JPH09506116A

JPH09506116A - Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法

Info

Publication number: JPH09506116A
Application number: JP8513191A
Authority: JP
Inventors: キンスラー，オラフ・ビー; ガブリエル，ナンシー・イー; フアーラー，クリステイン・イー; デプリンス，ランドルフ・ビー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 1997-06-17
Anticipated expiration: 2016-06-18
Also published as: US20060233746A1; US20040181035A1; US20120296072A1; US5824784A; CA2472085A1; EP0733067B1; ES2131811T3; NZ281469A; CN1229388C; EP0822199A3; US7090835B2; IL112585A0; IL134754A; CA2178752A1; JP3177251B2; AU706700B2; IL112585A; US5985265A; EP1564219A1; IL134754A0

Abstract

(57)【要約】水溶性ポリマーのタンパク質への結合に関連する方法と組成物を提供する。タンパク質またはその類似体のＮ末端を修飾する方法、および新規なＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物を含む組成物、および関連製造方法を提供する。また化学修飾コンセンサスインターフェロンも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物および方法発明の技術分野本発明はタンパク質修飾の広範な技術分野に関し、さらに詳しくは、タンパク質またはその類似体に対する水溶性ポリマーの結合に関する（「タンパク質」という用語は本明細書で使用する場合、特に断わらない限り「ポリペプチド」またはペプチドと同じ意味である）。また本発明は、タンパク質またはその類似体のＮ末端を修飾する新規な方法およびその結果得られる組成物に関する。別の態様で、本発明は新規なＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物および関連する製造法に関する。また本発明は化学的に修飾された共働性インターフェロン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）に関する。背景治療に用いるタンパク質は大部分が、組換えＤＮＡ法が広く進歩した結果、適切な形態で充分な量を現在入手することができる。組換えタンパク質が入手可能になったので、タンパク質の製造と化学修飾が進歩している。このような修飾を行う目的の一つはタンパク質の保護である。化学結合によって、タンパク質分解酵素がタンパク質の骨格自体と物理的に接触するのを有効に遮断することができその結果分解が防止される。追加の利点としては、特定の条件下で、治療用タンパク質の安定性と循環時間を増大しかつ免疫原性を減少させることが挙げられる。タンパク質の修飾と融合タンパク質を説明する総説の文献はＦｒａｎｃｉｓ、ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ、３巻、４〜１０頁、１９９２年５月（英国、ロンドンＮ２０、オールド、フライアン・バーネット・レーン、マウンビュー・コート所在、Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ社発行）である。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）は、治療用タンパク質産物を製造するのに用いられている化学薬剤部分の一つである［「ＰＥＧ化する（ｐｅｇｙｌａｔｅ）」という動詞は少なくとも一つのＰＥＧ分子を結合させることを意味する］。例えば、ＡｄａｇｅｎすなわちアデノシンデアミナーゼのＰＥＧ化製剤は重篤な合併型免疫不全症を治療することが証明されている；ＰＥＧ化スーパーオキシドジスムターゼは頭部外傷を治療するための臨床試験が行われている；ＰＥＧ化α−インターフェロンは肝炎を治療するための第１相臨床試験で試験されている；ＰＥＧ化グルコセレブロシダーゼとＰＥＧヘモグロビンは前臨床試験（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｔｅｓｔｉｎｇ）中であることが報告されている。ポリエチレングリコールを結合すると、タンパク質分解を起こさないよう防御することが報告されており（Ｓａｄａら、Ｊ．ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７１巻、１３７〜１３９頁、１９９１年）そして特定のポリエチレングリコール部分を結合する方法も利用できる（１９７９年１２月１８日付け発行のＤａｖｉｓらの米国特許第４，１７９，３３７号「Ｎｏｎ−ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」；および１９７７年１月１１日付け発行のＲｏｙｅｒの米国特許第４，００２，５３１号「ＭｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｗｉｔｈＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌａｎｄＰｒｏｄｕｃｔＰｒｏｄｕｃｅｄＴｈｅｒｅｂｙ」参照。総説については、Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編集「ＥｎｚｙｍｅｓａｓＤｒｕｇｓ」３６７〜３８３頁、１９８１年のＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉらの報告参照）。以下のような他の水溶性ポリマーも使用されている。すなわち、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）などである。ポリエチレングリコールの場合、その分子をタンパク質に結合するのに各種の方法が用いられている。一般にポリエチレングリコール分子は、タンパク質に見られる反応性基を通じてタンパク質に結合される。例えばリシン残基またはＮ末端のアミノ基などのアミノ基は上記の結合を行うのに便利である。例えばＲｏｙｅｒ（上記米国特許第４，００２，５３１号）は、ポリエチレングリコール分子を酵素に結合するのに還元的アルキル化反応を用いたと述べている。１９９３年４月２８日付けで発行されたＷｒｉｇｈｔのヨーロッパ特許第０５３９１６７号「ＰｅｇＩｍｉｄａｔｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤｅｒｉｖａｔｅｓＴｈｅｒｅｏｆ」には、遊離アミノ基を有するペプチドと有機化合物は、ＰＥＧの直接的誘導体（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）または類縁の水溶性有機ポリマーで修飾されることが記載されている。１９９０年２月２７日付けで発行されたＳｈａｗの米国特許第４，９０４，５８４号には、ポリエチレングリコール分子を反応性アミン基を通じて結合するためタンパク質中のリシン残基の数を改変することが記載されている。化学修飾された治療用タンパク質の具体例は顆粒球コロニー刺激因子すなわち「Ｇ−ＣＳＦ」である。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の迅速な増殖と血流中への放出を誘発するので、感染と戦う治療効果がある。１９９０年１２月１２日付けで公表されたヨーロッパ特許第０４０１３８４号「ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＭｏｄｉｆｉｅｄＧｒａｎｕｌｏｃｙｔｅＣｏｌｏｎｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒ」には、ポリエチレングリコール分子が結合されるＧ−ＣＳＦを製造する場合の材料と方法が記載されている。修飾Ｇ−ＣＳＦとその類似体も、１９９２年３月４日付けで公表されたヨーロッパ特許第０４７３２６８号「ＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＲｅｌｅａｓｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇａＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＣｏｖａｌｅｎｔｌｙＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＴｏＡＷａｔｅｒＳｏｌｕｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒ」に報告されており、その明細書には、ポリエチレングリコールのような水溶性粒子ポリマーに共有結合させた各種Ｇ−ＣＳＦと誘導体の使用が述べられている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾ポリペプチドは１９８９年１０月４日付けで公表されたヨーロッパ特許第０３３５４２３号に報告されている。他の例はＰＥＧ化ＩＬ−６であり、ヨーロッパ特許第０４４２７２４号「ＭｏｄｉｆｉｅｄｈＩＬ−６」（同時係属中のアメリカ特許出願第０７／６３２，０７０号参照）はＩＬ−６に付加されたポリエチレングリコール分子を開示している。１９８５年９月１１日付けで公表されたヨーロッパ特許第０１５４３１６号は、リンホカインと、ポリエチレングリコールのアルデヒドとの反応を報告している。ポリマーをタンパク質に結合する多くの方法は結合基として作用する部分を用いて行われる。しかしこのような部分は抗原性である。結合基を用いないトレシルクロリド法（Ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｍｅｔｈｏｄ）を利用できるが、トレシルクロリドを使用すると有毒な副生物を生成することがあるので、この方法は治療用製品を製造するのに利用することは難しい（Ａｈｅｒｎ．、Ｔ．およびＭａｎｎｉｎｇ、Ｍ．Ｃ．編集「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎｖｉｖｏｐａｔｈｗａｙｓｏｆｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」Ｐｌｅｎｕｍ社、米国ニューヨーク１９９１年のＦｒａｎｃｉｓらの報告およびＦｉｓｈｅｒら編集「ＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＵｓｉｎｇＡｑｕｅｏｕｓＰｈａｓｅＳｙｓｔｅｍｓ、ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＩｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク、１９８９年の２１１〜２１３頁のＤｅｌｇａｄｏらの論文「ＣｏｕｐｌｉｎｇｏｆＰＥＧｔｏＰｒｏｔｅｉｎＢｙＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＷｉｔｈＴｒｅｓｙｌＣｈｌｏｒｉｄｅ、ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＩｎＩｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙＣｅｌｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」参照）。Ｃｈａｍｏｗら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５巻、１３３〜１４０頁、１９９４年は、還元的アルキル化反応で行う、ＣＤ４免疫アドヘジン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）のモノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒドによる修飾を報告している。その著者らは、ＣＤ４−Ｉｇの５０％が、ＰＥＧ化度を制御できる条件下でＭｅＰＥＧで修飾されたと報告している（上記文献の１３７頁）。またこれらの著者は、修飾されたＣＤ４−Ｉｇの（タンパク質ｇｐ１２０に対する）生体外での結合能はＭｅＰＥＧ化度に相関する比率で低下すると報告している（上記文献参照）。およびタンパク質基質（インスリン）のＣ末端カルボキシル基に対するリンカー基カルボヒドラジドの選択的結合を報告するＲｏｓｅら、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２巻、１５４〜１５９頁１９９１年も参照）。しかし、特定のタンパク質に関する技術の現在の一般的な技術水準では、Ｇ− ＣＳＦのようなタンパク質のＮ末端に水溶性ポリマーを選択的に結合させることはできない。