JPH0851975A - 新規なβ−マンナナーゼとその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なβ−マンナナーゼとその製造方法。 【構成】 微工研菌寄第8856号で寄託されたβ−マンナ
ナーゼ生産能を有する生育の至適pHをアルカリ性に有す
るバチルス属に属する微生物を培養してβ−マンナナー
ゼを培養液中に生成・蓄積させ、この培養液からβ−マ
ンナナーゼを採取する。 【効果】 β−Ｄ−マンナンを加水分解して分解生成物
を有効利用したり、β−Ｄ−マンナン自体を糊料等とし
て使用した後に分解・除去するのに有用なβ−マンナナ
ーゼを効率良く生産することができ、しかもこの酵素は
pH安定性、高温安定性等において優れているので、酵素
の工業的な大規模利用が可能。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なβ−マンナナーゼ
と、このβ−マンナナーゼ生産能を有するアルカリ側に
生育の至適pHを有する好アルカリ性の新規微生物を用い
た新規β−マンナナーゼの製造方法とに関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】β−マンナナーゼは、分子内にβ−１，
４−Ｄ−マンノピラノシド結合を持つホモおよびヘテロ
のβ−Ｄ−マンナンであるマンナン、グルコマンナン、
ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナンなどの主要
骨格であるβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を任
意に加水分解し、粘性を低下せしめると同時に一連のマ
ンノオリゴ糖を生成する酵素である。

【０００３】β−Ｄ−マンナンを含むものとしてはアイ
ボリーナッツ（学名：フイテレフアス・マクロカルパ）
やコロゾがよく知られている。β−１，４−マンナン含
有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリエンシ
ス、オーキス・マキユラタなどが知られている。ガラク
トマンナンはイナゴマメ及びグアーの種子に含まれる各
々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガムが代
表的なものであり、この二種のガラクトマンナンは、そ
のままあるいは化学的な改質を施した後、工業的に広く
使用されている。また、ガラクトマンナンは大豆、コー
ヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメクサ、コロハな
どマメ科の植物にも多く含まれている。その他のガラク
トマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコパリア、グ
レデイツシャ・フエロクス、レウカエナ・グラウカなど
が知られている。グルコマンナン含有物としてはコンニ
ャク（学名：アモルフオフアラス・コンニャク）が最も
有名であるが、サトイモ科のアルム根、マツ属のジャツ
クパイン、ラン科の球根、エゾマツやハリモミなどのト
ウヒ属の植物などが知られている。その他のグルコマン
ナン含有植物としては、アスパラガス・オフィシナリ
ス、エレムラス・フスカス、エレムラス・レゲリー、エ
レムラス・スペクタビリス、フアセオラス・アウレウス
などが知られている。これらは、一般にアルカリ抽出法
などにより得られている。また、これらβ−Ｄ−マンナ
ンは糊料あるいは増粘剤として、食品工業や繊維産業で
工業的に大量に消費されているものである。

【０００４】これらβ−Ｄ−マンナンを任意に加水分解
する酵素として知られているβ−マンナナーゼは、従来
から多数の研究者の研究対象とされており、非常に多く
の微生物由来のものが検討されてきた。例えば、糸状菌
〔アドバンスズ イン カルボハイドレート ケミスト
リー アンド バイオケミストリー (Advances inCarbo
hydrate Chemistry and Biochemistry), 1976, 32, 29
9〜316 〕、糸状菌〔アクタ ケミカ スカンジナビカ
(Acta. Chem. Scand.) 1968, 22, 1924; 農化, 1969,
43, 317;バイオケミカル ジャーナル(Biochem. J.), 19
84, 219, 857〕、放線菌〔アグリカルチュラル アンド
バイオロジカル ケミストリー(Agric.Biol. Chem.), 19
84, 48, 2189〕、細菌〔ジャーナル オブ バイオケミ
ストリー(J. Biochem.), 1982, 91, 1181；特開昭57-6
5182号〕などの酵素が良く研究されている。

