JPH1038885A - 免疫学的診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原タンパク質の抗原決定基が遮蔽されるこ
となく不溶性担体上に担持された、感度の高い免疫学的
診断試薬を提供する。 【解決手段】 診断学上有用である抗原タンパク質
（例、梅毒トレポネーマの表面抗原蛋白質）とグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質が、
グルタチオンが予め担持された不溶性担体（例、スチレ
ン−メタクリル酸共重合体粒子）に、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼとグルタチオンとの結合を介して
担持されていることを特徴とする免疫学的診断試薬
（例、免疫学的梅毒診断試薬）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、診断学上有用であ
る抗原タンパク質、特に梅毒トレポネーマ表面抗原蛋白
質が担持された不溶性担体からなる免疫学的診断試薬に
関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に感染症では、感染しているか否か
は、血液中の細菌やウイルス等に対する抗体の存在によ
り判断される。また、ある種のガンにおいてはガン細胞
が分泌するタンパク質に対する抗体が出現することが知
られており、ガンの診断に利用されている。臨床検査分
野において、従来より、これら感染症の抗原タンパク質
やガン細胞分泌タンパク質を不溶性担体に担持させ、抗
体との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度
合いを検出することにより、該抗体を測定する免疫測定
方法が用いられてきた。このような測定方法としては、
赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られている。

【０００３】このような方法では不溶性担体上に抗原を
担持させる場合、物理的吸着法や化学反応を用いた化学
結合法が用いられてきた。しかしながら、これらの方法
では、抗原タンパク質が結合する方向が限定できない。
つまり、エピトープが不溶性担体上に吸着又は結合して
しまい、抗体が結合できなくなる場合があり、この場合
は抗原タンパク質が有効に機能しなくなり、測定の感度
低下の原因になっていた。

【０００４】例えば、特開平７−２８７０１７号公報に
は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、Ｇ
ＳＴという）と梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質
との融合タンパク質を用いて、抗梅毒トレポネーマ抗体
を測定する診断試薬が開示されている。しかしながら、
この試薬においては、不溶性担体に対して直接融合タン
パク質が担持されているので、融合タンパク質が結合す
る方向が限定されず、抗原タンパク質側が不溶性担体に
結合することがあり、この場合は、外側に位置するＧＳ
Ｔが立体障害となり、エピトープに抗体が結合できない
ことがあり、この結果、不溶性担体に結合している融合
タンパク質の全てが有効に機能せず、測定の感度低下の
原因となっていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的は、抗原タンパク質の
エピトープが遮蔽されることなく不溶性担体上に担持さ
れた、感度の高い免疫学的診断試薬を提供することであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の免疫学的
診断試薬（以下、請求項１記載の発明を本発明１とい
う）は、診断学上有用である抗原タンパク質とグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質が、
グルタチオンが予め担持された不溶性担体に、グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンとの結合
を介して担持されていることを特徴とする。

【０００７】請求項２記載の免疫学的診断試薬（以下、
請求項２記載の発明を本発明２という）は、診断学上有
用である抗原タンパク質とグルタチオンとの融合タンパ
ク質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが予め
担持された不溶性担体に、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼとグルタチオンとの結合を介して担持されて
いることを特徴とする。

【０００８】請求項３記載の免疫学的診断試薬（以下、
請求項３記載の発明を本発明３という）は、上記抗原タ
ンパク質が梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質であ
る請求項１又は２記載の免疫学的診断試薬である。

【０００９】請求項４記載の免疫学的診断試薬（以下、
請求項４記載の発明を本発明４という）は、上記グルタ
チオンが還元型グルタチオンである請求項１〜３のいず
れか１項記載の免疫学的診断試薬である。

【００１０】請求項５記載の免疫学的診断試薬（以下、
請求項５記載の発明を本発明５という）は、上記不溶性
担体が、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸
塩共重合体又はスチレン−メタクリル酸共重合体である
請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫学的診断試薬で
ある。

