PL185711B1 - Zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, sposób jego wytwarzania, sposób amplifikacji kwasu nukleinowego, mieszanina reakcyjna do amplifikacji PCR i zestaw do PCR - Google Patents
Zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, sposób jego wytwarzania, sposób amplifikacji kwasu nukleinowego, mieszanina reakcyjna do amplifikacji PCR i zestaw do PCRInfo
- Publication number
- PL185711B1 PL185711B1 PL96315803A PL31580396A PL185711B1 PL 185711 B1 PL185711 B1 PL 185711B1 PL 96315803 A PL96315803 A PL 96315803A PL 31580396 A PL31580396 A PL 31580396A PL 185711 B1 PL185711 B1 PL 185711B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- enzyme
- thermostable
- amplification
- incubation
- reaction
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 161
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 161
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 38
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 title claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 31
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 title claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 103
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 89
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 82
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims abstract description 13
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 9
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 claims abstract 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 162
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 161
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical compound CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 26
- FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxy-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound CCOC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FMJUDUJLTNVWCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- -1 anhydride 3, 4,5,6-tetrahydrophthalic anhydride Chemical class 0.000 claims description 8
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dimethylmaleic anhydride Chemical compound CC1=C(C)C(=O)OC1=O MFGALGYVFGDXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 239000011369 resultant mixture Substances 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 84
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 56
- 239000000047 product Substances 0.000 description 48
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 17
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 17
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrahydro-2-benzofuran-1,3-dione Chemical compound C1CCCC2=C1C(=O)OC2=O HMMBJOWWRLZEMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 5
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229910014033 C-OH Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910014570 C—OH Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- CSJDCSCTVDEHRN-UHFFFAOYSA-N methane;molecular oxygen Chemical compound C.O=O CSJDCSCTVDEHRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 1
- 241001427367 Gardena Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710085030 Gene 32 protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241000204671 Pyrodictium Species 0.000 description 1
- 241000531165 Pyrodictium abyssi Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 241000204315 Thermosipho <sea snail> Species 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 229940023019 aconite Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005583 trifluoroacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Furan Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
1. Enzym termostabilny, inaktywowany odwracalnie przez modyfikacje chemiczna, znamienny tym, ze inkubacja termostabilnego, chemicznie zmodyfikowanego enzymu w buforze wodnym o pH alkalicznym w temperaturze ponizej okolo 25°C nie powoduje znaczacego wzrostu aktywnosci enzymatycznej w czasie krótszym niz okolo 20 minut, reagent modyfikujacy jest bezwodnikiem dikarboksylowym o wzorze 1, w którym R1 i R2 oznaczaja wodór albo rodniki organiczne, które moga byc zwiazane, albo o wzorze 2, w którym R1 i R2 oznaczaja rodniki organiczne, które moga byc zwiazane, a wodory sa w polozeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo calkowita inaktywacje enzymu, zas inkubacja wspomnianego zmodyfikowanego chemicznie enzymu w buforze wodnym, o pH okolo 8-9 w temperaturze 25°C, w temperaturze wyzszej niz okolo 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywnosci enzymatycznej w czasie krótszym niz okolo 20 minut. 2. Enzym wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze posiada aktywnosc termostabilnej polimerazy DNA albo termostabilnej ligazy. 3. Enzym wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze posiada aktywnosc termostabilnej polimerazy DNA, która zostala uzyskana z gatunku wybranego sposród grupy rodzajów, skladajacej sie z Thermus aguaticus, Thermus thermophilus i Thermotoga maritima. P L 185711 B 1 PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, sposób jego wytwarzanią sposób amplifikacj i kwasu nukleinowego, mieszanina reakcyjna do amplifikacji PCR i zestaw do PCR. Wynalazek dotyczy, ogólnie, dziedziny chemii kwasów nukleinowych. W szczególności, dotyczy sposobów amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego i sposobów zmniejszania amplifikacji nieswoistych.
Proces amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest dobrze znany w technice i ujawniony w patentach USA Nr 4/683,202; 4,683,195 i 4,965,188. Dostawcy, jak Perkin Elmer, Norwalk, CT sprzedają reagenty do PCR i publikują protokoły PCR.
W każdym cyklu amplifikacji, dwuniciowa sekwencja docelowa podlega denaturacji, każda ze zdenaturowanych nici swoiście wiąże się ze starterem zaś startery ulegają wydłużaniu dzięki działaniu polimerazy DNA. Swoistość amplifikacji zależy od swoistości hybrydyzacji starterów. Startery dobierane są pod względem komplementamości lub zasadniczej
185 711 komplementamości z sekwencjami występującymi na końcu 3' każdej z nici docelowej sekwencji kwasu nukleinowego. W podwyższonych temperaturach zwykle stosowanych w PCR, startery hybrydyzują wyłącznie z zamierzoną docelową sekwencją. Jednakże, mieszaniny reakcyjne do amplifikacji są zwykle przygotowywane w temperaturze pokojowej, znacznie poniżej temperatury niezbędnej do zapewnienia swoistości hybrydyzacji startera. W takich mniej surowych warunkach startery mogą wiązać się nieswoiście z innymi, tylko częściowo swoistymi sekwencjami kwasu nukleinowego (lub nawet z innymi starterami) i zapoczątkowywać syntezę niepożądanych produktów, które mogą być amplifikowane równocześnie z sekwencją docelową. Amplifikacja nieswoistych produktów wydłużania starterów może współzawodniczyć z amplifikacją pożądanych sekwencji docelowych i może znacznie zmniejszać wydajność amplifikacji sekwencji docelowej. Problemy spowodowane amplifikacją nieswoistą dyskutowane są dalej w Chou i in.. Nuci. Acids Res., 20(7):1717-1723.
Amplifikacja nieswoista może być zmniejszona przez redukcję tworzenia produktów wydłużania starterów związanych z niedocelowymi sekwencjami przed rozpoczęciem reakcji. W jednej z metod, określanej jako protokół „hot-start”, jeden lub więcej kluczowych reagentów nie dodaje się do mieszaniny reakcyjnej dopóki temperatura nie wzrośnie wystarczająco by zapewnić niezbędną swoistość hybrydyzacji. W ten sposób, mieszanina reakcyjna nie może podtrzymać reakcji w czasie gdy waninki reakcji nie zapewniają swoistej hybrydyzacji starterów.
Metody oparte na „hot-start” mogą być przeprowadzone manualnie przez otwarcie probówki reakcyjnej po wstępnym etapie inkubacji w wysokiej temperaturze i dodanie brakującego reagentu. Jednakże, manualne metody „hot-start” są pracochłonne i zwiększają ryzyko zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej. Metody „hot-start” stosujące materiał termowrażliwy, jak wosk, w celu rozdzielenia lub odgraniczenia składników reakcji opisane są w Patencie USA Nr 5,411,876 oraz w Chou i in., patrz wyżej. W sposobach tych, wysoka temperatura wstępnej inkubacji roztapia materiał termowrażliwy umożliwiając zmieszanie się reagentów.
Inny sposób zmniejszenia tworzenia produktów wydłużania starterów związanych z sekwencjami niedocelowymi przed rozpoczęciem reakcji polega na zahamowaniu polimerazy DNA przy użyciu związków, które wiążą się niekowalencyjnie z polimerazą DNA w sposób możliwy do odwrócenia przy użyciu ciepła. Patent USA Nr 5,338,671 opisuje zastosowanie przeciwciał swoistych dla polimerazy DNA w celu zahamowania aktywności polimerazy DNA. Przeciwciała muszą być inkubowane z polimerazą DNA w buforze w temperaturze pokojowej przed włączeniem jej do mieszaniny reakcyjnej, w celu umożliwienia wytworzenia komleksów przeciwciało-polimeraza DNA. Zahamowanie aktywności polimerazy DNA przeciwciałami jest zniesione wysoką temperaturą w trakcie wstępnej inkubacji. Wadą tej metody jest wysoki koszt oraz duża czasochłonność wytworzenia przeciwciał swoistych dla polimerazy DNA, zwłaszcza w dużych ilościach. Ponadto, dodanie przeciwciał do mieszaniny reakcyjnej może wymagać przeprojektowania reakcji amplifikacji.
Tworzenie produktów wydłużania może być również zahamowane przez dodanie związku, który niekowalencyjnie wiąże się ze starterami w sposób możliwy do odwrócenia przy pomocy ciepła, zapobiegając w ten sposób hybrydyzacji starterów z jakimikolwiek sekwencjami, docelowymi czy innymi. Przykładowo, jednołańcuchowe białko wiążące dodane do mieszaniny reakcyjnej wiąże się ze starterami zapobiegając w ten sposób hybrydyzacji starterów i hamując wydłużanie starterów. Poprawę w ilości uzyskanego produktu PCR białka genu 32 opisano w Schwartz i in., 1990, Nuci. Acids. Res., 18(4):10.
Amplifikacja nieswoista może być zmniejszona przez degradację produktów wydłużania wytworzonych ze starterów związanych z sekwencjami niedocelowymi przed rozpoczęciem reakcji, jak np. przez zastosowanie sposobów opisanych w Patencie USA Nr 5,418,149 i w W092/01814. Degradacja nowopowstałych produktów wydłużania uzyskiwana jest przez włączenie do mieszaniny reakcyjnej dUTP i UNG i inkubowanie mieszaniny reakcyjnej w 45-60°C przed przeprowadzeniem reakcji amplifikacji. Wadą tego sposobu jest współzawodnictwo procesu degradacji produktów wydłużania z tworzeniem tych produktów oraz to, że eliminacja nieswoistych produktów wydłużania starterów jest mniej kompletna.
185 711
Standardowe techniki biologii molekularnej, chemii białek i chemii kwasów nukleinowych, które są w zakresie wiedzy fachowca, są w pełni opisane w literaturze. Patrz, przykładowo, Molecular Cloning - A Laboratory Manuał, Colo. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Sambrook i in., 1988);
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, wyd., 1984); Nucleic Acid Hybrydisation (B. D. Hames i S. J. Higgins, wyd., 1984);
Chemical Reagents for Protein Modyfication (CRC Press) oraz seria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.). Wszystkie patenty, zgłoszenia patentowe oraz publikacje wymienione zarówno powyżej jak i poniżej, załączono tu jako odnośniki.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów i odczynników do amplifikacji kwasu nukleinowego przy użyciu reakcji amplifikacji opartej na starterach jak to wymieniono w dołączonym zestawie zastrzeżeń. Sposoby te i odczynniki dostarczają prostego i ekonomicznego sposobu rozwiązania problemu nieswoistej amplifikacji. Sposoby te wykorzystują odwracalnie inaktywowany enzym termostabilny, który może być reaktywowany przez inkubację w podwyższonej temperaturze. Nieswoista amplifikacja jest znacznie zmniejszona ponieważ mieszanina reakcyjna nie podtrzymuje wydłużania dopóki temperatura mieszaniny reakcyjnej nie zostanie podniesiona do temperatury zapewniającej swoistość hybrydyzacji starterów.
Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy odwracalnie inaktywowanych enzymów termostabilnych wytworzonych w reakcji pomiędzy enzymem termostabilnym katalizującym reakcję wydłużania startera, a odczynnikiem modyfikującym. Reakcja powoduje znaczne, najkorzystniej niemal zupełne, zmniejszenie aktywności enzymu. Inkubacja zmodyfikowanego enzymu w wodnym buforze o odczynie alkalicznym w temperaturach poniżej około 25°C powoduje nie powoduje zwiększania się aktywności enzymu przez około 20 minut. Inkubacja zmodyfikowanego enzymu w wodnym buforze o pH 8-9 przy 25°C, w temperaturze powyżej 50°C powoduje co najmniej dwukrotny wzrost aktywności wydłużania starterów w ciągu około 20 minut, odwracalnie inaktywowane enzymy termostabilne według wynalazku, katalizują wydłużanie starterów bądź są niezbędne do zajścia wydłużania starterów. Korzystne enzymy obejmująpolimerazy i ligazy DNA.
Korzystnymi reagentami modyfikującymi są bezwodniki kwasów dikarboksylowych o wzorze 1, w którym R! i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R, i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane a wodory są w położeniu cis. Rodnik organiczny może być związany bezpośrednio z pierścieniem wiązaniem węgiel-węgiel albo przez wiązanie węgiel-heteroatom, jak wiązanie węgiel-tlen, węgiel-azot czy węgiel-siarka. Rodniki organiczne mogą być związane ze sobą tworząc strukturę pierścieniowąjak w, przykładowo, bezwodniku 3,4,5,6-tetrahydroftalowym.
Korzystne reagenty obejmują bezwodnik maleinowy; podstawione bezwodniki maleinowe jak bezwodnik cytrakonowy, bezwodnik cis-akonitowy czy bezwodnik 2,3-dimetylomaleinowy; bezwodnik egzo-cis-3, 6-endokso-A4-tetrahydroftalowy i bezwodnik 3,4,5,6-tetrahydroftalowy. W szczególności, bezwodnik cytrakonowy i bezwodnik cis-akonitowy są korzystne do wytwarzania odwracalnie inaktywowanych polimeraz DNA do zastosowania w amplifikacjach PCR.
Inny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobów przeprowadzania reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego z zastosowaniem odwracalnie inaktywowanych termostabilnych enzymów według wynalazku. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego w próbce obejmujących etapy:
(a) doprowadzenia do kontaktu próbki z mieszaniną reakcyjną do amplifikacji, zawierającą starter komplementarny do docelowego kwasu nukleinowego i zmodyfikowany enzym termostabilny, wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego katalizującego reakcję wydłużania startera i reagentu modyfikującego, przeprowadzanej w pH alkalicznym, w temperaturze poniżej około 25°C, która to reakcja powoduje modyfikację chemiczną enzymu, powodującą zasadniczo całkowitą inaktywację aktywności enzymu, przy czym inkubacja zmodyfikowanego enzymu w buforze wodnym, który w 25°C ma pH 8-9, w temperaturze powyżej 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie mniejszym niż 20 minut; oraz
185 711 (b) inkubacji powstałej mieszaniny z etapu (a) w temperaturze wyższej niż około 50°C w czasie odpowiednim do reaktywowania enzymu i umożliwienia tworzenia produktów wydłużania startera.
Jako korzystną metodę, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego zawartego w próbce, obejmującego;
(a) doprowadzenie do kontaktu próbki z mieszaniną reakcyjną do amplifikacji, zawierającą starter komplementarny do docelowego kwasu nukleinowego i zmodyfikowany enzym termostabilny, wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego i bezwodnika kwasu dikarboksylowego o wzorze 1, w którym Rj i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym Rj i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, powodującej zasadniczo całkowitą inaktywację aktywności enzymu oraz; oraz (b) inkubację powstałej mieszaniny z etapu (a) w temperaturze wyższej niż około 50°C w czasie odpowiednim do reaktywowania enzymu i umożliwienia tworzenia produktów wydłużania startera.
Korzystne wykonania sposobu wykorzystują odwracalnie zmodyfikowane enzymy, które zmodyfikowano z użyciem korzystnych reagentów modyfikujących. W niektórych wykonaniach wynalazku, etap inkubacji, etap (b), przeprowadzany jest przed rozpoczęciem reakcji amplifikacji. W innych wykonaniach, inkubacja powodująca reaktywację enzymu jest integralnym etapem w procesie amplifikacji. Przykładowo, etap denaturacji przeprowadzany w każdym cyklu PCR może powodować równocześnie reaktywację zmodyfikowanej polimerazy DNA.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, reakcja amplifikacji jest reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) oraz stosowana jest odwracalnie inaktywowana, termostabilna polimeraza DNA. Mieszanina reakcyjna inkubowana jest przed przeprowadzeniem reakcji amplifikacji w temperaturze wyższej niż temperatura przyłączania startera reakcji amplifikacji. Tak więc, polimeraza DNA pozostąje inaktywowana, dopóki temperatura jest wyższa niż temperatura zapewniająca swoistość reakcji amplifikacji, zmniejszając w ten sposób amplifikację nieswoistą
Inny aspekt wynalazku dotyczy mieszanin reakcyjnych do amplifikacji, zawierających odwracalnie inaktywowany termostabilny enzym według wynalazku, wraz z reagentami do przeprowadzenia reakcji amplifikacji. W korzystnym wykonaniu mieszanina reakcyjna do amplifikacji zawiera startery oligonukleotydowe do przeprowadzenia PCR.
