JPH09508616A - テキサフィリンを用いる放射線増感 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 放射線増感剤として用いられるテキサフィリンが提供される。放射線増感剤として用いられるテキサフィリンの有利な特性は、以下を包含する：ｉ）低レドックス電位、これは放射線照射により誘導された水和電子を、ヒドロキシルラジカルを中和させるよりむしろ、テキサフィリンに流動させ、ヒドロキシルラジカルが細胞損傷を生じるようにする、ii）比較的安定性のテキサフィリンラジカル（このラジカルは容易に反応して隣接分子を共有結合的に変化させ、さらなる細胞損傷を生じさせる）、iii）固有の生体局在化、およびiv）Ｏ₂の存在下または不在下で差異がないこと。これらの特性により、テキサフィリンは固形新生物の低酸素領域の治療に特に有効となる。新生物またはアテロームを有する個体の処置方法は、放射線増感剤および光力学的腫瘍治療のための薬剤としてのテキサフィリンの使用、または内部および外部電離放射線についてのテキサフィリンの使用を包含する。新規なテキサフィリンが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 テキサフィリンを用いる放射線増感発明の分野 本発明は、放射線増感剤、およびＸ線照射が治療に有効であることが判明した 放射線増感および他の状態のためのテキサフィリン（texaphyrin）の使用の分野 に関する。発明の背景 放射線増感剤は、放射線治療の効果を増強するために用いられる薬剤である。 治療に有効と考えられる線量の放射線を送達するには、局所的に腫瘍を制御する 必要性と、送達される放射線線量により周囲の正常組織に損傷を与える可能性と の間のバランスをとることが必要である（Bushら、1978）。従って、局所制御と 両立できる最低限の放射線線量を用いることが望ましい。このことを達成するた めの１つの方法としては、送達放射線の腫瘍に対する細胞障害性を増強するため に放射線増感剤を用いることが挙げられる。 放射線照射は、細胞内の重大標的、最も一般的には染色体DNAに損傷を与える ことにより細胞死を引き起こす（HendricksonおよびWithers、1991）。放射線治 療は、２つのタイプの電離放射線に依存する：（１）直接電離原子内粒子放射線 （例えば、α粒子およびβ粒子（電子）、中性子、プロトン、中間子、重荷電イ オンなど）、ならびに（２）間接電離電磁放射線（これは高周波Ｘ線またはγ線 を包含する種々の周波数を有する波の一群として存在する）。しかし、これら２ つのうち電磁放射線が今日、放射線治療においてより一般的に用いられている。 組織において、Ｘ線またはγ線の形態の電磁放射線は、分子（特に水）と相互作 用し得、高エネルギー電子の放出を引き起こす。この電子が、DNA中の糖−リン 酸結合を直接切断し得るか（直接的作用）、または電子放出の過程において、DN A中の化学（糖−リン酸）結合を切断し得る遊離（非荷電）ラジカルを最終的に 生じさせ得る（間接的作用）。間接的メカニズムを通して引き起こされる損傷が より重要である（HendricksonおよびWithers、1991；Mulcahyら、1993；Rubinお よびSiemann、1993；Chapmanら、1974）。これらの損傷効果は、以下に示される ような水の放射線生成物によって媒介される： 放射線損傷は、主としてヒドロキシルラジカル、HO^●、すなわち酸化ラジカル により生成される。このラジカルは高い反応性を有し、短命である。このラジカ ルは、主としてそれが生成される周辺（±４nm）に損傷を引き起こす。ラジカル が水和電子（ｅ^- _aq）と接触するような場合、このラジカルは、水酸化物イオン （OH^-）への変換により不活性化される。水和電子は強い還元種であり、高エネ ルギー性である。水和電子は、ヒドロキシルラジカルに比較すると非常に可動性 であり、即座に移動し得、そして直接的作用を通じてDNAを損傷し得る。しかし 、上述したように、水和電子もまたヒドロキシルラジカルを容易に不活性化させ る。強い電子親和性を有する薬剤は、溶媒和電子を「吸収する（soak up）」こ とによって、それらがヒドロキシルラジカルを中和することを防ぎ、それにより ヒドロキシルラジカルにそれらの効果を及ぼし得る（AdamsおよびDewey、1963） 。従って、酸素および強い電子親和性を有する他の化合物が放射線増感剤として 作用することが期待される。 放射線照射により誘導された細胞損傷に対する生物学的応答は種々の内因性お よび外因性の化合物により調整され得るので、放射線治療が局所治癒を首尾良く 達成できないことには種々の要因が考えられる。例えば、スルフヒドリル化合物 （システイン、ジチオトレイトール、およびシステアミンを包含する）は、還元 剤として作用し（RubinおよびSiemann、1993）、そしてイオン対の組換えを容易 にすることにより、生細胞を電離放射線の致死効果に対して保護することが示さ れている。細胞性スルフヒドリル化合物の涸渇が放射線増感を生じ得ることもま た観察されている。 放射線治療の失敗の原因となる主な要因の１つ、すなわち耐放射線性は、低酸 素である。固形腫瘍中の低酸素細胞は、電離放射線の損傷効果に対して2.5〜３ 倍耐性であることが観察されている（Tannock、1972；Watsonら、1978；両方と もBrown、1984に引用されている）。腫瘍の局所治癒／制御速度は、放射線線量 が有効に増加すると共に増加し得る；しかし、このような増加は、周辺部の十分 に酸素化された正常組織を腫瘍細胞より大きな程度で損傷させる（Shenoyおよび Singh、1992）。腫瘍放射線増感の特定の改変は、放射線量の分割照射（fractio nation）および放射線化学増感剤の使用の試みにより達成される腫瘍酸素化状態 の変化を通じて行われた（Wang、1988；ShenoyおよびSingh、1992）。 この分割照射により、線量回分の間で細胞再集合（repopulation）および致死 量以下の損傷の修復が起こり、１回の激しい線量の照射に比較して、正常組織に おける放射線照射影響が減少される。悪性腫瘍組織では、放射線増感酸素化細胞 が破壊されて、続いて腫瘍の大きさが減少する。続いて、機能的な脈管構造から 離れた位置にある耐放射線性の低酸化細胞が再度酸素化され、従って放射線感受 性になる。また、細胞周期内での細胞の再分類が生じ、これにより癌細胞をより 放射線感受性にする。このように腫瘍細胞と正常細胞との間で応答の差異が生じ るので、放射線の分割照射により、等線量の１回の放射線照射よりも殺腫瘍性と なる。 種々のタイプの電子親和性試薬は、酸素供給の漸減により細胞の放射線増感を 促進することが知られている（ShenoyおよびSingh、1992）。しかし、これらの ほとんどがインビボにおける非毒性線量の照射では活性を示さない。例えば、よ りよく知られている薬剤の１つであるミソニダゾールを用いる臨床試験は、それ が多くの動物およびヒトの腫瘍に対して非常に有効であることを示した（Thomli nsonら、1976；Ashら、1979；Denekampら、1980；これら全てはBrown、1984に引 用されている）。しかし、神経の副作用のために、その臨床有用性が深刻に制限 される（Kallman、1972；Discheら、1977；Urtasunら、1978；Wasermanら、1979 ；これら全てはBrown、1984に引用されている；およびDischeら、1979）。ニト ロイミダゾール治療指数を改善することを目的としたアプローチは、親油性を低 下させて神経組織貫入および毒性を制限すること、および腎クリアランスを促進 することを包含する（Beardら、1993）。これらのミソニダゾール第２世代アナ ログを用いる臨床試験もまた報告されており、現在続行中である（Robertsら、1 984；Colemanら、1984；Saundersら、1984；Colemanら、1986；Horwichら、198 6；Newmanら、1986；Discheら、1986；Colemanら、1987；Newmanら、1988；Work manら、1989）。しかし、このアプローチは、まだ非常に有効な低酸素細胞増感 剤を生成していない。 ハロゲン化ピリミジンもまた放射線増感剤として研究されている。これらの薬 剤は、DNAの構造変化を通して細胞の放射線感受性を変化させ、DNAを放射線不活 化に対してより感受性にする。しかし、薬物は長期間にわたって細胞内に存在し なければならない。これは、放射線増感の程度がチミジン置換の程度に直接関連 するからである。さらに、薬剤は、急速な肝分解および脱ハロゲン化を受け得る （ShenoyおよびSingh、1992）。ハロゲン化ピリミジンの長期使用を限定する主 な要因は、骨髄毒性になることである（Kinsellaら、1984a；Kinsellaら、1984b ；Kinsellaら、1985；ShenoyおよびSingh、1992に引用されている）。 低酸素細胞増感剤は、癌治療の化学改変剤の広範なカテゴリーに入る。化学改 変剤は通常それ自身細胞障害性ではないが、標準的な放射線治療に対する組織応 答を改変または増強する。放射線治療または化学的治療の改変剤の最終的な有用 性は、それが治療指数を改変する能力に依存する。 テキサフィリンは以下に記載されている：米国特許第4,935,498号、第5,162,5 09号、第5,252,720号、第5,292,414号、第5,272,142号、および第5,256,399号； 米国特許出願第08/135,118号、第08/196,964号、第08/294,344号、および第08/2 27,370号；ならびにPCT/US94/06284、これらは全て本明細書中に参考として援用 されている。種々のテキサフィリンの光物理的特性が米国特許第5,252,720号（ 本明細書中に参考として援用されている）に報告されており、これは690〜880nm のスペクトル範囲の強い低エネルギー光吸収、高い三重項量子収率、および一重 項酸素の効率的な生成を含む。米国特許第5,252,720号にはまた、種々の置換テ キサフィリン金属錯体を用いる包膜ウイルスの光増感不活性化、ならびにアテロ ーム、肝臓、腎臓、および腫瘍の磁気共鳴画像法（MRI）が記載されている。こ れらの大員環の側鎖基の極性および電荷を変化させることにより、HIV-1のよう な遊離包膜ウイルスおよびウイルス感染周辺単核細胞への結合の程度、速度、お よび部位が変化し、従って光増感剤の取り込み、および骨髄を汚染する白血病細 胞またはリンパ腫細胞の光増感が調整される。有用な方法としては、アテロー ムならびに良性および悪性腫瘍の処置において、磁気共鳴画像法でこれらのテキ サフィリンを用い、次いで光力学的腫瘍治療を行うことが包含される。 本発明は、放射線増感のためのテキサフィリンを提供する。テキサフィリンは 放射線損傷を増強し、先行技術の放射線増感剤の欠点の多くを克服する。発明の要旨 本発明は、放射線増感剤としてのテキサフィリンを提供する。本発明はさらに 新生物またはアテロームを有する宿主のための放射線治療方法を提供し、以下の 工程を包含する：ｉ）宿主にテキサフィリンを投与する工程、およびii）新生物 またはアテロームの近位部のテキサフィリンに電離放射線を照射する工程。テキ サフィリンは、本明細書中で放射線増感特性を有することが示されている；それ らは、コントロール実験と比較されるように、テキサフィリンの周辺部で電離放 射線からの細胞障害性を増強する。電離放射線は、Ｘ線、内部および外部γ発光 ラジオアイソトープ、およびイオン化粒子を含むが、これらに限定されない。 テキサフィリンは、芳香族五座大員環「拡大ポルフィリン」である。テキサフ ィリン、水溶性テキサフィリン、および調製方法は当該分野で公知であり、本明 細書中に参考として先に援用されている米国特許および米国特許出願に開示され ている。おそらくその固有の親油性のために、テキサフィリンは、新生物組織お よびアテロームにおいて、非新生物組織および非アテロームプラークに関連して 、より大きな生体局在化を示す。新生物は良性または悪性の腫瘍であり得る。 上記方法は、検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより、宿主におけ る局在化部位を決定するさらなる工程を包含し得る。本明細書中で用いられる「 検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより」とは、位置が、以下のよう な局在化手段、例えば、蛍光分光法（特に、テキサフィリンが非メタル化されて いるか、または反磁性金属と錯形成されている場合）；磁気共鳴画像法（テキサ フィリンが常磁性金属を含有する場合）；ガンマカメラ身体走査法（金属がγ放 出性である場合）；または診断用Ｘ線、特にテキサフィリンに結合した金属のＫ 電子の周囲にエネルギーを有する単色または多色Ｘ線を用いることにより見出さ れ得ることを意味する。放射性免疫診断のためのγ放出性金属は、米国特許第 5,252,720号に記載されており、これは本明細書中に参考として援用されている 。好ましいγ放出性金属は¹¹¹In(III)である。 これらの各方法において、テキサフィリンは金属と錯形成されているが、この 金属がテキサフィリンの放射線増感特性の中心となるわけではない。金属は、テ キサフィリン錯体の安定性にとって重要であり得る。電離放射線は、金属が放射 性金属でない限り、外部由来である。ある場合では、電離放射線は放射性金属由 来であり、外部からの放射線と組み合わせて用いられ得る。 本発明のさらなる実施態様は、新生物またはアテロームの処置における放射線 増感および光力学的治療の組合せ方法のためのテキサフィリンの使用である。こ の方法は、感光性テキサフィリンの投与、および新生物またはアテロームの近位 に電離放射線および光を送達することを包含する。感光性テキサフィリンはメタ ルフリーのテキサフィリンまたはテキサフィリン−反磁性金属錯体である。ある いは、検出可能な第１のテキサフィリンが、検出可能なテキサフィリンに関連づ けることにより局在化が行われ得るように投与され得る。第２の感光性テキサフ ィリンは、放射線増感および光力学的治療の両方が行われ得るように、第１のテ キサフィリンと共にまたはその後に投与され得る。この方法は、以下の工程を包 含する：ｉ）宿主に、第１の薬剤として検出可能なテキサフィリンを投与する工 程、ii）検出可能なテキサフィリンに関連づけることにより宿主中の局在化部位 を決定する工程、iii）宿主に、第２の薬剤として感光性テキサフィリンを投与 する工程、およびiv）新生物またはアテロームの近位に電離放射線照射および光 照射を行う工程。第２の薬剤は、第１の薬剤と本質的に同一の生体局在化特性を 有し、光への暴露の際に酸素を生成する能力を示す。光力学的効果は、無酸素性 電子転移プロセスまたは有酸素性酸素ベースプロセスから誘導され得る。細胞障 害性酸素生成物は、一重項酸素、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド、ま たはヒドロパーオキシルラジカルであり得る。感光性テキサフィリンは、反磁性 金属錯体またはメタルフリー種であり得る。本発明の好ましい反磁性金属テキサ フィリン錯体は、B2T2（米国特許第5,252,720号を参照のこと、これは本明細書 中に参考として援用されている）またはT2BET（本出願の実施例１を参照のこと ）のLu(III)、La(III)、またはIn(III)である。 テキサフィリン金属錯体は、'720号特許に記載されるように、固有の生体局在 化特異性を有しており、例えば、肝臓、腎臓、腫瘍、およびアテロームのような 脂質リッチ領域に局在化している。非新生物組織および非アテロームプラークに 比較して、新生物組織およびアテロームにおいて「より大きな生体局在化を示す 」とは、非新生物組織および非アテロームプラークに関連して新生物組織および アテロームに対してより大きな固有の親和性を有することを意味する。