【０００５】しかし、これらの酵素はいずれも温度安定
性に劣るか、培養に長時間が必要なものが多く、酵素を
工業的に安価に使用する場合に難点を残していた。天然
界に再生可能な資源として大量に存在するβ−Ｄ−マン
ナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によるマ
ンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクトース
などの糖類を効率良く回収・利用するためには、安定性
に優れ、酵素の精製が容易であることが好ましい。しか
し、動物、植物、微生物などに起源を持つ従来提案され
ていたβ−マンナナーゼは、上記のような理由で工業的
に大規模利用するには理化学的特性、特に温度安定性、
至適ｐＨなどにおいて不十分であり、また経済性の点で
も不利であった。従って、製造・精製が容易で、しかも
高い安定性を有するこの種の酵素を新たに開発すること
は、デンプンと共に天然界に大量に存在する再生利用可
能なβ−マンナンを分解し、あるいは分解生成物（マン
ノース、ガラクトース、グルコース、マンノオリゴ糖
等）を回収・利用する上で極めて大きな意義をもつ。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は上記の
各種要件を満足する新規な酵素であるβ−マンナナーゼ
と、この酵素を高い生産効率で生成する方法とを提供す
ることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
使用可能なβ−マンナナーゼが具備すべき上記諸性質を
有する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく、広
く天然界を検索した結果、アルカリ性に生育の至適pHを
有するバチルス属に属するある種の新規微生物が上記要
件を備えた酵素を産生し、またこれを量産性良く産生す
ることを見出して本発明を完成した。本発明の第１の対
象は新規微生物が生産する新規なβ−マンナナーゼにあ
る。本発明の第２の対象はこのβ−マンナナーゼの製造
方法にある。

【０００８】上記新規微生物（ＡＭ−００１株）はβ−
マンナナーゼとβ−マンノシダーゼの生産能を有し、生
育の至適pHをアルカリ側に有するバチルス属に属する新
規微生物であり、微工研菌寄第8856号（ＦＥＲＭ Ｐ−
8856）で寄託されている。この新規菌株は本発明者が天
然界から新たに検索・単離されたものである。この菌株
をバージェーズ マニュアル オブ デターミナティブ
バクテリオロジー (Bergey's Mannual of Determinat
ive Bacteriology), 第８版およびザ・ジーナス・バチ
ルス〔The Genus Bacillus：米国、デパートメント オ
ブ アグリカルチャー (Dept. of Agricalture) 版〕に
従って同定すると、好気性有胞子桿菌であり、運動性が
あり、周べん毛を有し、グラム染色バリアブルであるこ
とからバチルス属(Bacillus sp.)に属することは明らか
であったが、pH 7.5〜11.5のアルカリ性で良く生育する
ことから、既知のバチルス属菌とは分類学上異なる新菌
株と考えた。表１は、単離したβ−マンナナーゼ／β−
マンノシダーゼ生産菌（ＡＭ−００１株）の菌学的諸性
質を示している。

【０００９】

【表１】 β−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼ生産菌株 （ＡＭ−００１）の菌学的性質 (1) 形態学的性質 形 状 桿 菌 サイズ 0.6 〜0.8 ×３〜５μｍ 運動性 有り（周べん毛） グラム染色 バリアブル 胞子のう わずかにふくらんでいる 胞子の形および寸法 楕円型で1.2 ×２μｍ 末端 (2) 各種培地での生育 肉汁液体培地 もろい菌環をつくり白濁 肉汁寒天平板 周辺全縁、凸円状、色は白濁 肉汁ゼラチン穿刺培養 ＋ グルコース・肉汁液体培地 による嫌気的生育 − 硝酸塩からの嫌気的ガスの生成 − 5.0 ％食塩肉汁液体培地 ＋ 7.5 ％食塩肉汁液体培地 − (3) 生化学的性質 ゼラチンとカゼインの加水分解 ＋ デンプンの加水分解 ＋ クエン酸の利用 ＋ (4) 生化学的性質 硝酸塩の還元 − ＶＰ−テスト − インドールの生成 − 硫化水素 − 無機窒素源の利用 − 色素の生成 − ウレアーゼ − オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ 酸素に対する態度 − （嫌気） (4) 生育のpHと温度 生育pH 7.5〜11.5 生育温度 〜50℃ (5) 糖の資化 Ｌ−アラビノース、Ｌ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、 Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、 ショ糖、 乳糖、トレ ハロース、ラフィノース、デンプン、グリセリン、Ｄ−ソルビット、Ｄ− マンニット、イヌリン、セルロースを資化する。 また、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、トレハロ ースにより酸を生成し、ガスは生成しない。 (注) ＋： 生育する又は陽性 −： 生育しない又は陰性