むしろ、現在の方法では、例えばリシン側基のような反応性基（タンパク質内のどこに位置しているかにかかわらず）またはＮ末端に非選択的に結合する。そのため不均一な混合物が生成する。例えば、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子の場合、いくつかの分子は、他の分子と異なる数のポリエチレングリコール部分を有している。例えば、５個のリシン残基を有するタンパク質分子が上記の方法で反応させると、ある分子は６個のポリエチレングリコール部分を有し、またある分子は５個、またある分子は４個、またある分子は３個、またある分子は２個、またある分子は１個のＰＥＧ部分を有し、またある分子はＰＥＧ部分をもっていない。そして、いくつかのポリエチレングリコール部分を有する分子において、そのポリエチレングリコール部分は、異なる分子と同じ位置に結合していないこともある。このことは、治療用のＰＥＧ化タンパク質製品を開発する場合不利である。このような開発を行う場合、生物活性を予知できることが重要である。例えば、スーパーオキシドジスムターゼとポリエチレングリコールの非選択的結合の場合、得られる修飾酵素のいくつかの画分は全く不活性であったと報告されている（Ｐ．ＭｃＧｏｆｆら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６巻、３０７９〜３０９１頁、１９８８年）。治療用のタンパク質がロット毎に組成が異なる場合、上記の予知を得ることができない。ポリエチレングリコール部分のいくつかは、ある位置では他の位置の場合と同様に安定に結合できないので、このようなＰＥＧ部分はタンパク質から解離することになる。勿論、このようなＰＥＧ部分がランダムに結合し、したがってランダムに解離する場合、治療用タンパク質の薬物動態を正確に予知することはできない。消費者からみれば、その循環時間はロット毎に変動するので投与量が不正確になる。メーカーから見ると、治療用タンパク質を販売するための法律上の承認を得るのに複雑さが加わる。その上に、上記の方法は、（タンパク質とポリマーの間に）結合部分なしでは選択的Ｎ末端化学修飾を行えない。結合部分を用いると、抗原性があるかもしれないので不利である。したがって、選択的にＮ末端が化学修飾されたタンパク質とその類似体が得られる方法が要望されている。そのタンパク質としてはＧ−ＣＳＦや共働性インターフェロンなどがあるがこれら２種の化学修飾されたタンパク質を以下に例示する。本発明はこの要望をいくつかの態様で検討するものである。発明の要約本発明は、Ｎ末端化学修飾タンパク質の実質的に均質な製剤とその製造方法に関する。予想外のことであったが、Ｇ− ＣＳＦのＮ末端を化学修飾すると、この分子の別の位置に一つの化学修飾がなされている他のＧ−ＣＳＦ種にはみられない、安定性の利点を示した。またも予想外であったが、Ｎ末端を化学修飾されたＧ−ＣＳＦを製造する本発明の方法で、還元的アルキル化反応を用いて、Ｎ末端を選択的に修飾する条件を提供することができ、かつこの方法はＧ−ＣＳＦのみならず他のタンパク質（またはその類似体）に広く適用できることが見出されたのである。また驚くべきことであるが、還元的アルキル化反応を用いると、最終生成物（水溶性ポリマーとのアミン結合を有するタンパク質）が、アミド結合を有する同じポリマー／タンパク質結合体よりはるかに安定であることが見出された。このように修飾された他の一つのタンパク質（下記実施例で説明する）は共働性インターフェロンである。したがって、一層詳細に以下に説明するように、本発明には、特定のタンパク質の特定の修飾のみならずタンパク質（またはその類似体）の化学修飾に関するいくつかの態様がある。一つの態様で、本発明は、Ｎ末端を化学修飾されたＧ−ＣＳＦ（またはその類似体）の実質的に均質な製剤および関連する方法に関する。下記の一実施例は、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ −ＣＳＦが他のタイプのモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦより安定であることを例証している。さらに、Ｇ−ＣＳＦ分子のＮ末端はポリエチレングリコールとの反応で利用し易いので、高比率のＮ末端がＰＥＧ化されるためこの分子種には加工面での利点がある。また本発明は、タンパク質またはその類似体のＮ末端残基のα−アミノ基を選択的に活性化して、そのＮ末端に水溶性ポリマー部分を選択的に結合させる一つのタイプの還元的アルキル化反応に関する。この方法によって、（ポリエチレングリコールが使用される場合）タンパク質部分に直接結合されたポリエチレングリコール部分を有するＰＥＧ化タンパク質分子の製剤のみならず、ポリマー／タンパク質結合分子の実質的に均質な製剤が提供される。Ｇ−ＣＳＦと共働性インターフェロンの場合についてこの方法を以下に説明するが、これらは本発明の追加の態様を提供する。図面の簡単な説明図１Ａは、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのイオン交換クロマトグラフィーから得たピークのクロマトグラムを図示したものである。図１ＢはモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの各種の分子種のＳＤＳ− ＰＡＧＥである。図２はＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールであり、（レーンＡ）：組換えヒトメチオニルＧ−ＣＳＦの標準品；（レーンＢ）：ＳＣＭ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦ反応混合物；（レーンＣ）：Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーンＤ）：リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；（レーンＥ）：リシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。図３Ａ、３Ｂおよび３ＣはＨＰＬＣエンドプロテイナーゼＳＶ８ペプチドマッチングトレーシングであり、図３ＡはＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；図３Ｂはリシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；および図３Ｃはリシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを示す。図４はモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種のｉｎｖｔｒｏ生物活性を非ＰＥＧ化標準品のそれと比較して示す棒グラフである。図５Ａと５ＢはモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体のｉｎｖｉｖｏ生物活性のアッセイ結果を示すグラフであり、図５Ａは、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン４１モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを一回皮下注射した後のハムスターの平均白血球数を示し、そして図５Ｂは上記の各種モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ誘導体を一回皮下注射した後の、正味の平均白血球数の曲線下面積を示す。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはリシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの安定性の試験結果のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールである。図６Ａと図６Ｂは、（６Ａ）Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたは（６Ｂ）リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った安定性試験のプロフィールを示す。図６Ｃは、リシン３５モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのｐＨ６．０で４℃にて行った時間を延長した安定性試験の結果を示すプロフィールである。時間（「Ｔ」）は日数を示す。図７は、ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦとメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＭＷ６ｋＤａ）との還元的アルキル化反応の過程での反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣによる分析結果を示す。図８は、ＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＷはやはり６ｋＤａ）を用いた反応混合物のサイズ排除ＨＰＬＣによる分析結果を示す。図９は、分子量が異なる（６ｋＤａ、１２ｋＤａおよび２０ｋＤａ）ＭＰＥＧアルデヒド類でｒｈ−Ｇ−ＣＳＦの還元的アルキル化を行うことによって製造したモノＮ末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する、一回の皮下投与後の全白血球応答を示す。詳細な説明本発明はＮ末端化学修飾蛋白の実質的に均質な調製物およびその製造方法に関する。１つの態様において、本発明はＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ組成物およびその製造方法に関する。本発明の方法（Ｎ末端修飾Ｇ−ＣＳＦの製造方法および本発明の還元的アルキル化方法の両方）は、モノポリマー／蛋白質結合体の実質的に均質な混合物を与えるものである。本明細書で使用する「実質的に均質な」という表現は、観察されるポリマー／蛋白質結合体分子のみが１つのポリマー部分を有するものであることを指す。調製物は未反応の（即ちポリマー部分を欠く）蛋白を含有してよい。ペプチド地図作成およびＮ末端配列決定により確認されるとおり、後述する１つの実施例は少なくとも９０％のモノポリマー／蛋白質結合体および最大１０％の未反応蛋白質であるような調製物を与えるものである。好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物質は、調製物の少なくとも９５％であり（後述する実施例に示す）、そして最も好ましくは、Ｎ末端モノＰＥＧ化物質は調製物の９９％以上である。モノポリマー／蛋白質結合体は生物学的活性を有する。ここに提供される本発明の「実質的に均質な」Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ− ＣＳＦ調製物は、例えばロット毎の薬物動態を推測することが臨床適用上容易であること等のような、均質な調製物の利点を示すのに十分均質であるものである。ポリマー／蛋白質結合体分子の混合物を調製することを選択してもよく、本発明により提供される利点は、混合物中に含有されるモノポリマー／蛋白質結合体の比率を選択してよい点である。即ち、所望により、種々の数の連結ポリマー部分（即ち、ジ−、トリ−、テトラ−等）を有する種々の蛋白の混合物を調製し、本発明の方法で調製したモノポリマー／蛋白質結合体物質と組合わせ、そして、所定の比率のモノポリマー／蛋白質結合体を得てよい。前記した通り造血疾患の治療に用いる治療用蛋白であるＧ−ＣＳＦを用いる実施例を以下に記載する。一般的に、本発明の実施に用いるＧ−ＣＳＦは哺乳類動物から単離された形態であるか、または、化学合成方法の生成物であるか、または、ゲノムまたはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成により得られる外来性ＤＮＡ配列の原核生物または真核生物の宿主発現による産物であってよい。適当な原核生物宿主には、種々の細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が包含され；適当な真核生物宿主には酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は、哺乳類またはその他の真核生物炭水化物によりグルコシル化されていてもよいし、または非グリコシル化形態であってもよい。Ｇ−ＣＳＦ発現産物はまた（−１位に）初期メチオニンアミノ酸残基を有してよい。とりわけＥ．ｃｏｌｉ由来の組み換えＧ−ＣＳＦが特に商業的な現実性が最も大きいという理由から好ましいものの、本発明は上記した形態のＧ−ＣＳＦのいずれかおよび全ての使用を意図したものである。特定のＧ−ＣＳＦ類似体は、生物学的機能性を有することが報告されており、これらはまた、例えば、１つ以上のポリエチレングリコール分子を付加することにより、化学修飾してよい。Ｇ−ＣＳＦ類似体は米国特許第４，８１０，６４３号に報告されている。