「本質的 に同一の生体局在化特性」とは、第２の薬剤が、組織において第１の薬剤により 示されるのとほぼ同様の選択標的特性を有するテキサフィリン誘導体であること を意味する。第１の薬剤および第２の薬剤は、同一のテキサフィリンであり得る 。重要なことに、ヒドロキシル化テキサフィリンは、親油性領域への局在化に対 して最適であり、さらに取り扱いを容易にするに十分な水溶性を示す脂質−水分 配係数を有する。 テキサフィリンは、以下の構造ＡまたはＢのテキサフィリンから選択され得る ： ここで、Ｍは、Ｈ、二価金属カチオン、または三価金属カチオンである。好まし い二価金属カチオンは、以下からなる群から選択される：Ca(II)、Mn(II)、Co(I I)、Ni(II)、Zn(II)、Cd(II)、Hg(II)、Fe(II)、Sm(II)、およびUO₂(II)。好ま しい三価金属カチオンは、以下からなる群から選択される：Mn(III)、Co(III)、 Ni(III)、Fe(III)、Ho(III)、Ce(III)、Y(III)、In(III)、Pr(III)、Nd(III)、S m(III)、Eu(III)、Gd(III)、Tb(III)、Dy(III)、Er(III)、Tm(III)、Yb(III)、L u(III)、La(III)、およびU(III)。 このテキサフィリン構造において、Ｒ₁からＲ₄およびＲ₆からＲ₉は、独立して 、水素、ヨーダイド以外のハライド、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨー ドアルキル以外のハロアルキル、ニトロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキ ル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキ シアミノアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキ ル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルである。Ｒ₅およ びＲ₁₀は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシ アルキル、オキシヒドロキシアルキル、アミノアルキル、オキシアミノアルキル 、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子に対 するカップルであり；そしてＲ₁₁は、アルキル、アルケニル、オキシアル キル、またはヒドロキシアルキルであり、ここで、これらは約３個までの炭素原 子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有する。上記のテキサ フィリンにおいて、ここでＲ₆およびＲ₉が水素以外である場合、Ｒ₅およびＲ₁₀ は水素またはメチルである；そしてここでＲ₅およびＲ₁₀が水素以外である場合 、Ｒ₆およびＲ₉は水素、ヒドロキシル、またはヨーダイド以外のハライドである 。Ｎは０、１、または２である。 上記のテキサフィリンにおいて、ヨーダイド以外のハライドとは、フルオライ ド、クロライド、またはブロマイドであり得る。アルキル、アリール、ヒドロキ シアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、糖類、カルボキシア ルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向性分子は、炭素−炭素結合 または炭素−酸素結合を介してテキサフィリンに共有結合している。アリールは 、フェニル置換基、またはニトロ、カルボキシ、スルホン酸、ヒドロキシ、オキ シアルキル、またはヨーダイド以外のハライドを有するフェニル置換基であり得 る。この場合、フェニル基における置換基は、大員環を形成する縮合工程後の合 成工程において添加され得る。 本発明の１つの実施態様では、テキサフィリンは部位指向性分子にカップリン グされて、標的インビボ送達のための複合体を形成する。「標的部位に対する特 異性」とは、テキサフィリン複合体と標的部位とを、例えば、イオン強度、温度 、ｐＨなどの生理的条件下で接触させた際に、特異的結合が生じることを意味す る。この相互作用は、複合体の特定の残基と標的の特異的な残基との特異的な静 電的相互作用、疎水的相互作用、エントロピー相互作用、または他の相互作用に より生じ、この相互作用を促進するに有効な条件下で安定な錯体を形成し得る。 本発明において意図されている代表的な部位指向性分子は、以下を包含するが 、これらに限定されない：オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレ オチドアナログ；ポリアミド（生物学的レセプターに対して親和性を有するペプ チド、およびタンパク質（例えば、抗体、低密度リポタンパク質、およびリポタ ンパク質のAPOタンパク質）を包含する）；ステロイドおよびステロイド誘導体 ；ホルモン（例えば、エストラジオールまたはヒスタミン）；ホルモン擬態（例 えばモルヒネ）；ならびにさらなる大員環（例えば、サフィリン（sapphyrin） お よびルビリン（rubyrin））。オリゴヌクレオチドは、インビボ安定性を促進す るために、塩基、糖、鎖末端、または主骨格のリン酸基で誘導体化され得る。リ ン酸基の修飾は本発明の１つの実施態様において好ましい。これはリン酸結合が ヌクレアーゼ活性に対して感受性であるからである。好ましい誘導体は、メチル ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびホスホルアミ デートなどである。さらに、リン酸結合は、非リン酸結合（例えば、アミド結合 ）と完全に置換され得る。オリゴヌクレオチド鎖の末端への付加はまた、エキソ ヌクレアーゼ耐性を提供する。糖修飾は、リボヌクレオチドにおけるリボース部 分の酸素に結合されるアルキル基を含み得る。特に、このアルキル基は、好まし くはメチル基であり、そしてこのメチル基は、リボースの2'酸素に結合している 。他のアルキル基はエチルまたはプロピルであり得る。用語「ヌクレオチド」お よび「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で用いられるように、天然に存在す るヌクレオチドおよび合成ヌクレオチドの両方、ポリヌクレオチドおよびオリゴ ヌクレオチド、ならびにそれらのアナログおよび誘導体のことをいう。 用語「テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体」とは、テキサフィリンが 、複合体の内部残基となるように、オリゴヌクレオチドがテキサフィリンに5'結 合または3'結合あるいはその両方のタイプの結合で結合されていることを意味す る。このオリゴヌクレオチドまたは他の部位指向性分子は、結合基を介してテキ サフィリンに直接結合され得るか、または可変長のカップルを介してテキサフィ リンに直接結合され得るかのいずれかである。処理の間、例えば、テキサフィリ ン金属錯体−オリゴヌクレオチド複合体のテキサフィリン部分は、オリゴヌクレ オチドがその相補的DNAに結合する際に標的組織の周辺に配置されることが想起 される。 カップルは、結合基、すなわちテキサフィリン大員環から離れて別の分子に共 有結合されるように設計された反応基の反応により形成される共有結合生成物で として記載され得る。代表的な結合基またはカップルは、アミド、アミン、チオ エーテル、エーテル、またはオリゴヌクレオチドの結合についての実施例に記載 されているようなリン酸共有結合である。最も好ましい実施態様では、オリゴヌ クレオチドおよび他の部位指向性分子は、炭素−窒素結合、炭素−イオウ結合、 または炭素−酸素結合を介してテキサフィリンに共有結合される。オリゴヌクレ オチド、抗体、ホルモン、またはサフィリンは、処置部位への局在化に対する結 合特異性を有し得、そして生物学的レセプターは処置部位に局在化され得る。 用語「生物学的レセプターに対して親和性を有するペプチド」とは、ペプチド と生物学的レセプターとを、例えば、イオン強度、温度、ｐＨなどの適切な条件 下で接触させた際に、特異的結合が生じることを意味する。この相互作用は、ペ プチドの特定のアミノ酸またはグリコール酸残基とレセプターの特定のアミノ酸 またはグリコール酸残基との特異的な静電的相互作用、疎水的相互作用、エント ロピー相互作用、または他の相互作用により生じ、この相互作用を促進するに有 効な条件下で安定な錯体を形成し得る。この相互作用は、３次元コンホメーショ ン、ならびに相互作用に関与するペプチドおよびレセプターのいずれかまたは両 方の機能または活性を変化させ得る。生物学的レセプターについて親和性を有す るペプチドは、エンドルフィン、エンケファリン、成長因子（例えば、上皮成長 因子）、ポリ-L-リジン、ホルモン、タンパク質のペプチド領域などを包含し得 る。ホルモンは、例えばエストラジオールであり得る。 上記構造ＡおよびＢが本発明において好ましいが、本発明はこれらに限定され ず、いかなるテキサフィリンまたはテキサフィリン金属錯体が本発明の放射線増 感方法において用いられ得る。 本明細書中で提供されるテキサフィリンを用いる放射線治療方法は、処置の特 異性を最適化するための多数の戦略を取り込んでいる。第１には、テキサフィリ ンの脂質リッチ組織への固有の生体局在化であり、第２には、部位指向性分子を テキサフィリンの周囲に複合体化させることが可能なことであり、そして第３に は、特定の部位に放射線を照射することが可能なことである。例えば、相補的オ リゴヌクレオチドは、標的基質と塩基対合するように設計され、そして投射放射 線の位置決め（手動または機械的手段のいずれかによる）は、細胞障害性が特定 の生体部位（例えば、深部腫瘍部位（deep-seated tumor site））で効果を及ぼ すことが必要とされる場合、特に有利となる。この場合において、光力学的治療 は、処置のための放射線治療と有利に組み合わされ得る。テキサフィリンは、身 体組織が比較的透過である波長（700〜900nm）の光を吸収するという事実が、特 に有利である。この手順により、身体内の深部で放射線および光ベースのオリゴ ヌクレオチド戦略が遂行され得る。この手順は、テキサフィリンまたはテキサフ ィリン複合体が局在化されない場合に、他の組織の放射線照射による損傷または 感光性を比較的ほとんど生じさせない。 上記のテキサフィリン構造Ａにおいて、Ｎは典型的には２以下の整数である。 二価または三価の金属カチオンを有する塩基性大員環の文脈においては、Ｎは１ または２である；しかし、当業者は、本明細書の開示を考慮すれば、Ｎの値が置 換基Ｒ₁からＲ₁₀に存在する電荷、および共有結合した部位指向性分子に存在す る電荷（例えば、オリゴヌクレオチドのリン酸基の電荷）によって変化すること を認識し得る。 アルキルとは、１〜10個の炭素原子からなる直鎖状または分枝状のアルキル基 を意味する。アルケニルとは、１〜10個の炭素原子からなり、１または２個の二 重結合を有する直鎖状または分枝状のアルケニル基を意味する。ヒドロキシアル キルとは、１〜20個のヒドロキシル基が結合されているアルキル基を意味する。 アルコキシとは、酸素に結合しているアルキル基を意味する。ヒドロキシアルコ キシ基とは、エーテル結合、およびヒドロキシル基または置換ヒドロキシル基な どを有するアルキル基を意味する。糖類は、酸化糖、還元糖、または置換糖を包 含し、ヘキソース（例えば、D-グルコース、D-マンノース、またはD-ガラクトー ス）；ペントース（例えば、D-リボースまたはD-アラビノース）；ケトース（例 えば、D-リブロースまたはD-フルクトース）；二糖類（例えば、スクロース、ラ クトース、またはマルトース）；誘導体（例えば、アセタール、アミン、ホスホ リル化糖）；オリゴ糖、ならびに種々の糖の開環鎖形態などが挙げられる。アミ ン誘導体化糖の例には、ガラクトサミン、グルコサミン、シアリル酸、およびD- グルカミン誘導体（例えば、1-アミノ-1-デオキシソルビトール）がある。アミ ノアルキルとは、アミン基を有するアルキル基を意味する。オキシアミノアルキ ルとは、エーテル結合を有し、かつアミン基を有するアルキル基を意味する。カ ルボキシアミドアルキルとは、二級または三級アミド結合などを有するアルキル 基を意味する。カルボキシアルキルとは、１つ以上のカルボキシル基、または１ つ以上のエステル結合を有するアルキル基を意味する。 上記のテキサフィリン構造について、ヒドロキシアルコキシは、独立してヒド ロキシ置換基およびエーテル分枝を有するアルキル基であり得るか、またはC_{(n- x)} H_((2n+1)-2x)O_xO_yまたはOC_(n-x)H_((2n+1)-2x)O_xO_y（ここでｎは、１から10ま での正の整数であり、ｘは、０またはｎ以下の正の整数であり、そしてｙは、０ または((2n＋1)−2x)以下の正の整数である）であり得る。ヒドロキシアルコキ シまたは糖類は、C_nH_((2n+1)-q)O_yR^a _q、OC_nH_((2n+1)-q)O_yR^a _q、または（CH₂）_nC O₂R^a（ここでｎは、１から10までの正の整数であり、ｙは、０または((2n＋1)− q)未満の正の整数であり、ｑは、０または2n＋1以下の正の整数であり、そしてR^a は、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、糖類、C_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_w O_z、O₂CC_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_wO_z、またはN(R)OCC_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_wO_zである ）であり得る。この場合において、ｍは、１から10までの正の整数であり、ｗは 、０またはｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または((2m＋1)−2w)以下の正の 整数であり、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはC_mH_{((2m+ 1)-r)} O_zR^b _r（ここでｍは、１から10までの正の整数であり、ｚは、０または((2m ＋1)−r)未満の正の整数であり、ｒは、０または2m＋1以下の整数であり、そし てR^b、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、または糖類である）である 。 カルボキシアミドアルキルは、二級または三級アミド連結、または(CH₂)_nCONH R^a、O(H₂)_nCONHR^a、(CH₂)_nCON(R^a)₂、またはO(CH₂)_nCON(R^a)₂を有するアルキル （ここでｎは、１から10までの正の整数であり、そしてR^aは、独立してＨ、アル キル、ヒドロキシアルキル、糖類、C_(m-w)Ｈ_((2m+1)-2w)O_wO_z、O₂CC_(m-w)H_{((2m+ 1)-2w)} O_wO_z、N(R)OCC_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_wO_z、または部位指向性分子である）で ある。この場合において、ｍは、１から10までの正の整数であり、ｗは、０また はｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または((2m＋1)−2w)以下の正の整数であ り、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、またはC_mH_((2m+1)-r)O_zR^b _r である。