【００１０】この新規菌株は以下のようにしてスクリー
ニングした。この新規菌株の採取場所は国立市谷保の圃
場内における古ダタミの腐朽堆肥である。該堆肥カスを
水に懸濁し、上澄の一滴を以下組成の寒天培地に塗抹し
た。使用した寒天培地は寒天２％、 0.5％のNaＨＣ
Ｏ₃ 、ヤシ油抽出残渣１％、 0.5％のポリペプトン、
0.5％の酵母エキス、0.1 ％のＫ₂ＨＰＯ₄および0.02％
のMgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有する。この寒天平板培地で37
℃にて好気的に培養し、平板上に現われた各コロニーを
得、夫々のコロニーを更に寒天を除いた他は上記と同じ
組成の液体培地中で30〜40℃で48〜72時間好気的に培養
した。次いで、各培養液を12,000Ｇで10分間、４℃で遠
心分離し、菌体と上澄とに分離した。かくして得た上澄
液と、 0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.0)に菌体を懸濁させて
得られる懸濁液とから以下に述べるような活性測定法に
よりβ−マンナナーゼ活性を示すものを選んだ。その結
果、上記のような菌学的諸特性を有する菌株が分離でき
た。

【００１１】本発明の上記新菌株はβ−マンナナーゼを
菌体外に生産し且つβ−マンノシダーゼを菌体内に生産
する能力を有している。従って、この性質を利用してこ
れら酵素を有利に生産することができる。すなわち、本
発明のβ−マンナナーゼの製造方法は、上記新規菌株を
培養し、β−マンナナーゼを培養液中に生成・蓄積さ
せ、かつβ−マンノシダーゼを菌体内に生成・蓄積さ
せ、培養液からβ−マンナナーゼを採取することを特徴
としている。

【００１２】この方法で得られるβ−マンナナーゼは以
下のような理化学的特性を有している。 （イ）作用：マンナン、グルコマンナン、ガラクトマン
ナン、ガラクトグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マン
ノピラノシド結合を非特異的に加水分解し、マンノオリ
ゴ糖を生成する。 （ロ）基質特異性：β−マンナンに特異的に作用し、α
−マンナンに作用せず、β−１，４−Ｄ−マンノテトラ
オース以上の分子量をもつマンノオリゴ糖に作用し、こ
れを加水分解する。 （ハ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは８〜10であ
り、60℃、30分間の加熱条件下ではpH６〜10の範囲内で
安定である。 （ニ）温度に対する安定性：pH 8.0、30分間の加熱条件
下では65℃まで安定である。 （ホ）作用適温の範囲：65℃近傍に至適作用温度を有す
る。 （ヘ）失活条件：60℃、30分間の処理条件ではpH 5.0お
よび12.5で完全に失活し、また、pH8.0 、30分間の処理
では、80℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化：塩化第二水銀、硝酸銀、エチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡＮａ₂)、 尿
素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベン
ゼンスルフォン酸ナトリウム（ＤＢＳ）により阻害を受
ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点： 5.0〜
5.4 （リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
子量：43,000±3,000 および 57,000±3,000