【００１１】以下、本発明１について説明する。

【００１２】本発明１で用いられる、診断学上有用であ
る抗原タンパク質とは、本発明１の目的にあった病原体
などの抗原タンパク質であれば特に限定されない。例え
ば、細菌の抗原タンパク質として、梅毒トレポネーマ、
ヘリコバクター・ピロリ、マイコプラズマ、淋菌などの
抗原タンパク質が挙げられる。ウイルスの抗原タンパク
質として、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
Ｃ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、陰部ヘルペスウ
イルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、などの抗
原タンパク質が挙げられる。また、ガン細胞が特異的に
発現する抗原タンパク質などであってもよい。本発明１
は、梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク質の場合に特
に有効である。

【００１３】上記梅毒トレポネーマの表面抗原タンパク
質の場合、該抗原タンパク質としては、分子量４７ｋＤ
ａの梅毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection
andImmunity 57(1),196-203(1989)）、４４ｋＤａの梅
毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Journal of Genet
ical Microbiology 133,1793-1803(1987))、４２ｋＤａ
の梅毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection an
d Immunity 57(9),2612-2623(1989)) 、３５ｋＤａの梅
毒トレポネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Im
munity 59(10),3536-3546(1991))、３４ｋＤａの梅毒ト
レポネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Immuni
ty 57(11),3314-3323(1989))、１７ｋＤａの梅毒トレポ
ネーマ表面抗原タンパク質（Infection and Immunity 6
1,1202-1210(1993) ）、１５ｋＤａの梅毒トレポネーマ
表面抗原タンパク質（MolecularMicrobiology 4,1371-1
379(1990)) などが知られており、これらはいずれも使
用可能である。これらの中でも、梅毒トレポネーマの主
要な表面抗原タンパク質と考えられている４７ｋＤａの
表面抗原タンパク質、１７ｋＤａの表面抗原タンパク
質、１５ｋＤａの表面抗原タンパク質などが好ましい。

【００１４】本発明１の免疫学的診断試薬においては、
単独の抗原タンパク質のＧＳＴとの融合タンパク質が、
グルタチオン担持不溶性担体に結合されて試薬となされ
ていても良いが、上記の梅毒トレポネーマの表面抗原タ
ンパク質のように、一つの細菌、ウイルス又はガン細胞
などに対して、複数の抗原タンパク質が公知となってい
るものの場合、複数の抗原タンパク質の各々についての
ＧＳＴとの融合タンパク質が混合されて、同一のグルタ
チオン担持不溶性担体に結合されて試薬となされていて
も良いし、また、各々についてのＧＳＴとの融合タンパ
ク質が別々にグルタチオン担持不溶性担体に結合された
ものが混合されて試薬となされていても良い。

【００１５】本発明１で用いられる、抗原タンパク質と
ＧＳＴとの融合タンパク質は、一般的には、遺伝子組換
え手法により得られる。この手法を詳しく説明すると、
抗原タンパク質の遺伝子が公知のものであれば、ＰＣＲ
法により抗原タンパク質のＤＮＡを増幅、精製し、これ
をＧＳＴ遺伝子を含むプラスミドベクターに導入する。
得られたプラスミドベクターを大腸菌に導入し、大腸菌
に融合タンパク質を大量生産させる。上記融合タンパク
質の抗原タンパク質とＧＳＴとの結合順序はどのような
ものであってもよい。すなわち、Ｃ−末端側に、抗原タ
ンパク質があってもよいし、ＧＳＴがあってもよい。

【００１６】本発明１で用いられる、抗原タンパク質と
ＧＳＴとの融合タンパク質は、また、化学的手法によっ
ても得ることができる。この場合、まず、抗原タンパク
質とＧＳＴは別々に得なければならない。抗原タンパク
質は病原菌体などから精製されたものでもよいし、大腸
菌などに生産させたものが精製されたものでもよい。ま
た、ＧＳＴは大腸菌により容易に大量生産可能である。
精製された抗原タンパク質上には、それを構成している
アミノ酸由来の官能基がいくつか存在する。例えば、カ
ルボキシル基、アミノ基、チオール基などである。これ
らの官能基を利用して、ＧＳＴと架橋剤を用いて化学的
に結合させると、抗原タンパク質の様々な部位にＧＳＴ
を結合させることが可能であり、その全てを本発明１に
用いることができる。上記架橋剤としては、例えば、水
溶性カルボジイミドや二価性試薬などが用いられる。

