ−３０５２物質は通常は培養濾液中に含まれる
ので、培養濾液を濾過または遠心分離により菌体を分離
する。培養濾液からＫＰ−３０５２物質を採取するに
は、培養液より水溶性物質の採取に用いられる公知の方
法、例えばイオン交換クロマトグラフイー、ゲル濾過ク
ロマトグラフイー、遠心向流分配クロマトグラフイー、
高速液体クロマトグラフイー等を組み合わせあるいは繰
り返すことによってＫＰ−３０５２物質を純粋に採取す
ることができる。

【００２７】本ＫＰ−３０５２物質の物理化学的性状は
次の通りであ。 （１）性状：白色粉末、 （２）分子量：３４４．１５７３（Ｍ＋Ｈ、高分解能高
速原子衝撃質量分析による）、 （３）分子式：Ｃ₁₃Ｈ₂₁Ｎ₅ Ｏ₆ （高分解能高速原子衝
撃質量分析による）、 （４）融点：２６０℃（分解）、

【００２８】（５）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝−９゜（ｃ
＝０．６５、Ｈ₂ Ｏ）、 （６）紫外部吸収極大（水溶液）：図１に示すとおり、
２２０ｎｍ（ショルダー、ε＝７５００）に吸収極大を
有する、 （７）赤外部吸収極大（ＫＢｒ錠）：図２に示すとお
り、３４５０、１６３０、１５９０、１４９０、１４２
０、１３７０、１３５０ｃｍ^-1に極大吸収を有する、

【００２９】（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル（４
００ＭＨｚ）：重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）およ
びスピン結合定数Ｊ（Ｈｚ）は次の通りである。８．０
４（１Ｈ，ｓ）、７．０２（１Ｈ，ｓ）、３．７２（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝６）、３．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，
５）、３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，５）（但し、
ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｍ：多重線を表
す）、

【００３０】（９）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１０
０ＭＨｚ）：重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）は次の
通りである。１８０．１ｓ、１７６．８ｓ、１７６．５
ｓ、１３７．３ｄ、１３３．８ｓ、１１９．５ｄ、６
５．３ｄ、６３．８ｄ、５５．８ｄ、４９．８ｔ、４
６．６ｔ、３０．９ｔ、３０．７ｔ（但し、ｓ：一重
線、ｄ：二重線、ｔ：三重線を表す）、

【００３１】（１０）溶剤に対する溶解性：水に可溶、
メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルムに難
溶、 （１１）呈色反応：ニンヒドリン反応に陽性、

【００３２】以上にＫＰ−３０５２物質の各種理化学的
性状について述べたが、このような性質に一致する化合
物はこれまでに報告されておらず、したがって、ＫＰ−
３０５２物質は新規物質であると決定した。

【００３３】次に、本ＫＰ−３０５２物質の抗菌活性つ
いて以下に述べる。濾紙円板（直径８ｍｍ、アドバンテ
ック社製）に本ＫＰ−３０５２物質の２００μｇ／ｍl
の水溶液をそれぞれ浸漬し、一定時間風乾して水を飛ば
した後、これをミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）の含菌寒天平板に張り付
け、３５℃で２４時間培養後、濾紙円板の周りにできた
生育阻止円の直径を表３にそれぞれ示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】本抗生物質はいくつかの微生物に対して生
育阻害活性を示した。また、ＫＰ−３０５２物質は二形
性を示すカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）が菌糸形で生育する血清添加培地にお
いて、細胞の形態を変化させた。したがって、ＫＰ−３
０５２物質は細菌や真菌感染症の治療用あるいは予防用
組成物として有効に使用し得る。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、細菌または真菌感染症の
治療剤あるいは予防剤として有用な新規な抗生物質ＫＰ
−３０５２ならびに放線菌ＫＰ−３０５２株からの該物
質の製造法が得られる。

【００３７】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれのみに限定されるものではない。グ
ルコース０．１％、でんぷん（和光純薬工業社製）２．
４％、ペプトン（大五栄養化学社製）０．３％、肉エキ
ス０．３％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製）
０．５％、炭酸カルシウム０．４％からなる液体培地
（ｐＨ７．０）を１００ｍl ずつ分注した５００ｍl 容
三角フラスコ１本に寒天斜面培地で培養した放線菌ＫＰ
−３０５２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７５）を１白金耳
ずつ接種し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を
得た。

【００３８】カルチベータＮｏ．１００（焼津水産化学
工業社製）１．０％、グルコース１．０％、酵母エキス
０．５％、炭酸カルシウム０．２％からなる液体培地
（ｐＨ６．５）を１００ｍl ずつ分注した５００ｍl 容
三角フラスコ３０本に種培養液２ｍl ずつ接種し、２７
℃で１４４時間振とう培養した。