【００１３】次に、本発明の新規なβ−マンナナーゼの
製造方法についてさらに詳しく説明する。上記のβ−マ
ンナナーゼ／β−マンノシダーゼ生産菌を適当な培地に
接種し、該菌体の生育温度の観点から30〜40℃で48〜72
時間、好気的に培養する。ここで培地は炭素源、窒素源
の他、必要に応じて無機塩、微量栄養素を含むものであ
る。炭素源としては従来公知の各種材料を使用すること
ができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム、
キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する植
物などを典型例として例示できる。窒素源としても特に
制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スティープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機態窒
素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機態窒素などが安価かつ入手容易なも
のとして例示できる。なお、有機態窒素源は炭素源とな
ることはいうまでもない。更に、これら炭素源、窒素源
の他に、一般に使用されている各種の塩、例えばマグネ
シウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビ
タミンなどを添加することも可能である。本発明方法で
使用するのに適した培地は、例えば１％のコンニャク
粉、２％のポリペプトン、 0.2％の酵母エキス、0.1％
のＫ₂ＨＰＯ₄および0.2％のMgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有す
る液体培地にすることができる。また、上記微生物の生
育pHは塩基性の範囲内であるので、適当なアルカリを用
いて上記培地のpH値を調整する必要がある。そのために
pH調整剤としては 0.5％炭酸水素ナトリウムを典型例と
して拳げることができるが、これに限定されず、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸
ナトリウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ試薬も使
用できる。本発明方法で用いられる菌の培養はバッチ
式、連続式のいずれによっても実施することができる。

【００１４】上記菌株はβ−マンナナーゼを菌体外生産
するので、生産されたβ−マンナナーゼは培養液中に放
出され、そこに蓄積される。こうして生成した酵素をそ
のまま利用することもできる。例えば、培養液中の菌体
を遠心分離、濾過などで除去した後、得られる上澄液
（粗酵素液）をそのままβ−マンナンの加水分解反応に
適用することも可能である。これは経済的に有利な方法
である。

【００１５】また、生成した酵素を分離・精製して用い
ることもできる。この場合には、例えば菌体破砕・抽出
後、硫安による塩析、エタノール、アセトン、イソプロ
パノール等による溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過
法、イオン交換樹脂等による一般的な酵素精製法により
精製することができる。以下に、β−マンナナーゼの好
ましい精製法の１例を説明する。好アルカリ性バチルス
属に属する本発明のＡＭ−００１菌株を例えば上記のよ
うな培地に植菌し、37℃で72時間好気的に培養して得ら
れる培養液に 0.8％(w/v) のセタブロン（セチルトリメ
チルアンモニウムブロマイド）を添加し、30分間放置し
た後、０℃で20分間 7,000 r.p.mで遠心分離して菌体を
除き、３ｌの上澄液を得る。次いで、この上澄液に硫酸
アンモニウムを加えて75％飽和とし、４℃で一夜放置す
る。生じた沈澱を濾別し、10mM燐酸緩衝液（pH7.0)に溶
解させ、一夜４℃で同緩衝液に対して透析する。生じた
沈殿を遠心分離して除き、得られた上澄液を同上緩衝液
で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール 650Ｍに吸着させ、
0.1〜0.5 ＭのNaClを含む同上緩衝液の濃度勾配法によ
って酵素を溶出する。溶出した活性画分を集め、同上緩
衝液に対して一度、４℃で透析した後、同上緩衝液で平
衡化したハイドロキシアパタイトに吸着させる。ついで
0.01〜0.4 Ｍリン酸緩衝液（pH7.0)の濃度勾配法によっ
て酵素を溶出させると、β−マンナナーゼ活性を持った
２つの画分（Ｆ−Ａ、Ｆ−Ｂ）が得られ、２つの画分を
合わせた活性収率は29％である。次いで、各フラクショ
ンを各々平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃
縮し、該濃縮酵素を高速液体クロマトグラフ用蛋白質分
取精製用カラム、ショデックス プロテイン(SHODEX pr
otein) ＷＳ−２００３で分離し、10ｍＭリン酸緩衝液
（pH7.0)を用いて溶出する。かくして得られた活性画分
を濃縮した後、同上カラムを用いて同一条件で再度クロ
マトグラフィーにかけ、得られた活性画分を濃縮すると
精製酵素が得られる。次いで、これらの精製酵素をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法〔バイオケ
ミカル＆バイオフィジカル リサーチ コミュニケーシ
ョンズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 1967, 28
, 815 〕およびポリアクリルアミドディスク電気泳動
法〔アナルズ ニューヨーク アカデミック サイエン
ス (ANN. N.Y. Acad. Sci.), 121, 404 1964) 〕で、こ
れらの均一性を検討した結果、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドディスク電気泳動法ではＦ−ＡおよびＦ−Ｂ画分の
いずれでも各々分子量57,000±3,000 および43,000±3,
000 の均一のバンドが検出されたが、ポリアクリルアミ
ドディスク電気泳動法では、Ｆ−Ａ画分についてはβ−
マンナナーゼ活性を有する２本のバンドが検出され、ま
た、Ｆ−Ｂ画分については該電気泳動法によっても均一
のバンドが検出された。なお、これらの３つのβ−マン
ナナーゼは、分子量を異にする以外は、それらの酵素化
学的諸性質はほぼ同一であった。