Inny aspekt wynalazku dotyczy zestawów zawierających odwracalnie inaktywowany enzym termostabilny według wynalazku oraz jeden lub wiele reagentów do amplifikacji.
Wzór 3 przedstawia strukturę bezwodnika cytrakonowego, a wzór 4 bezwodnika cisakonitowego. Na rysunku przedstawiony jest też schemat reakcji pomiędzy bezwodnikiem cytrakonowym a lizyną.
Figura 1 pokazuje wyniki amplifikacji przeprowadzonej z użyciem cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq, jak to opisano w przykładzie 4.
Figura 2 pokazuje wyniki amplifikacji przeprowadzonych z użyciem cytrakonylowanej polimerazy DNA, jak to opisano w przykładzie 6.
Figura 3 pokazuje wyniki prowadzonych w różnym czasie inkubacji poprzedzających reakcje amplifikacji przeprowadzonych z użyciem cytrakonylowanych albo cisakonitylowanych polimeraz DNA, jak to opisano w przykładzie 9.
Figura 4 pokazuje wyniki różnej liczby cykli w amplifikacjach przeprowadzonych z użyciem cytrakonylowanych albo cis-akonitylowanych polimeraz DNA, jak to opisano w przykładzie 10.
Aby ułatwić zrozumienie wynalazku, zdefiniowano poniżej niektóre określenia.
Określenia „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” dotyczą starterów, sond i fragmentów oligomerowych, które mają być wykryte, i są to terminy ogólne dla polidezoksyrybonukleotydów (zawierających 2-dezoksy-D-rybozę), dla polirybonukleotydów (zawierających D-rybozę) oraz dla każdego innego rodzaju polinukleotydu, który jest N-glikozydem zasady purynowej czy pirymidynowej, albo zmodyfikowanej zasady purynowej czy pirymidynowej.
185 711
Nie zamierzone jest jakiekolwiek rozróżnianie co do długości pomiędzy określeniami „kwas nukleinowy” i „oligonukleotyd” i określenia te będą używane zamiennie. Określenia te odnoszą się tylko do struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, określenia te obejmują dwu- i jednoniciowy DNA, jak również dwu- i jednoniciowy RNA. Oligonukleotydy mogą być wytwarzane każdym odpowiednim sposobem. Przegląd sposobów syntezy przedstawiono w Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187.
Określenie „hybrydyzacja” dotyczy tworzenia struktury dupleksu przez dwa jednoniciowe kwasy nukleinowe, dzięki parowaniu komplementarnych zasad. Hybrydyzacja może zajść pomiędzy w pełni komplementarnymi nićmi kwasu nukleinowego albo „zasadniczo komplementarnymi” nićmi kwasu nukleinowego, które zawierają małe regiony niezgodności. Warunki, w których będą hybiydyzo wały wyłącznie w pełni komplementarne nici kwasu nukleinowego określane są jako „surowe warunki hybrydyzacji” albo „warunki hybrydyzacji swoistej dla sekwencji”. Stabilne dupleksy sekwencji zasadniczo komplementarnych mogą być uzyskane w mniej surowych warunkach hybrydyzacji. Osoby biegłe w dziedzinie technologii kwasu nukleinowego mogą określić stabilność dupleksu empirycznie, uwzględniając wiele zmiennych obejmujących, przykładowo, długość i ilość par zasad oligonukleotydów, siłę jonową i występowanie omyłkowych par zasad, opierając się na wytycznych w stanie techniki (patrz, np. Sambrook i in., 1989, wyżej).
Ogólnie, surowe warunki hybrydyzacji wybrane są tak by były o około 5°C poniżej punktu topnienia (Tm) dla danej sekwencji przy określonej sile jonowej i pH. Tm jest temperaturą (przy określonej sile jonowej i pH), w której dysocjuje 50% par zasad. Zmniejszenie surowości warunków hybrydyzacji umożliwia tolerowanie niezgodności sekwencji; stopień tolerancji niezgodności może być kontrolowany odpowiednim dobraniem warunków hybrydyzacji.
Określenie „starter” dotyczy oligonukłeotydu, naturalnego bądź syntetycznego, zdolnego do działania jako punkt zapoczątkowujący syntezę DNA w warunkach, w których wywoływana jest synteza produktu wydłużania startera, komplementarnego do nici kwasu nukleinowego, tzn. w obecności czterech różnych trifosforanów nukleozydów i czynnika polimeryzacji (tzn. polimerazy DNA albo odwrotnej transkryptazy) w odpowiednim buforze oraz w odpowiedniej temperaturze. Analogi oligonukleotydów, jak „peptydowe kwasy nukleinowe”, mogą działać jako startery i objęte są pojęciem „startery” w znaczeniu tu użytym. Starter, korzystnie, jest jednoniciowym oligodezoksyrybonukleotydem. Odpowiednia długość startera zależy od zamierzonego zastosowania startera i zawiera się zwykle pomiędzy 6 a 50 nukleotydów. Krótkie startery, ogólnie, wymagają niższych temperatur aby wytworzyć odpowiednio stabilne kompleksy hybrydowe z matrycą. Starter nie musi odzwierciedlać dokładnie sekwencji matrycowego kwasu nukleinowego, ale musi być odpowiednio komplementarny by hybrydyzować z matrycą.
Określenie „wydłużanie startera” w znaczeniu tu użytym dotyczy zarówno syntezy DNA powstałego w wyniku polimeryzacji pojedynczych trifosforanów nukleozydów przy użyciu startera jako punktu zapoczątkowanią jak również przyłączania dodatkowych oligonukleotydów do startera powodując wydłużanie startera. W znaczeniu tu użytym, określeniem „wydłużanie startera” obejmuje się ligację dwóch oligonukleotydów, powodującą powstanie dłuższego produktu, który może służyć jako cel w dalszych cyklach amplifikacji. W znaczeniu tu użytym, określenie „starter” obejmuje oligonukleotydy, stosowane w procesach amplifikacji opartych na ligacji, wydłużane przez ligację drugiego oligonukłeotydu hybrydyzującego w pozycji stycznej.
Starter może wykazywać dodatkowe cechy, które umożliwiają wykrywanie bądź immobilizację starterą ale nie zmieniają zasadniczych właściwości startera, czyli działania jako punkt zapoczątkowania syntezy DNA. Przykładowo, startery mogą zawierać dodatkową sekwencję kwasu nukleinowego na końcu 5', która nie hybrydyzuje z docelowym kwasem nukleinowym, ale ułatwia klonowanie amplifikowanego produktu. Region startera, który jest wystarczająco komplementarny do matrycy by hybrydyzować, określany jest tu jako region hybrydyzujący.
185 711
Określenia „region docelowy” i „docelowy kwas nukleinowy” dotyczą regionu albo sekwencji częściowej kwasu nukleinowego, która ma być amplifikowana. Miejsce hybrydyzacji startera może być określone jako region docelowy hybrydyzacji startera.
W znaczeniu tu użytym, starter oligonukleotydowy jest „swoisty” dla sekwencji docelowej jeżeli liczba obecnych niezgodności pomiędzy oligonukleotydem a sekwencją docelową jest mniejsza niż liczba niezgodności pomiędzy oligonukleotydem a sekwencjami niedocelowymi, które mogąbyć obecne w próbce. Warunki hybrydyzacji mogąbyć dobrane tak by tworzyły się stabilne dupleksy tylko wówczas, gdy liczba istniejących niezgodności nie jest wyższa niż liczba istniejących niezgodności pomiędzy oligonukleotydem i sekwencją docelową. W takich warunkach oligonukleotyd może tworzyć stabilny dupleks wyłącznie z sekwencją docelową. Tak więc, zastosowanie starterów swoistych w odpowiednio surowych warunkach amplifikacji umożliwia swoistą amplifikację tych sekwencji docelowych, które zawierają docelowe miejsca wiązania startera. Zastosowanie warunków amplifikacji swoistych dla sekwencji umożliwia swoistą amplifikację tych sekwencji docelowych, które zawierają dokładnie komplementarne miejsca wiązania starterów.
Określenie „amplifikacja nieswoista” dotyczy amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego innych niż sekwencje docelowe, która wynika z tego, że startery hybrydyzują z sekwencjami innymi niż sekwencje docelowe i następnie służą jako substrat do wydłużania startera. Hybrydyzacja startera z sekwencją niedocelową określana jest jako „hybrydyzacja nieswoista” i może zachodzić w wyniku warunków przedreakcyjnych o mniejszej surowości i niższej temperaturze.
Określenie „enzym termostabilny” w znaczeniu tu użytym odnosi się do enzymu, który jest stosunkowo stabilny w wysokiej temperaturze. Enzymy termostabilne mogą znieść inkubacje w wysokiej temperaturze, stosowanej w celu usunięcia grup modyfikujących, zwykle wyższej niż 50°C, bez szkody w postaci nieodwracalnej utraty aktywności. Zmodyfikowane enzymy termostabilne możliwe do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują termostabilne polimerazy DNA i ligazy.
Określenie „termostabilne polimerazy DNA” odnosi się do enzymu, który jest stosunkowo stabilny w wysokiej temperaturze i katalizuje polimeryzację trifosforanów nukleozydów dającą w wyniku produkt wydłużania startera, który jest komplementarny do jednej z nici kwasu nukleinowego sekwencji docelowej. Enzym zapoczątkowuje syntezę na końcu 3' startera i postępuje w kierunku końca 5' matrycy do momentu zakończenia syntezy. Oczyszczone termostabilne polimerazy DNA opisano w patentach USA Nr 4,889/818; 5,352,600; 5,079,352; 5,591,086 i 5,210,036 oraz W091/09950; W092/03556; W092/06202 i W092/09689.
Enzym „uzyskany” z organizmu odnosi się do enzymu, który został oczyszczony z organizmu albo do rekombinowanej wersji enzymu, którą oczyszczono z organizmu oraz obejmuje enzymy, w których zmodyfikowano sekwencję aminokwasową przy użyciu technik biologii molekularnej.
Określenie „odwracalnie inaktywowany”, w znaczeniu tu użytym, oznacza enzym, który inaktywowano w reakcji ze związkiem, co spowodowało modyfikację kowalencyjną (określaną, również jako modyfikację chemiczną) enzymu, przy czym związek modyfikujący jest możliwy do usunięcia w odpowiednich warunkach. Reakcja, która powoduje usunięcie związku modyfikującego nie musi być odwrotnością reakcji modyfikacji. O ile istnieje reakcja, która powoduje usunięcie związku modyfikującego i przywrócenie czynności enzymu, enzym uważany jest za odwracalnie inaktywowany.
Określenie „mieszanina reakcyjna” dotyczy roztworu zawierającego reagenty niezbędne do przeprowadzenia danej reakcji. „Mieszanina reakcyjna do amplifikacji” oznacza roztwór zawierający reagenty niezbędne do przeprowadzenia reakcji amplifikacji i zwykle zawiera startery oligonukleotydowe i polimerazę DNA lub ligazę w odpowiednim buforze. „Mieszanina reakcyjna do PCR” zwykle zawiera startery oligonukleotydowe, termostabilną polimerazę DNA, dNTP oraz dwuwartościowy kation metalu w odpowiednim buforze. Mieszanina reakcyjna określana jest jako kompletna, jeśli zawiera wszystkie reagenty niezbędne do umożliwienia reakcji, zaś niekompletna, jeżeli zawiera wyłącznie część niezbędnych
185 711 reagentów. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że składniki reakcji są zwykle przechowywane jako osobne roztwory, z których każdy zawiera część wszystkich składników, dla wygody, oraz ze względu na stabilność podczas przechowywania i w celu umożliwienia niezależnego dobierania stężeń składników w zależności od zastosowania, oraz, że składniki reakcji łączone są przed reakcją w celu wytworzenia kompletnej mieszaniny reakcyjnej .
Sposoby według niniejszego wynalazku obejmują przeprowadzenie reakcji amplifikacji przy użyciu aktywowanego ciepłem enzymu termostabilnego, który jest niezbędny do wydłużania startera. Przed inkubacją w wysokiej temperaturze, która aktywuje enzym, mieszanina reakcyjna do amplifikacji nie podtrzymuje wydłużania startera i nie tworzą się żadne produkty wydłużania, nieswoiste czy inne. Po inkubacji w wysokiej temperaturze, która reaktywuje enzym, reakcja amplifikacji jest utrzymywana w podwyższonych temperaturach, co zapewnia swoistość reakcji. Tak więc, produkty wydłużania tworzą się wyłącznie w warunkach zapewniających swoistość amplifikacji.
W sposobach według niniejszego wynalazku, enzym aktywowany ciepłem w stanie aktywnym katalizuje reakcję wydłużania startera. Do zastosowania w typowych reakcjach amplifikacji, np. w PCR, aktywowany ciepłem enzym termostabilny posiada, w swym stanie aktywnym, aktywność polimerazy DNA. Do zastosowania w układach amplifikacji opartej na ligazie, aktywowany ciepłem enzym termostabilny ma, w swym aktywnym stanie, aktywność ligazy DNA.
W układach amplifikacji opartej na ligazie, „produkt wydłużania” tworzony jest przez ligację pierwszego oligonukleotydu (objętego tu określeniem „starter”) z drugim oligonukleotydem hybrydyzującym stycznie do końca 3' pierwszego oligonukleotydu. Drugi oligonukleotyd może hybrydyzować bezpośrednio stycznie do startera, i wówczas konieczna jest wyłącznie ligaza, albo może hybrydyzować o jedną lub więcej zasad od startera, i wówczas potrzebna jest aktywność polimerazy w celu wydłużenia startera przed ligacją. W obu przypadkach łączenie dwóch oligonukleotydów, które hybrydyzują w regionach stycznych docelowego DNA, objęte jest pojęciem „wydłużanie startera”.
Odwracalnie inaktywowane enzymy termostabilne, według wynalazku, są wytwarzane w reakcji pomiędzy enzymem a reagentem modyfikującym, co powoduje odwracalną chemiczną modyfikację enzymu powodującą całkowitą lub prawie całkowitą utratę aktywności enzymatycznej. Modyfikacja polega na kowalencyjnym związaniu grupy modyfikującej przez białko. Związek modyfikujący dobrany jest tak, by modyfikacja była odwracana przez inkubację w podwyższonej temperaturze w buforze do reakcji amplifikacji. Odpowiednie enzymy i grupy modyfikujące opisane są poniżej.
Odwracalnie inaktywowane enzymy posiadające, w swym stanie aktywnym, aktywność polimerazy DNA są wytworzone z termostabilnych polimeraz DNA. Termostabilne polimerazy DNA możliwe do zastosowania w reakcjach amplifikacji są dobrze znane w technice i mogą być uzyskane z licznych źródeł, jak termofilne eubacteria czy archebacteria gatunków z rodzaju Thermus, Thermotoga, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus i Thermosipho. Reprezentatywnymi przykładami gatunków, z których mogą być uzyskane termostabilne polimerazy DNA użyteczne w amplifikacjach PCR są Thermus aąuaticus, Thermus thermophilus, Thermatoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi i Thermosipho africanus. Termostabilne polimerazy DNA opisano w patentach USA Nr 4,889,818; 5,352,600; 5,079,352; 5,591,086 i 5,210,036 oraz W091/09950; W092/03556; W092/06202 i W092/09689. Termostabilne polimerazy DNA dostępne są w handlu z Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Odwracalnie inaktywowane enzymy termostabilne odpowiednie do zastosowania w innych procesach amplifikacji, jak amplifikacje oparte na ligazie, wytwarza się z enzymów termostabilnych opisanych w odnośnikach zacytowanych niżej, które opisują różne sposoby amplifikacji.
Sposoby według niniejszego wynalazku, nie są ograniczone do wymienionych enzymów. Przykładowo, każda termostabilna polimeraza DNA opisana w literaturze, do zastosowania w reakcjach amplifikacji, może być zmodyfikowana, jak to tu opisano, w celu wytworzenia odwracalnie inaktywowanego enzymu odpowiedniego do zastosowania w niniejszych
185 711 sposobach. Ogólnie, każdy enzym katalizujący wydłużanie startera lub wymagany, by mogło zajść wydłużanie startera, oraz wystarczająco termostabilny by wytrzymać inkubację w wysokiej temperaturze w celu reaktywacji bez bezpowrotnej utraty aktywności, oraz możliwy do modyfikacji, jak to tu opisano, w celu wytworzenia enzymu odwracalnie inaktywowanego, może być zastosowany w niniejszych sposobach. Osoby biegłe w dziedzinie wiedzy mogą, dla danego enzymu, optymalizować warunki reakcji modyfikacji i reakcji amplifikacji, w oparciu o podane tu wytyczne.