この場合において、ｍは、１から10までの正の整数であり、ｚは、０ または((2m＋1)−r)未満の正の整数であり、ｒは、０または2m＋1以下の整数で あり、そしてR^bは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、または糖類で ある。好ましい実施態様では、R^aは、オリゴヌクレオチ ドである。 カルボキシアルキルは、カルボキシル置換エーテル、アミド置換エーテル、あ るいはエーテルまたはC_nH_((2n+1)-q)O_yR^c _qまたはOC_nH_((2n+1)-q)O_yR^c _qから除去 された三級アミドを有するアルキルであり得、ここでｎは、１から10までの正の 整数であり；ｙは、０または((2n＋1)−q)未満の正の整数であり、ｑは、０また は2n＋1以下の正の整数であり、そしてR^cは、(CH₂)_nCO₂Rd、(CH₂)_nCONHR^d、(CH₂ )_nCON(R^d)₂、または部位指向性分子である。この場合において、ｎは、１から10 までの正の整数であり、R^dは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキシアルキル、糖 類、C_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_wO_z、O₂CC_(m-w)H_((2m+1)-2w)O_wO_z、またはN(R)OCC_{(m-w )} H_((2m+1)-2w)O_wO_zである。この場合において、ｍは、１から10までの正の整数 であり、ｗは、０またはｍ以下の正の整数であり、ｚは、０または((2m＋1)−2w )以下の正の整数であり、そしてＲは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ま たはC_mH_((2m+1)-r)O_zR^b _rである。この場合において、ｍは、１から10までの正の 整数であり、ｚは、０または((2m＋1)−r)未満の正の整数であり、ｒは、０また は2m＋1以下の正の整数であり、そしてR^bは、独立してＨ、アルキル、ヒドロキ シアルキル、または糖類である。好ましい実施態様では、R^cは、オリゴヌクレオ チドである。 本発明の現在好ましい実施態様は、新生物またはアテロームを有する宿主のた めの放射線治療方法であり、この方法は、ｉ）宿主に、薬学的に有効な量のテキ サフィリンのGd錯体を投与する工程、およびii）電離放射線を、新生物またはア テロームの近位のテキサフィリンに照射する工程を包含する。本発明のより好ま しい実施態様は、テキサフィリンがT2B2のGd錯体、4,5-ジエチル-10,23-ジメチ ル-9,24-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-16,17-(3-ヒドロキシプロピルオキシ)-13 ,20,25,26,27-ペンタアザペンタシクロ[20.2.1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]ヘプタコサ- 1,3,5,7,9,11(27),12,14,(19),15,17,20,22(25),23-トリデカエン、またはT2BET のGd錯体、4,5-ジエチル-10,23-ジメチル-9,24-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-16 ,17-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-ペンタアザペンタシ クロ-[20.2.1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]ヘプタコサ-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,2 0,22(25),23-トリデカエンである場合の上記方法である。特に好ましい実施 態様は、テキサフィリンがT2BETのGd錯体である場合である。 現在好ましいテキサフィリンにおいては、Ｒ₁はヒドロキシアルキルであり、 そしてＲ₂、Ｒ₃、およびＲ₄はアルキルである。あるいは、Ｒ₃は部位指向性分子 または部位指向性分子に対するカップルであり得、好ましくは、オリゴヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチドに対するカップルであり得る。さらに好ましいテ キサフィリンにおいては、Ｒ₁は(CH₂)₂CH₂OHであり、Ｒ₂およびＲ₃はCH₂CH₃であ り、Ｒ₄はCH₃であり、そしてＲ₇およびＲ₈はOCH₂CH₂CH₂OHである。あるいは、Ｒ₈ は部位指向性分子、またはそれに対するカップルであり、好ましくは、オリゴ ヌクレオチド、またはそれに対するカップルであり、より好ましくは、O(CH₂)_nC O-オリゴヌクレオチド（ここでｎは１〜７であり、そして好ましくは１〜３であ る）であり；そしてＲ₇はHである。さらに現在好ましい実施態様においては、Ｒ₁ は(CH₂)₂CH₂OHであり、Ｒ₂およびＲ₃はCH₂CH₃であり、Ｒ₄はCH₃であり、Ｒ₇お よびＲ₈はO(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃であり、あるいは、Ｒ₈は部位指向性分子また はそれに対するカップルであり得、好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはそれ に対するカップルであり得、より好ましくは、O(CH₂)_nCO-オリゴヌクレオチド（ ここでｎは１〜７であり、そして好ましくは１〜３である）である。他の現在好 ましい実施態様においては、Ｒ₁〜Ｒ₁₀は、テキサフィリンＡ１〜Ａ３８に関し て表１に示されている通りである。 ピロール窒素上に置換基を有する構造Ｂのテキサフィリンは、目的の新規な組 成として提供される。実施例２の表２は、この誘導体化テキサフィリンについて 意図される置換基の要約を示す。ピロール窒素置換基（Ｒ₁₁）は、約３個までの 炭素原子を有するアルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキ シ基であり得る；但し、この置換基は第１結合炭素の周囲で回転可動性を有し、 残りの基をテキサフィリン平面の外側に位置させる。従って、好ましいアルケニ ルは、CH₂CH＝CH₂である。ピロール窒素置換基は、最も好ましくはメチル基であ る。 本発明のさらなる実施態様は、ピロール窒素上に置換基（Ｒ₁₁）を有するテキ サフィリンの合成方法である。この方法は、ｉ）有機溶媒中で、ピロール窒素上 に置換基を有する非芳香族テキサフィリン、ブレンステッド塩基、および酸化 体を混合する工程；およびii）この混合物を少なくとも２時間、室温で撹拌する かまたは還流下で加熱する工程を包含する。非芳香族テキサフィリンは、構造Ｉ を有するトリピランアルデヒドまたはケトン；および構造IIを有する置換オルト −フェニレンジアミンにより生成される： Ｒ₁からＲ₄およびＲ₆からＲ₉は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド 、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニ トロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロ キシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシ、カ ルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指 向性分子に対するカップルである。Ｒ₅およびＲ₁₀は、独立して、水素、アルキ ル、アリール、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキ ル、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシ アミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ₁₁は 、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルであり、 ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原子の周囲 で回転可動性を有する。 好ましい合成方法においては、Ｒ₁₁はメチルであり、ブレンステッド塩基はト リエチルアミンまたはN,N,N',N'-テトラメチル-1,8-ジアミノナフタレン（「プ ロトンスポンジ(proton sponge)」）であり、酸化体は空気であり、そしてこの 空気は有機溶媒を飽和しており、または酸化体は、酸素、酸化白金、o-ク ロロニル、または2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノンであり得る。撹 拌工程または還流下での加熱工程は、少なくとも２時間かつ約24時間まで混合物 を撹拌または還流下で加熱することを包含し、そして有機溶媒はメタノール、メ タノールおよびクロロホルム、またはメタノールおよびベンゼン、またはメタノ ールおよびジメチルホルムアミドを含み得る。 本発明の薬学的調製物は、単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと組み合 わせて、単回投与または複数回投与のいずれかで投与され得る。適切な薬学的キ ャリアは、不活性の固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液、および種々の有機溶 媒を含み得る。次いで、本発明のテキサフィリンと薬学的に受容可能なキャリア とを組み合わせることにより形成される薬学的組成物は、次いで、種々の投与剤 形（例えば、注射用溶液）で容易に投与され得る。 非経口投与のために、ゴマ油またはラッカセイ油、プロピレングリコール水溶 液、または滅菌水溶液中のテキサフィリンの溶液が用いられ得る。このような水 溶液は、必要であれば適切に緩衝化され、そして液体希釈剤はまず十分な生理食 塩水またはグルコースにより等張とされる。これらの特定の水溶液は、特に、静 脈内投与、筋内投与、皮下投与、および腹膜腔内投与に適切である。これに関連 して、用いられ得る滅菌水性媒体は、本明細書の開示を考慮すれば当業者に公知 である。 注射用途に適した薬学的剤形は、滅菌水性溶剤または分散剤、および滅菌注射 用溶剤または分散剤の即座の調製のための滅菌散剤を包含する。全ての場合にお いて、剤形は、滅菌されていなければならず、そして注射器で容易に使用できる 程度に流体でなければならない。それはまた製造および貯蔵の条件下で安定でな ければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の混入作用に対して保護され ねばならない。キャリアは、溶媒または分散媒であり得、これらは、例えば、水 、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、お よび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油 を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により 、必要粒子サイズの維持により（分散剤の場合）、および界面活性剤の使用によ り維持され得る。微生物の作用は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パ ラ ベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって 防止され得る。多くの場合、等張性物質、例えば糖（例えばマンニトールまたは デキストロース）または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。より好ましい等 張性物質は、約２〜８％濃度のマンニトール溶液であり、最も好ましくは約５％ 濃度のマンニトール溶液である。注射用組成物吸収は、組成物において、吸収を 遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用い ることにより延期され得る。 滅菌注射用溶液は、活性化合物を、上記で列挙した種々の他の成分と共に、適 切な溶媒中に必要量入れ、必要であれば滅菌濾過することにより調製される。一 般に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、基本分散媒および上記で列挙したもの の必要とされる他の成分を含有する滅菌媒体中に入れることにより調製される。 滅菌注射用溶液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法には、真空乾 燥法および凍結乾燥法があり、これにより、既に滅菌濾過したそれらの溶液から 、任意の所望される付加成分を加えた活性成分の粉末が得られる。 本明細書で用いられるように、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意の および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性物 質、および吸収遅延剤などを包含する。このような媒体および薬剤を薬学的に活 性な物質に対して用いることは当業者に周知である。従来の媒体または薬剤が活 性成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。 補足的な活性成分もまた組成物中に取り込まれ得る。 適用されている特許法の条約に従って、用語「ａ」および「an」は、請求の範 囲を含む本出願において用いられる場合「１つ以上」を意味する。図面の簡単な説明 以下の図面は本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに説明するた めに含まれる。本発明は、１以上のこれらの図面を本明細書中の特定の態様の詳 細な説明と組み合わせて参照することにより、より一層理解され得る。 図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃは、本発明の好ましいテキサフィリン、T2BET²⁺ 、4,5-ジエチル-10,23-ジメチル-9,24-ビス（3-ヒドロキシプロピル）-16,17-ビ ス [2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-13,20,25,26,27-ペンタアザペ ンタシクロ[20.2.1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]ヘプタコサ-1,3,5,7,9,11(27),12,14(19 ),15,17,20,22(25),23-トリデカエンの合成を示す。 図２は、ピロール窒素に置換基を有する誘導体化されたテキサフィリン２_Gを 示す。 図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、テキサフィリン金属錯体−オリゴヌクレオチ ド複合体を調製するための段階的合成スキームを示す。図３Ａは、テキサフィリ ン金属錯体3'-結合-オリゴヌクレオチド複合体の合成を示す。図３Ｂおよび図３ Ｃは、5'結合オリゴヌクレオチド複合体を得るアプローチを示す。波線のついた 丸は、結合基を有する制御された細孔のシリカを示す。 図４は、水性イソプロピルアルコール中でのパルス放射線分解を示す。光学密 度は、ガドリニウムテキサフィリンπラジカルカチオン、GdT2B2^+●の形成の時 間（μ秒）に対してプロットされている。 図５Ａおよび図５Ｂは、図４で形成されるπラジカルカチオンの時間（ｍ秒） に対する減衰を示す。