【００１７】本発明１で用いられるグルタチオンは、還
元型グルタチオンであることが好ましい。酸化型グルタ
チオンでは、ＧＳＴとの結合能が著しく低下する。

【００１８】本発明１で用いられる不溶性担体として
は、例えば、有機高分子粒子、微生物、血球、細胞膜片
等が挙げられる。

【００１９】上記有機高分子粒子としては、例えば、不
溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の
天然高分子粒子；ポリスチレン、スチレン−スチレンス
ルホン酸塩共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合
体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合
体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビ
ニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粒子
等が挙げられ、特に合成高分子粒子を均一に懸濁させた
ラテックスが好ましく、特に、ポリスチレン、スチレン
−スチレンスルホン酸塩共重合体又はスチレン−メタク
リル酸共重合体粒子が好ましい。

【００２０】上記ラテックス粒子を用いる場合、粒径
は、０．１〜１．０μｍが好ましく、０．１〜０．５μ
ｍがより好ましい。

【００２１】本発明１において、不溶性担体にグルタチ
オンを担持しておく方法としては、不溶性担体とグルタ
チオンの化学反応を利用する方法、不溶性担体へのグル
タチオンの物理吸着を利用する方法などが挙げられる。

【００２２】上記化学反応を利用する方法としては、例
えば、水溶性カルボジイミドを用いて縮合反応にて結合
させる方法が挙げられる。この場合は、不溶性担体を懸
濁した懸濁液とグルタチオン溶液とを混合したものに、
水溶性カルボジイミド溶液を添加する。これを攪拌する
ことにより容易にペプチド結合を形成する架橋反応が起
こり、不溶性担体とグルタチオンを結合することができ
る。なお、この場合は、不溶性担体表面にカルボキシル
基が存在するものでなければならない。このような不溶
性担体としては、例えば、スチレン−メタクリル酸共重
合体からなるラテックス粒子が好ましい。

【００２３】上記スチレン−メタクリル酸共重合体から
なるラテックス粒子を用いる場合、そのカルボキシル基
の量は、表面荷電が０．０３〜０．７５ｍｅｑＣＯＯ^-
／ｇが好ましく、０．０５〜０．４０ｍｅｑＣＯＯ^- ／
ｇがより好ましい。

【００２４】上記縮合反応を用いる場合、ラテックス粒
子とグルタチオンの間に、適当なスペーサーを介して結
合させることもできる。このようなスペーサーとして
は、β−アミノアラニン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノ
カプロン酸、グルタミン酸などのアミノ酸が好ましい。

【００２５】上記水溶性カルボジイミドとしては、例え
ば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣという）、１−シ
クロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミドメト−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチル−
３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド過
塩素酸塩等が挙げられるが、水への溶解度、反応性等の
点からＥＤＣが好ましい。

【００２６】上記ＥＤＣを用いる場合、反応液中のＥＤ
Ｃ濃度は、低くなると十分に反応が進行しなくなり、高
くなるとＥＤＣが溶解せずに析出するので５〜３０％
（ｗ／ｖ）が好ましい。

【００２７】上記ＥＤＣによる反応の反応温度は、低く
なると十分に反応が進行しなくなり、高くなるとグルタ
チオンが変性する恐れがあるので、０℃〜４０℃が好ま
しい。

【００２８】上記化学反応よる場合、反応液中のグルタ
チオンの濃度は、低くなると不溶性担体上の全てのカル
ボキシル基と反応せず十分な量が担持されなくなるの
で、１％（ｗ／ｖ）以上が好ましい。

【００２９】不溶性担体へのグルタチオンの物理吸着を
利用する方法の場合、不溶性担体とグルタチオンとを溶
液中で接触させることにより、グルタチオンと不溶性担
体の荷電により容易に吸着が起こる。