W korzystnych wykonaniach wynalazku, odwracalna inaktywacja enzymu termostabilnego przeprowadzana jest przez odwracalne zablokowanie reszt lizynowych na drodze modyfikacji chemicznej grup ε-aminowych reszt lizynowych. Modyfikacja lizyn w regionach aktywnych białka powoduje inaktywację białka. Dodatkowo, modyfikacja lizyn poza regionem aktywnym może przyczyniać się inaktywacji białka przez oddziaływanie sferyczne lub zmiany konformacyjne. W literaturze opisano liczne związki reagujące z grupami aminowymi w sposób odwracalny. Przykładowo, grupy aminowe mogą być odwracalnie modyfikowane przez trifluoroacetylowanie (patrz Goldberger i Anfinsen, 1962, Biochemistry 1:410); amidynowanie (patrz Hunter i Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc., 84:3491); maleilowanie (patrz Butler i in., 1967, Blochem. J., 103:78); acetoacetylowanie (patrz Marzotto i in., 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun., 26:517; i Marzotto i in., 1968, Biochim. Biophys. Acta 154:450); tetrafluorosukcynylowanie (patrz Braunitzer i in., 1968, Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 349:265) i cytrakonylowanie (patrz Dixon i Perham, 1968, Biochem. J., 109:312-314; Habeeb i Atassi, 1970, Biochemistry 9(25):4939-4944).
Korzystnymi reagentami do chemicznej modyfikacji grup ε-aminowych reszt lizynowych są bezwodniki kwasów dikarboksylowych o wzorze 1, w których R] i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R! i R2 oznaczają, rodniki organiczne, które mogą być związane a wodory są w położeniu cis. Rodnik organiczny może być związany bezpośrednio z pierścieniem wiązaniem węgiel-węgiel albo przez wiązanie wegiel-heteroatom, jak wiązanie węgiel-tlen, węgiel-azot lub wegiel-siarka. Rodniki organiczne mogą być związane ze sobą tworząc strukturę pierścieniową jak w, przykładowo, bezwodniku 3,4,5,6-tetrahydroftalowym.
Bezwodniki dikarboksylowe reagują z grupami aminowymi białek dając odpowiednie acylowane produkty, jak to pokazano dla bezwodnika cytrakonowego na Figurze 1. Odwracalność powyższych bezwodników dikarboksylowych jest, jak się uważa, wzmaganą przez obecność podwójnego wiązania cis-węgiel-węgiel albo wodorów cis, które utrzymują końcową grupę karboksylową acylowanych reszt w orientacji przestrzennej odpowiedniej do oddziaływania z grupą amidową, i następnie deacylowania. Patrz, Palacian i in., 1990, Mol. Celi. Biochem., 97:101-111, opis możliwego mechanizmu reakcji acylowania jak i deacylowania. Inne podstawniki mogą podobnie ograniczać rotację wokół wiązania 2,3 reszty acylowej w acylowanym produkcie i związki takie, jak się oczekuje, działają w sposobach według niniejszego wynalazku.
Przykłady korzystnych reagentów obejmują bezwodnik maleinowy; podstawione bezwodniki maleinowe jak bezwodnik cytrakonowy, bezwodnik cis-akonitowy czy bezwodnik 2,3-dimetylomaleinowy; bezwodnik egzo-cis-3,6-endokso-A4-tetrahydroftalowy i bezwodnik 3,4,5,6-tetrahydroftalowy. Reagenty te są dostępne w handlu z, przykładowo, Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) czy Spectrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA). Modyfikacje termostabilnych polimeraz DNA z zastosowaniem, jako reagentów, podstawionych bezwodników maleinowych: bezwodnika cytrakonowego i bezwodnika cis-akonitowego, opisane są w przykładach.
Względne stabilności grup aminowych acylowanych z użyciem powyższych reagentów zmniejszają się w następującym porządku: bezwodnik maleinowy; bezwodnik egzo-cis-3,6endokso-A4-tetrahydroftalowy, bezwodnik cytrakonowy, bezwodnik 3,4,5,6-tetrahydroftalowy, bezwodnik cis-akonitowy i bezwodnik 2,3-dimetylomaleinowy (patrz, Palacian i in., wyżej). Optymalne warunki inkubacji aktywującej dla enzymów modyfikowanych poszczególnymi reagentami określono empirycznie, jak to opisano w przykładach.
185 711
W patencie USA Nr 5,262,525 opisane są sposoby modyfikacji chemicznej białek, z użyciem związków będących bezwodnikami kwasów dikarboksylowych, wytworzonymi w reakcji Dielsa-Aldera bezwodnika maleinowego z di enem. Związki opisane w tym opisie, posiadające opisaną tu stabilność, mogąbyć użyteczne w niniejszym wynalazku.
Sposoby według niniejszego wynalazku nie są ograniczone do wymienionych związków modyfikujących czy modyfikacji białka przez modyfikowanie chemiczne reszt lizynowych. Do wytwarzania odwracalnie inaktywowanego enzymu jest odpowiedni każdy z opisanych w literaturze związków reagujących z białkami i powodujących u nich odwracalną całkowitą lub prawie całkowitą utratę aktywności enzymatycznej, przy czym modyfikacja taka jest odwracalna przez inkubację w podwyższonej temperaturze w buforze do reakcji amplifikacji. Jeżeli staną się dostępne nowe związki odwracalnie modyfikujące białka, będą one również odpowiednie do zastosowania w niniejszym wynalazku. Tak więc, związki do wytwarzania modyfikowanych enzymów termostabilnych według niniejszego wynalazku obejmują związki spełniające poniższe kryteria:
(1) reakcja z enzymem termostabilnym katalizującym wydłużanie startera powoduje znaczącą inaktywację enzymu;
(2) inkubacja powstałego enzymu zmodyfikowanego w buforze wodnym o pH około 8-9 w temperaturze równej lub niższej od temperatury pokojowej (25°C) nie powoduje znaczącego zwiększenia aktywności enzymu w czasie krótszym niż około 20 minut; i (3) inkubacja powstałego zmodyfikowanego enzymu termostabilnego w buforze do reakcji amplifikacji, o pH 8-9 w temperaturze pokojowej, w podwyższonej temperaturze wyższej niż około 50°C powoduje co najmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż 20 min.
Przydatność poszczególnego związku modyfikującego może być rutynowo określona empirycznie w oparciu o dostarczone tu wytyczne. Protokół doświadczalny do zmierzenia powyższych właściwości, stopnia osłabienia aktywności enzymu powstałego w wyniku modyfikacji białka i stopień odzyskania aktywności enzymatycznej w następstwie inkubacji w podwyższonej temperaturze w mieszaninie do reakcji amplifikacji, opisane są w przykładach.
Wytwarzanie odwracalnie inaktywowanych enzymów termostabilnych
Modyfikacja chemiczna reszt lizynowych w białkach opiera się na zdolności grup ε-aminowych tych reszt do reagowania z nukleofilem. Odprotonowana grupa aminowa jest postacią reaktywną faworyzowaną w pH alkalicznym. Reakcja modyfikacji przeprowadzana jest przy pH 8,0 - 9,0, w buforze wodnym w temperaturze równej lub niższej niż temperatura pokojowa (25°C). Reakcja jest praktycznie zakończona po 12-24 godzinach inkubacji. Odpowiednie warunki reakcji są znane w technice i opisane dalej w przykładach.
Bezwodniki dikarboksylowe łatwo reagują z wodą dając odpowiedni kwas. Stąd, znaczna frakcja reagentu jest hydrolizowana podczas modyfikacji grup aminowych białka. Stopień hydrolizy zwiększa się wraz z pH. Wzrost hydrolizy zachodzący przy pH wyższym niż 9 może spowodować suboptymalne acylowanie białka.
Ogólnie, w reakcji acylowania stosuje się molowy nadmiar reagentu modyfikującego względem białka. Optymalny stosunek molowy reagentu modyfikującego do enzymu zależy od użytego reagentu i określany jest empirycznie. Przykładowo, polimeraza DNA Taq jest zasadniczo całkowicie inaktywowana (<5% początkowej aktywności) przez reakcję z 20-krotnym lub wyższym nadmiarem molowym bezwodnika cytrakonowego. Minimalny stosunek molowy modyfikatora, który powoduje praktycznie całkowitą inaktywację enzymu może być określony przez przeprowadzenie reakcji inaktywacji z serią rozcieńczeń reagentu modyfikującego, jak to opisano w przykładach.
W sposobach według niniejszego wynalazku nie jest konieczne by enzym był całkowicie inaktywowany, wystarczy by był znacząco inaktywowany. W znaczeniu tu użytym, enzym jest znacząco inaktywowany, gdy aktywność enzymu w następstwie reakcji z modyfikatorem jest mniejsza niż 50% aktywności początkowej. Redukcja amplifikacji nieswoistej może być uzyskana z użyciem enzymu znacząco inaktywowanego. Stosunek molowy modyfikatora do enzymu w reakcji może być wybrany empirycznie tak, by powodował niemal całkowitą inaktywację albo znaczącą inaktywację enzymu w oparciu o dostarczone tu wytyczne.
185 711
Odpowiednie stosunki molowe dostarczono w przykładach. Odpowiednie warunki reakcji do inaktywacji nie wymienionych enzymów mogąbyć określone w standardowych doświadczeniach w oparciu o dostarczone tu wytyczne.
Ważnym aspektem enzymów inaktywowanych ciepłem, według wynalazku, jest ich stabilność podczas przechowywania. Ogólnie, związki tu opisane są stabilne przez dłuższy czas, co eliminuje potrzebę przygotowywania bezpośrednio przed każdym użyciem. Przykładowo, cytrakonylowana polimeraza DNA Taq pozostaje, jak stwierdzono, inaktywowana przez co najmniej cztery tygodnie, jeżeli jest przechowywana w 25°C. Zalecane warunki przechowywania różnią się zależnie od zastosowanego modyfikatora, ale ogólnie, preparat inaktywowanego enzymu powinien być przechowywany w temperaturze równej lub niższej niż temperatura pokojowa (25°C), zaś najkorzystniej w lodówce. W szczególności, bardziej niestabilne zmodyfikowane enzymy, takie jak modyfikowane z użyciem bezwodnika 2,3-dimetylomaleinowego, powinny być przechowywane w lodówce.
Sposoby według niniejszego wynalazku obejmują zastosowanie mieszaniny reakcyjnej zawierającej odwracalnie inaktywowany enzym termostabilny i poddanie mieszaniny inkubacji w wysokiej temperaturze przed reakcją amplifikacji lub jako jej integralna część. Inkubacja w wysokiej temperaturze powoduje deacylowanie grup aminowych i odzyskanie aktywności przez enzym.
Deacylowanie zmodyfikowanych grup aminowych spowodowane jest zarówno wzrostem temperatury jak i równoczesnym obniżeniem pH. Reakcje amplifikacji są zwykle przeprowadzane w buforze Tris-HCl posiadającym pH 8.0 - 9.0 w temperaturze pokojowej. W temperaturze pokojowej w warunkach alkalicznego buforu reakcyjnego występuje acylowana postać grupy aminowej. Pomimo, że pH buforu reakcyjnego Tris-HCl ustalono na 8,0 - 9,0 w temperaturze pokojowej, pH buforu Tris-HCl zmniejsza się ze wzrostem temperatury. Tak więc, pH buforu reakcyjnego zmniejsza się w podwyższonych temperaturach, przy których przeprowadzane są reakcje amplifikacji, zaś w szczególności, w jakich przeprowadzana jest inkubacja aktywująca. Przy obniżonym pH buforu reakcyjnego zachodzi deacylowanie grup aminowych.
Zmiana pH zachodząca na skutek wysokiej temperatury warunków reakcji, zależy od zastosowanego bufora. Zależność pH różnych buforów stosowanych w reakcjach biologicznych od temperatury opisana została w Good i in., 1966, Biochemistry 5 (2):467-477. Dla buforu Tris, zmiana pKa, tzn. pH w środku zakresu buforu, zależy od temperatury w następujący sposób:
ApKa/°C=-0.031. Przykładowo, pKa buforu Tris-HCl przygotowanego w temperaturze 25°C podlega spadkowi o 2.17 podczas inkubacji aktywującej w temperaturze 95°C.
Jakkolwiek, reakcje amplifikacji przeprowadzane są zwykle w buforze Tris-HCl, mogą być one przeprowadzane w buforach wykazujących mniejsze lub większe zmiany pH w zależności od temperatury. W zależności od zastosowanego bufora pożądany będzie mniej lub bardziej stabilny zmodyfikowany enzym. Przykładowo, stosowanie reagentów modyfikujących powodujących powstanie mniej stabilnego zmodyfikowanego enzymu pozwala na odzyskanie wystarczającej aktywności enzymu pod wpływem mniejszej zmiany pH. Wybór zmodyfikowanego enzymu odpowiedniego do zastosowania w konkretnym buforze opiera się na porównaniu empirycznym względnych stabilności enzymów zmodyfikowanych różnymi reagentami, jak to opisano wyżej.
W sposobach według niniejszego wynalazku, aktywacja zmodyfikowanego enzymu uzyskiwana jest przez inkubację w temperaturze równej lub wyższej niż temperatura hybrydyzacji startera (przyłączania) stosowana w reakcji amplifikacji w celu zapewnienia swoistości amplifikacji. Czas inkubacji niezbędnej do odzyskania aktywności przez enzym zależy od temperatury i pH mieszaniny reakcyjnej oraz od stabilności acylowanych grup aminowych enzymu, co zależy od reagentu modyfikującego zastosowanego do wytwarzania zmodyfikowanego enzymu. Możliwy do zastosowania jest szeroki zakres warunków inkubacji; warunki optymalne należy określić empirycznie dla każdej reakcji. Ogólnie, inkubacja jest przeprowadzana w buforze do amplifikacji w temperaturze wyższej niż około 50°C przez czas od około 10 sekund do około 20 minut. Warunki inkubacji prowadzonej w celu reaktywacji enzymów
185 711 nie wyszczególnionych lub inkubacji nie wymienionych mieszanin reakcyjnych można zoptymalizować doświadczalnie w rutynowych doświadczeniach, w oparciu o podane tu wytyczne.
W korzystnym wykonaniu, amplifikację PCR przeprowadza się z użyciem odwracalnie inaktywowanej termostabilnej polimerazy DNA. Temperatura przyłączania stosowana w amplifikacji PCR wynosi zwykle 55-75°C, zaś preinkubację przeprowadza się w temperaturze równej lub wyższej niż temperatura przyłączania, korzystnie w temperaturze wyższej niż około 90°C. Mieszanina reakcyjna do amplifikacji korzystnie inkubowana jest w około 90-100°C przez około 12 minut w celu reaktywacji polimerazy DNA przed cyklicznymi zmianami temperatury. Odpowiednie warunki inkubacji przedreakcyjnej dla typowej amplifikacji PCR opisano w przykładach, wraz z wpływem różnych warunków inkubacji przedreakcyjnej na amplifikację.
Pierwszy etap typowej amplifikacji PCR obejmuje denaturację ciepłem dwuniciowego docelowego kwasu nukleinowego. Dokładne warunki niezbędne do denaturacji próbki kwasu nukleinowego zależą od długości i składu próbki kwasu nukleinowego. Zwykle, inkubacja w 90-100°C przez od około 10 sekund do około 4 minut jest wystarczająca do pełnej denaturacji próbki kwasu nukleinowego. Początkowy etap denaturacji może służyć jako inkubacja przedreakcyjna do reaktywacji polimerazy DNA. Jednakże, zależnie od czasu i temperatury początkowego etapu denaturacji oraz od modyfikatora zastosowanego do inaktywacji polimerazy DNA, przywrócenie aktywności polimerazy DNA może być niecałkowite. Jeżeli maksymalne odzyskanie aktywności przez enzym jest konieczne, inkubacja przedreakcyjna może być wydłużana lub alternatywnie, może być zwiększona liczba cykli amplifikacji.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, zmodyfikowany enzym i początkowe warunki denaturacji wybrane są tak, że podczas wstępnego etapu inkubacji jest odzyskiwana tylko frakcja możliwej do odzyskania aktywności enzymatycznej. W następnych cyklach PCR, z których każdy obejmuje etap denaturacji w wysokiej temperaturze następuje dalsze odzyskiwanie aktywności przez enzym. Tak więc, aktywacja czynności enzymu jest opóźniona w trakcie początkowych cykli amplifikacji. To „uwalnianie w czasie” aktywności polimerazy DNA dalej zmniejszą jak zaobserwowano, amplifikację nieswoistą. Wiadomo, że nadmiar polimerazy DNA przyczynia się do amplifikacji nieswoistej. W niniejszych sposobach, ilość aktywności polimerazy DNA jest niska podczas początkowych etapów amplifikacji gdy liczba sekwencji docelowych jest niską co powoduje zmniejszenie ilości tworzonych nieswoistych produktów wydłużania. Maksymalna aktywność polimerazy DNA jest obecna podczas późniejszych etapów amplifikacji gdy liczba sekwencji docelowych jest wysoką co umożliwia wysoką wydajność amplifikacji. Jeżeli to konieczne, liczba cykli amplifikacji może być zwiększona aby skompensować małą ilość aktywności polimerazy DNA podczas wstępnych cykli. Wpływ różnej liczby cykli amplifikacji na amplifikację pokazano w przykładach.