図５Ａのプロットは、このカチオンが、図５Ｂ[K=(1.9±0 .7)×10⁹M^-1s^-1]に示されるような酸素の存在による影響を受けない長い半減期[ K=(1.7±0.5)×10⁹M^-1s^-1]を有することを示す。これらのデータは、GdT2B2^+● πラジカルカチオンが酸素より低い還元ポテンシャルを有し、従って、その電子 を酸素に供与しないことを示す。 図６は、テキサフィリンラジカルGdT2B2(H^●)によるシトシンの共有結合的変 性の速度定数(k₂＝約10⁶M^-1s^-1)を示す。これらのデータは、比較的安定である にも関わらずテキサフィリンラジカルが反応性であり、そして隣接する分子に損 傷を引き起こすことを示す。 図７は、20μMのGdB2T2²⁺存在下または非存在下での放射線線量(グレイ単位) に対するマウスL1210細胞の殺傷を示す。増感剤促進比(enhancement ratio)は1. 62である。 図８は、GdB2T2²⁺がL1210細胞の殺傷に与える影響を示す。増感剤促進比をGdB 2T2²⁺濃度に対してプロットする。1.5より大きいSERは、臨床的に有意である。 これらのデータは、増感剤としてのGdB2T2²⁺の効果は、濃度と共に増加すること を示す。 図９は、25グレイでの放射線分解において、GdB2T2²⁺が核酸の鎖切断に及ぼす 効果を示す。L1210細胞を、指示された濃度のGdB2T2²⁺に曝し、溶解し、そして 核酸物質をサイズ選択フィルターを通過させた。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、テキサフィリンを用いるヒトHT-29の放射線照射 増感を示す。図１０Ａは、テキサフィリン非存在下（●）、ならびにGdT2B2²⁺（ ▲）、GdT2BET²⁺（◆）、およびLuT2BET²⁺（■）での細胞の殺傷を示す。図１０ Ｂは、GdT2BET²⁺非存在下（●）、ならびに10μM（■）、20μM（◆）、および4 0μM（▲）の濃度での存在下における細胞の殺傷を示す。 図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃおよび図１１Ｄは、20グレイ（図１１Ａおよび 図１１Ｂ）および３０グレイ（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の線量で放射線照射し た全ての動物について、放射線照射およびT2BET(40μmol／kg注射)を与えた動物 と、放射線照射のみを与えた動物（コントロール）とに関する全体的な生存およ び初期の癌のない生存（primary canser-free survival）（完全応答物）を示す 。各グループには４匹の動物がいて、放射線照射はテキサフィリンの注入の２時 間後に行った。記号は：○、放射線照射のみ（全体的な生存）；●、放射線照射 のみ（初期の癌のない生存）；△、T2BETおよび放射線照射（全体的な生存）； ▲、T2BETおよび放射線照射（初期の癌のない生存）である。好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、放射線治療における放射線増感、および放射線治療および光力学的 腫瘍治療を含む２方面の(two-pronged)処置プロトコルへのテキサフィリンの使 用を包含する。より詳細には、本発明は、テキサフィリン存在下での、放射線照 射により増強された細胞毒性および増強された核酸鎖切断を示す。実施例１〜４ は、好ましいテキサフィリン、および部位指向性分子に結合したテキサフィリン の合成を記載する。実施例５〜８は、放射線増感、放射線治療、および光力学的 腫瘍治療を伴う放射線治療へのテキサフィリンの使用を記載する。 テキサフィリンの合成は、米国特許第4,935,498号、同第5,162,509号、同第5, 252,720号、および米国特許出願第08/098,514号、同第08/135,118/号、同第08/1 96,964号、同第08/227,370号、および同第08/294,344号に記載され、これらは全 て本明細書に参考として援用されている。大員環のＢ（ベンゼン環）部分のR₆− R₉位の置換基は、それらが前駆体（分子の３、４、５および６位のオルト−フェ ニレンジアミン）に結合することにより大員環に取り込まれる。分子のT（トリ ピラン）部分の置換基の導入は、ピロール環の適切な官能化により達成され、R₅ 位およびR₁₀位の置換基は、置換オルト−フェニレンジアミンとの縮合前の合成 工程で５位のトリピレンの適切な官能化によって取り込まれる。より好ましくは 、官能化は：R₆およびR₉が水素以外の場合には、R₅およびR₁₀は水素またはメチ ルであり；R₅およびR₁₀が水素以外の場合には、R₆およびR₉は、水素、ヒドロキ シ、またはヨウ化物以外のハロゲン化物である。 任意のテキサフィリンまたはテキサフィリン金属錯体を放射線増感剤として用 い得る。放射線増感に好ましい構造Ａのテキサフィリンの代表的な置換基を表１ に挙げる。これらの化合物に対しては、R₄は好ましくはメチルである。 大員環のR₅位またはR₁₀位の置換基は、大員環の縮合の前または後のいずれか に誘導体化され得る。置換基は５個までの炭素原子を有するアルキル基、または ニトロ、カルボキシル、硫酸、ヒドロキシル、ハライドまたはアルコキシ（この アルコキシのアルキルはヒドロキシアルキルなどであり得る）によってさらに誘 導体化され得るフェニル基を含み得る。 テキサフィリンの二価または三価の金属錯体は、慣例によりN⁺の形式電荷で示 され、Nはそれぞれ１または２である。本発明に記載される錯体は、金属イオン に対する電荷の中和および／または配位の飽和を与える１以上のリガンドをさら に有し得ることが当業者に理解される。そのようなリガンドには、クロライド、 ニトレート、アセテート、およびヒドロキシド等が挙げられる。 金属の存在は、テキサフィリンの放射線増感特性にとって重要ではない；しか し、金属は、テキサフィリン錯体の安定性に寄与する。金属テキサフィリンとそ の対イオンとの錯体は、本出願の目的のための中性の錯体であるとみなされる； 例えば、GdT2B2(OAc)₂は、中性の錯体である。GdT2B2²⁺のようなテキサフィリン の金属錯体は、２価の正電荷を有する。GdT2B2²⁺が電子を得ると、それは短命な πラジカルカチオンであるGDT2B2^2+●となる。このカチオンはプロトンを得るか または再調整されテキサフィリンラジカルGdT2B2(H^●)（実施例５に記載される ように有意な安定性を有する）となる。 酸素は、生理学的システムにおける最終的な電子受容体である。しかし、テキ サフィリンは、酸素のレドックス電位より低いレドックス電位を有する。全ての 還元体はテキサフィリンを還元し、以下に挙げるレドックス電位から理解され得 るように、スーパーオキシドでさえ還元する： e^- _aq＝-2.80Ｖ ポルフィリン＝-0.6〜-1.8Ｖ キノン＝-0.2〜-1.0Ｖ Ｏ^- ₂＝-0.18V GdT2B2^●＝+0.08Ｖ 従って、ガドリニウムテキサフィリンは容易に電子を「吸収」し、それらがヒド ロキシルラジカルまたは他の酸化された種との反応を防止する。このガドリニウ ムテキサフィリンの低しレドックス電位は、テキサフィリンの部位で受けた放射 線照射の損傷の量を増強するテキサフィリンの特性である；テキサフィリン非存 在下では、ヒドロキシルラジカルおよび水和電子が再化合し放射線照射損傷はほ とんど起こらないが、一方テキサフィリン存在下では、ヒドロキシルラジカルは 遊離であり、損傷を引き起こす。さらに、テキサフィリンによる電子の捕捉は、 水和電子がヒドロキシルラジカルに誘導された損傷部位と相互作用してその損傷 を修復することを妨げる。 他に規定しない限り、本明細書中で用いる全ての専門用語および技術用語は、 本発明が属する分野の当業者によって理解される一般的な意味と同じ意味を有す る。本明細書中に記載される方法および材料と同じかまたは類似したあらゆる方 法および材料が本発明の実施もしくは試験において用いられ得るが、ここでは好 ましい方法および材料について説明する。他に言及しない限り、本明細書中で用 いられる技術は、当業者に周知の標準的方法論である。 実施例１ テキサフィリンT2BETの合成 本実施例は、エトキシ基を含む置換基を有する好ましいテキサフィリン（T2BE Tと称される）の合成を提供する。 ルテチウム(III)アセテート(lutetium(III)acetate)水和物をStrem Chemicals , Inc.(Newburyport，MA)から、ガドリニウム(III)アセテート四水和物をAesar/ Johnson Matthey(Ward Hill，MA)から購入した。LZY-54ゼオライトをUOP(Des Pl ains,IL)から購入した。アセトン、氷酢酸、メタノール、エタノール、イソプロ ピルアルコール、およびn-ヘプタンをJ.T.Baker(Phillipsberg，NJ)から購入し た。トリエチルアミンおよびアンバライト904アニオン交換樹脂をAldrich(Milwa ukee，WI)から購入した。全ての化学物質はACSグレードであり、更なる精製を行 わずに用いた。 4,5-ジエチル-10,23-ジメチル-9,24-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-16,17-ビス [2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-ペンタアザペンタシクロ[20.2 .1.1^3,6.1^8,11.0^14,19]ヘプタコサ-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),2 3-ト リデカエンのガドリニウム(III)錯体の合成(1_I、図１Ａ、Ｈ1Ｂおよび図１Ｃ)。 重要な中間体である1,2-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エトキシ]-4 ,5-ジニトロベンゼン1_Eを、図１Ａに概略した３工程の合成プロセスに従って調 製した。 トリエチレングリコールモノメチルエーテルモノトシレート1_Bの合成：マグネ チックスターラーバーおよび1000mL圧力等化滴下漏斗(pressure-equalizing dro pping funnel)を備えた、オーブンで乾燥した12Lの三口丸底フラスコ内に、水(1 800mL)中のNaOH(440.0g、11.0モル)溶液を添加し、混合物を０℃に冷却した。TH F(1000mL)中のトリエチレングリコールモノメチルエーテル1_A(656.84g、4.0モル )を添加した。清澄な溶液を０℃で15分間激しく撹拌し、そしてTHF(2.0L)中の塩 化トシル(915.12、4.8モル)を１時間にわたって滴下した。反応混合物をさらに １時間０℃で撹拌し、10％HCl(5.0L)を添加して(pH5〜7まで)反応を停止した。 二相の混合物を4Lの分液漏斗に分けて移し、有機層を取り出し、そして水層をt- ブチルメチルエーテル(3×250mL)で抽出した。合わせた有機抽出物をブライン(2 ×350mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、そして減圧下でエバポレートし、明るい色 のオイルとして1217.6g(95%)の1_Bを得た。この物質をさらに精製することなく次 の工程に用いた。 1,2-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エキシ-ベンゼン1_Dの合成。オ ーバーヘッド撹拌機、還流冷却器およびガス管を備えた乾燥した5Lの丸底フラス コ中で、K₂CO₃(439.47g、3.18モル)およびMeOH(1800mL)をアルゴン雰囲気下で混 合した。この充分に撹拌された懸濁液に、カテコール1_c(140.24g、1.27モル)を 添加し、そして混合物を加熱還流した。次いで、1_B(1012.68g、3.18モル)を一度 に添加した。この懸濁液を24時間還流しながら撹拌し、室温まで冷却して、セラ イトによって濾過した。このパッドを500mLのメタノールですすぎ、合わせた濾 液を減圧下でエバポレートした。得られた茶色の残渣を10％NaOH(800mL)に溶解 し、塩化メチレン(800mL)を撹拌しながら添加した。この混合物を2Lの分液漏斗 に移し、有機層を取り出し、水層を塩化メチレン(3×350mL)で抽出した。有機抽 出物を合わせてブラインで洗浄し(350mL)、乾燥させ(MgSO₄)、減圧下でエバポレ ートし、そして残渣を数時間真空で乾燥させ485.6g(95%)の1,2-ビス[2-[2-(2- メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ-ベンゼン1_Dを得た。1_Dについて：bp.165- 220℃、(0.2-0.5mmHg)、FAB MS、M⁺:m/e 402;HRMS、M⁺:402.2258(C₂₀H₃₄O₈に関 する計算値、402.2253)。 1,2-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-4,5-ジニトロベン ゼン1_Eの合成。オーブンで乾燥させた1Lの丸底フラスコ内で、1_D(104g、0.26モ ル)および氷酢酸(120mL)を合わせて５℃に冷却した。このよく撹拌した溶液に濃 硝酸(80mL)を15〜20分間かけて滴下した。混合物の温度を、冷却および酸の添加 の速度を調節することにより40℃未満に保持した。添加後、反応物をさらに10〜 15分間撹拌し、次いで０℃に冷却した。発煙硝酸(260mL)を30分間にわたって滴 下しその間溶液の温度を30℃未満に保持した。添加が完了した後、反応が完了す るまで赤色の溶液を室温で撹拌し(約５時間、TLC:95/5；CH₂Cl₂／MeOH)、次いで 、よく撹拌した氷水(1500mL)に注いだ。塩化メチレン(400mL)を添加し、二相の 混合物を2Lの分液漏斗に移し、有機層を取り出した。水層をCH₂Cl₂(2×150mL)で 抽出し、合わせた有機層を10%NaOH(2×150mL)およびブライン(250mL)で洗浄し、 乾燥し(MgSO₄)、そして減圧下で濃縮した。得られたオレンジ色のオイルをアセ トン(100mL)に溶解し、その溶液にn-ヘキサン(500mL)を重層してフリーザー内で 保存した。得られた沈殿物を濾過して回収し101.69g(80%)の1_Eを黄色い固体とし て得た。1_Eについて: mp 43-45℃；FAB MS、(M+H)⁺:m/e 493；HRMS、(M+H)⁺:493 .2030(C₂₀H₃₃N₂O₁₂に関する計算値、493.2033)。 1,2-ジアミノ-4,5-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]ベン ゼン1_F（図１Ｂ）の合戒。クライゼンアダプター、圧力等化滴下漏斗、および還 流冷却器を備えた、オーブンで乾燥した500mLの丸底フラスコ内で、1,2-ビス[2- [2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-4,5-ジニトロベンゼン1_E(20g、0. 04モル)を無水エタノール(200mL)に溶解した。この清澄な溶液に、10％炭素担持 パラジウム(4g)を添加し、暗黒色の懸濁液をアルゴン雰囲気下で加熱還流した。 EtOH(20mL)中のヒドラジン水和物(20mL)を、突沸を避けるように10分間かけて滴 下した。得られた茶色の懸濁液を1.5時間加熱還流したところ、その時点で反応 混合物は色を失い、そしてTLC分析(95/5;CH₂Cl₂/MeOH)は、ジアミンに相当する 低いRf値のUV活性スポットを示した。従って、この混合物をセライトにより熱次 濾過して、パッドを無水エタノール(50mL)ですすいだ。溶媒を減圧下で除去して 、得られた明るい茶色のオイルを真空（暗所）で24時間乾燥し、15.55g(89%)の1 ,2-ジアミノ-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]ベンゼン1_Fを 得た。