生物学的活性を有することが報告されているその他のＧ−ＣＳＦ類似体の具体例は、開示された各類似体の活性に関する記載はないが、例えばＡＵ−Ａ−７６３８０／９１号、ＥＰ０４５９６３０号、ＥＰ０２７２７０３号、ＥＰ０４７３２６８号およびＥＰ０３３５４２３号に記載されている。またＡＵ−Ａ−１０９４８／９２、ＰＣＴＵＳ９４／００９１３号およびＥＰ０２４３１５３号も参照されたい。一般的に、本発明で有用なＧ−ＣＳＦおよびその類似体は、Ｎ末端αアミノ基を選択的に化学修飾するための本明細書に記載した化学修飾方法を実施し、得られた生成物が所望の生物学的特性を有するかどうかを、本明細書に記載した生物活性検定法などにより調べることにより確認してよい。当然ながら、非ヒト哺乳類を治療する際に所望により、組み換えネズミ、ウシ、イヌＧ−ＣＳＦ等のような組み換え非ヒトＧ−ＣＳＦを用いてよい。例えばＰＣＴＷＯ９１０５７９８号およびＰＣＴＷＯ８９１０９３２号を参照されたい。即ち、本発明の別の態様は、Ｎ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦ類似体組成物を包含する。前記したとおり、Ｇ−ＣＳＦ類似体には、アミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するようなものが包含される（後記する実施例１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較される）。Ｎ末端ＰＥＧ化された場合に好中球の生産を選択的に刺激するような機能を有すると予測されるようなＧ−ＣＳＦ類似体は、Ｇ−ＣＳＦ受容体への結合のために必要ではないＮ末端を有するものである。Ｈｉｌｌ等、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ９０：５１６７−５１７１（１９９３）およびＰＣＴＵＳ９４／００９１３参照。使用するポリマー分子は水溶性ポリマーから選択してよい。（本明細書に記載する還元的アルキル化のためには、ポリマーは単一の反応性アルデヒドを有さなければならない。）選択されたポリマーは、それに結合する蛋白が生理学的環境のような水性の環境で沈殿しないように、水溶性でなければならない。還元的アルキル化のためには、本発明の方法に関して記載したとおり重合度を制御できるように、選択されたポリマーは単一の反応性アルデヒドを有さなければならない。ポリマーは分枝鎖または非分枝鎖であってよい。好ましくは、最終製品調製物の治療上の使用のためには、ポリマーは薬学的に許容されるものである。当業者は、ポリマー／蛋白質結合体を治療に用いるのかどうかという判断、そして、そうであれば、所望の用量、循環時間、蛋白分解に対する耐性およびその他の判断に基づき、所望の重合体を選択できる。Ｇ−ＣＳＦについては、これらは本明細書に記載した検定方法を用いて確認してよく、そして、当業者は、その他の治療用蛋白のための適切な検定方法を選択しなければならない。水溶性ポリマーは例えば、上記したもの（発明の背景参照）、および、デキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールよりなる群からから選択してよい。後述するような最適化のための条件については、ポリマーはどのような分子量のものでもよく、そして、分枝鎖または非分枝鎖であってよい。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という表現は、ポリエチレングリコールの調製においては、記載した分子量よりも、一部の分子は高分子量、一部は低分子量になることを指す）。後述する実施例１および２は、ＰＥＧ６０００を使用しているが、これは精製が容易であり適当なモデル系が得られることから選択したものである。所望の治療特性（例えば所望の徐放性持続時間、作用、場合により生物学的活性、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または非抗原性、および、治療用蛋白または類似体に対するポリエチレングリコールのその他の知られた作用）に応じて、その他の大きさのものも使用しうる。本発明の１つの特定の態様は、ポリエチレングリコール部分およびＧ−ＣＳＦ部分を有するＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦである。本発明の組成物を得るためには、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝鎖状態等による）、反応混合物中のＧ−ＣＳＦ蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、実施するＰＥＧ化反応の種類、選択されたＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得るための方法、および使用するＧ−ＣＳＦの種類を適宜選択してよい。更に、本発明の組成物および方法は、医薬組成物の製造、治療および薬剤製造の方法を包含する。蛋白分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は、反応混合物中のその濃度の変化に応じて変化する。一般的に、最適な比率（未反応の蛋白またはポリマーが過剰に存在しないという反応の効率の点で）は選択されたポリエチレングリコールの分子量により決定される。更に、本発明の１つの実施例では非特異的ＰＥＧ化およびＮ末端モノＰＥＧ化種の後の精製を行なうため、比率は使用できる反応性の基の数により異なる（典施例では、一般的にモノＰＥＧ化物質を得るために蛋白：ＰＥＧ分子のかなり低い反応比を用いている（蛋白分子当たり１．５ＰＥＧ分子）。Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得るためには、ＰＥＧ化の方法は前記したような種々の方法から選択してよく、または、後述する実施例２に記載するとおり本発明の還元的アルキル化を用いてよい。ポリエチレングリコール部分と蛋白部分との間に連結基を用いない方法は、Ｆｒａｎｃｉｓ等の蛋白性薬剤の安定性：分解のｉｎｖｉｖｏ経路および蛋白安定化方法（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎｖｉｖｏｐａｔｈｗａｙｓｏｆｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、（Ｅｄｓ。Ａｈｅｒｎ．、ＴａｎｄＭａｎｎｎｉｎｇ、Ｍ．Ｃ）Ｐｌｅｎｕｍ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９１）に記載されている。あるいは、Ｄｅｌｇａｄｏ等の「トレシルクロライドを用いた活性化による蛋白へのＰＥＧのカップリング、免疫親和性細胞調製への応用（ＣｏｕｐｌｉｎｇｏｆＰＥＧｔｏＰｒｏｔｅｉｎＢｙＡｃｔｉｖａｔｉｏｎＷｉｔｈＴｒｅｓｙｌＣｈｌｏｒｉｄｅ，ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＩｎＩｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙＣｅlｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、Ｆｉｓｈｅｒ等編、水層系を用いた分離、細胞生物学およびバイオテクノロジーにおける応用、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．、１９８９、ｐｐ．２１１−２１３はトレシルクロライドを使用しており、このためポリエチレングリコール部分と蛋白部分との間には連結基が存在しない。この方法は、トレシルクロライドの使用により毒性副産物が形成されるため、治療用製品の製造のために使用するのは困難である。本発明の実施例の１つではカルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用している。後に詳細に記載するとおり、別の実施例では本発明の還元的アルキル化方法を用いている。Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ調製物を得るための方法（即ち必要に応じてこの部分を別のモノＰＥＧ化部分から分離すること）は、ＰＥＧ化Ｇ −ＣＳＦ分子の集団からＮ末端ＰＥＧ化物質を精製することにより行なうことができる。例えば、下記に示す例ではＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦをまずイオン交換クロマトグラフィーにより分離してモノＰＥＧ化物質の電荷特性を有する物質を得て（同じ見掛け上の電荷を有する別の多ＰＥＧ化物質が存在する場合がある）、そして次に、モノＰＥＧ化物質をサイズ排除クロマトグラフィーにより分離する。この方法では、Ｎ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが別のモノＰＥＧ化種並びに別の多ＰＥＧ化種から分離される。その他の方法も報告されている。例えば、１９９０年５月３日に公開されたＰＣＴＷＯ９０／０４６０６号はＰＥＧ含有水性２相系中でＰＥＧ／蛋白付加物を分配することを包含するＰＥＧ−蛋白付加物の混合物の分画方法を報告している。別の態様において、本発明は、Ｎ末端化学修飾蛋白（または類似体）を選択的に得るための方法を提供する。特定の蛋白における誘導体形成のために使用できる種々のタイプの第一アミノ基の反応性の差（リジンｖｓＮ末端）を利用した還元的アルキル化による蛋白修飾方法を以下に記載する。適切な反応条件のもとでカルボニル基含有ポリマーを用いてＮ末端において蛋白の実質的に選択的な誘導体形成を行なうことができる。反応は蛋白のリジン残基のεアミノ基とＮ末端残基のαアミノ基とのｐＫａの差を利用することができるようなｐＨで行なう。このような選択的誘導体形成により、水溶性ポリマーの蛋白質への結合が制御でき、ポリマーとの結合体形成は蛋白のＮ末端で主に起り、リジン側鎖アミノ基のようなその他の反応性の基の修飾はほとんど起らない。重要かつ意外な点は、本発明はその他の化学修飾方法を用いる場合に必要とされるような更に進んだ精製を行なうことなく、モノポリマー／蛋白結合体分子の実質的に均質な調製物を製造するための方法を提供する。また、アミン結合を有する生成物は、意外にも、アミド結合を用いて調製した生成物よりも安定であり、これは後に記載する凝集試験で明らかにされる。特に、ポリエチレングリコールを用いる場合は、本発明はまた、抗原性を有する可能性のあるような結合基を有さず、そして、蛋白部分に直接カップリングするポリエチレングリコール部分を有するＮ末端ＰＥＧ化蛋白を毒性副生成物を生じることなく、提供する。反応は以下に示すようなダイアグラムで説明できる（還元剤の例としてシアノホウ水素化ナトリウムを示した）。即ち本発明の１つの態様は、（ａ）アミノ基１つ以上を有する蛋白部分を、水溶性ポリマー部分と、還元的アルキル化条件下、上記蛋白部分のアミノ末端でα アミノ基を選択的に活性化させるのに適するｐＨで反応させることにより、上記水溶性ポリマーを上記αアミノ基に選択的に結合すること；および（ｂ）反応生成物を得ること、を包含するポリマー／蛋白結合体の製造方法である。場合により、そして治療用製品のためには好ましくは反応生成物を未反応部分から分離する。本発明の別の態様は、このような還元的アルキル化により、アミノ末端にαアミノ基を有するいかなる蛋白にも重合体を選択的に結合することが可能であり、そしてモノポリマー／蛋白結合体の実質的に均質な調製物が得られる点である。「モノポリマー／蛋白結合体」という用語は、本明細書においては、蛋白部分に結合した単一のポリマー部分を有する組成物を指す（更に、本明細書に記載する蛋白類似体を用いた結合体も包含される）。モノポリマー／蛋白結合体はＮ末端に位置するポリマー部分を有するが、リジンの場合のようなアミノ側鎖基には有さない。調製物は、好ましくは８０％を超えるモノポリマー／蛋白結合体、更に好ましくは９５％を超えるモノポリマー／蛋白結合体である。モノポリマー／蛋白結合体分子の実質的に均質な集団を得るためには、反応条件は、所望の蛋白のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にするようなものである。このような反応条件は一般的に、リジンアミノ基とＮ末端α− アミノ基におけるｐＫａの差を与える（ｐＫはアミノ基の５０％がプロトン化され、５０％がされないようなｐＨである）。一般的に、Ｎ末端のα−アミノ基の修飾を最適なものとするには、異なる蛋白に対し、異なるｐＨを用いることができる。ｐＨは使用する蛋白に対するポリマーの比率にも影響を及ぼす。一般的に、ｐＨがｐＫより低い場合は、蛋白に対してより大過剰のポリマーが必要である（即ち、Ｎ末端α−アミノ基の反応性が低いほど、最適な条件を達成するためにはより多くのポリマーが必要になる）。ｐＨがｐＫより高い場合は、ポリマー：蛋白の比はそれほど大きくなる必要は無い（即ち、より多くの反応性の基が使用できるため、必要なポリマー分子数は少なくなる）。もう１つの重要な条件はポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が高いほど、蛋白に結合するポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適にする際には、ポリマーの分枝鎖状態を考慮しなければならない。