Zaletą sposobów według wynalazku jest fakt, że sposoby te nie wymagają manipulacji przy mieszaninie reakcyjnej po pierwszym jej przygotowaniu. Tak więc, sposoby te są idealne do zastosowania w automatycznych układach amplifikujących oraz w sposobach amplifikacji in situ, w których dodawanie reagentów po początkowym etapie denaturacji albo zastosowanie bariery woskowej jest niewygodne albo niepraktyczne.
Sposoby według niniejszego wynalazku są szczególnie odpowiednie dla redukcji nieswoistych amplifikacji podczas PCR. Jednakże, wynalazek nie jest ograniczony do żadnego szczególnego układu amplifikacji. Odwracalnie inaktywowane enzymy według niniejszego wynalazku mogą być zastosowane w każdym układzie amplifikacji opartym na starterach, stosującym enzymy termostabilne i wykorzystującym temperaturę w celu zapewnienia swoistości amplifikacji. Niniejsze sposoby mogą być zastosowane w izotermicznych układach amplifikujących stosujących enzymy termostabilne. Tylko przejściowa inkubacja w podwyższonej temperaturze jest wymagana by enzym odzyskał aktywność. Po poddaniu mieszaniny reakcyjnej inkubacji w wysokiej temperaturze w celu odzyskania aktywności przez enzym, przeprowadza się reakcję w odpowiedniej temperaturze.
Oprócz PCR (patent USA Nr 4,683,195; 4,683,202 i 4,965,188) inne sposoby amplifikacji obejmują choć nie są ograniczone do: reakcji łańcuchowej ligazy (LCR, Wu i Wallace, 1989, Genomics 4:560-569 i Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193); reakcji
185 711 łańcuchowej polimerazy ligazy (Barany, 1991, PCR Methods andApplic. 1:5-16); Gap-LCR (publikacja patentu PCT Nr W090/01069); reakcja reparacji łańcuchowej (publikacja patentu europejskiego Nr 439,182 A2), 3SR (Kwoh i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:11731177; Guatelli i in., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878;
publikacja patentu PCT Nr W092/08800) i NASBA (patent USA Nr 5,130,238). Wynalazek niniejszy nie jest ograniczony do żadnego konkretnego układu amplifikacji. O ile zostaną opracowane inne układy, mogą one odnosić korzyści przez wprowadzenie niniejszego wynalazku. Ostatnie postępy w układach amplifikacji zostały opublikowane w Abramson i Myers, 1993, Current Opinions in Biotechnology 4:41-47.
W stanie techniki opisane są sposoby przygotowania próbek odpowiednich do reakcji amplifikacji (patrz, przykładowo, Sambrook i in, wyżej, oraz cytowana literatura opisująca sposoby amplifikacji). Proste i szybkie sposoby przygotowywania próbek do amplifikacji PCR sekwencji docelowych opisane są w Higuchi, 1989, PCR Technology (wyd. Ehrlich, Stockton Press, New York) i w PCR Protocols, Rozdz. 18-20 (Innis i in., wyd. Academic Press, 1990). Specjaliści w tej dziedzinie wiedzy są w stanie wybrać i empirycznie optymalizować odpowiedni protokół.
W literaturze wyczerpująco są opisane sposoby detekcji produktu amplifikacji. Standardowa metoda obejmuje analizę przez elektroforezę na żelu albo przez hybrydyzację z sondami oligonukleotydowymi. Wykrywanie hybryd wytworzonych pomiędzy sondami i amplifikowanym kwasem nukleinowym może być przeprowadzone wieloma sposobami, włączywszy format badania dot-blot i format badania odwrotnego dot-blot (patrz. Saiki i in., 1986, Naturę 324:163-166; Saiki i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230; publikacja patentu PCT Nr W089/11548; patent USA Nr 5,008,182 i 5,176,775; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (wyd. Innis i in., Academic Press, San Diego, CA):337-347. Sposoby odwrotnego dot-blot z zastosowaniem płytek mikrostudzienkowych opisane są w równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu USA Nr 141,355 (odpowiadającym EP-A-420260);. patencie USA Nr 5,232,829; Loeffelholz i in., 1992, J. Clin. Microbiol. 30 (11):2847-2851; Mulder i in., 1994, J. Clin. Microbiol. 32 (2):292-300 i Jackson i in, 1991, AIDS 5:1463-1467.
Innym odpowiednim sposobem badania, określanym jako badanie 5'-nukleazą opisane jest w patencie USA Nr 5,210,015 oraz w Holland i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. W badaniu 5'-nukleazą znakowane sondy są degradowane równolegle do wydłużania startera dzięki egzonukleazowej aktywności 5'-3' polimerazy DNA, np. polimerazy DNA Taq. Wykrywanie produktów rozkładu sondy wskazuje, że zachodzi hybrydyzacja pomiędzy sondą i docelowym DNA oraz, że zachodzi reakcja amplifikacji. Patent USA Nr 5,491,063 (odpowiadający EP-A-699,768) i EP-A-713,921 opisują ulepszone sposoby wykrywania degradacji sondy, która zachodzi równolegle z amplifikacją.
Alternatywnym sposobem wykrywania amplifikacji kwasu nukleinowego przez pomiar wzrostu całkowitej ilości dwuniciowego DNA w mieszaninie reakcyjnej jest opisany przez Higuchi i in., 1992, Bio/Technology 10;413-417; Higuchi i n., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030 i w publikacja patentu europejskiego Nr 487,218 i 512,334. Wykrywanie dwuniciowego docelowego DNA polega na zwiększonej fluorescencji, którą wykazuje bromek etydyny (EtBr) i inne znaczniki wiążące DNA po związaniu z dwuniciowym DNA. Zwiększenie ilości dwuniciowego DNA w wyniku syntezy sekwencji docelowej powoduje wykrywalny wzrost fluorescencji. Problemem w tym sposobie jest fakt, że synteza sekwencji nieswoistych, np. nieswoista amplifikacja, powoduje zwiększenie fluorescencji co interferuje z pomiarem wzrostu fluorescencji na skutek syntezy sekwencji docelowych. Tak więc, sposoby według niniejszego wynalazku są szczególnie użyteczne, ponieważ zmniejszają amplifikację nieswoistą minimalizując w ten sposób wzrost fluorescencji wynikający z amplifikacji sekwencji nieswoistych.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zestawów, jednostek składających się z licznych pojemników zawierających składniki użyteczne w wykonywaniu niniejszych sposobów. Użyteczny zestaw zawiera odwracalnie motywowany enzym termostabilny i jeden lub wiele reagentów do przeprowadzania reakcji amplifikacji, jak startery oligonukleotydowe, substraty w postaci trifosforanów nukleozydów, kofaktory i odpowiedni bufor.
185 711
Przedstawione poniżej przykłady niniejszego wynalazku dostarczono wyłącznie w celu zilustrowania nie zaś w celu ograniczania wynalazku. Liczne wykonania wynalazku, w zakresie zastrzeżeń następujących po przykładach, staną się oczywiste dla specjalisty po przeczytaniu poniższego tekstu i przykładów.
Przykład 1
Test aktywności polimerazy
Wszystkie pomiary aktywności polimerazy DNA opisane w tym przykładzie, poniżej, wykonano przy użyciu następującego testu aktywności polimerazy DNA. Test wykonano, zasadniczo, jak to opisano w Lawyer i in., 1989, J. Biol. Chem., 264:6427-6437 oraz w ulotce dołączonej do polimerazy AmpliTaą® (Perkin Elmer, Norwalk, CT), zamieszczone tu jako odnośnik.
Jedną jednostkę aktywności enzymu określa się jako ilość zdolną do włączenia 10 mmoli dNTP w nierozpuszczalny w kwasie materiał w ciągu 30 minut podczas 10-minutowej inkubacji w 74°C. Z powodu labilności zmodyfikowanego enzymu, pomiary aktywności przeprowadzono w 50°C i standaryzowano w stosunku do wzorcowego roztworu polimerazy DNA Taq, który badano w 74°C.
Reakcje przeprowadzono w objętości 50 μΐ, zawierającej następujące odczynniki:
mM TAPS (sól sodowa kwasu Tris-(hydroksymetylo)-metylopropanosulfonowego, pH 9,3 (w temperaturze pokojowej));
mM KC1;
mM MgCl2;
mM β-merkaptoetanol;
po 200 μΜ dATP, dGTP i dTTP;
100 μΜ [a-32P]-dCTP (0,05-0,1 Ci/nmol);
aktywowany DNA spermy łososia.
Przykład 2
Cytrakonylacj a polimerazy DNA Taq.
Przykład ten opisuje modyfikację polimerazy DNA Taq przy użyciu bezwodnika cytrakonowego. Pomiary aktywności cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq, które wskazują stosunek molowy czynnika modyfikującego do enzymu w reakcji inaktywacji, niezbędny do uzyskania całkowitej inaktywacji polimerazy DNA, opisano w Przykładzie 3, poniżej.
Polimerazę DNA Taq (AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk, CT) zastosowano w początkowym stężeniu 1,3 mg/ml. We wstępnych doświadczeniach polimerazę DNA Taq dializowano wobec 1000-krotnej objętości 0,1 M boranu sodu o pH 8,63. Etap ten, jak stwierdzono, nie był kluczowy i w późniejszych doświadczeniach polimerazę DNA Taq stosowano bezpośrednio w buforze Tris (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 65 mM KC1, pH 7,5) bez dializowania wobec boranu sodu.
Bezwodnik cytrakonowy (11,06 M) jest dostępny w handlu (Aidrich, Milwaukee, WI). Stężenie początkowe bezwodnika cytrakonowego uzyskano przez 100-krotne rozcieńczenie 11,06 M bezwodnika cytrakonowego w DMF (N,N-dimetyloformamid).
Dla jednego zestawu reakcji modyfikacji, przygotowano serię rozcieńczeń roztworu bezwodnika cytrakonowego przez kolejne 2-krotne rozcieńczenia w DMF. Dla każdego roztworu w serii, 4 μΐ rozcieńczonego roztworu bezwodnika cytrakonowego dodawano do 400 μΐ roztworu polimerazy DNA Taq (po dializie wobec boranu sodu) i uzyskano roztwory o stosunku molowym bezwodnika cytrakonowego do polimerazy DNA Taq rzędu 80/1, 40/1, 20/1 i 10/1. Roztwory inkubowano przez noc w 4°C w celu inaktywcji polimerazy DNA Taq. W znaczeniu tu użytym, enzym zmodyfikowany w reakcji z N-krotnym molowym nadmiarem czynnika modyfikującego określany jest jako enzym NX. Stąd, powstałe cytrakonylowane polimerazy DNA Taq określane są tu jako polimerazy DNA Taq 80Χ, 40Χ, 20Χ i 10Χ.
Przeprowadzono dodatkowe reakcje modyfikacji przy molowych stosunkach czynnika modyfikującego do polimerazy DNA Taq (bez dializy wobec boranu sodu) 80Χ, 160Χ oraz 240Χ. Stosunki 160Χ i 240Χ uzyskano przez odpowiednie dobranie rozcieńczenia wyjściowego 11,06 M bezwodnika cytrakonowego w DMF (Ν,Ν-dimetyloformamid). Przykładowo, dla końcowego stosunku 160Χ, 11,06 M bezwodnik cytrakonowy rozcieńczono 1/50 w DMF,
185 711 i 4 μΐ powstałego bezwodnika cytrakonowego dodano do 400 μΐ roztworu polimerazy DNA Taq. Powstałe cytrakonylowane polimerazy DNA Taq określane są tu jako polimerazy DNA Taq 240Χ, 160Χ i 80Χ.
Przykład 3
Inaktywacja z użyciem bezwodnika cytrakonowego i odzyskiwanie ciepłem aktywności polimerazy DNA
Przykład ten opisuje pomiary aktywności cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq według Przykładu 2, przed i po reaktywacji cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq przez inkubację w wysokiej temperaturze. Mierzono wpływ pH na ilość aktywności odzyskanej po reaktywacji ciepłem cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq.
Próbki cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq rozcieńczono 1/200 w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCl, 100 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40, 16% gliceryny. pH buforu wynosiło 8,25 w temperaturze pokojowej. Rozcieńczone próbki cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq inkubowano w 90°C przez 20 minut albo utrzymywano w temperaturze pokojowej jako kontrolę. Po inkubacji, próbki rozcieńczano 1/5 w buforze do rozcieńczania enzymu (25 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 1 mM β-merkaptoetanol, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40, 0,1% żelatyna) i badano aktywność jak to opisano w przykładzie 1. Poniżej przedstawiono aktywności polimeraz DNA po inkubacji. Stosunek molowy odnosi się do stosunku molowego bezwodnika cytrakonowego do polimerazy DNA Taq, używanego w reakcji modyfikacji. Każda z aktywności jest średnią dwóch aktywności mierzonych dla
| dwóch próbek. | ||
| stosunek molowy | Aktywność (% kontroli) | |
| niepodgrzewany | inkubacja 90°C | |
| Kontrola | 100 | - |
| 80Χ | 0 | 16 |
| 40Χ | 0 | 28 |
| 20Χ | 3,7 | 38 |
| 10Χ | 38 | 63 |
Całkowita inaktywacja polimerazy Taq została uzyskana przy zastosowaniu powyżej 20-krotnego nadmiaru molamego bezwodnika cytrakonowego. Po inkubacji całkowicie inaktywowanej polimerazy DNA Taq w 90°C przez 20 minut, odzyskano minimum 16% aktywności.
Jakkolwiek, więcej aktywności enzymatycznej odzyskano przy zastosowaniu 40Χ cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq niż przy użyciu 80Χ cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq, może być bardziej praktyczne zastosowanie w komercyjnym zestawie 80Χ (łub wyżej) cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq, aby zapewnić większą tolerancję produkcji.
Podobne doświadczenia przeprowadzono z zastosowaniem bufora o pH 7,75 w tempe-
| raturze pokojowej. Wyniki przedstawiono poniżej . | ||
| stosunek molowy | Aktywność (% kontroli) niepodgrzewany | inkubacja 90°C |
| Kontrola | 100 | - |
| 80Χ | 0 | 61 |
| 40Χ | 0 | 67 |
| 20Χ | 3,5 | 70 |
| 10Χ | 35 | 77 |
Ilość odzyskanej aktywności polimerazy DNA była większa przy niższym pH.
Aktywności polimeraz DNA Taq 80Χ i 160Χ (bez dializy wobec boranu sodu) mierzono przed i po reaktywacji przez inkubowanie w wysokiej temperaturze, zasadniczo tak, jak to opisano powyżej. pH bufora zastosowanego do inkubacji wynosiło 8,0 w temperaturze pokojowej. Wyniki przedstawiono poniżej. Każda z aktywności jest średnią dwóch aktywności mierzoną dla dwóch próbek.
185 711
Aktywność (% kontroli) stosunek molowy niepodgrzewany inkubacja 90°C
| Kontrola | 100 | - |
| 160Χ | 0 | 19 |
| 80Χ | 0 | 29 |
Wpływ pH na reaktywację był dalej obserwowany przez porównanie odzyskanej aktywności polimeraz DNA Taq 80Χ z trzech reaktywacji przy różnych pH. Powyższe dane wskazują, że aktywność enzymatyczna jest odzyskiwana nawet gdy zastosowano wysoki nadmiar molowy modyfikatora w reakcji modyfikacji.