【００１６】β−マンナナーゼ活性の測定法および活性
表示法は以下の通りである。0.1 Ｍのグリシン−NaＯＨ
−NaCl緩衝液（pH9.0) 0.4mlと、１％ (w/v)のコンニャ
クマンナン水溶液 0.5mlに酵素液 0.1mlを混合し、50℃
で10分間反応させた後、ソモギー〔Somogyi;ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー(J.Biol. Che
m.), 1952, 195, 19 〕液1.0ml を添加して酵素を失活
させた後、沸騰水浴中で加熱する。10分後、氷浴中で急
冷し、ネルソン〔Nelson, ジャーナルオブ バイオロジ
カル ケミストリー(J. Biol. Chem.), 1944, 153, 37
5〕液を1.0ml を加え、よく撹拌した後、水を加えて10m
lにする。着色度を紫外光（波長:660nm) で 100μｇ／m
lのマンノースを標準として測定する。酵素活性の単位
は前述の条件下で１分間に１μmol のマンノースに相当
する還元糖を生成するのに要する酵素量を１単位として
表示する。上記菌株ＡＭ−００１の産成するβ−マンナ
ナーゼの分子量としては43,000±3,000 と57,000±3,00
0 の２つが観察される。その理由は不明であるが、先ず
大きい分子量のものが生成し、次いで分子の一部が脱落
して低分子量のものができる、例えば、ある種のプロテ
アーゼによって分解され、上記の各分子量のものがある
比率で共存するためと考えられる。なお、この過程の前
後の物性の変化は分子量以外には観察されない。表２は
従来公知の微生物由来の各種β−マンナナーゼとの理化
学的性質と酵素化学的性質を示している。

【００１７】

【表２】 各種β−マンナナーゼ 起源 Streptomyces.sp. Aeromonas.sp. 至適pH 6.5 5.5 至適温度（℃) 55 ─ pH安定性 ５〜8.5 ５〜9.5 （30℃、３hrs) （20℃、20hrs) 温度安定性 pH6.8で安定 pH6.0で15分 30 分45℃ 45℃で安定 60 分45℃ 55℃で失活 180 分40℃ ─ 残存活性 30分55℃ 85 ％ ─ 60分55℃ 65 ％ ─ 180分55℃ 30 ％ ─ 等電点 3.65 5.6 分子量 42,900 (SDS-PAGE) 24,000 (ゲル濾過)

【００１８】

【表３】 各種β−マンナナーゼ 起源 Asp.tamarii Aspergillus niger Bacillus subtilis 至適pH 4.5 3.0, 3.8 6.0 至適温度（℃) ─ 65 60 pH安定性 ─ 2.0 〜9.2 5.0〜9.5 温度安定性 ─ 80 ℃で失活 70℃で失活 等電点 ─ 4.10 5.24 分子量(SDS-PAGE) 56,000 420,000 220,000 53,000

【００１９】

【表４】 各種β−マンナナーゼ 起源 Rhizopus niveus Alkalophilic Bacillus 至適pH 5.5 9.0 至適温度（℃) 40 65 pH安定性 2.5〜10.0 ６〜10（60℃) 温度安定性 ─ 60℃ 等電点 ─ 5.1〜5.2 分子量 ─ 30,000±3,000 以下、本発明の実施例を説明する。

