JPH10276787A - アスペルギルス・オリザによるタンパク質の製造方法 - Google Patents

アスペルギルス・オリザによるタンパク質の製造方法

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JPH10276787A
JPH10276787A JP9356759A JP35675997A JPH10276787A JP H10276787 A JPH10276787 A JP H10276787A JP 9356759 A JP9356759 A JP 9356759A JP 35675997 A JP35675997 A JP 35675997A JP H10276787 A JPH10276787 A JP H10276787A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 アスペルギルス・オリザを用いるタンパク質
の製造方法。 【解決手段】 アスペルギルス・オリザにおいて、タン
パクを発現させ且つ分泌するための新規な方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はアスペルギルス・オ
リザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）による
異種タンパク生成物の分泌生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】今日までに、組換えＤＮＡ技術によるポ
リペプチドまたはタンパクを生産するため数多くの方法
が開発されてきた。主な興味は細菌および酵母に集中さ
れてきたのであり、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、
バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）およびサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は例え
ば発現および選択系に関して詳細に特徴化されているも
のである。
【０００３】上記の微生物のほかに、アスペルギルス・
ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）のような
糸状菌は、詳細に特徴化されている組換えＤＮＡベクタ
ー用の宿主微生物として有望な候補であり、酵素を商業
的に生産するのに広範囲に用いられている微生物であ
る。形質転換された宿主微生物から形質転換細胞を選択
できる選択マーカーが用いられる形質転換系の開発に、
特に努力が集中されてきた。
【０００４】過去数年間にアスペルギルス・ニドランス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の形質
転換のための各種選択マーカーが報告され、菌の細胞分
化を制御する遺伝学的および分子学的方法を研究する目
的で糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ
の組込み形質転換の手法が近年になり開発されてきた。
【０００５】Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換は、Ｎ
ｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａｐｙｒ−４遺伝子
（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、
（１９８３年）、２８４〜２８９頁）、Ａ． ｎｉｄｕ
ｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子（Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．
ら、Ｇｅｎｅ、第２６巻、（１９８３年）、２０５〜２
２１頁）、Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ遺伝子
（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４
年）、１４７０〜１４７４頁）およびＡ． ｎｉｄｕｌ
ａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子（Ｊｏｈｎ，Ｍ．Ａ．およびＰ
ｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．，第６巻、（１９８４年）３８６〜３８９頁）を含
むプラスミドを用いて説明されてきた。形質転換するＤ
ＮＡは、比較的低い頻度（典型的には１０００個未満の
形質転換体／１μｇのＤＮＡ）で宿主ゲノムに組込まれ
ることが分かった。
【０００６】ごく最近に、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍ
ｄＳ遺伝子を用いるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒの形質転換が報告され（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．とＨｙ
ｎｅｓ，Ｍ．Ｊ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第４
巻、（１９８５年）、４７５〜４７９頁）、ａｍｄＳは
単一の窒素源としてのアセタミド上では強力には成長で
きないＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換
に使用される有力な選択マーカーであることが示され
た。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓのａｒｇＢ遺伝子を用いるＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの形質転換も、最近
報告された（Ｂｕｘｔｏｎ，Ｆ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ、第
３７巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおける異種タンパクの発現の
ための系は、主として、この菌における遺伝子発現の制
御法が十分には知られておらず且つクローニングベクタ
ー上に好適な選択可能な遺伝子マーカーが欠如している
ことにより、これまでは開発されなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段、発明の作用および効果】
本発明によれば、上記の形質転換技法を用いて、異種タ
ンパクを高水準で発現させまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｏｒｙｚａｅにおける同種タンパクの産生を増進さ
せることができる。本明細書において用いられる「異種
タンパク」という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅによっては
産生されないタンパクを意味し、一方「同種タンパク」
という表現はＡ． ｏｒｙｚａｅ自体によって産生され
るタンパクを意味する。
【０００９】更に具体的には、Ａ． ｎｉｇｅｒおよび
Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓの形質転換に用いたマーカー遺
伝子を使用することによって、所望なタンパク生成物を
暗号化するＤＮＡで形質転換したＡ． ｏｒｙｚａｅ株
の選択が可能である。これら前者の菌類とＡ． ｏｒｙ
ｚａｅとの系統発生的距離（Ｒａｐｅｒ，Ｋ．Ｂ．およ
びＦｅｎｎｅｌｌ，Ｄ．Ｉ．，（１９６５年）Ｔｈｅ
Ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のために、これ
はまったく予知されないものであった。
【００１０】本発明は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、具体
的にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおけるタンパク生
成物の発現に極めて効果的なプロモーターであって、Ｔ
ＡＫＡ−アミラーゼプロモーターまたは任意に上流活性
化配列が先行する上記プロモーターの機能的部分として
特徴化されるものを提供する。
【００１１】使用した形質転換法は、Ａ． ｎｉｄｕｌ
ａｎｓの形質転換法の変法（Ｂａｌｌａｎｃｅ，Ｄ．
Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．，第１１２巻、（１９８３年）、２８４〜
２８９頁、Ｔｉｌｂｕｒｎ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｇｅｎｅ、第
２６巻、（１９８３年）、２０５〜２２１頁）、Ｙｅｌ
ｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，第８１巻、（１９８４年）、１
４７０〜１４７４頁）およびＡ．ｎｉｇｅｒの形質転換
についてのＢｕｘｔｏｎらの方法、（Ｇｅｎｅ、第３７
巻、（１９８５年）、２０７〜２１４頁）に類似の方法
であった。本発明の方法では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅは、宿主株のゲノム中に組込むことがで
きるが、形質転換前は宿主株に有しない選択マーカーを
含むベクター系で形質転換される。
【００１２】好ましい選択マーカーはａｒｇＢ（Ａ．
ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ． ｎｉｇｅｒ）、ｔｒｐＣ
（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ａｍｄＳ（Ａ． ｎｉｄ
ｕｌａｎｓ）またはｐｙｒ４（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ
ｃｒａｓｓａ）遺伝子、またはＤＨＦＲ（ジヒドロフォ
レートレダクターゼまたはその変異株）遺伝子である。
更に好ましい選択マーカーはａｒｇＢまたはａｒｍＳ遺
伝子である。野生型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株は通常はａｒ
ｇＢ+ である（すなわち、ａｒｇＢ遺伝子がＡ． ｏｒ
ｙｚａｅにおいて機能的である）。
【００１３】ａｒｇＢを選択マーカーとして選択する場
合には、このマーカーに対して遺伝子に欠損を有する
Ａ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変異株を宿主株として用
いなければならない。Ａ． ｏｒｙｚａｅのａｒｇＢ変
異株はＦ．Ｐ．Ｂｕｘｔｏｎらが報告したのと同様にし
て調製することができる（Ｇｅｎｅ、第３７巻、（１９
８５年）、２０７〜２１４頁）。ａｒｇＢ変異株はオル
ニチントランスカルバミラーゼ遺伝子に欠損を有する変
異株として定義される。他方、ａｍｄＳ遺伝子は、野生