Przykład 4
Amplifikacja PCR z zastosowaniem cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq
Przykład ten pokazuje zastosowanie cytrakonylowanej termo-stabilnej polimerazy DMA opisanej w Przykładzie 2, w amplifikacji PCR.
Protokół PCR
Amplifikacje przeprowadzono z zastosowaniem zmodyfikowanej polimerazy DNA Taq 240Χ, opisanej w Przykładzie 2, rozcieńczonej 1/20, 1/40 i 1/80. Rozcieńczenia wykonano w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (w temperaturze pokojowej), 100 mM KC1, 0,1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 1 mM DTT (ditiotreitol), 50% glicerol, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40 (bufor do przechowywania AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk, CT). Dla porównania, przeprowadzono również amplifikacje z zastosowaniem niezmodyfikowanej polimerazy DNA Taq w rozcieńczeniu 1/10, 1/20, 1/40 i 1/80.
Sklonowaną sekwencję genomowąHTLV-I amplifikowano z użyciem starterów SK432 i SK111. Sekwencje starterów są przedstawione w patencie USA Nr 5,418,149. PCR przeprowadzono w objętości 100 μΐ w następujących warunkach:
Mieszanina reakcyjna:
kopii matrycy DNA HTLY-I mM Tris, pH 8,3
50mMKCl
0,5 μΜ startery
200 μΜ dATP, dCTP i dGTP
400 μΜ dUTP
0,5 μΐ roztworu cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq
2,5 mM MgCl2 ng hpDNA jednostka UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
Profil cyklu termicznego: inkubacja przedreakcyjna:
cykle Denaturacja:
Przyłączanie/wydłużanie:
cykli Denaturacja:
Przyłączanie/wydłużanie: Inkubacja końcowa:
90°C przez 10 minut 98°C przez 1 minutę 60°C przez 2 minuty 94°C przez 1 minutę 60°C przez 1 minutę 60°C przez 7 minut.
Amplifikowane produkty analizowano przez elektroforezę na 4% żelu agarozowym w buforze IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kwas bomy, 0,0025 m disodowy EDTA). Elektro forezę przeprowadzono w 100 V przez około 2 godziny. Bromek etydyny (0,5 pg/ml) dodano po elektroforezie w celu zabarwienia wszelkiego obecnego DNA. Żel odbarwiono w IX TBE, zaś prążki DNA zabarwione bromkiem etydyny uwidaczniano przez naświetlenie UV. Wyniki
Wyniki przedstawiono na Figurze 1. Zaznaczono prążek odpowiadający amplifikowanej sekwencji docelowej. Widoczne na żelu prążki inne niż prążek odpowiadający amplifikowanej sekwencji docelowej, odpowiadają produktom wytworzonym przez nieswoistą amplifikację sekwencji niedocelowych. Wynik amplifikacji z zastosowaniem cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq (oznaczonej Taq, HS) widoczny jest przez porównanie wzorca prążków oraz intensywności wzdłuż każdej ze ścieżek. Ponieważ amplifikacja nieswoistych produktów współzawodniczy z amplifikacją sekwencji docelowej, wzrost amplifikacji sekwencji doce
185 711 lowej dalej wskazuje na zmniejszenie amplifikacji nieswoistych. Stąd, zmiana we względnej ilości produktów w każdej ze ścieżek wskazuje najlepiej na wpływ inkubacji przedreakcyjnej na amplifikację nieswoistą.
Amplifikację z zastosowaniem niemodyfikowanej polimerazy DNA Taq spowodowały powstanie głównie nieswoistych produktów amplifikacji. Zastosowanie cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq spowodowało znaczny wzrost intensywności prążka odpowiadającego amplifikowanej sekwencji docelowej oraz znaczny spadek intensywności prążków odpowiadających produktom amplifikacji nieswoistej. Dane wskazują że amplifikacja PCR z zastosowaniem odwracalnie inaktywowanej polimerazy DNA znacznie zmniejsza amplifikację nieswoistą i znacznie zwiększa ilość pożądanej amplifikowanej sekwencji docelowej.
Przykład 5
Inne cytrakonylowane termostabilne polimerazy DNA
Przykład ten opisuje cytrakonylację kilku innych termostabilnych polimeraz DNA, dodatkowo do polimerazy DNA Taq opisanej wyżej. Zmodyfikowano następujące termostabilne polimerazy DNA:
1) termostabilną polimerazę DNA z Thermus thermophilus (rTth, Perkin Elmer, Norwalk, CT) jak opisano w W091/09950;
2) zmutowaną termostabilną polimerazę DNA z Thermatoga maritima (UITma™, Perkin Elmer, Norwalk, CT) jak opisano w W092/03556;
3) zmutowaną postać termostabilnej polimerazy DNA z Thermus aguaticus, pozbawionej aktywności egzonukleazy 3'5', jak opisano w W092/06200. Enzym ten określany jest tu jako Taq CS albo AmpliTaq®CS.
Dla każdej z powyższych polimeraz DNA przygotowano roztwór wyjściowy o stężeniu około 200 jednostek/μί. Dla porównanią 1,3 mg/ml polimerazy Taq, jak to zastosowano w poprzedzających przykładach, jest odpowiednikiem około 260 jednostek/μί. Każdą z polimeraz DNA zmodyfikowano, zasadniczo, jak to opisano w przykładzie 2, powyżej 10 μΐ bezwodnika cytrakonowego połączono z 1000 μΐ roztworu każdej z polimeraz. Powstały roztwór inkubowano w 4°C przez noc.
Przykład 6
Amplifikacja PCR z zastosowaniem cytrakonylowanych polimeraz DNA
Przykład ten opisuje zastosowanie cytrakonylowanych termostabilnych polimeraz DNA, opisanych w Przykładach 2 i 5, w amplifikacjach PCR.
Protokół PCR
Amplifikację przeprowadzono z zastosowaniem rozcieńczeń zmodyfikowanych polimeraz DNA. Rozcieńczenia wykonano w buforze zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 w temperaturze pokojowej), 100 mM KC1, 0,1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy), 1 mM DTT (ditiotreitol), 50% glicerol, 0,5% Tween 20, 0,5% Nonidet P40 (bufor do przechowywania AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Sekwencję genomową HTV-1 amplifikowano z zastosowaniem starterów SK145 i SK431 (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Startery SK145 i SK 431 opisano w patencie USA 5,481,149 oraz następujących publikacjach naukowych: SK145 opisano w Kwok i in., 1990, Nuci. Acids Res. 18:999-1005; SK 431 opisano w Jackson i in., 1991, AIDS 5:1463-1467. PCR przeprowadzono w objętości 100 ul w następujących warunkach:
Mieszanina reakcyjna:
100 kopii matrycy DNA HIV-1 mM Tris, pH 8, 3
50mMKCl
0,5 μΜ startery
200 μΜ dATP, dCTP i dGTP
400 μΜ dUTP
0,5 μΐ roztworu polimerazy DNA
2,5 mM MgCl2 pg hpDNA jednostka UNG (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
185 711
Profil cyklu termicznego: inkubacja przedreakcyjna:
cykli Denaturacja:
Przyłączanie/wydłużanie: Inkubacja końcowa:
95°C przez 12 minut 94°C przez 1 minutę 60° C przez 1 minutę 60°C przez 7 minut.
Etap inkubacji przedreakcyjnej służył również jako wstępny etap denaturacji. Wstępny etap denaturacji jest stosowany rutynowo w typowych reakcjach amplifikacji w celu zapewnienia całkowitej denaturacji dwuniciowego substratu. Każdy z cykli PCR rozpoczyna się etapem denaturacji w 94°C przez 1 minutę. Tak więc, bezpośrednio po wstępnej inkubacji przedreakcyjnej przeprowadzonej w 95°C przez 12 minut, mieszanina reakcyjna inkubowana była w 94°C przez 1 minutę podczas etapu denaturacji w pierwszym cyklu.
Amplifikowane produkty analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym (100 ml 3% NuSieve® i 0,5% SeaKem®) w buforze IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kwas bomy, 0,0025 m dwusodowy EDTA). Elektroforezę przeprowadzono przy 100 V przez około 2 godziny. Bromek etydyny (0,5 pg/ml) dodano po elektroforezie w celu zabarwienia wszelkiego obecnego DNA. Zel odbarwiono w IX TBE zaś prążki DNA zabarwione bromkiem etydyny uwidaczniano przez naświetlenie UV. Amplifikacje z zastosowaniem cytrakonylowanych polimeraz DNA.
Rozcieńczenia (1/10, 1/20, 1/40 i 1/80) cytrakonylowanych polimeraz DNA, opisanych w Przykładzie 5, oraz cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq 250Χ, opisanej w przykładzie 2, zastosowano w amplifikacjach kwasu nukleinowego HIV-1 zaś amplifikowane produkty analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Dla porównania, przeprowadzono amplifikacje z zastosowaniem rozcieńczeń niemodyfikowanej polimerazy DNA Taq.
Wyniki przedstawiono na Figurze 2. Zaznaczono prążek odpowiadający amplifikowanej sekwencji docelowej. Prążki, które pojawiają się na żelu a nie są prążkami odpowiadającymi amplifikowanej sekwencji docelowej, odpowiadają produktom wytworzonym przez nieswoistą amplifikację sekwencji nieswoistych. Wynik amplifikacji z zastosowaniem cytrakonylowanej polimerazy DNA widoczny jest przez porównanie wzorca prążków oraz intensywności wzdłuż każdej ze ścieżek. Ponieważ amplifikacja nieswoistych produktów współzawodniczy z amplifikacją sekwencji docelowej, wzrost amplifikacji sekwencji docelowej dalej wskazuje na zmniejszenie amplifikacji nieswoistych. Stąd, zmiana we względnej ilości produktów w każdej ze ścieżek wskazuje najlepiej na wpływ inkubacji przedreakcyjnej na amplifikację nieswoistą.
Amplifikację z zastosowaniem niemodyfikowanej polimerazy DNA Taq spowodowały powstanie głównie nieswoistych produktów amplifikacji w rożnych rozcieńczeniach enzymu. Zastosowanie cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq spowodowało znaczny wzrost intensywności prążka odpowiadającego amplifikowanej sekwencji docelowej we wszystkich rozcieńczeniach z wyjątkiem rozcieńczenia 1/80, oraz znaczny spadek intensywności prążków odpowiadających produktom amplifikacji nieswoistej. Dane wskazują, że amplifikacja PCR z zastosowaniem odwracalnie inaktywowanej polimerazy DNA znacznie zmniejsza amplifikację nieswoistą i znacznie zwiększa ilość pożądanej amplifikowanej sekwencji docelowej.
Zastosowanie cytrakonylowanych polimeraz DNA UITma, Taq CS i rTth również spowodowało większą produkcje swoistych produktów amplifikacji w porównaniu z amplifikacjami z zastosowaniem niemodyfikowanej polimerazy DNA Taq, wraz z równoczesną redukcją ilości nieswoistych produktów amplifikacji. Wyniki wskazują, że sposoby według niniejszego wynalazku są ogólnie możliwe do zastosowania w przypadku termostabilnych polimeraz DNA.
Należy odnotować, że, jakkolwiek wyniki wskazują na funkcjonalność niniejszego wynalazku, wyniki uzyskane z użyciem cytrakonylowanych polimeraz DNA Taq, UITma, Taq CS i rTth nie są bezpośrednio porównywalne ponieważ warunki modyfikacji nie były porównywalnie optymalizowane dla każdej z polimeraz DNA. W szczególności, jakkolwiek każdy roztwór wyjściowy polimerazy DNA zawierał taką samą ilość jednostek na mililitr, nie badano molamości roztworów, a więc nie badano nadmiaru molamego bezwodnika cytrakonowego w każdej z modyfikacji. Osoby biegłe w dziedzinie mogą stwierdzić, że optymalne warunki modyfikacji mogą być określone empirycznie z zastosowaniem zamieszczonych tu protokołów.
185 711
Przykład 7
Cis-akonitylowana polimeraza DNA
Przykład ten opisuje modyfikację polimerazy DNA Taq przy użyciu bezwodnika cisakonitowego.
Modyfikację z zastosowaniem bezwodnika cis-akonitowego przeprowadzono zasadniczo tak, jak opisano w Przykładzie 2, z tą zasadniczą różnicą, że bezwodnik cis-akonitowy sprzedawany jest jako proszek, a nie płyn. Polimerazę DNA Taq (AmpliTaq®, Perkin Elmer, Norwalk, CT) w buforze Tris (50 mM Tris-HCl 1 mM EDTA, 68 mM HC1, pH 7,5) zastosowano w stężeniu wyjściowym 1,3 mg/ml. Roztwór wyjściowy bezwodnika cis-akonitowego (Aldrich, Milwaukee, WI) przygotowano przez rozpuszczenie 20 mg bezwodnika cisakonitowęgo w 1 ml 100% EtOH.
lub 20 μΐ roztworu bezwodnika cis-akonitowego otrzymano roztwory o stosunku molowym bezwodnika cis-akonitowego do polimerazy DNA Taq rzędu dodano do 1000 μΐ roztworu polimerazy DNA Taq, i 90/1 i 180/1. Roztwory inkubowano w 4°C przez noc, w celu inaktywowania polimerazy DNA Taq.
Porównania amplifikacji z zastosowaniem cis-akonitylowanej polimerazy DNA Taq i amplifikacji z zastosowaniem cytrakonylowanej polimerazy DNA Taq opisano poniżej.
Przykład 8
Inaktywacja z użyciem bezwodnika cis-akonitowego i odzyskiwanie ciepłem aktywności polimerazy DNA
Aktywności cis-akonitylowanych polimeraz DNA Taq 90Χ i 180Χ, wytworzonych według Przykładu 7, mierzono przed i po reaktywacji inkubacją w wysokiej temperaturze, zasadniczo tak, jak opisano w przykładzie 3, powyżej. pH buforu podczas inkubacji wynosiło 8,0. Wyniki przedstawiono poniżej. Każda z aktywności jest średnią z dwóch aktywności mierzonych dla dwóch próbek.
Aktywność (% kontroli) stosunek molowy niepodgrzewany inkubacja 90°C
Kontrola 100180Χ 050
90Χ 0118
Porównanie wyników z wynikami przykładu 3 wskazuje, że cis-akonitylowanie jest łatwiej odwracalne niż cytrakonylowanie. Do pełnej inaktywacji polimerazy DNA konieczny jest większy nadmiar molowy bezwodnika cis-akonitowego oraz po inkubacji w wysokiej temperaturze odzyskiwana jest większa aktywność. Nie jest znana przyczyna, dla której aktywność mierzona po modyfikacji 90-krotnym nadmiarem molamym bezwodnika cis-akonitowego i reaktywacji ciepłem jest wyższa niż 100%, ale może to być spowodowane niedokładnością testu aktywności albo może odzwierciedlać jakąś modyfikację polimerazy DNA.
Przykład 9
Wpływ czasu inkubacji przedreakcyjnej
Przykład ten opisuje wpływ czasu inkubacji przedreakcyjnej na ilość uzyskanego produktu.
Amplifikacje przeprowadzono z zastosowaniem cytrakonylowanych i cis-akonitylowanych polimeraz DNA Taq, przygotowanych jak to opisano wyżej. Dla każdego zestawu warunków amplifikacji zastosowano polimerazy DNA Taq zmodyfikowane 80-krotnym i 160krotnym nadmiarem molowym bezwodnika cytrakonowego i 90-krotnym i 180-krotnym nadmiarem bezwodnika cis-akonitowego. Amplifikacje przeprowadzono stosując układ modelu HIV-1 opisany w Przykładzie 6, wyżej, z takim wyjątkiem, że zmieniał się czas wstępnej inkubacji przedreakcyjnej. Dla każdego preparatu enzymu przeprowadzono amplifikacje stosując inkubacje przedreakcyjne w ciągu 12, 6, 3 i 0 minut.
Jak zaznaczono powyżej, etap inkubacji przedreakcyjnej służył jako etap denaturacji wstępnej. Każdy z cykli PCR rozpoczynał się etapem denaturacji. Bezpośrednio po wstępnej inkubacji przedreakcyjnej przeprowadzanej w 95°C przez 12, 6, 3 i 0 minut, każdą z mieszanin reakcyjnych inkubowano w 94°C przez 1 minutę, podczas etapu denaturacji pierwszego
185 711 cyklu, tak więc, jeżeli nie stosowano inkubacji przedreakcyjnej, odzyskiwano aktywność enzymatyczną podczas etapu denaturacji cykli początkowych .