【００３０】物理吸着法の場合、十分に吸着を行わせる
ために、グルタチオンの量を不溶性担体の量の２倍以上
で用いるのが好ましく、例えば、不溶性担体が１％（ｗ
／ｖ）の濃度であれば、グルタチオンの濃度は２％（ｗ
／ｖ）以上が好ましい。

【００３１】上記吸着反応の反応温度は、低くなると十
分に反応が進行しなくなり、高くなるとグルタチオンの
立体構造が変化したり、分解する恐れがあるので、０℃
〜４０℃が好ましい。

【００３２】抗原タンパク質とＧＳＴとの融合タンパク
質を、グルタチオンが予め担持された不溶性担体に、グ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンと
の結合を介して担持させるには、通常、両者を混合させ
るだけで結合がおこる。これは、グルタチオンがＧＳＴ
の基質であるためである。

【００３３】上記結合反応の温度は、０℃よりも低くな
ると溶液が凍結してしまい反応が進行しなくなり、４０
℃よりも高くなると抗原タンパク質が失活してしまうの
で、０℃〜４０℃が好ましく、４〜１０℃が特に好まし
い。

【００３４】上記結合反応時の反応溶液のｐＨは、７〜
１０が好ましい。これは、還元型グルタチオンが酸化型
になるのを防ぐためである。さらに、酸化型になるのを
防ぐために、ジチオトライコールなどの還元剤を反応溶
液中に存在させるのが好ましい。反応溶液中の還元剤の
濃度は０．１〜１００ｍＭが好ましい。

【００３５】以下、本発明２について説明する。

【００３６】本発明２は、本発明１における、抗原タン
パク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融
合タンパク質の代わりに、抗原タンパク質とグルタチオ
ンとの融合タンパク質が用いられ、グルタチオンが予め
担持された不溶性担体の代わりに、ＧＳＴが予め担持さ
れた不溶性担体が用いられることの他は、本発明１と同
様である。従って、本発明１の説明で述べたことと同様
の部分についてはその説明を省略する。

【００３７】本発明２の免疫学的診断試薬においては、
単独の抗原タンパク質のグルタチオンとの融合タンパク
質が、ＧＳＴ担持不溶性担体に結合されて試薬となされ
ていても良いが、一つの細菌、ウイルス又はガン細胞な
どに対して、複数の抗原タンパク質が公知となっている
ものの場合、複数の抗原タンパク質の各々についてのグ
ルタチオンとの融合タンパク質が混合されて、同一のＧ
ＳＴ担持不溶性担体に結合されて試薬となされていても
良いし、また、各々についてのグルタチオンとの融合タ
ンパク質が別々にＧＳＴ担持不溶性担体に結合されたも
のが混合されて試薬となされていても良い。

【００３８】本発明２で用いられる、抗原タンパク質と
ＧＳＴとの融合タンパク質は、グルタチオンは３個のア
ミノ酸からなる単純なポリペプチドであるので、これに
対応するＤＮＡをＤＮＡ合成機で作製後、抗原タンパク
質遺伝子が組み込まれたプラスミドに組み込み、大腸菌
により発現させることにより得ることができる。また、
化学的方法でも本発明１の説明におけるＧＳＴをグルタ
チオンに代えたことの他は本発明１と同様にして得るこ
とができる。

【００３９】本発明２で用いられるグルタチオンも、還
元型グルタチオンであることが好ましい。酸化型グルタ
チオンでは、ＧＳＴとの結合能が著しく低下する。

【００４０】本発明２において、不溶性担体にＧＳＴを
担持しておく方法としては、不溶性担体とＧＳＴの化学
反応を利用する方法、不溶性担体へのＧＳＴの物理吸着
を利用する方法などが挙げられる。

【００４１】上記化学反応を利用する方法、物理吸着を
利用する方法などの詳細は、本発明１の説明におけるグ
ルタチオンをＧＳＴに代えたことの他は本発明１と同様
にして行うことができる。

【００４２】抗原タンパク質とグルタチオンとの融合タ
ンパク質を、ＧＳＴが予め担持された不溶性担体に、Ｇ
ＳＴとグルタチオンとの結合を介して担持させる方法の
詳細は、本発明１と同様である。