型Ａ． ｏｒｙｚａｅ株がこの遺伝子を含まないので、
この野生株の形質転換の選択マーカーとして用いること
ができる。
【００１４】遺伝子配列を促進する機能を暗号化するＤ
ＮＡ配列は、典型的にはプロモーター、転写ターミネー
ターおよびポリアデニル化シグナルである。当業界にお
いて周知のように上流活性化配列およびエンハンサー配
列が先行することのあるプロモーターはＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅにおいて強力な転写活性を示す
ことができる如何なるＤＮＡ配列であってもよく、アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、
セルラーゼおよび解糖酵素のような細胞外および細胞内
タンパクのいずれをも暗号化する遺伝子から誘導するこ
とができる。
【００１５】好適なプロモーターはＡ． ｏｒｙｚａｅ
ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅ
ｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ． ｎｉｇｅ
ｒグルコアミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ中性α−アミラ
ーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼおよびＲ
ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについての
遺伝子から誘導することができる。解糖酵素の遺伝子か
らのプロモーターの例は、ＴＰＩ，ＡＤＨおよびＰＧＫ
である。
【００１６】本発明による好ましいプロモーターは、
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーター
である。ＴＡＫＡアミラーゼは周知のα−アミラーゼ
（Ｔｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第
５８巻、シリーズＢ（１９８２年）、２０８〜２１２
頁）である。プロモーター領域を暗号化するＤＮＡは、
ＴＡＫＡ−アミラーゼゲノム性クローンから誘導した。
プロモーターおよびプロモーターの上流の領域の配列
を、プレ領域およびＴＡＫＡ−アミラーゼについての構
造遺伝子の５′末端と共に図１に示す。
【００１７】実施例２に更に詳細に説明されるように、
プレ領域およびプロモーターおよび上流活性化配列を含
むＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、
Ａ．ｏｒｙｚａｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍから誘導され、Ｂ
ａｍＨＩを消化したｐＢＲ３２２に挿入されて、プラス
ミドｐＴＡＫＡ １７を生成した（図２を参照された
い）。ｐＴＡＫＡ １７ Ａ． ｏｒｙｚａｅから誘導
されたＤＮＡは５．５kbＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩ−
ＢａｍＨＩ／Ｓａｕ ３ＡＩフラグメントとして示さ
れ、プロモーターおよび上流活性化配列は位置０で開始
する２．１kbフラグメントを表わす。
【００１８】ＢｇｌII部位までのプロモーターおよび上
流活性化配列の確立されたＤＮＡ配列を、図１に示す。
プロモーターは、ＴＡＫＡ−アミラーゼプレ配列のＭｅ
ｔ（１）コドンに先行するヌクレオチド−１で終了す
る。プレ配列を暗号化するヌクレオチド配列は６３個の
ヌクレオチドから構成され、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼ
はヌクレオチド６４に対応する位置から開始する。
【００１９】ｐＴＡＫＡ １７から、プロモーターに対
して上流の配列を含む全プロモーター配列またはその機
能的部分は、当業者に公知の手段によって誘導すること
ができる。プロモーター配列は、プロモーター配列を、
例えば所望なタンパク生成物またはことなるプレ領域
（シグナルペプチド）を暗号化する遺伝子のような他の
ＤＮＡとの連結を促進する特異的な制限部位を導入する
ために、リンカーを備えていてもよい。
【００２０】本発明による方法では、（ＳａｌＩ部位の
開始を表わす）ヌクレオチド−１１４４（図１を参照さ
れたい）からヌクレオチド−１０の配列を、プロモータ
ー領域の十分に機能する部分の一例として使用した。本
発明のもう一つの態様では、ヌクレオチド−１１７６か
ら−１までのヌクレオチド配列は、ｐＴＡＫＡ １７か
らの未だ配列されていない１．０５kbフラグメントが先
行した。各種のフラグメントを使用できることは、当業
者にとって明らかである。
【００２１】本発明の一態様によれば、プロモーターお
よび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１
１４４からヌクレオチド−１０の配列を表わす下記の配
列または機能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２２】 GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG
【００２３】もう一つの態様によれば、プロモーターお
よび上流活性化配列は、図１におけるヌクレオチド−１
１７６から−１までの配列を表わす下記の配列または機
能的に同等なヌクレオチド配列を有する。