Produkty amplifikacji analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Wyniki przedstawiono na figurze 3. Zaznaczono prążek odpowiadający amplifikowanej sekwencji docelowej. Widoczne na żelu prążki inne niż prążek odpowiadający amplifikowanej sekwencji docelowej, odpowiadają produktom wytworzonym przez nieswoistą amplifikację sekwencji niedocelowych.
Wyniki pokazują że przy zastosowaniu cis-akonitylowanej polimerazy DNA, wszystkie czasy inkubacji przedreakcyjnej spowodowały powstanie silnego prążka odpowiadającego amplifikowanemu produktowi. Amplifikację przeprowadzone bez inkubacji przedreakcyjnej spowodowały powstanie niemal takiej samej ilości produktu co amplifikację z zastosowaniem inkubacji przedreakcyjnych.
W przeciwieństwie do powyższego, wyniki pokazują że przy zastosowaniu cytrakonylowanej polimerazy DNA, aby uzyskać maksymalną ilość produktu, wymagana jest przynajmniej 3 minutowa inkubacja. Amplifikację przeprowadzone bez inkubacji przedreakcyjnej spowodowały powstanie znacznie mniejszej ilości amplifikowanego produktu. Wyniki wskazują że aktywność cis-akonitylowanych polimeraz DNA jest odzyskiwana znacznie szybciej niż cytrakonylowanych polimeraz DNA.
Przykład 10
Wpły w liczby cykli
Przykład ten opisuje wpływ zwiększania liczby cykli amplifikacji w celu kompensacji krótkiego okresu inkubacji przedreakcyjnej.
Przeprowadzono amplifikację z zastosowaniem polimeraz DNA Taq zmodyfikowanych przez zastosowanie 80-krotnego i 160-krotnego nadmiaru molamego bezwodnika cytrakonowego oraz 90-krotnego i 180-krotnego nadmiaru molamego bezwodnika cis-akonitowego. Amplifikację przeprowadzono zasadniczo tak, jak opisano wyżej w układzie modelu HIV-1, opisanego w Przykładzie 6, z takim wyjątkiem, że zmieniały się wstępne inkubacje przedreakcyjne i liczby cykli. Dla każdego preparatu enzymu, przeprowadzono amplifikację w oparciu o poniższe warunki:
inkubacja przedreakcyjna liczba cykli amplifikacji minut, 80°C60
060
048
043
039
Produkty amplifikacji analizowano przez elektroforezę na żelu agarozowym. Wyniki przedstawiono na Figurze 4. Wyniki pokazują że zwiększanie liczby cykli amplifikacji może skompensować utratę wydajności amplifikacji spowodowaną niecałkowitą reaktywacją aktywności polimerazy DNA, gdy stosowana jest inkubacja przedreakcyjna.
Dla każdej polimerazy DNA, zwiększenie liczby cykli amplifikacji spowodowało zwiększenie ilości produktu amplifikacji. Wpływ ten był najmniejszy w przypadku cisakonitylowanej polimerazy DNA Taq, którą jak to pokazano w Przykładzie 9, wymaga krótkiej lub żadnej inkubacji przedreakcyjnej.
185 711
wzór 1 wzór 2
o II
wzór 3 wzór 4
185 711 hc^c-oh nh2
CH ch3-c
CH2
CH
O ch2 ch2 ch2
-HN-CH — C —
NH
NH ch2 ch2 ch2 ch2 ch2 ch2
CH2 O ch2 o
-HN-CH— CHN-CH—Cnh3 I ch2
I ch2
I ch2 I ch2 o i II
-HN-CH — C—
O II C-OH
CH3- C
II
CH
I C-OH
II o
SCHEMAT
185 711
Amplifikacja HTLV
HTLV Amplification startery: Primers: SK111/SK432
Matryca: Template.’ PUC E56, 30 copies 30 kopii wzorce: Standards: óX174/Haelll
Taq TaąHS θ'— CM^OOCM^-aj ZA __ __ __ __
FIG. 1 ♦Target
Sekwencja docelowa
Anplifikacja HIV
HIV Amplification startery: Primers: SK145/SK431
Matryca: Template: 100 copies 100 kopii
HS (derywatyzowana)
HS (deróatized)
Taq Taq UTTma Taq.CS rTth
—Target
Sekwencja docelowa
FIG. 2
185 711
HIV Amplification With AmpliTaq, HS
Amplifikacja HIV przy użyciu AmpliTaq, HS
Startery: Primers: SK145/SK431
Matryca: Template: 100COpieS 1OO kopii cis-akonitowy cis-aconitic ~90x Ϊ80Χ cytrakonowy citraconic
80x 160x
6 3 0 12 6 3 0 12 6 3 012 6 3 0
--Target
Sekwencja docelowa
12,6,3 or 0 minutes pre-activation at 95°C before 38 PGR cycles.
Aktywacja w 95®C przez 12, 6. 3 albo O minut poprzedzająca 38 cykli PCR
FIG. 3
185 711
Startery: Matryca:
HIV Amplification With AmpliTaq, HS
Amplifikacja HIV przy użyciu AmpliTaq, HS
Primers: SK145/SK431
Template: 100 copies 100 kopii cis 90x cis 180x cii 80x dt 160x 6Q 60 4843 39606048 43 396060 48 433960 6048 4339
cykli + 12 minut preinkubacji w 80°C
60=60 cycles with a 12 minutę, 80°C pre-incubation
60=60 cycles, no pre-incubatior: 60=60 cykli, 1
48=48 cycles, no pre-incubation 48=48 cykli, . bez prełnkubacJi
43=43 cycles, no pre-incubation 43=43 cykli,
39=39 cycles, no pre-incubation 39=39 cykli, J
FIG.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.
Cena 4.00 zł.
Claims (11)
- Zastrzeżenia patentowe1. Enzym termostabilny, inaktywowany odwracalnie przez modyfikację chemiczną, znamienny tym, że inkubacja termostabilnego, chemicznie zmodyfikowanego enzymu w buforze wodnym o pH alkalicznym w temperaturze poniżej około 25°C nie powoduje znaczącego wzrostu aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut, reagent modyfikujący jest bezwodnikiem dikarboksylowym o wzorze 1, w którym Rt i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R] i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo całkowitą inaktywację enzymu, zaś inkubacja wspomnianego zmodyfikowanego chemicznie enzymu w buforze wodnym, o pH około 8-9 w temperaturze 25°C, w temperaturze wyższej niż około 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut.
- 2. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność termostabilnej polimerazy DNA albo termostabilnej ligazy.
- 3. Enzym według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada aktywność termostabilnej polimerazy DNA, która została uzyskana z gatunku wybranego spośród grupy rodzajów, składającej się z Thermus aguaticus, Thermus thermophilus i Thermotoga maritima.
- 4. Enzym według zastrz. 3, znamienny tym, że został wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego z reagentem modyfikującym, który jest wybrany z grupy składającej się z bezwodnika maleinowego, bezwodnika egzo-cis-3,6-endokso-A4-tetrahydroftalowego, bezwodnika cytrakonowego, bezwodnika 3,4,5,6-tetrahydroftalowego, bezwodnika cis-akonitowego i bezwodnika 2,3-dimetylomaleinowego.
- 5. Enzym według zastrz. 4, znamienny tym, że został wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego z reagentem modyfikującym, który jest w nadmiarze molowym większym niż 20-krotny w stosunku do enzymu termostabilnego.
- 6. Enzym według zastrz. 5, znamienny tym, że został wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego z reagentem modyfikującym, a enzym termostabilny jest termostabilną polimerazą DNA uzyskaną z Thermus aguaticus zaś reagent modyfikujący jest bezwodnikiem cis-akonitowym.
- 7. Enzym według zastrz. 5, znamienny tym, że został wytworzony w reakcji mieszaniny enzymu termostabilnego z reagentem modyfikującym, a enzym termostabilny jest termostabilną polimerazą DNA uzyskaną z Thermus thermophilus zaś reagent modyfikujący jest bezwodnikiem cis-akonitowym.
- 8. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego chemicznie enzymu termostabilnego, który jest odwracalnie inaktywowany, znamienny tym, że obejmuje reakcję mieszaniny enzymu termostabilnego z reagentem modyfikującym, prowadzoną przy alkalicznym pH w temperaturze niższej niż około 25°C, jako reagent stosuje się bezwodnik dikarboksylowy o wzorze 1, w którym R] i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R1 i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo całkowitą inaktywację enzymu.
- 9. Sposób amplifikacji docelowego kwasu nukleinowego zawartego w próbce, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:(a) doprowadzenie do kontaktu próbki z mieszaniną reakcyjną do amplifikacji,, zawierającą starter komplementarny do docelowego kwasu nukleinowego i zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, który jest inaktywowany odwracalnie przez modyfikację chemiczną, przy czym inkubacja termostabilnego, chemicznie zmodyfikowanego enzymu w bu185 711 forze wodnym o pH alkalicznym w temperaturze poniżej około 25°C nie powoduje znaczącego wzrostu aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut, reagent modyfikujący jest bezwodnikiem dikarboksylowym o wzorze 1, w którym Rj i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R] i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo całkowitą inaktywację enzymu, zaś inkubacja wspomnianego zmodyfikowanego chemicznie enzymu w buforze wodnym, o pH około 8-9 w temperaturze 25°C, w temperaturze wyższej niż około 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut; oraz (b) inkubacja powstałej mieszaniny z etapu (a) w temperaturze wyższej niż około 50°C w czasie odpowiednim do reaktywowania wspomnianego chemicznie zmodyfikowanego enzymu termostabilnego i umożliwienia tworzenia produktów wydłużania startera.
- 10. Mieszanina reakcyjna do amplifikacji metodą reakcji łańcuchowej polimerazy, składająca się z pary starterów i chemicznie zmodyfikowanego enzymu termostabilnego, który jest inaktywowany odwracalnie przez modyfikację chemiczną przy czym inkubacja termostabilnego, chemicznie zmodyfikowanego enzymu w buforze wodnym o pH alkalicznym w temperaturze poniżej około 25°C nie powoduje znaczącego wzrostu aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut, reagent modyfikujący jest bezwodnikiem dikarboksylowym o wzorze 1, w którym R! i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogą być związane, albo o wzorze 2, w którym R] i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo całkowitą inaktywację enzymu, zaś inkubacja wspomnianego zmodyfikowanego chemicznie enzymu w buforze wodnym, o pH około 8-9 w temperaturze 25°C, w temperaturze wyższej niż około 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut.
- 11. Zestaw do przeprowadzania reakcji łańcuchowej polimerazy, zawierający chemicznie zmodyfikowany enzym termostabilny, który jest inaktywowany odwracalnie przez modyfikację chemiczną przy czym inkubacja termostabilnego, chemicznie zmodyfikowanego enzymu w buforze wodnym o pH alkalicznym w temperaturze poniżej około 25°C nie powoduje znaczącego wzrostu aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut, reagent modyfikujący jest bezwodnikiem dikarboksylowym o wzorze 1, w którym R! i R2 oznaczają wodór albo rodniki organiczne, które mogąbyć związane, albo o wzorze 2, w którym R1 i R2 oznaczają rodniki organiczne, które mogą być związane, a wodory są w położeniu cis, przy czym reakcja powoduje zasadniczo całkowitą inaktywację enzymu, zaś inkubacja wspomnianego zmodyfikowanego chemicznie enzymu w buforze wodnym, o pH około 8-9 w temperaturze 25°C, w temperaturze wyższej niż około 50°C powoduje przynajmniej dwukrotny wzrost aktywności enzymatycznej w czasie krótszym niż około 20 minut. * * *
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US267395P | 1995-08-25 | 1995-08-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL315803A1 PL315803A1 (en) | 1997-03-03 |
| PL185711B1 true PL185711B1 (pl) | 2003-07-31 |
Family
ID=21701916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96315803A PL185711B1 (pl) | 1995-08-25 | 1996-08-23 | Zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, sposób jego wytwarzania, sposób amplifikacji kwasu nukleinowego, mieszanina reakcyjna do amplifikacji PCR i zestaw do PCR |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5773258A (pl) |
| EP (1) | EP0771870B1 (pl) |
| JP (1) | JP3026554B2 (pl) |
| KR (1) | KR100221097B1 (pl) |
| CN (1) | CN1282741C (pl) |
| AT (1) | ATE176499T1 (pl) |
| AU (1) | AU689047B2 (pl) |
| BR (1) | BR9603563A (pl) |
| CA (1) | CA2184105C (pl) |
| CZ (1) | CZ289237B6 (pl) |
| DE (2) | DE69601488T2 (pl) |
| DK (1) | DK0771870T3 (pl) |
| ES (1) | ES2101668T3 (pl) |
| HU (1) | HU221750B1 (pl) |
| IL (1) | IL119088A (pl) |
| MX (1) | MX9603608A (pl) |
| NO (1) | NO323552B1 (pl) |
| PL (1) | PL185711B1 (pl) |
| RU (1) | RU2174556C2 (pl) |
Families Citing this family (307)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096499A (en) * | 1996-03-22 | 2000-08-01 | Geron Corporation | Mammalian DNA primase screen and activity modulating agents |
| US20030215857A1 (en) * | 1996-12-20 | 2003-11-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
| US6828094B2 (en) * | 1996-12-20 | 2004-12-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application |
| US6605428B2 (en) * | 1996-12-20 | 2003-08-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application |
| US6399304B1 (en) * | 1996-12-20 | 2002-06-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules |
| JPH10276776A (ja) * | 1997-04-07 | 1998-10-20 | Toyobo Co Ltd | 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ |
| US6183998B1 (en) * | 1998-05-29 | 2001-02-06 | Qiagen Gmbh Max-Volmer-Strasse 4 | Method for reversible modification of thermostable enzymes |
| US6132416A (en) * | 1998-09-01 | 2000-10-17 | Broselow; James B. | Universal medication dosing system |
| US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
| GB9920194D0 (en) * | 1999-08-27 | 1999-10-27 | Advanced Biotech Ltd | A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US7923205B2 (en) * | 2000-08-25 | 2011-04-12 | Toshikazu Shiba | Method for protecting personal information |
| EP1334113A4 (en) * | 2000-10-20 | 2007-08-08 | Expression Diagnostics Inc | EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL |
| JP2002199877A (ja) * | 2000-11-30 | 2002-07-16 | Advanced Biotechnologies Ltd | 酵素の可逆的な不活性化およびその酵素を含むキット |
| GB0110501D0 (en) * | 2001-04-30 | 2001-06-20 | Secr Defence Brit | Amplification process |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) * | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| EP1275735A1 (en) * | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
| ATE427992T1 (de) * | 2001-11-14 | 2009-04-15 | Toyo Boseki | Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon |
| CA2409775C (en) * | 2001-12-03 | 2010-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro |
| WO2003060116A1 (en) * | 2002-01-09 | 2003-07-24 | Sysmex Corporation | Nucleic acid detection method and system thereof |
| RU2215037C1 (ru) * | 2002-04-15 | 2003-10-27 | Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Способ ферментативного синтеза днк |
| US20050221349A1 (en) * | 2002-05-30 | 2005-10-06 | Stuart Wilson | Methods of detecting target molecules and molecular interactions |
| US6896727B2 (en) * | 2002-06-28 | 2005-05-24 | Seh America, Inc. | Method of determining nitrogen concentration within a wafer |
| EP1403379A1 (en) * | 2002-09-24 | 2004-03-31 | QIAGEN GmbH | Enhanced coamplification of nucleic acids |
| RU2240350C1 (ru) * | 2003-03-11 | 2004-11-20 | НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ | Способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов |
| AU2004225520A1 (en) | 2003-03-25 | 2004-10-14 | Stratagene | DNA polymerase fusions and uses thereof |
| DE10315640A1 (de) * | 2003-04-04 | 2004-10-14 | Ignatov, Konstantin | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
| US20070248978A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-25 | Expression Diagnostics, Inc. | Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity |
| US7892745B2 (en) * | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| AU2004203649B2 (en) | 2003-08-12 | 2006-01-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Thermostable Taq polymerase fragment |
| WO2005085475A1 (en) | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Applera Corporation | Methods, compositions and kits for use in polynucleotide amplification |
| KR100624490B1 (ko) | 2004-05-27 | 2006-09-20 | 바이오퀘스트(주) | 화학변형 열안정성 ｄｎａ 중합효소 |
| WO2005118773A2 (en) | 2004-05-28 | 2005-12-15 | Wafergen, Inc. | Apparatus and methods for multiplex analyses |
| WO2005123913A2 (en) * | 2004-06-09 | 2005-12-29 | Nustar Laboratory | Reversibly modified thermostable enzyme compositions and methods of making and using the same |
| US7700281B2 (en) * | 2004-06-30 | 2010-04-20 | Usb Corporation | Hot start nucleic acid amplification |
| US20060019288A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-26 | Applera Corporation | Methods, reaction mixtures, and kits for ligating polynucleotides |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| US20060051796A1 (en) * | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Inga Boell | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| EP1634965B1 (en) | 2004-09-09 | 2010-01-20 | Roche Diagnostics GmbH | Real time PCR with the addition of pyrophosphatase |
| US7642055B2 (en) | 2004-09-21 | 2010-01-05 | Applied Biosystems, Llc | Two-color real-time/end-point quantitation of microRNAs (miRNAs) |
| ATE541055T1 (de) * | 2004-10-18 | 2012-01-15 | Univ Brandeis | Reagenzien und verfahren zur verbesserung der reproduzierbarkeit und zur reduzierung des mispriming bei der pcr-amplifikation |
| US20060228726A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-10-12 | Martin Patrick K | Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification |
| WO2006076650A2 (en) * | 2005-01-12 | 2006-07-20 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for selective amplification of nucleic acids |