一般的に、分子量が高いほど（または分枝鎖が多いほど）、ポリマー：蛋白の比は大きくなる。本発明の還元的アルキル化のためには、還元剤は水溶液中で安定であることが必要であり、好ましくは、還元的アルキル化の最初の工程で形成されるシッフ塩基のみを還元することができるものである。好ましい還元剤は、ナトリウムボロハイドライド、ナトリウムシアノボロハイドライド、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンよりなる群から選択される。後述する実施例ではナトリウムシアノボロハイドライドを用いた。水溶性ポリマーは上記した種類のものであってよく、そして、蛋白にカップリングするための単一の反応性アルデヒドを有するものでなければならない。ポリエチレングリコールについては、Ｇ−ＣＳＦへのカップリングにはＰＥＧ６０００、コンセンサスインターフェロンに対してはＰＥＧ１２０００の使用を以下に記載している。ただし、Ｇ−ＣＳＦの場合は、ＰＥＧ１２０００、２００００および２５０００も本発明の方法で良好に使用される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（例えば米国特許第５，２５２，７１４号参照）は水中の安定性の点で好都合である。前記したとおり、本発明の方法はＮ末端α−アミノ基を有するいかなる蛋白またはその類似体にも広範に適用できる。例えば、細菌内で発現された外来性ＤＮＡ配列の産物であるような蛋白は、細菌による発現の結果として、α−アミノ基を有するＮ末端メチオニル残基を有している。前記したとおり、ペプチド、並びにペプチド類似物およびその他の修飾蛋白も包含される。上記したＧ−ＣＳＦ類似体のような蛋白類似体、および非天然コンセンサスインターフェロンも本発明の方法に適している。即ち、本発明のＮ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦのためには、本明細書に記載したいずれのＧ−ＣＳＦまたは類似体も使用できる（例えば上記したもの）。後述する実施例では、１７４アミノ酸および余分にＮ末端メチオニル残基を有する細菌生産組み換えＧ−ＣＳＦを用いる。本明細書に記載するとおり、化学修飾は本明細書に記載するいずれの水溶性ポリマーを用いて行ってもよく、実施例ではポリエチレングリコールの使用を記載した。コンセンサスインターフェロンは本発明の実施例で使用されるもう１つの蛋白である。Ｎ末端モノＰＥＧ化のための本発明の還元的アルキル化方法を用いた化学修飾コンセンサスインターフェロンの調製を以下に記載する。即ち、本発明の別の態様は、これらの調製に関する。本発明においては、「コンセンサスインターフェロン」または「ＩＦＮ−ｃｏｎ」と記載するコンセンサスヒト白血球インターフェロンは、非天然のポリペプチドであり、全ての天然のヒト白血球インターフェロンサブタイプ配列に共通のアミノ酸残基を主に含んでおり、全てのサブタイプに共通なアミノ酸を含まない１つ以上の位置に、その位置に主に生じるアミノ酸であって且つ、少なくとも１つの天然のサブタイプの該位置に存在しないアミノ酸残基を有することがないアミノ酸を含む、ものである。ＩＦＮ−ｃｏｎには、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁，ＩＦＮ−ｃｏｎ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃という名称のアミノ酸配列が包含され、これらは、同一の譲受人の米国特許第４，６９５，６２３号および４，８９７，４７１号に開示されており、これら明細書の記載内容全体は参考のために本明細書に組み込まれる。（米国特許第４，８９７，４７１号および４，６９５，６２３号は本明細書で使用していない名称「α」を使用している。）ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記した特許に記載された通り、あるいは、その他の標準的な方法で合成してよい。ＩＦＮ−ｃｏｎポリペプチドは好ましくは、細菌宿主、特にＥ．ｃｏｌｉにトランスフォームまたはトランスフェクトされた合成ＤＮＡ配列の発現産物である。即ち、ＩＦＮ−ｃｏｎは組み換えＩＦＮ−ｃｏｎである。ＩＦＮ−ｃｏｎは好ましくはＥ．ｃｏｌｉ中で生産され、当該分野で良く知られ、そして、一般的にはＩＦＮ−ｃｏｎ₁についてＫｌｅｉｎ等のＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．４５４：２０５−２１５（１９８８）に記載された方法により精製される。精製されたＩＦＮ−ｃｏｎはイソフォームの混合物を含有し、例えば精製ＩＦＮ−ｃｏｎ₁はメチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁，脱メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁およびブロックされたＮ末端を有する脱メチオニルＩＦＮ−ｃｏｎ₁の混合物を含有する（Ｋｌｅｉｎ等、Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６：５３１−５３７（１９９０））。あるいは、ＩＦＮ−ｃｏｎは特定の単離されたイソフォームを含有する。ＩＦＮ−ｃｏｎのイソフォームは当業者の知る等電点電気泳動のような方法で相互に分離される。即ち、本発明のもう１つの態様は、コンセンサスインターフェロン部分がＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ−ｃｏｎ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃よりなる群から選択される化学修飾コンセンサスインターフェロンである。化学修飾は、ＰＥＧのような本明細書に記載する水溶性ポリマーを用いて行ない、本発明の還元的アルキル化方法を用いて選択的Ｎ末端化学修飾を行なってよい。本明細書に記載する実施例３は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ１２０００）にＮ末端で結合されたＩＦＮｃｏｎ₁部分を有する化学修飾ＩＦＮｃｏｎ₁を説明するものである。もう１つの態様において、本発明の方法は、ポリエチレングリコール部分が蛋白部分に直接結合し、別の連結基が存在せず、毒性副生成物が存在しないようなＰＥＧ化蛋白を提供する。実施例は本明細書に記載するとおりＧ−ＣＳＦおよびコンセンサスインターフェロンを含んでいる。ポリエチレングリコール部分がＧ −ＣＳＦ蛋白部分に直接結合しているようなＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ蛋白分子の集団（Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子の集団である必要はない）を得るためには、酸性ｐＨを用いるか、又は用いることなく、上記還元的アルキル化を実施してよい。本発明の更に別の態様においては、上記物質の医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は注射による投与、または経口投与、肺投与、経鼻投与またはその他の投与形態であってよい。一般的に、本発明が意図するものは、本発明のモノポリマー／蛋白結合体生成物の有効量を薬学的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体と共に含有する医薬組成物である。このような組成物は、種々の緩衝物質成分（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えばチメルソール、ベンジルアルコール）および増量剤（例えば乳糖、マンニトール）のような添加物；ポリ酢酸、ポリグリコール酸等のような重合体化合物の粒状調製物への、または、リポソームへの活性物質の配合を含む。このような組成物は、本発明のＮ末端化学修飾蛋白の物理的性状、安定性、ｉｎｖｉｖｏ徐放性、およびｉｎｖｉｖｏクリアランス速度に影響する。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ、１８版（１９９０、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１８０４２）の１４３５ −１７１２ページに記載されており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる。本発明の更に別の態様において、治療方法および医薬の製造方法が提供される。本発明のポリマー／Ｇ−ＣＳＦ結合体（または天然のＧ−ＣＳＦの造血生物作用を有する類似体）の投与により軽減または調節される症状は、典型的には、低下した造血または免疫機能、特に低好中球数により特徴づけられる症状である。このような症状は、化学療法または放射線療法のような他の目的のための治療の過程として誘発される。このような症状は、細菌、ウィルス、カビまたはその他の感染性疾患のような感染症に起因する場合がある。例えば、敗血症は細菌感染から生じる。あるいは、このような症状は、重度の慢性好中球減少症または白血病のように、遺伝的または環境的に誘発される。成人病分野では患者は低好中球数または低好中球運動性を有するため、年齢も重要な因子である。このような症状の一部は、Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）、ＣｉｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｍｏｒｓｔｙｎ、Ｇ．およびＴ．Ｍ．Ｄｅｘｔｅｒ、ｅｄｓ．、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．（１９９３）、３５１頁に記載されている。本発明のポリマー／Ｇ−ＣＳＦ結合体の投与により軽減または調節されるようなその他のあまり研究されていない症状には、Ｇ−ＣＳＦがプラスミノーゲン活性化物質の産生を誘発することから、血流中の脂質（またはコレステロール）の低下、および特定の心臓血管症状が包含される。これらの分野におけるＧ−ＣＳＦ（または類似体）の作用様式は、現時点では十分解明されていない。ポリエチレングリコールのような水溶性ポリマーを付加することは、生物活性の持続により治療過程当たりのＧ−ＣＳＦ注射の回数が少なくできるため、実際の患者に利益をもたらすものである。一般的に、本発明のポリマー／コンセンサスインターフェロンの投与により軽減または調節されるような症状は、コンセンサスインターフェロンが適用可能な症状であり、細胞増殖疾患、ウィルス感染、および多発性硬化症のような自己免疫疾患が包含される。ＭｃＭａｕｓＢａｌｍｅｒ、ＤＩＣＰ、ＴｈｅＡｎｎａｌｓｏｆＰｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ２４：７６１−７６７（１９９０）（ガン治療における生物応答調節剤の臨床使用：概説、第Ｉ部、インターフェロン）参照。コンセンサスインターフェロンを用いた細胞増殖疾患の治療のための方法および組成物は、１９９２年４月３０日公開のＰＣＴＷＯ９２／０６７０７号に記載されており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる。例えば、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）は本発明のＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン分子を用いて治療可能である。後述する実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏで化学修飾されたコンセンサスインターフェロンは非化学修飾コンセンサスインターフェロンの生物活性の２０％を有している。上記した分子の全てについて、更に研究を実施するに従って、種々の患者の種々の症状の治療のための適切な用量に関する情報が得られ、そして、当業者は、治療内容、投与対象の年齢および全身状態を考慮しながら、適切な用量を確認することが可能であろう。一般的に、注射または注入のためには、用量は０．０１ μｇ／ｋｇ体重（化学修飾しない蛋白のみの質量を計算）〜１００μｇ／ｋｇ（同じ計算に基づく）である。以下に記載する実施例は、上記した種々の態様を説明するものである。実施例１では、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの利点を（Ｇ−ＣＳＦｍｅｔ＋１７４アミノ酸型の）リジン−３５またはリジン−４１でモノＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦと比較しながら説明する。実施例２はＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦにおける本発明の還元的アルキル化を説明するものである。この方法はＮ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な調製物を与える。