1_Fについて：FAB MS、M⁺:m/e 432；HRMS、M⁺:432.2471(C₂₀H₃₆N₂O₈に関す る計算値、432.2482)。この物質をさらなる精製をすることなしに次の工程に用 いた。 4,5-ジエチル-10,23-ジメチル-9,24-ビス(3-ヒドロキシプロピル)-16,17-ビス [2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-13,20,25,26,27-ペンタアザペ ンタシクロ[20.2.1.1^3,6.18,11.0,^14,19]ヘプタコサ-3,5,8,10,12,14,16,18,20, 22,24-ウンデカエン(1_H)の合成。オーブンで乾燥した1Lの丸底フラスコに、2,5- ビス[(5-ホルミル-3-(3-ヒドロキシプロピル)-4-メチル-ピロール-2-イル)メチ ル]-3,4-ジエチルピロール1_G（1_Gの合成は、米国特許第5,252,720号において提 供され、本明細書中に参考として援用される）(30.94ｇ、0.0644モル)および4,5 -ジアミノ-ビス[2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]ベンゼン1_F(28. 79g、0.0644モル)を、アルゴン雰囲気下、無水メタノール(600mL)中で合わせた 。よく撹拌したこの懸濁液に、無水メタノール中(200mL)の濃塩酸(6.7mL)の混合 物を一度に加えた。この混合物を50℃まで徐々に加熱し、その時点で、反応物は 出発物質の濁った懸濁液から反応が進むにつれて暗赤色の一様な溶液に変わった 。３時間後、TLC分析およびUV/可視分光法(λ_max369nm)により反応が完了したと 判断した。反応混合物を室温まで冷却し、60gの活性炭(DARCO^TM)を添加し、得ら れた懸濁液を20分間撹拌した。暗い色の懸濁液をセライトによって濾過して活性 炭を除き、乾燥状態まで溶媒をエバポレートし、そして1_Hの粗生成物を真空下で 一晩乾燥した。1_Hをイソプロピルアルコール／n-ヘプタンから再結晶させ、50g( 85%)の深紅の固体を得た。1_Hについて：¹H NMR(CD₃OD):σ1.11(t,6H,CH₂CH₃)，1 .76(p,4H,pyrr-CH₂CH₂CH₂OH)，2.36(s,6H,pyrr-CH₃)，2.46(q,4H,CH₂CH₃)，2.64 (t,4H,pyrr-CH₂CH₂CH₂OH)，3.29[s,6H,(CH₂CH₂O)₃CH₃]，3.31(t,4H,pyrr-CH₂CH₂ CH₂OH)，3.43-3.85(m,20H,CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂O)，4.10(s,4H,(pyrr)₂-CH₂)， 4.22(t,4H,PhOCH₂CH₂O)，7.45(s,2H,PhH)，8.36(s,2H,HC=N)；UV/vis:[(MeOH)λ_max ,nm]：369；FAB MS，[M+H]⁺：m/e 878.5；HRMS，[M+H]⁺：m/e 878.5274([C₄₈ H₇₂N₅O₁₀]⁺に対する計算値、878.5279)。 4,5-ジエチル-10,23-ジメチル-9,24-ビヌ(3-ヒドロキシプロピル)-16,17-ビス [2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]-ペンタアザペンタシクロ[20.2 .1.1^3,61^8,11.0,^14,19]ヘプタコサ-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18,20,22(25),2 3-トリデカエン(1_I)のガドリニウム(III)錯体の合成。1_Iを図１Ｃに概略したプ ロセスに従って調製した。乾燥した2Lの三口丸底フラスコ内で、1_H(33.0g、0.03 6モル)およびガドリニウム(III)アセテート四水和物(15.4g、0.038モル)をメタ ノール(825mL)中で合わせた。よく撹拌したこの赤色溶液に、ガドリニウム(III) アセテート四水和物(15.4g、0.038モル)およびトリエチルアミン(50mL)を添加し 、反応物を加熱還流した。1.5時間後、ガス分散チューブ(gas dispersion tube) の補助により空気を４時間にわたって（すなわち、還流しながら）暗緑色の反応 溶液に吹きこんだ(流速＝20cm³/分)。この時点で、反応混合物をUV/可視分光法 により注意深くモニターした（すなわち、0.5〜1時間毎に、約１滴を４〜５mLの MeOHに希釈してスペクトルをとった）。反応は、UV/可視（MeOH比が342nm/472nm ＝0.22-0.24）により４時間後に完了したとみなした。暗緑色の反応物を室温ま で冷却し、セライトによって濾過して2Lの丸底フラスコに入れ、溶媒を減圧下で 除去した。暗緑色の固体をアセトン(1L)に懸濁し、得られたスラリーを室温で１ 時間撹拌した。懸濁液を濾過して赤色／茶色の不純物（不完全な酸化生成物）を 除去し、固体をアセトン(200mL)ですすぎ、そして風乾した。この複合体粗生成 物(35g)をMeOH(600mL)に溶解して15分間激しく撹拌し、セライトによって濾過し て2Lの三角フラスコに移した。さらに300mLのMeOHおよび90mLの水をこのフラス コに添加して、酢酸で洗浄したLZY-54ゼオライト(150g)も加えた。この懸濁液を 、約３〜４時間オーバーヘッドメカニカルスターラーによって撹拌した。ゼオラ イト抽出は、遊離のGd(III)が非存在となることにより完了したとみなした。[遊 離のガドリニウムについてテストするために、1_Iの粗生成物を逆相TLCプレート( Whatman KC8F、1.5×10cm)に多量にスポットして、メタノール中の10％酢酸を用 いてクロマトグラムを展開した。緑色の複合体は、溶媒の先端近くまでTLCプレ ートを上昇した。このような条件下では、全ての遊離ガドリニウム金属は起点に 残る。クロマトグラムを展開した後、プレートを乾燥し、プレートの下側1/4を メタノール中のArsenazo III溶液(10mLメタノール中4mg Arsenazo III)で染色し た。 ピンク色のバックグラウンドに対して、非常にかすかな青色のスポット（遊離の 金属を示す）が起点において観察され、遊離のガドリニウム金属がほとんどない ことを示した。］ゼオライトをWhatman #3濾紙を通して除去し、回収した固体を MeOH(200mL)ですすいだ。暗緑色の濾液をAmberlite IRA-904アニオン交換樹脂の カラム(長さ30cm×直径2.5cm)にかけてその樹脂から溶出させ(流速約10mL/分)、 300mLの1-ブタノールと共に２Ｌの丸底フラスコに入れた。この樹脂を、さらに1 00mLのMeOHですすぎ、合わせた溶出物を乾燥状態まで減圧下でエバポレートした 。緑色の光沢のある固体1_Iを40℃で数時間真空乾燥した。よく撹拌した55〜60℃ の1_Iのエタノール溶液(260mL)に、1Lの圧力等化滴下漏斗からn-ヘプタン(約600m L)を滴下した(流速4mL/分)。1.5時間のコース(300mL添加)の間に、緑色の錯体1_I が、暗い色の混合物から結晶化し始めた。添加が完了した後、緑色の懸濁液を冷 却し、室温で１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、固体をアセトン(250mL)ですす ぎ、24時間真空乾燥して26g(63%)を得た。UV/vis:[(MeOH)λ_max,nm]：316,350,4 15,473,739；FAB MS,(M-20Ac)⁺：m/e 1030;HRMS,(M-20Ac)⁺：m/e:1027.4036(C₄₈ H₆₆ ¹⁵⁵GdN₅O₁₀に関する計算値、1027.4016)。分析[C₅₂H₇₂GdN₅O₁₄]・0.5H₂Oに関 する計算値：C，53.96；H，6.36；N，6.05；Gd，13.59。実測値：C，53.73；H， 6.26；N，5.82；Gd，13.92。 1_Hのルテチウム(III)複今体の合成。大員環のリガンド1_H(14g、0.0153モル)を 、ルテチウム(III)アセテート水和物(9.75g、0.0230モル)およびトリエチルアミ ン(22mL)を用いて、空気で飽和させた(air-saturated)メタノール(1500mL)中で 還流し酸化的に金属化した。３〜４時間還流した後、ガス分散チューブの補助に より40分間にわたって暗茶色／緑色反応溶液に空気を吹き込んだ(流速＝20cm³/ 分)。この時点で、還流を一晩継続した。23時間後、空気をさらに40分間にわた って再び吹き込み、酸化／金属化を完了した。反応を還流で５時間継続し、次に UV-可視スペクトルの特徴により反応の完了を判断した。深緑色の溶液を室温に まで冷却し、セライトのパッドを通して濾過し、溶媒を減圧下で除去した。深緑 色の固体をアセトン(600mL)に懸濁し、室温で30分間撹拌し、次いで濾過して赤 色／茶色不純物（不完全な酸化生成物および過剰なトリエチルアミン）を洗い流 した。錯体の粗生成物をMeOH(300mL)に溶解し、約30分間撹拌し、次いでセライ トによ って濾過して１Ｌの三角フラスコに入れた。さらに50mLのMeOHおよび50mLの水を フラスコに加え、酢酸で洗浄したLZY-54ゼオライト(40g)も加えた。得られた混 合物を３時間撹拌するかまたは振盪し、次に濾過してゼオライトを除去した。ゼ オライトケーキをMeOH(100mL)ですすぎ、すすいだ溶液を濾液に加えた。濾液を 最初に150mLまで濃縮し、次に、予め処理したアンバライト IRA-904アニオン交 換樹脂（アセテート形態の樹脂）のカラム(長さ30cm×直径2.5cm)にかけた。ビ スアセテートルテチウム(III)テキサフィリン錯体を含む溶出物を回収し、減圧 下で乾燥するまで濃縮し、そして無水メタノール／t-ブチルメチルエーテルから 再結晶させて11.7g(63%)の光沢のある緑色の固体を得た。複合体について：UV/v is：[(MeOH)λ_max,nm(logε)]：354,414,474(5.10),672,732；FAB MS,[M-OAc^-]⁺ ：m/e 1106.4；HRMS，[M-0Ac^-]⁺：m/e 1106.4330([C₄₈H₆₆LuN₅O₁₀(OAc)]⁺に関す る計算値、1106.4351)。分析[C₅₂H₇₂LUN₅O₁₄]H₂Oに関する計算値：C，52.74；H ，6.30；N，5.91。実測値：C，52.74；H，6.18；N，5.84。 実施例２ ピロール窒素でのテキサフィリンの誘導体化 さらなるテキサフィリンの大員環は、ピロール窒素が誘導体化されている大員 環である。図２は、そのようなN-置換テキサフィリンの合成を示し、ここで、R_{1 1} 基は、前駆体トリピロール2_Eの中央のピロールの窒素に結合している。Wangら( 1977)は、ピロールのN-アルキル化のための１つの方法を提供している。図２に 示すような置換基R₅、R₆、R₉、およびR₁₀を有するテキサフィリン化合物の合成 は米国特許出願第08/196,964号に記載され、本明細書中で参考として援用されて いる。遊離のベース大員環は、蛍光検出を放射線照射増感の局在化手段として用 いる場合に、特に有用である。種々のテキサフィリン複合体の光学的特徴は、Se sslerら(1991)において記載され、本明細書中で参考として援用されている。 表２は、ピロール−窒素誘導体化テキサフィリン2_Gについて意図される置換基 の概略を示す。このテキサフィリンに関して、R₂およびR₃は、好ましくはエチル であり、R₄は好ましくはメチルである。R₁₁は、低級アルキル、アルケニル、ヒ ドロキシアルキル、または約３個までの炭素原子を有するアルコキシ基であり得 る；ただし、この基は第１番目の結合炭素の周りで回転可能であり、基の残りの 部分はテキサフィリン平面の外側に位置し得る。従って、好ましいアルケニルは 、CH₂CH=CH₂である。R₁₁は、最も好ましくはメチル基である。 実施例３ テキサフィリン部位指向性複合体 テキサフィリンを放射線照射増感剤として治療手順の一部としてインビボで用 いることは、処置部位に対するテキサフィリンの効果的な局在化に依存する。テ キサフィリンは、本来生体局在化特性を有し、肝臓のような脂肪親和性組織、腫 瘍およびアテロームに局在化する（例えば、米国特許第5,252,720号に記載され 、本明細書中で参考として援用する）。さらなる局在化特異性は、テキサフィリ ンまたはテキサフィリン−金属錯体を、部位指向性分子（例えば、ポリヌクレオ チドまたはオリゴヌクレオチド、例えば、実施例４に記載されたようなアンチセ ンスオリゴヌクレオチド；生物学的レセプターまたはタンパク質（例えば、抗体 、低比重リポタンパク(LDL)またはLDLのアポタンパク質；に親和性を有するペプ チドを含むポリアミド；ステロイドまたはステロイド誘導体；エストラジオール またはヒスタミンのようなホルモン；モルヒネのようなホルモン擬態；標的に結 合特異性を有する発色団または他の化合物；または、サフィリンまたはルビリン のようなさらなる大員環、と複合体化させることにより達成し得る。 テキサフィリンは特に、抗体複合体化を基にした治療において、二官能性キレ ート剤として作用するのに適している。なぜなら、テキサフィリンには抗体との 複合体化に適した官能基があるからである。それらはインビボで安定で、抗体の 免疫学的反応能を破壊しない共有結合を形成し、それらは比較的非毒性であり、 それらは、金属に結合して目的の金属を生理学的環境下に保持し、それらは生理 学的環境に容易に溶解し得る。これらのテキサフィリンのさらなる利点は、多く がさらなる機能化に適切であることである。カルボキシル化テキサフィリンの、 塩化チオニルまたはp-ニトロフェノールアセテートによる処理は、モノクローナ ル抗体または目的の他の部位指向性分子への結合に適した活性化したアシル種を 生成する。標準インサイチュカップリング法(例えば、1,1'-カルボニルジイミダ ゾール(CDI))を用いて複合体化に効果を及ぼし得る。 選択性を得る別の手段は、テキサフィリン複合体のサフィリン分子への共有結 合であり得る（Sesslerら、1992；Furutaら、1991；Sesslerら、1991；米国特許 第5,159,065号；米国特許第5,120,411号；同第5,041,078号）。サフィリンはDNA に結合し、Ｋは約10⁶M^-1（U.S.SN 07/964,607、本明細書中で参考として援用す る）であり、結合したテキサフィリン−サフィリン複合体は、サフィリン結合部 位に隣接した位置のテキサフィリン濃度を効果的に増加させ得た。サフィリンは 、テキサフィリンより高い蛍光量子収量を有するので、より多くの蛍光検出が可 能である。分子がレーザーの波長に対して最適化されているレーザーシステムが 用いられ得る。励起状態のサフィリンはそのエネルギーを、検出のために、複合 体化したテキサフィリンに移し得る。このテキサフィリン分子はさらに、選択的 放射線増感のために細胞膜を通過するように設計され得る。 実施例４ テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体 本実施例は、テキサフィリンがオリゴヌクレオチドまたはそのアナログにカッ プリングするかまたはテキサフィリンがオリゴヌクレオチドまたはそのアナログ の合成スキームに取り込まれて、相補的なオリゴヌクレオチドに結合特異性を有 するテキサフィリン−オリゴヌクレオチドまたはテキサイフィリン−オリゴヌク レオチドアナログ複合体を提供する合成手順を提供する。 アミド、エーテル、およびチオエーテルは、オリゴヌクレオチドのような部位 指向性分子をテキサフィリンにカップリングするために用いられ得る結合の代表 である。