【００２０】

【実施例】実施例１ 500ml 用の三角フラスコ中にグアーガムを 0.5％、コー
ンスティープリカーを５％、硫安を 0.1％、Ｋ₂ＨＰＯ₄
を 0,1％、MgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを0.02％および炭酸ソーダ
を0.25％含む培養液100ml(pH9.5)に、本発明による好ア
ルカリ性細菌バチルスＡＭ−００１菌株(FERM P-8856)
を植菌し、37度で48時間、200 r.p.m.で振とう培養し
た。次いで、該培養液を０℃で30分間、12,000r.p.m.で
遠心分離して菌体と培養上澄とを回収した。上記培養液
上澄中のβ−マンナナーゼ活性を上記のように測定し
た。結果は53単位／mlであった。

【００２１】

【発明の効果】天然界に比較的多量に存在するβ−Ｄ−
マンナンは、デンプンと同様にそのまま、または化学的
改質処理を施した後に糊料、増粘剤、食品材料等として
繊維、化粧品、食品、農薬等の各種分野において広く利
用されているが、このβ−Ｄ−マンナンを有効利用する
ためには、これを効率良く加水分解する酵素（βマンナ
ナーゼ、β−マンノシダーゼなど）を得る必要がある。
即ち、β−Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素
を得ることは、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、
マンノース、グルコース、ガラクトースなどの糖類とし
て、これを回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ−マンナ
ン自体として使用した後にこれを分解・除去するなどの
目的のために極めて重要である。このような用途におい
て、β−マンナナーゼは高温安定性を有し、しかも中性
〜アルカリ性領域に酵素反応の至適pHを有するものであ
ることが、工業的応用という観点から極めて望ましい。
しかし、このような目的で従来から種々起源のマンナン
分解酵素が見出され、利用されてきたが、例えばβ−マ
ンナナーゼでは高温安定性に劣るものであったり、酵素
産生微生物の培養時間が著しく長いものであり、経済性
の観点すなわちβ−Ｄ−マンナンの分解効率の観点から
望ましいものとはいえなかった。本発明者等は種々検索
し、好アルカリ性バチルス属に属するある種の微生物が
有用なβ−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼを高
い生産率で同時に生産することを見出した。この酵素は
上記β−Ｄ−マンナンの加水分解反応における諸要件を
満足するものであり、従来知られていた各酵素の諸問題
点をいずれも解決するものであることが分かった。即
ち、先ず、本発明の新規微生物はβ−マンナナーゼを菌
体外生産するので、酵素の分離・精製は極めて容易であ
り、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待できる。
更に、この酵素は高温安定性に優れ、しかもアルカリ側
（pH８〜10）に酵素反応の至適pHを有しているので、ア
ルカリ条件下で行われる各種植物からのβ−マンナンの
抽出操作後、従来のように酸性条件とするための操作を
施すことなくそのまま酵素分解反応に移行することが可
能であり、作業性、経済性の点で大巾な改善が望める。
更に、本発明の上記微生物はβ−マンノシダーゼを菌体
内生産し、このβ−マンノシダーゼははほぼ中性領域に
酵素反応の至適pHを有するので、上記のような抽出操作
後わずかなpH調節を施した後、次の分解反応に移行する
ことができる。また、この酵素はβ−マンナナーゼを含
む培養上澄の分離の際に得られる菌体をそのままあるい
は簡単な分離・精製操作を施した後使用でき、労力、量
産性、経済性の点で有利である。従って、本発明方法で
は、β−Ｄ−マンナンを加水分解して分解生成物を有効
利用したり、β−Ｄ−マンナン自体を糊料等として使用
した後に分解・除去するのに有用なβ−マンナナーゼを
効率良く生産することができ、しかもこの酵素はpH安定
性、高温安定性等において優れているので、酵素の工業
的な大規模利用が可能となる。要約すれば、β−Ｄ−マ
ンナンを効率良く加水分解するβ−マンナナーゼとβ−
マンノシダーゼを同時に生産する好アルカリ性バチルス
属に属する新規な微生物の生産する本発明の酵素は、β
−Ｄ−マンナンの加水分解反応に要求される諸条件をい
ずれも満足し、高い効率でこれを分解し、使用後の分解
・除去および分解生成物の有効利用を著しく容易にする
と共に経済的にも大巾な改善を保証し得るものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 秋野 利郎 埼玉県草加市氷川町470番地 (72)発明者 中村 信之 東京都国立市中１−４−23 (72)発明者 掘越 弘毅 東京都練馬区桜台４−39−８