【００４３】本発明１又は２の免疫学的診断試薬は、検
体と混合されて使用されることにより、測定対象である
検体中の抗体と、本発明の試薬の抗原タンパク質との抗
原抗体反応に基づいて上記抗体を測定することができ
る。

【００４４】上記の抗原抗体反応に際しては、検体を、
ｐＨ５．０〜９．０の緩衝液を用いて希釈してもよい。
上記の検体の希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液などが挙げられる。

【００４５】上記検体希釈液には、測定感度の向上、及
び抗原抗体反応の促進を目的として種々の増感剤を添加
することができる。上記増感剤としては、例えば、特開
平２−１７３５６７号公報に記載されたメチルセルロー
ス、エチルセルロース等のアルキル化多糖類、特開平５
−１８０８３８号公報に記載されたプルラン、ポリビニ
ルピロリドン等が挙げられる。

【００４６】また、上記検体希釈液には、検体中に存在
する他の物質により起こる非特異反応抑制を目的とし
て、牛血清アルブミン、卵性アルブミン等を添加するこ
ともできる。

【００４７】本発明１又は２の免疫学的診断試薬によっ
て、検体中の抗体を測定する際の測定系としては、例え
ば、前記不溶性担体と検体中の抗体との反応による前記
不溶性担体の凝集の程度を測定するものが挙げられ、特
に、不溶性担体としてラテックス粒子を用いるラテック
ス凝集反応系が好ましい。

【００４８】上記反応により生じた凝集を測定する方法
としては、凝集の程度を光学的に観察する方法あるいは
目視により観察する方法などが挙げられる。

【００４９】具体的には、光学的に観察する方法におい
ては、検体を検体希釈液で希釈した液に、本発明１又は
２の免疫学的診断試薬を含有する液（通常、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝
液、クエン酸緩衝液など）を混合した後、該混合液の散
乱光強度、吸光度又は透過光強度を測定する。測定の波
長は３００〜２４００ｎｍが使用でき、測定方法は公知
の方法に従い、用いる不溶性担体の粒径、濃度、反応時
間によって散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加
もしくは減少を測定する。またこれらの方法は単独で用
いられても併用されてもよい。

【００５０】目視により観察する方法においては、通
常、検体と本発明の免疫学的診断試薬を含む液を判定板
上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。
判定には単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮
影し画像処理を施すことによって判定することもでき
る。

【００５１】前記抗原抗体反応は通常の条件で行われ、
反応媒体としては、例えば、上記のように、リン酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液等が用いられる。
反応時のｐＨは、４．５〜１０．０が好ましく、さらに
好ましくは５．８〜８．０である。反応時の温度は、０
〜５０℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０℃で
ある。反応時間は適宜決められる。

【００５２】

【発明の実施の形態】本発明を実施例につき述べ、その
効果を具体的に説明する。 実施例１ （１）梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融
合タンパク質の調製 トレポネーマパリダム（Treponema Pallidum）継代ウサ
ギ睾丸の破砕物（常磐化学社製）より、トレポネーマパ
リダム菌体を抽出し、ゲノムＤＮＡを抽出した。すでに
４７ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は既知であるので、それを
もとにＤＮＡ合成装置を用いてプライマーを作成した。
前記で抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプラ
イマーを用いて、ＰＣＲ法により４７ｋＤａ抗原のＤＮ
Ａ断片を得た。次に、ＧＳＴとの融合タンパク質を発現
するために作られたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３（ファ
ルマシア社製）に、上記のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＧＥ
Ｘ−４Ｔ−３−４７ｋと命名した。