５'末端、３'末端、もしくは糖残基または塩基残基の内部にアミンで官 能化したオリゴヌクレオチドまたは他の部位指向性分子は、テキサフィリンの活 性化カルボン酸エステル誘導体で合成後に改変される。FeBr₃のようなルイス酸 の存在下において、ブロマイド誘導体化テキサフィリンは、オリゴヌクレオチド のヒドロキシル基と反応し、テキサフィリン結合基とオリゴヌクレオチドとの間 にエーテル結合を形成し得る。あるいは、１またはそれ以上のチオホスフェート 基またはチオール基を含むオリゴヌクレオチドアナログが、単数または複数のイ オウ原子でテキサフィリンのアルキルハライド誘導体と選択的にアルキル化され る。オリゴデオキシヌクレオチド−錯体複合体は、標的化DNAホスホジエステル 骨格とテキサフィリンとの間に任意の触媒相互作用を提供するように設計される 。 DNA、RNA、およびそれらのアナログの合成の一般的な論評について、以下を参 照のこと：Oligonucleotides and Analogues，F．Eckstein編、1991，IRL Press ， New York; Oligonucleotides Synthesis，M.J．Gait編、1984，IRL Press Oxfor d，England; Caraccioloら、(1989); Bioconjugate Chemistry，Goodchild，J． (1990);またはホスホネート合成、Matteucci，MD.ら、Nucleic Acids Res．14:5 399(1986)（参考文献は、本明細書に参考として援用される）。 一般に、従来の５'-３'結合を含むオリゴヌクレオチドの合成のために一般に 用いる３つの固相に基づくアプローチがある。これらは、ホスホルアミダイト法 、ホスホネート法、およびトリエステル法である。 オリゴマーDNAを合成するために商業的に用いられる現在の方法の簡単な説明 は、以下のとおりである：長さが約100残基までのオリゴマーを、市販の合成機 、例えば、Applied Biosystems Inc．(ABI)モデル392(ホスホルアミダイト化学 を用いる)で調製する。DNAは、ホスホルアミダイトと称される高反応性のリン(I II)試薬の連続した添加により３'から５'方向に合成される。最初の３'残基は、 制御孔シリカ固体支持体に共有結合され、これによりポリマーの操作が大いに容 易になる。各残基が伸長中のポリマー鎖にカップリングした後、リン(III)は、 ヨウ素溶液での短期処理により、さらに安定なリン(V)状態に酸化される。未反 応残基は無水酢酸でキャップされ、５'保護基は弱酸で除去される。このサイク ルは、所望のDNAポリマーが合成されるまで、さらに残基を付加することを繰り 返し得る。全長のポリマーは、塩基に曝すことにより、残っている保護基を除去 しながら、固体支持体から脱離される。一般的なプロトコールは、飽和エタノー ル性アンモニアを用いる。 ホスホネートを基にした合成は、ホスホン酸エステル結合（これは酸に対して 安定である）を得るために適切なアクチベーターの存在下で、遊離ヒドロキシル 基を有する固相−誘導体化ヌクレオチド鎖とカップリングされるべき位置で、ホ スホン酸部分を含む適切に保護されたヌクレオチドの反応により行われる。従っ て、ホスフェートまたはチオホスフェートへの酸化は、オリゴヌクレオチドの合 成の間、またはオリゴヌクレオチドの合成の完了後の任意の時点で行われ得る。 ホスホネートはまた、四塩化炭素の存在下で第一級アミンまたは第二級アミンと の反応によりホスホルアミデート誘導体に転化される。 トリエステル合成では、保護ホスホジエステルヌクレオチドが、カップリング 剤の存在下で、固体支持体に誘導体化された伸長中のヌクレオチド鎖の遊離ヒド ロキシル基で縮合される。この反応は、保護リン酸結合を生じ、この結合は、保 護されていないオリゴヌクレオチドを形成するために、オキシメート溶液で処理 され得る。 ３つのアプローチを一般的に示すために、取り込まれるヌクレオチドは、「活 性化」亜リン酸／リン酸基を有するとして認識される。一般的に用いられる固相 合成法の使用に加えて、オリゴヌクレオチドはまた、ジエステル合成のような液 相方法を用いて合成され得る。このような方法は実行可能であるが、一般に、任 意の実質的な長さのオリゴヌクレオチドを得るには効率が悪い。 インビボでの加水分解に耐性である好ましいオリゴヌクレオチドは、各塩基で ホスホロチオエート置換を含み得る(J．Org．Chem.，55:4693-4699，(1990)およ びAgrawal，(1990))。オリゴデオキシヌクレオチドまたはそれらのホスホロチオ エートアナログは、Applied Biosystem 380B DNAシンセサイザー(Applied Biosy stems，Inc.，Foster City，CA)を用いて合成され得る。 さらなる合成手順は、テキサフィリンを核酸合成スキームに直接的に、好まし くは固体支持体上で挿入する。テキサフィリン大員環は、オリゴヌクレオチドの 合成で使用される塩基性条件下で安定であるとは知られていなかった。例えば、 本明細書に示される結果が得られるまで、シッフ塩基であるテキサフィリンは、 オリゴヌクレオチド合成の間、特にアンモニアおよびエタノールの開裂ならびに 脱保護工程の間に用いられる塩基性条件で不安定であり得ると考えられていた。 本明細書に提供された段階合成は、手動で行われ得るか、または自動化され得 、そして液相中または固体支持体上で行われ得ることが意図される。固体支持体 合成は、自動化または手動式核酸シンセサイザーを用いて行われ得る。一般的な 支持体は、CPG(制御孔ガラス)およびCPS(制御孔シリカ)である。他の可能な固体 支持体はポリスチレン、ポリアミド／Kieselguhr、およびセルロース紙を含む。 この方法の好ましい実施態様は、固体支持体上での自動合成である。段階合成の 間にテキサフィリンをオリゴヌクレオチドに結合させることにより、改変後プロ トコールおよび生成物の第二の精製は必要でなくなる。これは、収率の向上を生 じ、規模の拡大を非常に容易にする。テキサフィリンは、遊離塩基性テキサフィ リン であり得るか、またはテキサフィリン金属錯体であり得る。 Ln(III)テキサフィリン、特にDyT2B2²⁺およびEuT2B1²⁺が、24時間室温でのエ タノール性アンモニアでの処理に対して安定であるという所見は、段階合成の間 にランタニド(III)テキサフィリン錯体でオリゴマーを誘導体化することが可能 であることを示唆する。 テキサフィリンまたはその金属錯体は、種々の方法で、オリゴヌクレオチドの 合成スキームに組み込まれ得る。可能な結合は、アミド結合、リン酸結合、チオ エーテル結合、アミノ結合、およびエーテル結合を含む。アミド結合は、大員環 の活性化カルボン酸誘導体とオリゴヌクレオチドに結合したアミノ結合基との反 応を表す。活性化は、DCCおよびNHS、EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピ ル)カルボジイミド)、またはNHS、ニトロフェニル、ペンタクロロフェニルの活 性化エステル、酸無水物、または塩化スルホニルを用いて、液層中または固体支 持体上で達成され得る。さらに、固体支持体反応のために、活性化は酸クロライ ドの形態であり得る。リン酸結合は、大員環の活性化ホスフェート誘導体とオリ ゴヌクレオチド上の５'ヒドロキシル基との反応を表す。活性化ホスフェートは 、ホスホルアミダイト、H-ホスホネート、トリエステル、またはジエステルであ り得る。 代表的な合成スキームをここに示す。図３Ａに記載のアプローチにおいて、金 属−テキサフィリン錯体3A₂は、６炭素アミン結合基を介して、固体支持体3A₁に 結合している。このアミド形成カップリング反応は、現在では、錯体を合成後に 結合させるために用いられる。テキサフィリンヒドロキシル基が、段階合成のた めに3A₃上でエステルとして保護されることに留意することが重要である。これ らの保護基は、エタノール性アンモニア処理に対して不安定である。このような 金属テキサフィリン誘導体化支持体を段階合成のために用い得、そして開裂およ び脱保護の際に、３'結合金属テキサフィリン−DNA複合体3A₄を生じる。アミド 形成反応はまた、脱保護および固体支持体からの開裂の前のDNA合成の終わりに 生じ得る。 図３Ｂに記載のとおり、金属テキサフィリン錯体3B₂のホスホルアミダイト誘 導体は、ホスファイト化剤およびジイソプロピルエチルアミンとのモノアルコー ル3B₁の反応により調製される。ヒドロキシル基は、この合成のためにエステル として再度保護される。生じるホスホルアミダイトは、最終残基としてシンセサ イザー上でカップリングされ、3B₃を形成する。このアプローチにおいて、脱保 護は、５'結合テキサフィリン金属錯体−DNA複合体3C₂を生じる。このテキサフ ィリン複合体は、結合基にアミド結合を有さない。 オリゴヌクレオチドへの内部結合にテキサフィリンを有するテキサフィリン− DNA複合体は、この段階アプローチを用いて合成され得る。ジヒドロキシテキサ フィリンを、ジメチルアミノピリジンおよびピリジンの存在下でジメトキシトリ チルクロライドで処理する。得られたモノ保護テキサフィリンを、ホスファイト 化剤およびジイソプロピルエチルアミンで処理し、モノ保護ホスホルアミダイト を得る。この生成物を、ヌクレオチド残基の代わりに、合成の間伸長中のオリゴ ヌクレオチドにカップリングさせて、内部結合にテキサフィリンを挿入する。次 いで、モノ複合体を、ヌクレオチドにさらにカップリングさせて、オリゴヌクレ オチドへの内部結合にテキサフィリンを有するテキサフィリン−DNA複合体を生 成させ得る。さらに、テキサフィリンのホスホネートまたはホスホジエステル誘 導体が、それぞれホスホネートまたはトリエステル法により同様の内部、３'、 または５'結合を形成させるために利用され得る。 オリゴヌクレオチドアナログ複合体は、本明細書に記載のように、同様の様式 でテキサフィリンにカップリングし得る。特に、ホスホロチオエート、2'-O-メ チル化リボヌクレオチド、または他の核酸アナログ（例えば、メチルホスホネー ト誘導体）は、安定性が増強されるために好ましく、誘導体化は、インビボでの ヌクレアーゼに対して備えられる。誘導体化RNA（例えば、2'-O-メチルRNAアナ ログ）のテキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体は、自己開裂に対して安定 性を提供する。RNAは、Luと錯体形成したテキサフィリンにより加水分解される ；しかし、2'-O-Me RNAは2'-OHを欠き、それ故、加水分解に対して安定である。 従って、RNAアナログオリゴマーは、テキサフィリン-オリゴヌクレオチド複合体 についてDNAオリゴマーより安定であり得る。RNAアナログ複合体の合成は、既に 本明細書に記載したテキサフィリン-DNA複合体と同様である。RNAアナログ複合 体は、DNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖と相補的であり得、二重らせんへの 結合の過程で三重らせんを形成する。 テキサフィリン−オリゴヌクレオチド複合体の合成のためのさらなる方法は、 ヌクレオチドを酵素的に取り込むことである。種々のDNAおよびRNAポリメラーゼ が用いられ得るが、E．coli由来のDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントおよ びターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼが好ましい。Goodchild ，J．(1990)は、オリゴヌクレオチドの酵素合成の一般的な説明を提供し、本明 細書に参考として援用される。 実施例５ ネズミ白血病細胞株の放射線増感 本実施例は、マウスL1210白血病細胞株の放射線分解を促進するための放射線 増感剤としてGdT2B2²⁺の使用を記載する。金属の存在は、テキサフィリンの放射 線増感特性に重要でない；しかし、金属はテキサフィリン錯体に安定性を与える 。対イオンを有する金属テキサフィリン錯体は、本出願の目的のために中性錯体 と意図される；例えば、GdT2B2(OAc)₂は、中性錯体である。GdT2B2²⁺のようなテ キサフィリンの金属錯体は、２つの正電荷を有する。GdT2B2²⁺が1つの電子を享 受する場合、それは短命π-ラジカルカチオン、GdT2B2^+●となる。π-ラジカル カチオンは1つのプロトンを享受するか、またはテキサフィリンラジカルGdT2B2( H)^2+●に転位し、以下に記載のように有意な安定性を有する。 物理学的研究 Gd-T2B2²⁺の放射線化学を、パルス放射線分解法により研究し、短バーストの 電離放射線(4MeVで100ns持続時間)をGd-T2B2²⁺水溶液に照射し、続く反応を吸収 スペクトル分析によりモニターした。溶液の条件は、ヒドロキシルラジカルまた は水和電子との反応のために放射線化学を最適化するように変化させた。第一に 、Gd-T2B2²⁺(1×10^-4M)含有水溶液(pH7)を、第二群のヒドロキシルラジカルに水 和電子を転化するように亜酸化窒素で飽和した： ｅ_aq ^-＋N₂O＋H₂O→N₂＋OH^-＋OH^● 吸収スペクトル分析によると、これらの条件下でヒドロキシルラジカルとGd-T 2B2²⁺との間に明らかな反応はなかった。第二に、Gd-T2B2²⁺(1×10^-4M)含有水溶 液(pH7)を、イソプロパノール(0.1M)の添加後、窒素で飽和した。この場合、第 一 の放射線分解事象で形成されたヒドロキシルラジカルは、イソプロパノールから 第三水素原子を引き抜き、アセトンケチルラジカルを形成する： OH^●＋(CH₃)₂CHOH→H₂O＋(CH₃)₂C^●OH この後者の種は、強力な還元剤であり、その結果としてこれらの反応条件は、 還元環境を提供する。水和電子およびアセトンケチルラジカルの両方が、１電子 プロセスでGd-T2B2²⁺を還元する。Gd-T2B2²⁺についてサイクリックボルタンメト リーにより測定された１電子還元電位は、約0.08V対NHEであることが見出され、 従って、化合物は、水溶液中で容易に還元される。 Gd-tex²⁺＋ｅ_aq ^-→Gd-tex^+● Gd-tex²⁺＋(CH₃)₂C^●OH→Gd-tex^+●＋(CH₃)₂CO＋H⁺ 結果として生じたGd-T2B2²⁺のπラジカルカチオン、Gd-T2B2^+●は吸収スペク トルの変化から容易に検出され、約200マイクロ秒にわたって崩壊することが見 出された。この反応は、Gd-T2B2²⁺の回復を生じず、その割合は、pHの減少にと もなって増加する。この基準において、観察される反応は、πラジカルカチオン のプロトン付加による： Gd-tex^+●＋H⁺→Gd-tex(H)^2+● プロトン付加されたラジカルであるGd-T2B2(H)^2+●は、もとのGd-T2B2²⁺を復 活しない錯体反応により、約30秒の寿命を有しながら非常にゆっくりと崩壊する 。このラジカルの寿命は、酸素の存在により影響されない。 追加のパルス放射線分解実験は、Gd-T2B2^+●がスーパーオキシドイオン(O₂ ^-) 、二酸化炭素πラジカルアニオン(CO₂ ^-)、ならびにエタノールおよびメタノール からの水素引抜により形成された炭素中心ラジカルによるGd-T2B2²⁺の還元によ り形成されたことを示した。さらに、プロトン付加されたラジカルが、水素原子 とGdT2B2²⁺との間の反応により形成されることが示された。 Gd-tex²⁺＋H^●→Gd-tex(H)^2+● 従って、放射線分解条件下で、全ての還元当量はGd-T2B2²⁺をGd-T2B2(H)^2+● に還元するために、反応条件にかかわらず利用され得る。 実験条件。細胞障害の研究のための放射線供給源は、Machlett OEG60 X線管を 装備したPhillips 50 KVP定電圧X線発生器、モデル120.102.1であった。線量測 定は、Friecke線量計を用いて行った。このシステムは、約２cmの直径の標的域 に110ラド／分を送達する。サンプルを、12ウエルトレーを装備するペトリ皿に 入れた。