| EP1885889A4 (en) * | 2005-05-11 | 2010-01-20 | Expression Diagnostics Inc | METHOD FOR MONITORING THE OPERATING STATUS OF TRANSPLANTS OVER GENLISTS |
| EP2308990B1 (en) | 2005-07-15 | 2012-09-26 | Life Technologies Corporation | Analyzing messenger RNA and micro RNA in the same reaction mixture |
| US20070128620A1 (en) | 2005-07-15 | 2007-06-07 | Applera Corporation | Hot start reverse transcription by primer design |
| US20070059713A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Lee Jun E | SSB-DNA polymerase fusion proteins |
| US20070212704A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-09-13 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids |
| DE102005047617A1 (de) * | 2005-10-05 | 2007-04-19 | Qiagen Gmbh | Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft |
| GB0600228D0 (en) * | 2006-01-06 | 2006-02-15 | Fermentas Uab | Inactivation method |
| CN101421417B (zh) * | 2006-02-27 | 2013-04-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 经由镁螯合的pcr热启动 |
| DE102006015960A1 (de) * | 2006-04-04 | 2007-10-11 | Qiagen Gmbh | Gemisch reversibel inhibierter Enzyme |
| US8232091B2 (en) | 2006-05-17 | 2012-07-31 | California Institute Of Technology | Thermal cycling system |
| ATE502122T1 (de) * | 2006-06-01 | 2011-04-15 | Trilink Biotechnologies | Chemisch modifizierte oligonukleotidprimer zur nukleinsäureamplifikation |
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| US8435774B2 (en) | 2006-06-28 | 2013-05-07 | Qiagen Gmbh | Enhancing reactivation of thermostable reversibly inactivated enzymes |
| EP2046989B1 (en) * | 2006-07-17 | 2013-03-20 | Brandeis University | Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US8048626B2 (en) | 2006-07-28 | 2011-11-01 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| CN106566855B (zh) * | 2006-07-31 | 2021-11-09 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸 |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| WO2008021431A2 (en) * | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| EP2102367A2 (en) * | 2006-11-09 | 2009-09-23 | XDX, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| KR100825279B1 (ko) * | 2006-11-30 | 2008-04-25 | 한국해양연구원 | Ｄｎα 중합효소 활성 증가 단백질 및 이를 암호화 하는유전자 |
| US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
| KR20100019409A (ko) * | 2007-01-22 | 2010-02-18 | 웨이퍼젠, 인크. | 고효율 화학 반응을 위한 장치 및 방법 |
| US20090036325A1 (en) * | 2007-05-25 | 2009-02-05 | Applera Corporation | Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers |
| KR20100049019A (ko) * | 2007-06-16 | 2010-05-11 | 이니그마 다이아그노스틱스 리미티드 | 조성물 |
| GB0711683D0 (en) * | 2007-06-16 | 2007-07-25 | Enigma Diagnostics Ltd | Compositions |
| WO2009029648A2 (en) * | 2007-08-27 | 2009-03-05 | Applera Corporation | Methods and compositions for pcr |
| WO2009032781A2 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction |
| WO2009087394A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Genesys Ltd | Cren7 chimeric protein |
| GB0803628D0 (en) * | 2008-02-28 | 2008-04-02 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804722D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| GB0804721D0 (en) * | 2008-03-14 | 2008-04-16 | Genesys Ltd | Enzyme |
| CA2658520C (en) * | 2008-03-19 | 2016-11-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers |
| EP2113574A1 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-04 | Biotype AG | Substances and methods for a DNA based profiling assay |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| EP2644708B1 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-17 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNASE-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US10227641B2 (en) | 2008-04-30 | 2019-03-12 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| EP2294076B1 (en) | 2008-05-27 | 2017-03-08 | TriLink BioTechnologies | Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated replication of nucleic acid |
| EP2300613A4 (en) * | 2008-06-18 | 2011-11-09 | Life Technologies Corp | THERMALLY STABLE CHEMICALLY MODIFIED POLYMERIAS DNA MUTANTS |
| WO2010002938A2 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-07 | Life Technologies Corporation | Method for direct amplification from crude nucleic acid samples |
| CN102149824A (zh) * | 2008-07-03 | 2011-08-10 | 阿莱洛吉克生物科学公司 | 保护亲核基团的组合物和方法 |
| WO2010028288A2 (en) | 2008-09-05 | 2010-03-11 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| US7910720B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-03-22 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Polyanion for improved nucleic acid amplification |
| US8206929B2 (en) | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| JP5818688B2 (ja) | 2009-01-08 | 2015-11-18 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | 核酸増幅反応の効率を改善するための方法および組成物 |
| RU2405823C2 (ru) * | 2009-01-29 | 2010-12-10 | Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН | Термостабильная днк-лигаза из археи рода thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность днк, кодирующая эту днк-лигазу |
| US9347092B2 (en) * | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
| JP5457222B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
| DE102009010639B4 (de) * | 2009-02-26 | 2020-07-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Verfahren und Anordnung zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit vor einer Messung |
| US8039215B2 (en) | 2009-03-10 | 2011-10-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay |
| AU2010224100B2 (en) | 2009-03-12 | 2015-10-22 | Brandeis University | Reagents and methods for PCR |
| US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
| US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
| US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
| JP5766178B2 (ja) | 2009-03-24 | 2015-08-19 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ | ＳｌｉｐＣｈｉｐ装置および方法 |
| US9834815B2 (en) | 2009-03-25 | 2017-12-05 | Life Technologies Corporation | Discriminatory positive/extraction control DNA |
| EP2414504A4 (en) * | 2009-04-03 | 2013-08-28 | Illumina Inc | DEVICES AND METHOD FOR HEATING BIOLOGICAL SAMPLES |
| US20120156728A1 (en) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Life Technologies Corporation | Clonal amplification of nucleic acid on solid surface with template walking |
| DE202010010523U1 (de) * | 2009-09-09 | 2010-11-18 | Helixis, Inc., Carlsbad | Optisches System für Mehrfachreaktionen |
| WO2011044444A2 (en) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Life Technologies Corporation | cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE |
| US20110117559A1 (en) * | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Small rna detection assays |
| US9321999B2 (en) | 2009-11-19 | 2016-04-26 | Solis Biodyne Oü | Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods |
| WO2011068569A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Biotium, Inc. | Heterocycle-substituted xanthene dyes |
| US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| EP2553463B1 (en) | 2010-03-26 | 2017-05-03 | Hongzhi Zou | Methods and materials for detecting colorectal neoplasm |
| US9068017B2 (en) | 2010-04-08 | 2015-06-30 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for inhibiting terminal transferase activity |
| US20110250598A1 (en) | 2010-04-12 | 2011-10-13 | Ulrike Fischer | Detergent free polymerases |
| EP2569452B1 (en) | 2010-05-14 | 2020-03-25 | Life Technologies Corporation | Karyotyping assay |
| US8618253B2 (en) * | 2010-05-25 | 2013-12-31 | Samsung Techwin Co., Ltd. | Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification |
| EP2576577B1 (en) | 2010-05-28 | 2015-03-18 | Life Technologies Corporation | Synthesis of 2', 3'-dideoxynucleosides for automated dna synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization |
| JP5926248B2 (ja) | 2010-06-18 | 2016-05-25 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ |
| CA2802239C (en) | 2010-06-18 | 2016-08-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| ES2536252T3 (es) | 2010-06-18 | 2015-05-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3' aumentada |
| WO2011157436A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| WO2011157432A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| EP2582806B1 (en) | 2010-06-18 | 2015-12-16 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| US8759062B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-06-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′- mismatch discrimination |
| WO2011157434A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| EP2582850B1 (en) | 2010-06-21 | 2016-11-09 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| EP2619329B1 (en) | 2010-09-24 | 2019-05-22 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers |
| CA2810316A1 (en) | 2010-10-04 | 2012-04-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for cell lysis and pcr within the same reaction vessel |
| CN103124796B (zh) | 2010-10-04 | 2016-08-03 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于pcr反应缓冲液中的细胞裂解的方法 |
| JP5798631B2 (ja) | 2010-10-04 | 2015-10-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Ｒｔ−ｐｃｒ反応緩衝液中での細胞溶解のための方法 |
| EP2630257B1 (en) | 2010-10-22 | 2017-08-02 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and kits for detection of 5-hydroxymethylcytosine |
| US8361720B2 (en) | 2010-11-15 | 2013-01-29 | Exact Sciences Corporation | Real time cleavage assay |
| US8916344B2 (en) | 2010-11-15 | 2014-12-23 | Exact Sciences Corporation | Methylation assay |
| WO2012125220A2 (en) | 2011-01-14 | 2012-09-20 | Life Technologies Corporation | Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas |
| EP3567121B1 (en) | 2011-01-17 | 2023-08-30 | Life Technologies Corporation | Workflow for detection of ligands using nucleic acids |
| CA2826696C (en) | 2011-02-02 | 2019-12-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Digital sequence analysis of dna methylation |
| US8765435B2 (en) | 2011-02-15 | 2014-07-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination |
| EP2683834B1 (en) | 2011-03-10 | 2017-12-06 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and biomarkers for detection of gastrointestinal cancers |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| ES2561885T3 (es) | 2011-04-11 | 2016-03-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas de actividad mejorada |
| CN104450680A (zh) | 2011-05-12 | 2015-03-25 | 精密科学公司 | 核酸的分离 |
| US8808990B2 (en) | 2011-05-12 | 2014-08-19 | Exact Sciences Corporation | Serial isolation of multiple DNA targets from stool |
| US8993341B2 (en) | 2011-05-12 | 2015-03-31 | Exact Sciences Corporation | Removal of PCR inhibitors |
| FI3461807T3 (fi) | 2011-06-08 | 2023-09-07 | Life Technologies Corp | Uudenlaisten detergenttien suunnittelu ja kehitys pcr-järjestelmissä käyttöä varten |
| US9567628B2 (en) | 2011-06-08 | 2017-02-14 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
| US10323236B2 (en) | 2011-07-22 | 2019-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| CA2839964C (en) | 2011-07-28 | 2019-03-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases with improved activity |
| US9758837B2 (en) | 2011-08-02 | 2017-09-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Sensitive and rapid method for Candidatus Liberibacter species detection |
| SG11201400724SA (en) | 2011-09-19 | 2014-04-28 | Genentech Inc | Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists |
| CN107267615A (zh) | 2011-09-23 | 2017-10-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | G形夹用于改进的等位基因特异性pcr的用途 |
| US10308980B2 (en) | 2011-11-04 | 2019-06-04 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| US9260714B2 (en) * | 2011-12-02 | 2016-02-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suppression of non-specific amplification with high-homology oligonucleotides |
| ES2668448T3 (es) | 2011-12-08 | 2018-05-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas con actividad mejorada |
| CN103998603B (zh) | 2011-12-08 | 2016-05-25 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有改进活性的dna聚合酶 |
| ES2569723T3 (es) | 2011-12-08 | 2016-05-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polimerasas de DNA con actividad mejorada |
| EP3425065B1 (en) | 2011-12-13 | 2021-04-21 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and kits for detection of methylation status |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| US9822417B2 (en) | 2012-01-09 | 2017-11-21 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer |
| GB201201547D0 (en) * | 2012-01-30 | 2012-03-14 | Olink Ab | Method and product |
| CA2863073C (en) | 2012-02-01 | 2021-04-27 | Certa Dose, Inc. | System for delivering medication |
| US11617835B2 (en) | 2012-02-01 | 2023-04-04 | Cd Acquisitions, Llc | Apparatuses, methods, and systems for delivering measured doses of medication |
| CN114717296B (zh) | 2012-02-03 | 2025-04-04 | 加州理工学院 | 多路生化测定中信号的编码和解码 |
| WO2013124738A2 (en) | 2012-02-21 | 2013-08-29 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| US9085761B1 (en) | 2012-06-14 | 2015-07-21 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplification of nucleic acids |
| JP6450308B2 (ja) | 2012-06-14 | 2019-01-09 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｃｒ）のための新規の組成物、方法、およびキット |
| EP3901243A1 (en) | 2012-08-03 | 2021-10-27 | California Institute of Technology | Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements |
| US9212392B2 (en) | 2012-09-25 | 2015-12-15 | Exact Sciences Corporation | Normalization of polymerase activity |
| GB201217405D0 (en) | 2012-09-28 | 2012-11-14 | Fermentas Uab | Protein removal agent |
| DK2914741T3 (da) | 2012-11-02 | 2017-11-20 | Life Technologies Corp | Hidtil ukendte sammensætninger og fremgangsmåder til forbedring af PCR-specificitet |
| US9710596B2 (en) | 2012-11-21 | 2017-07-18 | Exact Sciences Corporation | Methods for quantifying nucleic acid variations |
| US20140178911A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Characterization of thermostable dna polymerase |
| GB201301457D0 (en) | 2013-01-28 | 2013-03-13 | Fluorogenics Ltd | Freeze-dried composition |
| EP2971095B1 (en) | 2013-03-12 | 2019-11-20 | Life Technologies Corporation | Universal reporter-based genotyping methods, reaction mixture and kit |
| CA2905429A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbott Molecular Inc. | Minimizing errors using uracil-dna-n-glycosylase |
| CA2902916C (en) | 2013-03-14 | 2018-08-28 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting neoplasm |
| WO2014184684A2 (en) | 2013-05-16 | 2014-11-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection of hematological cancers |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| AU2014321355B2 (en) | 2013-09-20 | 2019-10-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for the analysis of radiosensitivity |
| EP3539944A1 (en) | 2013-10-25 | 2019-09-18 | Life Technologies Corporation | Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof |
| US10253358B2 (en) | 2013-11-04 | 2019-04-09 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiple-control calibrators for DNA quantitation |
| KR101488110B1 (ko) | 2013-11-29 | 2015-01-29 | 성균관대학교산학협력단 | 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용 |
| CN105452451B (zh) | 2013-12-06 | 2020-06-05 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 融合聚合酶 |
| US10138524B2 (en) | 2013-12-19 | 2018-11-27 | Exact Sciences Development Company, Llc | Synthetic nucleic acid control molecules |
| WO2015107430A2 (en) | 2014-01-16 | 2015-07-23 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer |
| JP2017503521A (ja) | 2014-01-22 | 2017-02-02 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 高温核酸合成で使用するための新規な逆転写酵素 |
| CN120700143A (zh) | 2014-03-31 | 2025-09-26 | 梅奥医学教育和研究基金会 | 检测结直肠赘生物 |
| US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
| US10184154B2 (en) | 2014-09-26 | 2019-01-22 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting cholangiocarcinoma |
| US20170253921A1 (en) | 2014-10-13 | 2017-09-07 | Life Technologies Corporation | Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers |
| WO2016094839A2 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Exact Sciences Corporation | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| CA3183545C (en) | 2014-12-12 | 2026-01-13 | Exact Sciences Corporation | Compositions and methods for performing methylation detection assays |
| EP3795681B1 (en) | 2014-12-16 | 2024-09-18 | Life Technologies Corporation | Polymerase compositions and methods of making and using same |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US10641772B2 (en) | 2015-02-20 | 2020-05-05 | Takara Bio Usa, Inc. | Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells |
| EP3967768A1 (en) | 2015-03-13 | 2022-03-16 | Life Technologies Corporation | Compositions for small rna capture, detection and quantification |
| US10435755B2 (en) | 2015-03-27 | 2019-10-08 | Exact Sciences Development Company, Llc | Detecting esophageal disorders |
| CN104845967B (zh) | 2015-04-15 | 2020-12-11 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用 |
| CA2983819A1 (en) | 2015-04-24 | 2016-10-27 | Atila Biosystems Incorporated | Amplification with primers of limited nucleotide composition |
| JP6822974B2 (ja) * | 2015-05-29 | 2021-01-27 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | シトラコン酸無水物によって微生物を不活性化する方法 |
| CN114574585A (zh) | 2015-08-31 | 2022-06-03 | 梅约医药教育及研究基金会 | 检测胃肿瘤 |
| USD938023S1 (en) | 2015-09-02 | 2021-12-07 | Certa Dose, Inc. | Drug delivery syringe |
| GB201518655D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Olink Ab | Method for generating proximity probes |
| IL310721B2 (en) | 2015-10-23 | 2025-11-01 | Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| CN108350485A (zh) | 2015-10-30 | 2018-07-31 | 精密科学发展有限责任公司 | 血浆dna的多重扩增检测测定以及分离和检测 |
| CN116144626A (zh) | 2016-01-13 | 2023-05-23 | 新英格兰生物实验室公司 | T7 rna聚合酶的热稳定变体 |
| WO2017121836A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic dna polymerase mutants |
| US10246740B2 (en) | 2016-01-27 | 2019-04-02 | Devyser Holding Ab | Selective amplification of desired nucleic acid regions in a target sequence |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| WO2017177025A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods, and kits for synthesis and detection of nucleic acids |
| CN109563546B (zh) | 2016-05-05 | 2022-09-09 | 精密科学发展有限责任公司 | 通过分析甲基化dna来检测肺肿瘤 |
| US20170321286A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Exact Sciences Corporation | Detection of lung neoplasia by amplification of rna sequences |
| KR20190030647A (ko) | 2016-05-11 | 2019-03-22 | 세르타 도즈, 인코포레이티드 | 방사선 용량결정 시스템 및 방법 |
| JP7106461B2 (ja) | 2016-06-07 | 2022-07-26 | セファイド | 熱安定性ポリメラーゼ阻害剤組成物及び方法 |
| US20170362640A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
| US10066263B2 (en) | 2016-06-17 | 2018-09-04 | California Institute Of Technology | Nucleic acid reactions and related methods and compositions |
| WO2017222056A1 (ja) * | 2016-06-23 | 2017-12-28 | 国立研究開発法人理化学研究所 | ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム |
| FR3053968A1 (fr) * | 2016-07-13 | 2018-01-19 | Biomerieux | Reactifs pour la protection reversible de molecules biologiques |
| EP3978624B1 (en) | 2016-07-19 | 2025-03-26 | Exact Sciences Corporation | Methylated control dna |
| WO2018017710A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Exact Sciences Development Company, Llc | Nucleic acid control molecules from non-human organisms |
| JP7075394B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-05-25 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | マルチウェルデバイスを用いたマルチｚ撮像及び分注 |
| CN110214183A (zh) | 2016-08-03 | 2019-09-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 腺苷核碱基编辑器及其用途 |
| WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| US11613777B2 (en) | 2016-08-26 | 2023-03-28 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
| WO2018044831A1 (en) | 2016-08-30 | 2018-03-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Cleavable hairpin primers |
| EP3507298B1 (en) | 2016-09-02 | 2023-08-30 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | Detecting hepatocellular carcinoma |
| KR102622411B1 (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-10 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| WO2018127786A1 (en) | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Oslo Universitetssykehus Hf | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| KR102892245B1 (ko) | 2017-01-27 | 2025-11-27 | 이그젝트 싸이언스 디블롭먼트 컴패니, 엘엘씨 | 메틸화된 dna 분석에 의한 결장 신조직형성의 검출 |
| JP2020507312A (ja) | 2017-02-10 | 2020-03-12 | ザイマージェン インコーポレイテッド | 複数の宿主用の複数のｄｎａコンストラクトのアセンブリ及び編集のためのモジュラーユニバーサルプラスミド設計戦略 |
| JP7356349B2 (ja) | 2017-02-28 | 2023-10-04 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 前立腺癌検出 |
| CA3053875A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | Etablissement Francais Du Sang | Rhd gene allele associated with a weak d phenotype and its uses |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US12390514B2 (en) | 2017-03-09 | 2025-08-19 | President And Fellows Of Harvard College | Cancer vaccine |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| KR20240116572A (ko) | 2017-03-23 | 2024-07-29 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| CN107312762B (zh) * | 2017-06-23 | 2020-08-11 | 苏州点晶生物科技有限公司 | 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 |
| EP3645710A1 (en) | 2017-06-26 | 2020-05-06 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic dna polymerase mutants |
| CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
| USD846383S1 (en) | 2017-08-10 | 2019-04-23 | Certa Dose, Inc. | Carton |
| EP3676376B1 (en) | 2017-08-30 | 2025-01-15 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| KR20250107288A (ko) | 2017-10-16 | 2025-07-11 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| WO2019094973A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Life Technologies Corporation | Compositions, methods and kits for urinary tract microorganism detection |
| JP7277460B2 (ja) | 2017-11-30 | 2023-05-19 | マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ | 乳癌の検出 |
| US10648025B2 (en) | 2017-12-13 | 2020-05-12 | Exact Sciences Development Company, Llc | Multiplex amplification detection assay II |
| US12406749B2 (en) | 2017-12-15 | 2025-09-02 | The Broad Institute, Inc. | Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US12454720B2 (en) | 2018-04-17 | 2025-10-28 | ChromaCode, Inc. | Methods and systems for multiplex analysis |
| US11712522B2 (en) | 2018-05-01 | 2023-08-01 | CD Acquistions, LLC | System and method for sequential delivery of measured doses of medication |
| US11679204B2 (en) | 2018-05-17 | 2023-06-20 | Cd Acquisitions, Llc | Syringe holder for medication dosing |
| US12157760B2 (en) | 2018-05-23 | 2024-12-03 | The Broad Institute, Inc. | Base editors and uses thereof |
| US12203129B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-01-21 | ChromaCode, Inc. | Formulations and signal encoding and decoding methods for massively multiplexed biochemical assays |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| CA3107002A1 (en) | 2018-08-15 | 2020-04-30 | Zymergen Inc. | Applications of crispri in high throughput metabolic engineering |
| US11408030B2 (en) | 2018-09-10 | 2022-08-09 | Andy Madrid | Test for detecting Alzheimer's disease |
| US11739306B2 (en) | 2018-09-13 | 2023-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Mutant DNA polymerase(s) with improved strand displacement ability |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| EP3880847B1 (en) | 2018-11-16 | 2025-09-03 | Oslo Universitetssykehus HF | Methods and compositions for characterizing bladder cancer |
| USD943737S1 (en) | 2019-01-22 | 2022-02-15 | Certa Dose, Inc. | Overdose resistant drug delivery syringe |
| US12351837B2 (en) | 2019-01-23 | 2025-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| CA3127329A1 (en) | 2019-01-24 | 2020-07-30 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting endometrial cancer |
| JP7687957B2 (ja) | 2019-03-14 | 2025-06-03 | インシリクサ， インコーポレイテッド | 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム |
| WO2020191233A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| US12473543B2 (en) | 2019-04-17 | 2025-11-18 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| CN110283801A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-27 | 遵义医科大学珠海校区 | 一种dna聚合酶的化学修饰方法 |
| EP4031683A4 (en) | 2019-09-16 | 2024-01-17 | Exact Sciences Corporation | Structure and temperature-dependent flap endonuclease substrates |
| US12435330B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-10-07 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing RNA |
| US11702704B2 (en) | 2019-10-31 | 2023-07-18 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting ovarian cancer |
| ES3030914T3 (en) | 2019-11-04 | 2025-07-02 | Mirnax Biosens S L | Bivalent reverse primer |
| EP3901286A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-27 | Mirnax Biosens, S.L. | Bivalent reverse primer |
| CN116113714A (zh) | 2020-02-18 | 2023-05-12 | 生命技术公司 | 用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法 |
| IL297761A (en) | 2020-05-08 | 2022-12-01 | Broad Inst Inc | Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence |
| EP4157856A2 (en) | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Qiagen Beverly, LLC | Polymerase enzyme |
| AU2021329899A1 (en) | 2020-08-19 | 2023-03-09 | Exact Sciences Corporation | Detecting non-hodgkin lymphoma |
| EP4204568A4 (en) | 2020-08-28 | 2024-09-11 | Duke University | Engineered polymerases and methods of using the same |
| CA3193099A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | David R. Liu | Prime editing guide rnas, compositions thereof, and methods of using the same |
| CN112359031A (zh) * | 2020-11-16 | 2021-02-12 | 北京丹大生物技术有限公司 | 一种热启动dna聚合酶及其制备方法和应用 |
| EP4274894A2 (en) | 2021-01-11 | 2023-11-15 | The Broad Institute, Inc. | Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision |
| WO2022155588A2 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples |
| WO2022159874A1 (en) | 2021-01-25 | 2022-07-28 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| CN114958797B (zh) * | 2021-02-20 | 2025-03-25 | 郑州思昆生物工程有限公司 | 突变型dna聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用 |
| WO2022203748A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences |
| WO2023014729A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of nucleic acid sequence loads |
| WO2023021330A1 (en) | 2021-08-16 | 2023-02-23 | University Of Oslo | Compositions and methods for determining a treatment course of action |
| CN118414438A (zh) | 2021-10-20 | 2024-07-30 | 生命科技公司 | 使用内部定量标准物定量核酸序列的组合物、试剂盒和方法 |
| WO2023076898A1 (en) | 2021-10-25 | 2023-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase |
| CN116410951A (zh) * | 2021-12-30 | 2023-07-11 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法和经该方法处理的Taq酶 |
| US20250145989A1 (en) | 2022-01-26 | 2025-05-08 | Seegene, Inc. | Method for detecting target nucleic acids in sample |
| AU2023298557A1 (en) | 2022-06-29 | 2025-01-16 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays |
| JP2025522828A (ja) | 2022-06-29 | 2025-07-17 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | チャネル内マルチプレックス化を用いて核酸を検出するための組成物、キット及び方法 |
| CN116024320A (zh) * | 2022-07-13 | 2023-04-28 | 上海翔琼生物技术有限公司 | 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法 |
| WO2024054925A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
| WO2024102839A1 (en) | 2022-11-10 | 2024-05-16 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of viral sequences |
| EP4619515A1 (en) | 2022-11-17 | 2025-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Prime editor delivery by aav |
| EP4646495A1 (en) | 2023-01-02 | 2025-11-12 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral sequences |
| US20240254568A1 (en) | 2023-01-27 | 2024-08-01 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting sti pathogen sequences |
| KR20260011156A (ko) | 2023-05-12 | 2026-01-22 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 다중 중합효소 연쇄반응 공정 및 데이터 분석을 위한 시스템 및 방법 |
| WO2025151807A1 (en) | 2024-01-11 | 2025-07-17 | Life Technologies Corporation | Crude lysate sample extraction for digital pcr |
| WO2025175212A1 (en) | 2024-02-15 | 2025-08-21 | Life Technologies Corporation | Methods for rapid extraction-free genotyping |
| WO2025175243A1 (en) | 2024-02-15 | 2025-08-21 | Life Technologies Corporation | Amplification and data collection protocol for rapid genotyping |
| WO2026055641A1 (en) | 2024-09-06 | 2026-03-12 | Exact Sciences Corporation | Methods and compositions for preparing biomolecule analytes from complex samples |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI69503C (fi) * | 1984-03-13 | 1986-02-10 | Neste Oy | Ytbelagd bergsbehaollare eller tunnel |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5374553A (en) * | 1986-08-22 | 1994-12-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima |
| WO1989002916A1 (en) * | 1987-09-28 | 1989-04-06 | Novo-Nordisk A/S | Method for immobilizing lipase |
| US5108892A (en) * | 1989-08-03 | 1992-04-28 | Promega Corporation | Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity |
| AU646430B2 (en) * | 1989-12-22 | 1994-02-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant expression vectors and purification methods for thermus thermophilus DNA polymerase |
| JP2709311B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1998-02-04 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アクチェンゲゼルシャフト | 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの５→３′のエキソヌクレアーゼ突然変異 |
| FR2674248B1 (fr) * | 1991-03-19 | 1993-06-11 | Elf Aquitaine | Procede de modification chimique des proteines. |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| ATE143057T1 (de) * | 1994-10-17 | 1996-10-15 | Harvard College | Dns polymerase mit veränderter nukleotid- bindungstelle |
-
1996
- 1996-07-11 US US08/680,283 patent/US5773258A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-19 US US08/684,108 patent/US5677152A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE69601488T patent/DE69601488T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 ES ES96113222T patent/ES2101668T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DE DE0771870T patent/DE771870T1/de active Pending
- 1996-08-17 AT AT96113222T patent/ATE176499T1/de active
- 1996-08-17 EP EP96113222A patent/EP0771870B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-17 DK DK96113222T patent/DK0771870T3/da active
- 1996-08-19 IL IL11908896A patent/IL119088A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-21 HU HU9602289A patent/HU221750B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-21 AU AU62179/96A patent/AU689047B2/en not_active Expired
- 1996-08-23 CA CA002184105A patent/CA2184105C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 NO NO19963541A patent/NO323552B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 RU RU96116815/13A patent/RU2174556C2/ru active
- 1996-08-23 PL PL96315803A patent/PL185711B1/pl unknown
- 1996-08-23 MX MX9603608A patent/MX9603608A/es unknown
- 1996-08-23 CZ CZ19962495A patent/CZ289237B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-24 KR KR1019960035291A patent/KR100221097B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-25 CN CNB961132191A patent/CN1282741C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 BR BR9603563A patent/BR9603563A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-26 JP JP08240996A patent/JP3026554B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL185711B1 (pl) | Zmodyfikowany chemicznie enzym termostabilny, sposób jego wytwarzania, sposób amplifikacji kwasu nukleinowego, mieszanina reakcyjna do amplifikacji PCR i zestaw do PCR | |
| JP3969581B2 (ja) | インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素 | |
| EP1201768B1 (en) | Amplification using modified primers | |
| EP1072679A2 (en) | Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure | |
| EP0962526A2 (en) | Method for reversible modification of thermostable enzymes | |
| JP5022383B2 (ja) | マグネシウム封鎖によるｐｃｒホットスタート | |
| US20160264950A1 (en) | Reversibly inactivated thermostable reverse transcriptases, compositions and methods for use | |
| CN104350160A (zh) | 利用通过核酸外切酶和核酸内切酶二者切割的寡核苷酸探针进行的核酸检测 | |
| PL191989B1 (pl) | Starter oligonukleotydowy do powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), para starterów oligonukleotydowych, układ starterów oligonukleotydowych, zestawy do wykrywania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) i sposób powielania kwasu nukleinowego ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) | |
| CN101426908B (zh) | 可逆性修饰的热稳定酶组合物及其制备方法和使用方法 | |
| Yoshida et al. | Novel properties of DNA polymerase β with poly (rA). oligo (dT) template-primer | |
| Gill et al. | Interaction of the family-B DNA polymerase from the archaeon Pyrococcus furiosus with deaminated bases | |
| JP2021505199A (ja) | 鋳型切り換え機構を通じて核酸ライブラリを調製するためのシステムと方法 | |
| US8129150B2 (en) | Mixture of reversibly inhibited enzymes | |
| US20170044506A1 (en) | cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE | |
| JP2002528121A5 (ja) | 高忠実度の熱安定性リガーゼおよびその使用 | |
| EP2183380B1 (en) | Methods and compositions for pcr | |
| JP2928992B2 (ja) | Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法 | |
| US20070264694A1 (en) | Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis | |
| KR20230124946A (ko) | 고-충실도 DNA 폴리머라아제를 이용한 rhPCR 기반 앰플리콘시퀀싱에서 프라이머 이량체 및 오프-타겟 증폭을 감소시키는 RNAse H2 돌연변이체 |