【００３９】培養液を遠心分離機（ＫＳ−３０００Ｐ、
久保田製作所製）で遠心分離し、得られた上清２．５Ｌ
をダウエックス５０Ｗイオン交換樹脂（Ｈ⁺ ：Ｎａ⁺ ＝
１：１、３００ｍl ）に吸着させた。これを１Ｎアンモ
ニア水で洗浄後、２Ｎアンモニア水１００ｍl で溶出し
た。溶出液を塩酸で中和し、マイクロアシライザー（マ
イクロアシライザーＧ３、旭化成工業社製）で脱塩後、
減圧濃縮により褐色物質２．７ｇを得た。この淡黄色物
質を少量の０．１Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．
１）に溶解後、同緩衝液で平衡化したＳＰ−セファデッ
クスイオン交換樹脂５０ｍl に吸着させた。

【００４０】これを、同溶液で洗浄後、０．２Ｍギ酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ３．１）で溶出した。この溶出液
を中和し、マイクロアシライザーで脱塩後、減圧濃縮に
より１２０ｍｇの淡黄褐色物質を得た。再び、これを少
量のメタノール−０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（６
０：４０）に溶解し、同溶液で平衡化したアミノシラン
処理シリカゲル（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＮＨ−ＤＭ
１０２０、富士シリシア化学社製）に吸着させた。

【００４１】次いで同溶液で洗浄後、メタノール−０．
１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（３０：７０）で溶出した。
得られた溶出液を減圧濃縮し、少量の水に溶解後、セフ
ァデックスＬＨ−２０カラム（６００ｍl 、φ３．８×
８５ｃｍ）にチャージし、水で溶出した。得られた活性
フラクションを減圧濃縮することにより白色粉末のＫＰ
−３０５２物質を６ｍｇ得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗生物質ＫＰ−３０５２の水溶液（２０μｇ／
ｍl ）の紫外部吸収スペクトルである。

【図２】抗生物質ＫＰ−３０５２の赤外部吸収スペクト
ル（ＫＢｒ法）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 洋子 東京都港区白金５丁目９番１号 社団法人 北里研究所内 (72)発明者 リュウ ジン ロン 中華人民共和国北京市天壇（番地なし） 中国医学科学院医薬生物技術研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する抗生物質Ｋ
   Ｐ−３０５２。 （１）性状：白色粉末、 （２）分子量：３４４．１５７３（Ｍ＋Ｈ，高分解能高
   速原子衝撃質量分析による）、 （３）分子式：Ｃ₁₃Ｈ₂₁Ｎ₅ Ｏ₆ （高分解能高速原子衝
   撃質量分析による）、 （４）融点：２６０℃（分解）、 （５）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝−９゜（ｃ＝０．６５，
   Ｈ₂ Ｏ）、 （６）紫外部吸収スペクトル（水溶液）：図１に示すと
   おり、少なくとも２２０ｎｍ（ショルダー、ε＝７５０
   ０）付近に極大吸収を有する、 （７）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ錠）：図２に示す
   とおり、３４５０，１６３０，１５９０，１４９０，１
   ４２０，１３７０，１３５０ｃｍ^-1に極大吸収を有す
   る、 （８）プロトン核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨ
   ｚ）：重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）およびスピン
   結合定数Ｊ（Ｈｚ）は次の通りである。８．０４（１
   Ｈ，ｓ）、７．０２（１Ｈ，ｓ）、３．７２（１Ｈ，
   ｔ，Ｊ＝６）、３．４５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１，５）、
   ３．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，５）、３．０２〜２．
   ８２（６Ｈ，ｍ）、２．０２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７，１
   ５）、１．９８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７，１５）（但し、
   ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｍ：多重線を表
   す）、 （９）¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ）：
   重水中での化学シフトδ（ｐｐｍ）は次のとおりであ
   る。１８０．１ｓ、１７６．８ｓ、１７６．５ｓ、１３
   ７．３ｄ、１３３．８ｓ、１１９．５ｄ、６５．３ｄ、
   ６３．８ｄ、５５．８ｄ、４９．８ｔ、４６．６ｔ、３
   ０．９ｔ、３０．７ｔ（但し、ｓ：一重線、ｄ：二重
   線、ｔ：三重線を表す）、 （１０）溶剤に対する溶解性：水に可溶、メタノール、
   アセトン、クロロホルムに難溶、 （１１）呈色反応：ニンヒドリン反応に陽性、
2. 【請求項２】 放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を生
   産する能力を有する微生物を培地に培養し、その培養物
   中にＫＰ−３０５２物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ
   Ｐ−３０５２物質を採取することを特徴とする抗生物質
   ＫＰ−３０５２の製造法。
3. 【請求項３】 放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を生
   産する能力を有する微生物が、ストレイン（Ｓｔｒａｉ
   ｎ） ＫＰ−３０５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７５）で
   ある請求項２記載の製造法。
4. 【請求項４】 放線菌に属するＫＰ−３０５２物質を生
   産する能力を有する微生物。
5. 【請求項５】 微生物がストレイン（Ｓｔｒａｉｎ）
   ＫＰ−３０５２（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７５）またはそ
   の変異株である請求項４に記載の微生物。