実施例３はＮ末端ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの本発明の還元的アルキル化を説明するものである。実施例１Ａ．組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの調製組換えヒトｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（本明細書では“ｒｈＧ−ＣＳＦ”または“ｒ −ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ”と呼ぶ）は、上述のようにＳｏｕｚａ特許、米国特許第４，８１０，６４３号にある方法に従って調製した。この特許は参考として本明細書に組み入れる。使用したｒｈＧ−ＣＳＦは、以下に示す（ＤＮＡ配列によってコードされる）アミノ酸配列をもつＥ．ｃｏｌｉ由来の組換え発現産物であった（配列番号１および２）：（これはまた対照動物に使用した非Ｐｅｇ化組成物でもあっ使用してもよい（このパッケージに入っているものは、本明細書に参考として組み入れる）。Ｂ．Ｐｅｇ化Ｇ−ＣＳＦの調製１０ｍｇ／ｍｌの上記ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ溶液を１００ｍＭＢｉｃｉｎｅｐＨ８．０に溶かした溶液を、平均分子量が６０００ダルトンの固体のＳＣＭ−ＭＰＥＧ（カルボキシメチルメトキシポリエチレングリコールのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル）（ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ）に添加した。これによってｒｈ−Ｇ−ＣＳＦよりもＳＣＭ−ＭＰＥＧが１．５モル過剰になった。１時間軽く攪拌した後、滅菌水で混合液を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、希釈したＨＣｌによってｐＨを４．０に調整した。反応は室温で起こさせた。この段階で反応混合物は主に３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦから構成されており、その他、ジＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、未修飾のｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、および反応の副産物（Ｎ−ヒドロキシスクシニミド）が含まれていた。Ｃ．Ｎ末端ＰＥＧ化ｒＨ−Ｇ−ＣＳＦの調製３形態のモノＰＥＧ化ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦは、イオン交換クロマトグラフィによって別々に分離した。反応混合液を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）で平衡化しているＰｈａｒｍａｃｉａＳセファロースＦＦカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＸＫ５０／３０リザーバ、ベッド容量４４０ｍｌ）に添加した（１ｍｇ蛋白質／ｍｌ樹脂）。カラムを３カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。蛋白質は０〜２３％の直線勾配の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１ＭＮａＣｌ）を１５カラム容量用いて溶出した。次に１カラム容量の１００％緩衝液Ｂでカラムを洗浄し、３カラム容量の緩衝液Ａで再度平衡化させた。操作全体の流速は８ｍｌ／分に維持した。溶離剤を２８０ｎｍでモニターし、５ｍｌの分画を収集した。モノＰＥＧ化した個々の分子種を含む分画は、図１Ａに従ってプールした。このようにプールした液をＹＭ１０７６ｍｍメンブランを使った３５０ｍＬＡｍｉｃｏｎ攪拌セルを使って濃縮した。モノＰＥＧ化分子種からジＰＥＧ化分子種を分離するため、イオン交換クロマトグラフィで得たプールした分画をサイズ排除クロマトグラフィにかけた。一般に、５〜１０ｍｇが入った２〜５ｍｌの溶液を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０で平衡化した１２０ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１６／６０カラムに添加した。カラムを１．５ｍｌ／分で１００分間操作し、２ｍｌの分画を収集した。溶離剤の蛋白質含有量を２８０ｎｍでモニターした。分離されたピークの分画をプールして分析にかけた。以下の表は各ピークの収量比率を比較したものである。このような条件下では、位置１７および２４にあるリジンは多分有意にＰＥＧ化されなかったと思われる。Ｄ．特性化各サンプルの特性を知るために５種類の分析を実施した：（１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（図１Ｂ）、（２）サイズ排除クロマトグラフィＨＰＬＣ（“ＳＥＣＨＰＬＣ”）（図２）、（３）ペプチドマッピング分析（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ）、（４）ｉｎｖｉｔｒｏＧ−ＣＳＦバイオアッセイ（図４）、および（５）ハムスターを用いたｉｎｖｉｖｏ試験（図５Ａおよび５Ｂ）。Ｎ末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦの各サンプルの組成に関する分析結果は、９５％以上がＮ末端にＰＥＧ化しており、残りは多分ＰＥＧ化していない物質だろうということを実証するものである（サンプルの残りはアッセイの検出限界より低かったが）。３種類のモノＰＥＧ化物質（Ｎ末端、リジン３５でのＰＥＧ化、リジン４１でのＰＥＧ化）の各々について、モノＰＥＧ化の割合を調べたところ、Ｎ末端およびリジン４１は９７％以上がモノＰＥＧ化されており、リジン３５でのＰＥＧ化物質はこれよりいくらか低かった。これは多分、アッセイ条件において分子が不安定であることによると思われる。以上をまとめると次の結果が得られた：方法１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは非還元４〜２０％ＩＳＳＤａｉｉｃｈｉＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ（東京）のミニゲルにおいて、コーマシーブリリアントブルーＲ−２５０染色剤を用いて実施された。ゲルはＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いた動的分子濃度計によってスキャンした。結果：結果は図１Ｂに示してある。レーン番号１（左から数えて）には蛋白質の分子量標準（ＮｏｖｅｘＭａｒｋ１２分子量標準）が入っていた。レーン２には３μｇのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ標準が含まれている。レーン３には１０μｇのＳＣＭ−ＰＥＧ−ＧＣＳＦ反応混合液が入っている。レーン４には１０μｇのＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが含まれている。レーン５にはＮ末端のメチオニンからの３５番目の残基に見出されたリジンにＰＥＧ化したモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが１０μｇ入っている。レーン６にはＮ末端のメチオニンから４１番目の残基に見出されたリジンにＰＥＧ化したモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが１０ｐｇ含まれている。図から分かるように、Ｎ末端にモノＰＥＧ化した物質が含まれているレーン３はバンドが一つである。２．サイズ排除クロマトグラフィー高圧液体クロマトグラフィー。ＳＥＣ−ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣシステム、ＢｉｏｓｅｐＳＥＣ３０００カラム、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．９を用いて、１ｍｌ／分の流速で２０分間実施した。シグナルは２８０ｎｍでモニターした。結果：図２から分かるように、Ｎ末端にモノＰＥＧ化したｒｈ −Ｇ−ＣＳＦを含むライン“Ｃ”はピークが１個であり、ライン“Ｄ”（リジン３５にモノＰＥＧ化した物質）および“Ｅ”（リジン４１にモノＰＥＧ化した物質）もやはりピークが１個であった。これはモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦから分離した分画は純度が実質的に高いことを示している。３．ペプチドマッピング。次の方法を用いた。“モノ−ＰＥＧ−１”、“モノ− ＰＥＧ−２”、“モノ−ＰＥＧ−３”と呼ばれる３つのサンプルを分析した。（ａ）還元アルキル化。モノ−ＰＥＧＧ−ＣＳＦの５００μｇのアリコートを高速真空乾燥し、６Ｍの塩酸グアニジンと１ｍＭのＥＤＴＡを含む０．３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）で濃度１ｍｇ／９５０μｌに再構成した。次にサンプルにヨード酢酸を加えてＳ−カルボキシメチル化し、３７℃で２０分間インキュベートした。次にＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＰｒｏｔｅｉｎカラムを用いてサンプルを脱塩し、緩衝液を交換した。脱塩しバッファ交換した後、緩衝液を追加することによってサンプルの濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調整した。（ｂ）エンドプロテイナーゼＳＶ８消化。サンプルはＳＶ８を用いて２５℃で２６時間消化した（酵素と基質の比は１：２５）。（ｃ）ＨＰＬＣペプチドマッピング。蛋白質消化物をＶｙｄａｃＣ４カラム（４．６×２００ｍｍ、粒子サイズ５μ、孔径３００Å）に注入し、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリルの直線勾配を用いて、ペプチドをＨＰＬＣによってマッピングした。ペプチドを手で収集し、配列分析のために高速真空乾燥した。結果：参照標準と比較して、（ｉ）（図３Ａ）“モノ−ＰＥＧ−１”（Ｎ末端モノＰＥＧ化物質）の場合、ピークは５７．３分で消え、７７．５分で新しいピークが現れた；（ｉｉ）（図３Ｂ）“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５にＰＥＧ化した物質）の場合、リテンションタイム３０．３分のペプチドのピーク高さが低下し、６６．３分に新しいピークが溶出された；（ｉｉｉ）（図３Ｃ） “モノ−ＰＥＧ−３”（リジン４１にＰＥＧ化した物質）の場合、リテンションタイム３０．３分のピークはなく、６６．４分に新しいピークが現れた。これらのペプチドはサンプルマップでの唯一の有意な差であった。わずかな消化の差のために、８６．１分のペプチドの一方の側にいくらか、小さい不完全な切断があった。（ｄ）Ｎ末端の配列分析。上記のマップに現れた“新しい”ペプチドの各々を、同定のためＮ末端を配列分析した。乾燥したペプチドを０．１％ＴＦＡで再構成し、ＡＢＩ蛋白質シーケンサで配列決定した。“ モノ−ＰＥＧ−１”（Ｎ末端にＰＥＧ化した物質）の場合、“新しい”ピーク（７７．５分）の６０％が１０サイクルで配列決定された。初期収率は５％未満であったが、これはＮ末端のメチオニル残基がポリエチレングリコール分子によってブロックされていることを示している。この最初のペプチドは初期収率が０％となるはずであったが、収率が５％未満であったのは、配列分析中にＮ末端のメチオニルからポリエチレングリコールが脱着した結果かもしれない。検出された配列は、Ｎ末端ペプチドのものでＭ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｓであった。“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５にＰＥＧ化した物質）の場合、総ピーク体積の８０％が６６．３分のピークに集まり、９サイクルで配列決定された。リジン３５の回収率は有意に低かったが、これは位置３５でのＰＥＧ化を示している。リジン４１の回収率はその他の残基と同じくらいで、この位置では修飾が行われていないことを示唆していた。３０．３分のペプチドは、標準参照マップの対応するピークと比べて、ピーク高さが低かった。３０．３分のペプチドは、対応するペプチドのピーク面積の５７．５％しかなかった。この分子種で検出された配列はＫ−Ｌ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであった。“モノ−ＰＥＧ−３”（リジン４１にＰＥＧ化した物質）の場合、６６．４分に溶出したペプチドについて収集された総ピーク体積の８０％が９サイクルで配列決定された。検出された配列はＫ−Ｌ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｋ−Ｌであり、リジン残基３５および４１を含んでいた。