３枚の非放射線照射皿およびGdT2B2²⁺を有さない細胞を含む３枚の皿を コントロール実験として供した。細胞およびGdT2B2²⁺を含む６枚の皿を所定の期 間放射線に曝した。各被曝後にトレーを機械アームで動かした。放射線分解後、 細胞を24時間インキュベートし、細胞生存率を、従来の細胞計測技術を用いて、 メチルレッド濃度およびトリパンブルー排除法により算出した。全ての実験は対 数増殖期の細胞(５×10⁵細胞/mL)を用いて行った。マウス白血病L1210細胞をRPM I1640細胞培地で維持した。 GdT2B2²⁺の保存溶液(1mM)を精製水中で調製し、そして小アリコートを細胞懸 濁液(５×10⁵細胞/mL)に添加した。この混合物を37℃で１時間インキュベートし 、その後単離し、洗浄し、そして栄養溶液で懸濁した。ほとんどの場合、GdT2B2²⁺ の濃度は、吸収スペクトル分析により測定されたとおり80μMであった。 細胞内DNA(またはRNA)の放射線誘導開裂を、アルカリ溶出クロマトグラフィー により測定した。ポリ塩化ビニルフィルター(孔サイズ２μm)を用いた。サンプ ルは、合計20Gyの放射線に曝した。 結果。イソプロパノール水溶液中でGdT2B2²⁺を用いて実施したパルス放射線分 解実験を、図４、５Ａ、および５Ｂに示す。図４は、GdT2B2^2+●πラジカルカチ オン形成を示す。図５Ａは、酸素を含まない溶液中でのπラジカルカチオンの崩 壊を示し、そして５Ｂでは、O₂の存在下での崩壊を示す。データは、GdT2B^2+● πラジカルカチオンの顕著な安定性を示し、そしてGdT2B2^+●がその電子を酸素 に渡さず、かつ酸素の存在により影響されないことを示す。このデータは、以下 にGdT2B2²⁺についての中間放射線分解生成物を示唆する： GdT2B2^+●πラジカルカチオンは、２ミリ秒未満の半減期を有する。それは、プ ロトンを享受するか、またはテキサフィリンラジカルGdT2B2(H)^2+●に転位し、G dT2B2(H)2^+●は十分な安定性および約30秒の相対的に長い半減期を有する。 図６のデータは、DNAおよびRNAの４つのヌクレオチド塩基の１つであるシトシ ンとGdT2B2(H)^2+●ラジカルとの反応についての速度定数を示す。GdT2B2(H)^2+● はシトシンと共有結合を形成し、おそらく、この反応は、GdT2B2(H)^2+●が結合 した核酸を不活性化すると考えられる。 従って、テキサフィリンは、放射線増感剤として使用するために３つの有益な 特性を有する： ｉ）テキサフィリンの低レドックス電位により、水和電子がテキサフィリンに流 れ、OH^●に対し損傷を生じさせ得る。 ii）テキサフィリンラジカルは比較的安定であるが、しかし隣接分子を共有結合 的に変性するために容易に反応する。 iii）テキサフィリンは、固有の生体局在化を有しおよびO₂の存在または非存在 に無関係であるために、固形新生物の低酸素領域の処置に特に有効である。それ は、レドックスサイクルとして酸素を「戻し」得る。 図７は、マウスL1210細胞を20μM GdT2B2²⁺および放射線照射に曝した実験か らのデータを示す。コントロールカーブは、GdT2B2²⁺の非存在下での細胞の殺傷 を示し、GdTXPを標識したカーブは、GdT2B2²⁺の存在下での細胞の殺傷を示す。 増感剤促進比(SER)は、GdT2B2²⁺を有さない95％の細胞を殺すのに必要な線量をG dT2B2²⁺を有する95％の細胞を殺すのに必要な線量で割った比である。増感剤に 効果がない場合、比は1.0である；非常に効果的な増感剤は、3.0の比を有する。 図７のデータは、20μMでGdT2B2²⁺は1.62のSERを有することを示す。(1.5より大 きいSERが、臨床上有意である)。SERを測定するための２つのさらなる方法は以 下のとおりである：ｉ）カーブが直線である場合、傾きを比較する；SERはこの 化合物の傾き対コントロールの傾きの比である、またはii）有用または臨床上重 要である特定の線量で、コントロールにおいて殺傷した細胞数(または％)の比を 、この化合物により殺傷した細胞数(または％)と比較する。 SERは、図８に示すようにGdT2B2²⁺の濃度の増加に伴い増加する。例えば、80 μMで、SERは2.2より大きく、生理学的に容認可能な最も高いレベルのGdT2B2²⁺ が、放射線増感の目的のために所望されることを示す。 合計20グレイの放射線および種々のレベルのGdT2B2²⁺に曝したL1210細胞から 得た全核酸サンプルをサイズ選択フィルターに通した(１グレイは、100ラドに等 しい吸収放射線線量の単位である)。図９のデータは、核酸はGdT2B2²⁺の非存在 下ではフィルターを通らなかったこと、およびGdT2B2²⁺の存在下で核酸はフィル ターを通るフラグメントに開裂されたことを示す。より高いレベルのGdT2B2²⁺に 曝して大量のフラグメントを生成した。明らかに、核酸鎖の切断は、GdT2B2²⁺の 存在下で放射線の結果として生じる。ヒドロキシルラジカルは鎖切断の原因であ りそうである。 本明細書に記載のテキサフィリンの放射線増感特性は、個体の治療に有効な放 射線線量の減少を可能にし得る。従って、処置が本発明のテキサフィリンの使用 を含む場合、悪心および正常な細胞に対する損傷のような放射線の副作用は減少 し得る。個体について予測される用量のレベルは、複数回投与で投与される２〜 20μmol/kgの範囲であり得る(例えば、各分割照射の前)。 テキサフィリンのこの放射線増感特性は、挿入された金属に依存せず、テキサ フィリンリガンドのみの機能である(すなわち、Gd(III)イオンは、このプロセス で還元されない)。ガドリニウムテキサフィリン錯体についてのインビトロおよ びインビボでの研究はまた、放射線損傷を増強する可能性を示唆し、そしてこの 増強が酸素の存在により影響されないので、テキサフィリンは、酸素性および低 酸素性の両方の腫瘍細胞で損傷を増加する可能性を有する。 実施例６ ヒト癌細胞株の放射線増感 本実施例は、インビトロでのヒトHT-29結腸腺癌細胞株の放射線分解を促進す るための放射線増感剤として、本発明による３つのテキサフィリンの使用を記載 する。 RMPI 1680栄養培地で維持されたHT-29細胞を種々の濃度のGdT2B2²⁺、GdT2BET^{2 +} 、またはLuT2BET²⁺テキサフィリンのいずれかで24時間37℃でインキュベートし た。インキュベート後、細胞を回収し、洗浄し、そして栄養培地に再懸濁した。 細胞懸濁液のアリコート(５mL；５×10⁵細胞/mL)を滅菌ペトリ皿にいれ、そして 種々の時間放射線分解に曝した。放射線線量をFricke線量測定により換算した。 放射線分解後、細胞を37℃で７日間インキュベートし、その後、細胞生存率をト リパンブルー排除法により評価した。結果は、非照射細胞に対する生存割合の対 数により示した。コントロールは、テキサフィリンに曝さないが、同じ条件下で 照射した細胞を用いて実施した。 20μM濃度での化合物についての結果は図１０Ａに示し、各テキサフィリン(Gd T2B2²⁺、▲；GdT2BET²⁺、◆；およびLuT2BET²⁺、■)の存在下で、細胞の殺傷の 促進が生じたことを示す。 GdT2B2²⁺についてそうであるように、増感剤促進比(SER)は、下記の表４およ び図１０Ｂに示すように、GdT2BET²⁺およびLuT2BET²⁺の各濃度の増加とともに増 加した。図１０Ｂはまた、GdT2BET²⁺の非存在下(ａ)および３つの濃度(ｂ、10μ M；ｃ、20μM；ｄ、40μM)でのGdT2BET2+の存在下で細胞の殺傷を示す。 種々のヒト(HT29)細胞株およびマウス(L1210、VA13、およびRIF-1)細胞株を用 いて20μM GdT2B2²⁺についてSERを決定するために行ったインビトロ研究は、有 意な放射線増感を示す(それぞれ、1.92、1.62、1.52、および1.05のSER)。特筆 すべきは、1.92のSERである。なぜなら、これはGdT2B2²⁺がヒト細胞株、ヒト結 腸癌細胞株HT29に有意な放射線増感を提供することを示唆するからである。 T2B2ガドリニウム錯体およびT2BETガドリニウム錯体の比較は、全ての測定さ れた濃度でHT29細胞において同等のSERを提供した。20μMのT2B2(SER=1.92)およ びT2BET(SER=2.08)でのHT29細胞の同等の放射線増感が表４に示される。これら の結果に基づき、２つの化合物は、同等の放射線増感剤と考えられる。さらに、 10、20、および40μMのT2BETにHT29細胞を曝した後の放射線増感(表４)は、T2BE Tとの有意な放射線増感を示す(それぞれ、SER=1.59、2.08、および2.45)。 これらの実験は、ガドリニウムテキサフィリン錯体が、パルス放射線分解条件 下で非常に容易に還元されることを示す。このプロセスは、酸素に依存しない。 還元ガドリニウムテキサフィリンラジカルは、シトシンの共有結合を変性し得、 あるいは細胞内DNAを変性し得る。ヒトおよびマウス細胞株を用いるインビトロ での研究は、有意な放射線増感を示す。DNAへの取り込みが、テキサフィリン誘 導性放射線増感の機構に関与しないので、この放射線増感は、酸素または細胞複 製に依存しない。 実施例７ インビボでの放射性感作 本実施例は、テキサフィリンT2BETのインビボでの放射性増感剤の効果を示す データを提供する。 SMT6腫瘍を有するドナーマウスを安楽死させ、そして腫瘍を無菌条件下で脚か ら取り出した。生存細胞数を顕微鏡下で算出し、そして次いで４〜６百万の細胞 を、麻酔下でレシピエント無腫瘍マウス下肢に注入した。レシピエントマウスの 腫瘍は、放射線処理前では、細胞の成長速度に依存して、４〜７日の成長期を経 た。 放射線処理の日に、ほぼ同じサイズの腫瘍を有するマウスを選択した。ガドリ ニウムテキサフィリンGdT2BET²⁺(2μmol/mL)を、尾静脈に注射することにより静 脈内に投与した。マウスを２または５時間後に照射処理した。250KV Phillips X 線機械およびリードシールドを有する特別なマウス下肢ジグを用いた。腫瘍を有 する右脚のみをX線に曝すように、ジグの内側にマウスをうつ伏せにして配置し た。単回線量が10、20、30、40、または50グレイの放射線を照射した。６つの研 究は、各コントロールおよび線量のグループにおいて平均して４匹の実験動物で 行った。死亡数および病気でない生存データは、放射線治療後75日間までの間に 、腫瘍サイズの定期的な測定と同時に得た。Kaplan-Meier生存カーブをプロット し、ｐ値をカーブのログランク分析(log rank analyses)により決定した。 実験は、GdT2BET²⁺注射および放射線照射が、コントロールと比較して評価さ れた全てのグループにおいて治療結果を改善することを示した。放射線だけを受 けた動物と比較して、統計学的有意性は、30グレイの放射線線量を受ける動物で のみ得られた。10グレイ(p=0.86)および20グレイ(p=0.50)の動物についてのKapl an-Meier生存カーブのログランク分析(図１１Ａ〜１１Ｂ)は、GdT2BET²⁺を有し ても有さなくてもそれほど異ならないが、30グレイ(p=0.03)の動物についてのカ ーブは分岐した(図１１Ｃ〜１１Ｄ)。40(p=0.60)および50グレイ(p=0.97)につい てのカーブは、処理においていかなる統計学的有意差をも示さない。しかし、統 計学的有意性を示さなかった研究は、より少数の動物に基づく。 データは、30グレイ線量の放射線が、腫瘍成長の部分的な制御を生じることを 示し、これはT2BET注射により効果を増し得る(図１１Ｃ〜１１Ｄ)。低線量の放 射線は、T2BET注射投与から利益を得るには十分でない。より高い線量では、腫 瘍応答は、コントロール(放射線照射のみ)動物ならびにT2BET注射および放射線 処理した動物の両方で非常に良く、増感剤での処理の利益を観察することが難し かった。 放射線増感剤としてのT2BET注射の効果はまた、生存および癌のない(最初の部 位)生存をプロットすることによりこれらの研究で示された(図１１Ａ〜１１Ｄ) 。腫瘍成長の遅れもまた、放射線(30、40、および50グレイ)およびT2BETを注入 した放射線増感剤の両方を受ける動物でより大きかった。 実施例８ 局在化および／または光力学的治療を合わせた放射線増感 本実施例は、局在化および放射線増感を合わせた方法、ならびに新生物組織お よびアテロームの破壊のためにPDTと合わせた放射線増感におけるテキサフィリ ンの使用を記載する。検出可能なテキサフィリンと関連づけることによる局在化 と合わせた放射線増感の方法は、以下のとおりである。検出可能なテキサフィリ ンを、新生物またはアテロームを有する宿主に投与する。宿主の局在化部位を、 テキサフィリンに関連づけることにより決定する。局在化手段は、特に、テキサ フィリンが非メタル化であるか、または反磁性金属と錯形成されている場合、蛍 光スペクトル分析；テキサフィリンが常磁性である金属を含む場合、磁気共鳴両 像法；金属がγ放出性である場合、ガンマカメラ身体走査法であり得るか；また は診断用X線、特に、テキサフィリンに結合した金属のＫ電子の周囲にエネルギ ーを有する単色または多色X線を用いることによる。放射性免疫診断用γ放出性 金属は、本明細書に参考として援用される米国特許第5,252,720号に記載されて いる。好ましいγ放出性金属は、¹¹¹In(III)である。テキサフィリン常磁性金属 錯体は、MRIにより腫瘍を視覚化する利益を提供する。好ましい常磁性金属は、G d(III)、Fe(III)、またはMn(II)であり、そして最も好ましい常磁性金属はガド リニウムである。処理映像面の明瞭度が、放射線治療送達の重要な成分であるの で、放射線治療と画像法とを合わせる機会がアピールされる。マウスおよびウサ ギにおけるGdT2BET²⁺注射をともなうインビボ実験は、GdT2BET²⁺注射が、５μmo l /kg程度の低用量で腫瘍の良好なコントラスト増強を生じ、¹⁴C標識したGdT2BET^{2 +} を用いる生体分布研究は、腫瘍と周辺組織の間に良好な差異を示した。 GdT2BET²⁺は、その電子スペクトルの可視部分で光吸収能を有する(主要吸収ピ ークが約415、473、および739ナノメーター)が、GdT2BET²⁺は、Gd非対合電子が 、光により誘導された有機リガンドの励起状態を直ぐに失活するので、光増感剤 ではない。遊離塩基テキサフィリンまたは反磁性金属と錯形成したテキサフィリ ンは感光性であり、そして光照射の際に一重項酸素を生じる。 光力学的治療と組み合わせた放射線増感の方法は以下の通りである。テキサフ ィリンを、良性または悪性の新生物細胞またはアテロームを有する宿主に投与す る。テキサフィリンは、放射線増感特性、および周辺組織に関連して良性または 悪性の新生物細胞またはアテロームプラークに対する選択的生体局在化を示す。 宿主の局在化部位を、以下の例を用いて、テキサフィリンに関連づけることによ り決定する：例えば、テキサフィリンの常磁性金属錯体が投与される場合、磁気 共鳴画像法；遊離塩基テキサフィリンまたはテキサフィリン反磁性金属錯体が投 与される場合、蛍光；またはγ放出性金属が投与されたテキサフィリン内で錯形 成される場合、ガンマカメラ(またはSPECT、シングルフォトン断層撮影)身体走 査法。好ましい常磁性金属は、Gd(III)である。好ましい反磁性金属は、Lu(III) 、In(III)、またはLa(II)である。好ましいγ放出性金属は、¹¹¹In(III)である 。 テキサフィリンの固有の放射線増感特性は、テキサフィリンの近位に照射され る場合、電磁放射線をより効果的および選択的にし得る。従って、より低い線量 の放射線を用い得る。放射線は、外部に由来し得るか、またはテキサフィリンに 結合した放射性金属のような内部に由来し得る。放射性金属の例は、¹⁵³Gd、¹¹¹ In、または⁹⁰Yを含む。あるいは、本質的に同一の生体局在化特性を有し、光に 曝される際に一重項酸素を生じる能力を示す第二テキサフィリン金属錯体を投与 する。