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記理化学的性質を有するβ−マンナナ
   ーゼ： （イ）作用：マンナン、グルコマンナン、ガラクトマン
   ナン、ガラクトグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マン
   ノピラノシド結合を非特異的に加水分解し、マンノオリ
   ゴ糖を生成する （ロ）基質特異性：β−マンナンに特異的に作用し、α
   −マンナンに作用せず、β−１，４−Ｄ−マンノテトラ
   オース以上の分子量をもつマンノオリゴ糖に作用し、こ
   れを加水分解する （ハ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは８〜10であ
   り、60℃、30分間の加熱条件下ではpH６〜10の範囲内で
   安定である （ニ）温度に対する安定性：pH 8.0、30分間の加熱条件
   下では65℃まで安定である （ホ）作用適温の範囲： 65℃近傍に至適作用温度を有
   する （ヘ）失活条件：60℃、30分間の処理条件では pH 5.0
   および12.5で完全に失活し、またpH8.0 、30分間の処理
   では80℃で完全に失活する （ト）阻害および活性化：塩化第二水銀、硝酸銀、エチ
   レンジアミン四酢酸二ナトリウム、 尿素、ドデシル硫酸
   ナトリウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウム
   により阻害を受ける （チ）クロマトフォーカシング法による等電点： 5.0
   〜5.4 （リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
   子量：43,000±3,000 および 57,000±3,000 。
2. 【請求項２】 下記理化学的性質： （イ）作用：マンナン、グルコマンナン、ガラクトマン
   ナン、ガラクトグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マン
   ノピラノシド結合を非特異的に加水分解し、マンノオリ
   ゴ糖を生成する （ロ）基質特異性：β−マンナンに特異的に作用し、α
   −マンナンに作用せず、β−１，４−Ｄ−マンノテトラ
   オース以上の分子量をもつマンノオリゴ糖に作用し、こ
   れを加水分解する （ハ）至適pHおよび安定pH範囲：至適pHは８〜10であ
   り、60℃、30分間の加熱条件下ではpH６〜10の範囲内で
   安定である （ニ）温度に対する安定性：pH 8.0、30分間の加熱条件
   下では65℃まで安定である （ホ）作用適温の範囲：65℃近傍に至適作用温度を有す
   る （ヘ）失活条件：60℃、30分間の処理条件では pH 5.0
   および12.5で完全に失活し、またpH8.0 、30分間の処理
   では80℃で完全に失活する （ト）阻害および活性化：塩化第二水銀、硝酸銀、エチ
   レンジアミン四酢酸二ナトリウム、 尿素、ドデシル硫酸
   ナトリウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウム
   により阻害を受ける （チ）クロマトフォーカシング法による等電点： 5.0
   〜5.4 （リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
   子量：43,000±3,000 および 57,000±3,000 を有するβ−マンナナーゼ生産能を有し且つ生育の至適
   pHをアルカリ性に有するバチルス属に属する微生物を培
   養して培養液中にβ−マンナナーゼを生成・蓄積させ、
   それを採取することを特徴とする菌体外β−マンナナー
   ゼの製造方法。
3. 【請求項３】 培養を30〜45℃の範囲内の温度下で好気
   的に行う請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 培養液のpHを 7.5〜11.5の範囲にする請
   求項２または３に記載の方法。
5. 【請求項５】 微生物の培養後、培養上澄液を分離し、
   更に精製して精製マンナナーゼとする特許請求の範囲第
   ２〜４項のいずれか一項に記載の方法。
6. 【請求項６】 上記のβ−マンナナーゼ生産能を有する
   微生物が工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
   第8856号で寄託された菌株である請求項２〜５のいずれ
   か一項に記載の方法。