リジン３５の回収率は他の残基の回収率と同じであった。リジン４１の回収率は有意に低く、これは位置４１でのＰＥＧ化を示していた。結果：“モノ−ＰＥＧ−１”はＮ末端にモノＰＥＧ化された物質である；“モノ−ＰＥＧ−２”はリジン３５に一部ＰＥＧ化された物質である；また“ モノ−ＰＥＧ−３”はリジン４１にＰＥＧ化された物質である。参照標準（非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）とＧＣＳＦモノＰＥＧ化１、２、３のペプチドマップを比較することによって、“モノ−ＰＥＧ−２”（リジン３５）と“モノ−ＰＥＧ−３ ”（リジン４１）のマップは、Ｎ末端ペプチドよりもピーク高さがわずかに低いことが分かった。これはリジン３５およびリジン４１物質に少量のＮ末端ＰＥＧ化物質が含まれていること、またはＮ末端のメチオニンのＰＥＧ化率が低いことを示唆している。４．Ｉｎｖｉｔｒｏ活性。物質は活性であった。図４はｉｎｖｉｔｒｏアッセイの結果を表している。記載の通り、Ｎ末端モノＰＥＧ化された物質の活性は、未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦの活性の６８％であった。方法：Ｇ−ＣＳＦのｉｎｖｉｔｒｏバイオアッセイはマウス３２Ｄ細胞のＧ− ＣＳＦ依存クローンを利用する細胞分裂アッセイである。細胞を５％のＦＢＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦが入ったＩｓｃｏｖｅｓ培地に入れて維持した。サンプルを加える前に、ｒｈＧ−ＣＳＦを含まない成長培地で細胞を２回洗浄した。４８から０．５ｎｇ／ｍｌ（４８００〜５０ＩＵ／ｍｌに相当）までの長い１２ポイントのｒｈＧ−ＣＳＦ標準曲線を作製した。標準曲線の直線部分（１０００〜３０００ＩＵ／ｍｌ）に入ると予想される４つの希釈液を各サンプルについて調製し、それぞれ３回ずつランした。これらの物質の見かけのｉｎｖｉｔｒｏ活性は低いため、ＰＥＧ化したｒｈＧ−ＣＳＦサンプルを約４〜１０倍に希釈した。各希釈度のサンプルまたは標準４０μｌを、１０，０００細胞／ウェルを含む９６ウェル・マイクロタイタープレートの適当なウェルに添加する。３７℃、５．５％ＣＯ₂という条件下に４８時間置いた後、各ウェルに０．５μｍＣｉのメチル−³Ｈ−チミジンを追加した。１８時間後、プレートを収穫し、カウントした。用量応答曲線（ｒｈＧ− ＣＳＦ濃度の対数（ｌｏｇ）ｖｓＣＰＭ−バックグラウンド）を作成し、標準曲線の直線部分に入るポイントについて、直線回帰分析を行った。未知のテストサンプルの濃度は、得た直線式を使って求め、希釈率について補正した。結果：結果は図４に示した。記載の通り、３種類のモノＰＥＧ化種のうちＮ末端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦのｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性が最高である。５．Ｉｎｖｉｖｏ活性。Ｉｎｖｉｖｏ試験によってＮ末端にＰＥＧ化した物質の活性を確認した。Ｉｎｖｉｖｏ試験は０．１ｍｇ／ｋｇのサンプルを１回皮下注射によって雄のゴールデンハムスターに投与することによって行った。１群、１時点当り４匹の動物から末梢血液を採取した。血清検体は採血当日に完全血球算定にかけた。平均白血球数を計算した。図５Ａおよび５Ｂから分かるように、各物質による反応は、０．１ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射の翌日後に最大に達している。２つのモノＰＥＧ化物質（Ｎ末端とリジン３５）は反応時間が長く、一方リジン４１で蛋白質をＰＥＧ化した物質の反応は未修飾ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎｖｉｖｏ活性より高くなかった（実際低い、図５Ｂ）。これらの結果は、ポリエチレングリコール分子を１個結合させることによって、蛋白質の治療プロフィールが劇的に変化する可能性があり、蛋白質をＰＥＧ化することの利点は修飾の部位に依存する可能性があることを示唆している。（単回皮下注射後の曲線下の正味平均ＷＢＣ面積（ＣＲＣＳｔａｎｄａｒｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃａｌＴａｂｌｅｓ、２６ｔｈＥｄ．（Ｂｅｙｅｒ、Ｗ．Ｈ．、Ｅｄ．）ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ１９８１．Ｐ．１２５）に従って算出）は、リジン３５とＮ末端のモノＰＥＧ化種では類似していた。）Ｅ．安定性試験更に、上述のように調製したＮ末端およびリジン３５にモノＰＥＧ化した分子種について、安定性試験を実施した。（リジン４１物質は、活性が未修飾Ｇ−ＣＳＦを上回らないことが実証されたため使用しなかった）。これらの試験によって、Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦがもう一方のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦであるモノＰＥＧ化リジン３５と比べて、保管中に予想外に安定していることが実証された。安定性はＳＥＣ−ＨＰＬＣを使って視覚化させた生成物の分解という点で評価した。方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦとリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦを、ｐＨ４．０およびｐＨ６．０という２種類のｐＨ、温度４℃の下でそれぞれ最高１６日間保管した。ｐＨを６．０に上げると、加速安定性試験の環境ができあがる。ｐＨ６．０のサンプルの場合、上述のように調製した、Ｎ未端にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦおよびリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦを、２０ｍＭの燐酸ナトリウム、５ｍＭの酢酸ナトリウム、２．５％マンニトール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むｐＨ６．０の緩衝液に入れ、最終蛋白質濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌとなるようにした。このアリコート１ｍｌを３ｍｌの滅菌済み注射用バイアルに入れて保管した。バイアルは各々４℃および２９℃において最高１６日間保管した。安定性はＳＥＣ−ＨＰＬＣトレーシングによって評価した。後の測定値が最初（時間＝０）の測定値と同じであった場合（肉眼検査によって確認）、そのサンプルはその期間だけ安定していたと見なされた。結果：結果は図６Ａ〜６Ｃに示した。（ａ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図６ＡはＮ末端にモノＰＥＧ化したＧ− ＣＳＦをｐＨ６、４℃で保管した場合のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示しており、図６Ｂはリジン３５にモノＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦをｐＨ６、４℃で保管した場合のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示している。リジン３５物質は分解されて、未修飾Ｇ−ＣＳＦと類似の分子量の物質になりつつあると解釈できる。（ｂ）ｐＨ４．０、温度４℃での長期保管。ＰＨ４．０、温度４℃という条件は、Ｎ末端種が分解を示さない比較的安定した条件を示すある種の対照を提供する。リジン３５種の場合、物質の分解がまだ起こっているが、速度はかなり遅い。（ｃ）ｐＨ６．０、温度４℃での比較。図６Ｃはこのような条件下に長期間保管した場合のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示している。記載の通り、ｐＨ６．０、温度４℃の場合、リジン３５物質は１６日目または３５日目では、６日目に観察されたもの（図６Ｂ）を上回る脱ＰＥＧ化は観察されなかった。これはこのような条件下では６日目を越えても脱ＰＥＧ化（不安定性）に変化がないことを示している。実施例２この実施例は、還元アルキル化を用いて実質的に均質なモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ群を調製する方法、およびこの群の特徴を示している。上記実施例で説明した組換えＧ−ＣＳＦを使用した。記載のように、この方法は、Ｎ末端を化学的に修飾した物質の収率という点で利点があるだけでなく、この還元アルキル化法のアミン結合は実質的に安定した生成物を産生するという利点がある。これは保存後の凝集の程度に大きな差があることによって実証される。Ａ．Ｎ末端のα−アミノ残基に結合させたモノ−メトキシポリエチレングリコール−ＧＣＳＦ結合体の調製２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ₃を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ５）中の、冷却し（４℃）攪拌したｒｈＧ−ＣＳＦ溶液（１ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、上記実施例のところで説明済み）に、５倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＭＰＥＧ）（平均分子量、６ｋＤａ）を加えた。同じ温度で反応混合物を攪拌し続けた。反応中に蛋白質の修飾がどの程度起こったかは、Ｂｉｏ−ＳｉｌＳＥＣ２５０−５カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてＳＥＣＨＰＬＣによってモニターした。溶離剤には０．０５ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ 、０．０５ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＮ₃ をｐＨ６．８にて用い、流速は１ｍｌ／分とした。１０時間ＳＥＣＨＰＬＣ分析を行った結果、蛋白質の９２％がモノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体に変換されていることが分かった。これは蛋白質濃度（Ａ₂₈ ₀ における吸光度によって決定）の記録である図７から分かる。この図からは、８．７２分にモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの溶離ピークがあり、また９．７８分に溶離する未反応Ｇ−ＣＳＦのマイナーピークがあることが分かる。図８はＭＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステルを用いて得たピークを示している。分子量は約６ｋＤａであった。図から分かるように、この反応によって得られた混合物は次のとおりであった：トリ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（約７．２５分のところにショルダー）、ジ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（７．６２分にピーク）、モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体（８．４３分にピーク）、および未反応のＧ−ＣＳＦ（９．８７分にピーク）。蛋白質の９２％がモノＰＥＧ化物質に変換されたこの１０時間の時点で、反応混合物のｐＨを１００ｍＭのＨＣｌでｐＨ４に調整し、反応混合物を１ｍＭのＨＣｌで５倍に希釈した。モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／１０ＳセファロースＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、イオン交換クロマトグラフィによって精製した。反応混合物をカラムに添加して流速１ｍｌ／分でランし、同緩衝液を３カラム容量用いて未反応のＭＰＥＧアルデヒドを溶出した。次に１ＭのＮａＣｌを含む０％〜４５％直線４００分勾配の２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を用いて、４℃において蛋白質−ポリマー結合体を溶出した。モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体を含む分画をプールして濃縮し、滅菌濾過した。同様にして、種々の平均分子量（１２、２０、２５ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドでｒｈ−Ｇ−ＣＳＦを修飾することによって得られる様々なモノ−ＭＰＥＧ −ＧＣＳＦ結合体を調製した。Ｂ．モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分析１．