【００５３】次に、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３−４７ｋを大腸
菌に導入し、培養した。培養液にイソプロピル−β−
（−）−チオガラクトピラノシドを加えることにより、
４７ｋＤａ抗原とＧＳＴの融合タンパク質の発現を誘導
した。十分に融合タンパク質が発現した大腸菌を超音波
処理により菌体を破砕し、遠心分離により細胞膜、核な
どを除いた上清に、グルタチオンセファロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）を加え、４℃で一晩ゆるやかに振とう
し、融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂに
吸着させた。遠心分離により融合タンパク質が吸着した
グルタチオンセファロース４Ｂを回収し、これをカラム
に充填した。数回洗浄の後、グルタチオン溶液を流すこ
とにより融合タンパク質がグルタチオンセファロース４
Ｂから遊離し溶出した。溶出液をリン酸緩衝食塩水（以
下、ＰＢＳという。食塩の濃度０．９重量％、ｐＨ７．
４）で透析することにより、過剰のグルタチオンを除去
し、融合タンパク質を得た。

【００５４】（２）グルタチオン担持ラテックス粒子懸
濁液の調製 スチレン−メタクリル酸共重合体ラテックス〔カルボキ
シル基０．２５ｍｅｑＣＯＯ^- ／ｇ、粒径０．４μｍ、
積水化学工業社製、１０％（ｗ／ｖ）〕０．２ｍｌに、
ｐＨ６．８の５０ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢ緩衝液
という）にＥＤＣを３０％（ｗ／ｖ）の割合で溶解した
溶液を１ｍｌ加え、室温で５時間攪拌した。遠心分離に
より未反応のＥＤＣを除去し、ＰＢ緩衝液で２回洗浄
後、２ｍｌのｐＨ９．０の１００ｍＭホウ酸緩衝液（以
下、ＢＢ緩衝液という）に懸濁した。この懸濁液に、Ｂ
Ｂ緩衝液に還元型グルタチオン（シグマ社製）を１％
（ｗ／ｖ）の割合で溶解した溶液を１ｍｌ加え、室温で
１２時間攪拌した。遠心分離により未反応のグルタチオ
ンを除去し、ＢＢ緩衝液で２回洗浄後、ジチオトレイト
ールを０．５ｍＭの濃度で含む２ｍｌのＰＢＳに懸濁し
て、グルタチオン担持ラテックス粒子懸濁液を得た。

【００５５】（３）免疫学的梅毒診断試薬の調製 上記（２）で得られたグルタチオン担持ラテックス粒子
懸濁液２ｍｌに、上記（１）で得られた融合タンパク質
溶液１００ｍｌ（融合タンパク質濃度１００μｇ／ｍ
ｌ）を添加し、４℃で１２時間緩やかに攪拌した。遠心
分離により未反応の融合タンパク質を除去し、牛血清ア
ルブミンを１％（ｗ／ｖ）含むＰＢＳ４ｍｌに懸濁し、
本発明の免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００５６】実施例２ 実施例１における梅毒トレポネーマ４７ｋＤａ抗原の代
わりに、梅毒トレポネーマ１５ｋＤａ抗原としたことの
他は、実施例１と同様に操作して、本発明の免疫学的梅
毒診断試薬を得た。

【００５７】比較例１ 実施例１の（１）項で得られた、梅毒トレポネーマ４７
ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融合タンパク質の溶液１００μ
ｌ（融合タンパク質濃度１００μｇ／ｍｌ）を、ポリス
チレンラテックス（粒径０．４μｍ、積水化学工業社
製、１０％（ｗ／ｖ））１００μｌに添加し、４℃で１
時間攪拌した。攪拌後の液に、牛血清アルブミンを１％
（ｗ／ｖ）含むｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸緩衝液２
ｍｌを添加し、１．５時間攪拌し、次いで、１０℃で３
０分間、１８０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。得ら
れた沈殿物に、牛血清アルブミンを０．２５％（ｗ／
ｖ）含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌ
を添加し、ラテックス粒子を懸濁させ、融合タンパク質
担持ラテックス粒子懸濁液からなる免疫学的梅毒診断試
薬を得た。

【００５８】比較例２ 実施例１の（１）項で得られた、梅毒トレポネーマ４７
ｋＤａ抗原とＧＳＴとの融合タンパク質の代わりに、実
施例２で得られた、梅毒トレポネーマ１５ｋＤａ抗原と
ＧＳＴとの融合タンパク質を用いたことの他は、比較例
１と同様に操作して、融合タンパク質担持ラテックス粒
子懸濁液からなる免疫学的梅毒診断試薬を得た。