第二のテキサフィリン金属錯体を、良性または悪性の新生物細胞またはア テロームの近接部で光照射し、あるいは光ファイバー(fiber optics)またはレー ザーを用いて光照射し、生成した一重項酸素から新生物組織破壊またはアテロー ムプラーク破壊を引き起こす。第二のテキサフィリン金属錯体中の金属は、反磁 性金属であり、好ましくはLa(III)、Lu(III)、またはIn(III)である。 さらなる実施態様は、テキサフィリン放射線増感剤および処置用感光性テキサ フィリンの使用である。この金属は放射線増感にとって重要でないので、この分 子は単一のテキサフィリン反磁性金属錯体であり得る。次いで、光力学的治療の ために光を用い、その後に電磁放射線照射するかまたは同時に電磁放射線照射す ることにより、細胞の共同作用的殺傷が達成される。別の実施態様は、内在性放 射性キレート化テキサフィリンおよび外部より適用した放射線による共同作用性 殺傷である。放射線増感および放射線治療の方法のインビトロでの使用は、骨髄 の処置、輸血または器官の移植における滅菌を含む。 テキサフィリン−金属錯体は、それ自身が、新生物、新生物組織、またはアテ ロームに対し高い固有の生体局在化選択性を示すことについて選択される。例え ば、B2T2およびT2BETテキサフィリンは、脂質含有量の高い組織、アテローム、 肝臓、腎臓、および新生物にインビボ親和性を示す。 テキサフィリン錯体は、このような生体医用放射線増感剤および光増感剤の良 い候補である。それらは、ヒドロキシルラジカルが放射線損傷を引き起こし得る 照射域で電子を「吸収し」、そしてテキサフィリンラジカルは隣接分子と共有結 合的に反応し、さらに放射線損傷を起こす。それらは、容易に入手され、低い固 有の細胞性障害、長い波長の吸収を有し、一重項酸素を生成し、生理学的環境で 可溶性であり、部位特異的に移動する分子に複合体化される能力を有し、迅速な 排除を有し、安定であり、そして合成的な変性に容易に供される。細胞の画像化 および破壊のためにテキサフィリンを用いる有意な利点は、以下のとおりである ： ｉ）1つのテキサフィリンが、両方の機能のために用いられ得る； ii）テキサフィリンは、固有の選択的生体局在化を有し、誘導体化のための電位 を有し、この局在化を促進する； iii）テキサフィリンは、放射線増感剤であるので、放射線照射はより効果的で あり、そして低線量の放射線が用いられ得、従って、ほとんど副作用を経験しな い；および iv）金属錯体は、放射線増感に必要でない。 本発明は、生体局在化選択性および放射線増強特性を有する単一な薬剤ととも に、特定の細胞を「見」て、「殺傷する」方法を提供する。 以下の参考文献は、以下に引用される理由のために、 本明細書中に参考としてその関連部分が採用されている。 本明細書中に記載される実施例および実施態様は説明のみを目的としており、 そして、その観点における種々の改変が当業者において示唆され、本出願の意図 および範囲ならびに添付の請求の範囲内に包含されることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 セスラー，ジョナサン エル. アメリカ合衆国 テキサス 78731，オー スティン，ウェンデル コーブ 3505―エ イ (72)発明者 ハリマン，アンソニー エム. フランス国 ビシェーム 67800 リュ デュ カナル，18 (72)発明者 ミラー，リチャード エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94028, ポートカ バレー，オーロン ８ (72)発明者 モディー，タラック ディー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086, サニーベール，ブエナ ヴィスタ アベニ ュー 243，アパートメント ナンバー206 (72)発明者 ヘミー，グレゴリー ダブリュー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086, サニーベール，ナンバー1508，ブエナ ヴ ィスタ アベニュー 243 (72)発明者 クラール，ビラディミア エイ. アメリカ合衆国 テキサス 78731，オー スティン，ナンバー254，グレイストーン ドライブ 3500 (72)発明者 マグダ，ダレン アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014, カパティーノ，ユニバーシティー ウェイ 10237

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．放射線増感剤として使用するための薬学的組成物の調製におけるテキサフ ィリンの使用。 ２．前記テキサフィリン組成物がさらに、宿主中の新生物またはアテロームの 局在化のために用いられる、請求項１に記載の使用。 ３．前記局在化が、蛍光手段、磁気共鳴画像手段、またはガンマカメラ身体走 査手段により行われる、請求項２に記載の使用。 ４．前記テキサフィリンが感光性テキサフィリンであり、そして該感光性テキ サフィリン組成物がさらに、新生物またはアテロームの光力学的治療のために用 いられる、請求項１、２、または３に記載の使用。 ５．前記薬学的組成物の調製において感光性テキサフィリンをさらに含む、請 求項１、２、または３に記載の使用であって、該組成物がさらに、新生物または アテロームの光力学的治療のために用いられる、使用。 ６．前記テキサフィリンが金属と錯形成されている、請求項１から５のいずれ か１項に記載の使用。 ７．前記金属がγ放出性金属である、請求項６に記載の使用。 ８．前記組成物がガンマカメラ身体画像法によるテキサフィリンの局在化のた めに用いられる、請求項７に記載の使用。 ９．前記金属が常磁性金属である、請求項６に記載の使用。 １０．前記組成物が磁気共鳴画像法によるテキサフィリンの局在化のために用 いられる、請求項９に記載の使用。 １１．前記金属が放射性金属である、請求項６に記載の使用。 １２．前記テキサフィリンが以下の構造ＡまたはＢを有する、請求項１から１ １のいずれか１項に記載の使用： ここで、 ＭはＨ、二価金属カチオン、または三価金属カチオンであり； Ｒ₁からＲ₄およびＲ₆からＲ₉は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド 、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニ トロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロ キシアルキル、糖類、アミノアルキル、オキシアミノアルキル、カルボキシ、カ ルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、部位指向性分子、または部位指 向性分子に対するカップルであり； Ｒ₅およびＲ₁₀は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキ ル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、アミノアルキル、オキシアミ ノアルキル、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアルキル、または部位指向 性分子に対するカップルであり； Ｒ₁₁は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキル であり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原 子の周囲で回転可動性を有し； ここでＲ₆およびＲ₉が水素以外である場合、Ｒ₅およびＲ₁₀は水素またはメ チルであり； ここでＲ₅およびＲ₁₀が水素以外である場合、Ｒ₆およびＲ₉は水素、ヒドロ キシル、またはヨーダイド以外のハライドであり；そして Ｎは０、１、または２である。 １３．前記部位指向性分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、 ステロイド、ホルモン、ホルモン擬態、または大員環である、請求項１２に記載 の使用。 １４．Ｒ₁が(CH₂)₂CH₂OHであり；Ｒ₂およびＲ₃がCH₂CH₃であり；Ｒ₄がCH₃であ り；Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₉、およびＲ₁₀がHであり；そしてＲ₈が部位指向性分子、 または部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ₁₁がメチルである、請 求項１２または１３に記載の使用。 １５．Ｒ₄がメチルであり、そしてＲ₁からＲ₃およびＲ₅からＲ₁₀が、テキサフ ィリンＡ₁からＡ₃₈に関する表１に記載の通りである、請求項１２または１３に 記載の使用。 １６．Ｒ₂およびＲ₃がエチルであり、Ｒ₄がメチルであり、そしてＲ₁およびＲ₅ からＲ₁₀が、テキサフィリンＢ１からＢ２８に関する表２に記載の通りである 、請求項１２または１３に記載の使用。 １７．Ｒ₁が(CH₂)₂CH₂OHであり；Ｒ₂およびＲ₃がCH₂CH₃であり；Ｒ₄がCH₃であ り；Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₉、およびＲ₁₀がHであり；Ｒ₇およびＲ₈がOCH₂CH₂CH₂OHであり ；そしてＲ₁₁がメチルである、請求項１２に記載の使用。 １８．Ｒ₁がCH₂CH₂CH₂OHであり；Ｒ₂およびＲ₃がCH₂CH₃であり；Ｒ₄がCH₃であ り；Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₉、およびＲ₁₀がHであり；Ｒ₇およびＲ₈がO(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂O CH₃であり；そしてＲ₁₁がメチルである、請求項１２に記載の使用。 １９．前記感光性テキサフィリンが反磁性金属と錯形成されており、そして該 反磁性金属がLu(III)、La(III)、およびIn(III)からなる群から選択される、請 求項４または５に記載の使用。 ２０．前記薬学的組成物が、新生物またはアテロームを有するヒト患者に投与 される、請求項１から１９のいずれか１項に記載の使用。 ２１．放射線増感剤を用いる新生物またはアテロームを有する患者の放射線治 療の改善方法であって、該改善が放射線増感剤として有効量のテキサフィリンで 該患者を処置する工程を包含する、方法。 ２２．以下の構造を有するテキサフィリン： ここで、 Ｒ₁からＲ₄およびＲ₆からＲ₉は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド 、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニ トロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロ キシアルキル、糖類、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアル キル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり； Ｒ₅およびＲ₁₀は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキ ル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボ キシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり； Ｒ₁₁は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキル であり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原 子の周囲で回転可動性を有し； ここでＲ₆およびＲ₉が水素以外である場合、Ｒ₅およびＲ₁₀は水素またはメ チルであり；そして ここでＲ₅およびＲ₁₀が水素以外である場合、Ｒ₆およびＲ₉は水素、ヒドロ キシル、またはヨーダイド以外のハライドである。 ２３．前記部位指向性分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、 ステロイド、ホルモン、ホルモン擬態、または大員環である、請求項２２に記載 のテキサフィリン。 ２４．Ｒ₁が(CH₂)₂CH₂OHであり；Ｒ₂およびＲ₃がCH₂CH₃であり；Ｒ₄がCH₃であ り；Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₉、およびＲ₁₀がHであり；Ｒ₈が部位指向性分子、または 部位指向性分子に対するカップルであり；そしてＲ₁₁がメチルである、請求項２ ２または２３に記載のテキサフィリン。 ２５．Ｒ₁が(CH₂)₂CH₂OHであり；Ｒ₂およびＲ₃がCH₂CH₃であり；Ｒ₄がCH₃であ り；Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₉、およびＲ₁₀がHであり；Ｒ₇およびＲ₈がOCH₂CH₂CH₂OHである か、またはＲ₇およびＲ₈がO(CH₂CH₂O)₂CH₂CH₂OCH₃であり；そしてＲ₁₁がメチル である、請求項２２に記載のテキサフィリン。 ２６．請求項２２または２３に記載のテキサフィリンを合成する方法であって 、以下の工程を包含する、方法： 有機溶媒中で、非芳香族テキサフィリン、ブレンステッド塩基、および酸化 体を混合する工程であって、ここで、該芳香族テキサフィリンは約３個までの炭 素原子のアルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキルを 有し、かつ中心トリピラン環窒素上の第１結合炭素原子の周囲で回転可動性を有 する、工程；および 該混合物を、少なくとも２時間室温で撹拌するかまたは還流下で加熱して、 芳香族テキサフィリンを形成する工程であって、該芳香族テキサフィリンは約３ 個までの炭素原子のアルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシ アルキルを有し、かつ中心トリピラン環窒素上の第１結合炭素原子の周囲で回転 可動性を有する、工程。 ２７．前記非芳香族テキサフィリンが、構造Ｉを有するジホルミルトリピロー ルと、構造IIを有するオルト−フェニレンジアミンとを縮合させることにより生 成される、請求項２６に記載の方法： ここで、 Ｒ₁からＲ₄およびＲ₆からＲ₉は、独立して、水素、ヨーダイド以外のハライド 、ヒドロキシル、アルキル、アリール、ヨードアルキル以外のハロアルキル、ニ トロ、ホルミル、アシル、ヒドロキシアルキル、オキシアルキル、オキシヒドロ キシアルキル、糖類、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアミドアル キル、部位指向性分子、または部位指向性分子に対するカップルであり； Ｒ₅およびＲ₁₀は、独立して、水素、アルキル、アリール、ヒドロキシアルキ ル、オキシアルキル、オキシヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、カルボ キシアミドアルキル、または部位指向性分子に対するカップルであり； Ｒ₁₁は、アルキル、アルケニル、オキシアルキル、またはヒドロキシアルキル であり、ここで、これらは約３個までの炭素原子を有し、そして第１結合炭素原 子の周囲で回転可動性を有し； ここでＲ₆およびＲ₉が水素以外である場合、Ｒ₅およびＲ₁₀は水素またはメ チルであり；そして ここでＲ₅およびＲ₁₀が水素以外である場合、Ｒ₆およびＲ₉は水素、ヒドロ キシル、またはヨーダイド以外のハライドである。 ２８．Ｒ₁₁がメチルである、請求項２７に記載の方法。