分子量モノＰＥＧ化結合体における分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、マトリックスアシステッドレーザーデソープション質量分析、平衡遠心分離によって求めた。結果は以下の表４に示した。調製したＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体の構造は、Ｎ末端の蛋白質シーケンシングとペプチドマッピングによって確認した。Ｎ末端のメチオニル残基の臭化シアン切断の結果、ポリエチレングリコールが除去された。２．生物学的活性ＰＥＧ化ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性は、³Ｈチミジンのマウス骨髄細胞への刺激取り込みを測定することによって求めた。Ｉｎｖｉｖｏ生物学的活性は、ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体またはｒｈＧ−ＣＳＦ（１００ｍｇ／ｋｇ）をハムスターに皮下注射し、総白血球数を測定することによって求めた。非誘導体化Ｇ−ＣＳＦと比較した生物活性は、ベヒクル（媒体）の対照曲線を引き算した後のＷＢＣ／時間曲線下の面積として計算した。ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ誘導体の相対的生物活性は、未修飾Ｇ−ＣＳＦと比較した生物活性のパーセンテージとして表した。これは、様々な分子量（６ｋＤａ、１２ｋＤａ、および２０ｋＤａ）のＭＰＥＧアルデヒドによるｒｈＧ−ＣＦの還元アルキル化によって調製したモノ−Ｎ末端ＭＰＥＧ−ＧＣＳＦ結合体に対する総白血球反応を示す図９に示してある。図から分かるように、モノＰＥＧ化分子はすべて反応を誘導した。使用したポリエチレングリコールの分子量が高いほど、白血球数が多くなった。但し、１２ｋＤａ型は２日目において２０ｋＤａ型と比較して、白血球数がわずかに多いだけであった。３．安定性試験２種類の化学的方法（アミドｖｓ還元アルキル化のアミン）によって調製したＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦの凝集程度を比較した。予想外のことだが、アミン化学を用いてＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦは、アミド結合によってＮ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦよりもかなり安定していることが分かった（ＮＨＳ化学反応は実施例１に説明済み）。方法：Ｎ末端にＰＥＧ化したＧ−ＣＳＦサンプルはどちらも、５％ソルビトールを含む１０ｍＭのＮａＯａｃ（ｐＨ４．０）に濃度１ｍｇ蛋白質／ｍｌで含まれていた。Ｇ−ＣＳＦはどちらもＰＥＧ６０００でＰＥＧ化した。アミド結合結合体は実施例１のとおりに調製し、アミン結合結合体は実施例２のとおりに調製した。各々６個ずつのサンプルを４５℃において８週間保存した。８週目の終りにサイズ排除クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィによって凝集程度を判断した。結果：現在の還元アルキル化法は、驚くべきことに高温で８週間保存した後も凝集が遥かに少ない物質を生成し、アセチル化よりも利点があることが実証された。以下の表は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）またはイオン交換（ＩＥ）を用いて得た、両方の物質の非凝集物質（“メインピーク”物質）の割合を示している：実施例３この実施例は化学的修飾コンセンサスインターフェロンを実証するものである。もっと詳しく言えば、この例はかなり均質なモノＰＥＧ化ＩＦＮ−ｃｏｎ₁群の調製方法、およびこの群の特性を実証している。この実施例はＩＦＮ−ｃｏｎ₁を使用しているが、上述のコンセンサスインターフェロンのいずれも化学的に修飾される可能性があることに注意すべきである。このような化学的修飾には、上にリストしたような任意の水溶性ポリマーを使用してよいが、ここではＰＥＧを使用している。ＰＥＧ化にはここではＰＥＧ１２０００を使用しているが、任意の水溶性ＰＥＧ種を使用してもよい（ＰＥＧ１２０００は取扱いが容易で便利なために選択した）。また、化学的修飾の方法としては種々あるが（アセチル化など）、Ｎ末端ＰＥＧ化のような選択的Ｎ末端化学的修飾については、この実施例で説明している本還元アルキル化法が好ましい。Ａ．コンセンサスインターフェロンの調製モノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの調製には、米国特許第４，６９５，６２３号（この全体を参照として本明細書に組み入れる）の図２にあるＩＦＮ−αｃｏｎ₁（本明細書ではＩＦＮ−ｃｏｎ₁と呼ぶ）を使用した。ＩＦＮ−ｃｏｎ₁は細菌内での外因性ＤＮＡの発現によって生成されたもので、Ｎ末端にメチオニル残基を持っていた。Ｂ．コンセンサスインターフェロンのＰＥＧ化２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ₃を含む、冷却し（４℃）攪拌しておいた１００ｍＭのリン酸ナトリウム中のＩＦＮ−ｃｏｎ₁溶液、ｐＨ４．０（３．４５ｍｇ／ｍｌ、Ｎ末端がブロックされた形態を３２．２５％含む）に、８倍モル過剰のメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ＭＰＥＧ）（平均分子量１２ｋＤａ）を加えた。反応中に蛋白質修飾がどの程度起こるかは、ＰＬＲＰ−Ｓ（ＰＬＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅｓＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のようなポリマーベースのポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）カラムを使った逆相ＨＰＬＣによってモニターした。１０時間の逆相ＨＰＬＣ分析の結果、Ｎ末端にブロックされたα−アミノ基を持つ蛋白質の８０％がＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ₁誘導体に変換されたことが分かった。１０時間の時点で、反応混合物を５倍の水で希釈し、モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ −Ｃｏｎ₁誘導体を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ１６／１０ＳセファロースＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィで精製した。反応混合物を流速１ｍｌ／分の流速でカラムに添加し、未反応のＭＰＥＧアルデヒドを３カラム容量の同緩衝液で溶出した。次に１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０の０％〜７５％の４２０分直線勾配を用いて、４℃において蛋白質−ポリマー結合体を溶出した。モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ₁誘導体を含む分画をプールし、濃縮して、滅菌濾過した。Ｃ．モノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの分析１．均質性精製したモノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ₁結合体の均質性は、１０〜２０％または４〜２０％プレキャストグラジェントゲル（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。分子量３５ｋＤａのところにメインバンドが現れた。各モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ₁種の有効サイズ（流体力学的半径）を調べるために、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル濾過カラムを使用した。蛋白質は２８０ｎｍにおける紫外線吸光度によって検出した。ＢＩＯ−ＲＡＤゲル濾過標準は、球状蛋白質分子量マーカーとして用いた。精製されたＮ末端モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ₁結合体の構造は、Ｎ末端蛋白質シーケンシングおよびペプチドマッピングの手法によって確認した。このＩＦＮ−ｃｏｎ₁調製物にはＮ末端がブロックされている物質が少し含まれており、この物質はＰＥＧ化されていなかった。しかしＰＥＧ化されていた物質は、Ｎ末端がモノＰＥＧ化されていた。このように、この種の状況では、イオン交換クロマトグラフィやサイズ排除クロマトグラフィといった他の方法によって、ブロックされている物質とされていない物質を分離したほうが良いかもしれない。２．生物学的活性モノ−ＭＰＥＧ−ＩＦＮ−Ｃｏｎ₁結合体のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性は、その抗ウイルス生物活性を測定することによって決定した。モノ−ＭＰＥＧ− ＩＦＮ−Ｃｏｎ₁結合体のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性は、ヒト（ＨｅＬａ）細胞におけるその抗ウイルス生物活性を測定することによって決定した。モノ−ＭＰＥＧ（１２ｋＤａ）−ＩＦＮ−Ｃｏｎ₁結合体は、未修飾種と比較して２０％のｉｎｖｉｔｒｏ生物活性（Ｕ／ｍｇ蛋白質）を示すことが分かった。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのところで指摘したように、ｉｎｖｉｔｒｏアッセィは生物学的活性を実証するのには有用であるが、特徴的な徐放性のために、化学的に修飾した蛋白質の活性がかなり低く出ることがある。Ｉｎｖｉｖｏ生物学的活性はｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性より高いかも知れない。Ｄ．Ｎ末端ブロック分子を除去した化学的修飾コンセンサスインターフェロン予め除去したＮ末端ブロック分子の一部を持つ上述のＩＦＮ−ｃｏｎ₁に対しても、本還元アルキル化を実施した。上述のように還元アルキル化法にはＰＥＧ１２０００とＰＥＧ２００００の両方を用いた。分子の見かけの分子量は以下のとおりであった：ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィを使ったＩＦＮ−ｃｏｎ₁ ２０ｋＤＡＰＥＧ結合体の分析では、３つのピークが現れた：モノＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ₁：総面積の６６％（２６５．９３ｍｌで溶出）蛋白質凝集物およびオリゴＭＰＥＧ−ＩＦＮ−ｃｏｎ₁結合体：総面積の２４％（２３８．４２ｍｌで溶出）未反応のＩＦＮ−ｃｏｎ₁：総面積の１０％（３２８．７７ｍｌで溶出）。条件はこれ以上最適化しなかった。クロマトグラフィまたはその他の方法を使えば、モノＰＥＧ化物質を更に分離することができるかも知れない。本発明を好ましい実施例について説明したが、当業者には修正や変更が可能であることは理解されよう。従って添付の請求の範囲はその発明の範囲内にあるこういったすべての同等の変更を包含するものである。