【００５９】感度の測定 実施例１、２で得られた、本発明の免疫学的梅毒診断試
薬、及び比較例１、２で得られた免疫学的梅毒診断試薬
について、以下のようにして感度を測定した。生化学自
動分析装置（日立７０５０形、日立製作所社製）によ
り、０、５０、１００、２５０、５００各タイターユニ
ット（以下、Ｔ．Ｕ．と略す）の標準梅毒トレポネーマ
陽性血清からなる標準液を測定した。測定条件は、温度
３７℃、波長５７０ｎｍとした。測定方法は、上記標準
液２０μｌを分注後、直ちに検体希釈液（梅毒診断用試
薬「メディエースＴＰＬＡ」（積水化学工業社製）に含
まれているものを用いた。）３５０μｌを添加・混合
し、次いで上記免疫学的梅毒診断試薬の５０μｌを添加
・混合した。反応量は、上記免疫学的梅毒診断試薬添加
後８０秒から３２０秒の間の吸光度変化量とした。この
吸光度変化量を１００００倍した値と標準血清のＴ．
Ｕ．との関係を図１（実施例１と比較例１）及び図２
（実施例２と比較例２）に示した。

【００６０】

【発明の効果】請求項１記載の免疫学的診断試薬の構成
は上記の通りであり、抗原タンパク質のエピトープが遮
蔽されることなく不溶性担体上に担持されているので、
感度の高い免疫学的診断試薬を提供する。請求項２記載
の免疫学的診断試薬の構成は上記の通りであり、抗原タ
ンパク質のエピトープが遮蔽されることなく不溶性担体
上に担持されているので、感度の高い免疫学的診断試薬
を提供する。請求項３記載の免疫学的診断試薬の構成は
上記の通りであり、梅毒トレポネーマの表面抗原タンパ
ク質のエピトープが遮蔽されることなく不溶性担体上に
担持されているので、感度の高い免疫学的梅毒診断試薬
を提供する。請求項４記載の免疫学的診断試薬の構成は
上記の通りであり、グルタチオンが還元型グルタチオン
であるので、抗原タンパク質のエピトープが遮蔽される
ことなく不溶性担体上に担持された、より感度の高い免
疫学的診断試薬を提供する。請求項５記載の免疫学的診
断試薬の構成は上記の通りであり、不溶性担体が、ポリ
スチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体又
はスチレン−メタクリル酸共重合体であるので、抗原タ
ンパク質のエピトープが遮蔽されることなく不溶性担体
上に担持された、より感度の高い免疫学的診断試薬を提
供する。また、請求項１〜５記載の免疫学的診断試薬は
感度が高いので、生化学自動分析機に適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１及び比較例１の感度測定の結果を示す
グラフである。

【図２】実施例２及び比較例２の感度測定の結果を示す
グラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 診断学上有用である抗原タンパク質とグ
   ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク
   質が、グルタチオンが予め担持された不溶性担体に、グ
   ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンと
   の結合を介して担持されていることを特徴とする免疫学
   的診断試薬。
2. 【請求項２】 診断学上有用である抗原タンパク質とグ
   ルタチオンとの融合タンパク質が、グルタチオン−Ｓ−
   トランスフェラーゼが予め担持された不溶性担体に、グ
   ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとグルタチオンと
   の結合を介して担持されていることを特徴とする免疫学
   的診断試薬。
3. 【請求項３】 上記抗原タンパク質が梅毒トレポネーマ
   の表面抗原タンパク質である請求項１又は２記載の免疫
   学的診断試薬。
4. 【請求項４】 上記グルタチオンが還元型グルタチオン
   である請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫学的診断
   試薬。
5. 【請求項５】 上記不溶性担体が、ポリスチレン、スチ
   レン−スチレンスルホン酸塩共重合体又はスチレン−メ
   タクリル酸共重合体である請求項１〜４のいずれか１項
   記載の免疫学的診断試薬。