【手続補正書】【提出日】１９９６年７月２２日【補正内容】請求の範囲１．医薬的に許容できる希釈剤、担体または助剤を任意に含有する、Ｎ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体の実質的に均質な製剤。２．前記Ｇ−ＣＳＦが、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される化学薬剤で化学修飾されている請求項１記載の製剤。３．前記Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体がポリエチレングリコールで化学修飾されている請求項２記載の製剤。４．前記ポリエチレングリコールの分子量が約２ｋＤａ〜１００ｋＤａである請求項３記載の製剤。５．前記ポリエチレングリコールの分子量が約６ｋＤａ〜２５ｋＤａである請求項４記載の製剤。６．前記製剤が、少なくとも９０％のＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体および１０％以下の非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体からなる請求項１記載の製剤。７．前記製剤が、少なくとも９５％のＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体および５％以下の非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体からなる請求項６記載の製剤。８．前記Ｇ−ＣＳＦが配列番号１に示す配列を有する請求項１記載の製剤。９．医薬的に許容できる希釈剤、担体または助剤を任意に含有するＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な製剤であって、（ａ）前記Ｇ−ＣＳＦが配列番号１に示すアミノ酸配列を有し；（ｂ）前記Ｇ−ＣＳＦが約１２ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール部分でモノＰＥＧ化されている、ことを特徴とする前記製剤。１０．（ａ）アミン結合によりＧ−ＣＳＦ部分のＮ末端のみに結合した分子量が約１２ｋＤａのポリエチレングリコール部分を有するモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な製剤、（ｂ）５％未満の非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子、および（ｃ）医薬的に許容できる希釈剤、助剤または担体を含有してなる医薬組成物。１１．請求項１〜９のいずれかに記載の製剤を含む造血障害治療用医薬。１２．単一の反応性アルデヒド基を有する水溶性ポリマーをタンパク質またはその類似体に結合させる方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記タンパク質部分のアミノ末端のα− アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、前記タンパク質部分を水溶性ポリマー部分と反応させて、前記水溶性ポリマーを前記α−アミノ基に選択的に結合させ、（ｂ）反応生成物を得、次いで（ｃ）任意に、反応生成物を未反応部分から分離する、ことを含んでなる方法。１３．前記ポリマーが医薬的に許容できる請求項１２記載の方法。１４．前記水溶性ポリマーが、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される請求項１２記載の方法。１５．前記ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１４記載の方法。１６．前記還元アルキル化反応に、ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンから選択される還元剤を使用する請求項１２記載の方法。１７．単一の反応性アルデヒド基を有するポリエチレングリコール分子をＧ− ＣＳＦ分子に結合する方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、前記Ｇ−ＣＳＦを前記ポリエチレングリコール分子と反応させ、（ｂ）ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得、次いで（ｃ）任意に、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦから分離する、ことを含んでなる方法。１８．前記ポリエチレングリコール分子の分子量が約６ｋＤａ〜約２５ｋＤａである請求項１７記載の方法。１９．請求項１７に記載の方法で製造したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ物質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガブリエル，ナンシー・イーアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリイー・パーク、ベア・クリーク・コート・3501 (72)発明者フアーラー，クリステイン・イーアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリイー・パーク、バリー・オーク・レーン・667 (72)発明者デプリンス，ランドルフ・ビーアメリカ合衆国、ノースカロライナー・ 27614、ローリイ、ハートランド・コート・129

Claims

【特許請求の範囲】１．医薬的に許容できる希釈剤、担体または助剤を任意に含有する、Ｎ末端化学修飾Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体の実質的に均質な製剤。２．前記Ｇ−ＣＳＦが、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される化学薬剤で化学修飾されている請求項１記載の製剤。３．前記Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体がポリエチレングリコールで化学修飾されている請求項２記載の製剤。４．前記ポリエチレングリコールの分子量が約２ｋＤａ〜１００ｋＤａである請求項３記載の製剤。５．前記ポリエチレングリコールの分子量が約６ｋＤａ〜２５ｋＤａである請求項４記載の製剤。６．前記製剤が、少なくとも９０％のＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体および１０％以下の非ＰＥＧ化Ｇ− ＣＳＦまたはその類似体からなる請求項１記載の製剤。７．前記製剤が、少なくとも９５％のＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体および５％以下の非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦまたはその類似体からなる請求項６記載の製剤。８．前記Ｇ−ＣＳＦが配列番号１に示す配列を有する請求項１記載の製剤。９．医薬的に許容できる希釈剤、担体または助剤を任意に含有するＮ末端モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均一な製剤であって、（ａ）前記Ｇ−ＣＳＦが配列番号１に示すアミノ酸配列を有し；（ｂ）前記Ｇ−ＣＳＦが約１２ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール部分でモノＰＥＧ化されている、ことを特徴とする前記製剤。１０．（ａ）アミン結合によりＧ−ＣＳＦ部分のＮ末端のみに結合した分子量が約１２ｋＤａのポリエチレングリコール部分を有するモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの実質的に均質な製剤、（ｂ）５％未満の非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子、および（ｃ）医薬的に許容できる希釈剤、助剤または担体を含有してなる医薬組成物。１１．請求項１〜１０のいずれかに記載の製剤の治療上有効な用量を投与することを含む造血障害の治療方法。１２．単一の反応性アルデヒド基を有する水溶性ポリマーをタンパク質またはその類似体に結合させる方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記タンパク質部分のアミノ末端のα− アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、前記タンパク質部分を水溶性ポリマー部分と反応させて、前記水溶性ポリマーを前記α−アミノ基に選択的に結合させ、（ｂ）反応生成物を得、次いで（ｃ）任意に、反応生成物を未反応部分から分離する、ことを含んでなる方法。１３．前記ポリマーが医薬的に許容できる請求項１２記載の方法。１４．前記水溶性ポリマーが、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される請求項１２記載の方法。１５．前記ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１４記載の方法。１６．前記還元アルキル化反応に、ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンから選択される還元剤を使用する請求項１２記載の方法。１７．単一の反応性アルデヒド基を有するポリエチレングリコール分子をＧ− ＣＳＦ分子に結合する方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、前記Ｇ−ＣＳＦを前記ポリエチレングリコール分子と反応させ、（ｂ）ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得、次いで（ｃ）任意に、ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦから分離する、ことを含んでなる方法。１８．前記ポリエチレングリコール分子の分子量が約６ｋＤａ〜約２５ｋＤａである請求項１７記載の方法。１９．請求項１７に記載の方法で製造したＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ物質。２０．少なくとも一つの水溶性ポリマー部分に結合させたコンセンサスインターフェロンタンパク質部分からなる化学修飾コンセンサスインターフェロン。２１．前記コンセンサスインターフェロン部分が、ＩＦＮ−ｃｏｎ₁、ＩＦＮ −ｃｏｎ₂およびＩＦＮ−ｃｏｎ₃からなる群から選択される請求項２０記載の化学修飾コンセンサスインターフェロン。２２．前記水溶性ポリマーが医薬的に許容できる請求項２１記載の化学修飾コンセンサスインターフェロン。２３．前記水溶性ポリマーが、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される請求項２０記載の化学修飾コンセンサスインターフェロン。２４．前記水溶性ポリマー部分がポリエチレングリコールである請求項２３記載の化学修飾コンセンサスインターフェロン。２５．前記水溶性ポリマー部分が、前記コンセンサスインターフェロン部分に、追加の結合基なしで直接結合されている請求項２０記載の化学修飾コンセンサスインターフェロン。２６．少なくとも一つのポリエチレングリコール部分に結合されたＩＦＮ−ｃｏｎ₁からなる化学修飾コンセンサスインターフェロン。２７．ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン。２８．単一の反応性アルデヒド基を有する水溶性ポリマーをコンセンサスインターフェロンに結合する方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記コンセンサスインターフェロン部分のアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、コンセンサスインターフェロン部分を水溶性ポリマー部分と反応させ、（ｂ）反応生成物を得、次いで（ｃ）任意に、反応生成物を未反応部分から分離する、ことを含んでなる方法。２９．前記ポリマーが医薬的に許容可能である請求項２８記載の方法。３０．前記水溶性ポリマーが、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類からなる群から選択される請求項２８記載の方法。３１．前記ポリマーがポリエチレングリコールである請求項３０記載の方法。３２．前記還元アルキル化反応に、ホウ水素化ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミン、ホウ酸トリメチルアミンおよびホウ酸ピリジンを使用する請求項２８記載の方法。３３．単一の反応性アルデヒド基を有するポリエチレングリコール分子をコンセンサスインターフェロン分子に結合する方法であって、（ａ）還元アルキル化反応の条件下、前記コンセンサスインターフェロンのアミノ末端のα−アミノ基を選択的に活性化するのに充分な酸性ｐＨ下で、前記コンセンサスインターフェロンを前記ポリエチレングリコール分子と反応させ、（ｂ）ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンを得、次いで（ｃ）任意に、上記ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンを非ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンから分離する、ことを含んでなる方法。３４．前記ポリエチレングリコール分子の分子量が約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａである請求項３３記載の方法。３５．請求項３３記載の方法で製造されたＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン物質。３６．モノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの実質的に均質な製剤。３７．約９０％のモノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンおよび約１０％の非ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンを含んでなる請求項３６記載の製剤。３８．（ａ）アミン結合によりコンセンサスインターフェロン部分のＮ末端のみに結合したポリエチレングリコール部分を有するモノＰＥＧ化コンセンサスインターフェロンの実質的に均質な製剤、（ｂ）５％未満の非ＰＥＧ化コンセンサスインターフェロン分子、および（ｃ）医薬的に許容できる希釈剤、助剤または担体を含有してなる医薬組成物。