【００２４】 AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACCCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT
【００２５】本発明のもう一つの見地によれば、後者の
配列では、ｐＴＡＫＡ １７からの１．０５kb未配列の
上流領域（図２における位置０〜１．０５）が先行して
もよい。ターミネーターおよびポリアデニル化配列はプ
ロモーターと同じ源から誘導することができる。エンハ
ンサー配列を構造中に挿入してもよい。
【００２６】発現した生成物は細胞の分裂を要する細胞
内に蓄積させて、生成物を単離することができる。この
付加的工程を回避し且つ細胞内で発現した生成物の可能
な分解量を最少限にするには、生成物を細胞から分泌す
るのが好ましい。この目的のため、所望な生成物の遺伝
子は、発現した生成物を細胞の分泌経路内への効果的に
向けるプレ領域を有する。自然に起こるシグナルまたは
リーダーペプチドまたはその機能的部分あるいは分泌を
行う合成配列であることができるこのプレ領域は、一般
的には分泌の際に所望な生成物から開裂して、培養液か
ら単離する準備のできた成熟生成物を残す。
【００２７】このプレ領域は、如何なる有機物源からの
ものであっても分泌されるタンパクの遺伝子から誘導す
ることができる。本発明によれば、プレ領域はＡｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ種からのグルコアミラーゼまたはアミラ
ーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種からのアミラーゼ遺伝
子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのリパー
ゼまたはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅからのα−因子の遺伝子または仔牛プロキモシン
遺伝子から誘導することができる。
【００２８】更に好ましくは、プレ領域はＡ． ｏｒｙ
ｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−
アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、
Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ＮＣＩＢ１１８３７からのマルトース
原性アミラーゼ、Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓまたはＢ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓｉｎから誘導される。有効なシグナル配
列は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼシグ
ナル、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギ
ン酸プロテイナーゼシグナルおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏ
ｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼシグナルである。ＴＡＫＡ−
アミラーゼシグナルは下記の配列を有する。
【００２９】
【化１】
【００３０】プロモーターおよびターミネーター配列に
機能的に連結した所望な生成物の遺伝子は、選択マーカ
ーを含むベクターに組込むことができ、または宿主株の
ゲノム中に組込むことができる別個のベクターまたはプ
ラスミド上に置いてもよい。本明細書で用いる「ベクタ
ー系」という表現は単一ベクターまたはプラスミドまた
は宿主ゲノム中に組込まれる全ＤＮＡ情報を含む２種類
以上のベクターまたはプラスミドを包含する。ベクター
またはプラスミドは、線状または閉じた円形分子であっ
てもよい。本発明の好ましい態様によれば、Ａ． ｏｒ
ｙｚａｅは２個のベクターであって、一つは選択マーカ
ーを含み、もう一つは宿主株に導入される残りの異種Ｄ
ＮＡから成り、プロモーター、所望な生成物および転写
ターミネーターの遺伝子およびポリアデニル化配列を含
むもので共形質転換される。
【００３１】通常は、Ａ． ｏｒｙｚａｅ形質転換体は
安定であり、選択マーカーの不在で培養することができ
る。形質転換体が不安定になる場合には、選択マーカー
を用いて培養の際に選択してもよい。形質転換細胞を、
次に問題のマーカーに対応する選択圧で培養する。
【００３２】本発明はＡ． ｏｒｙｚａｅにおいて多種
多様なポリペプチドまたはタンパク生成物を高収率で製
造する方法を提供する。Ａ． ｏｒｙｚａｅは長年にわ
たり例えばＴＡＫＡ−アミラーゼ酵素およびタンパク分
解酵素の生産に商業的規模で用いられてきており、従っ
てこの微生物の醗酵技術は十分に開発されており、この
微生物は食品工業において使用されることが証明されて
いる。
【００３３】本発明は、原則として如何なるポリペプチ
ドまたはタンパク生成物でも高収量での工業的生産に
Ａ． ｏｒｙｚａｅの使用可能性を提供する。かかる生
成物の例はキモシンまたはプロキモシンおよび他のレン
ネット、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓからの酸安定アミラーゼ、菌のリパー
ゼまたは原生生物のリパーゼおよび熱に安定な細菌また
は菌のアミラーゼである。
【００３４】本発明をプロキモシン、Ｒｈｉｚｏｍｕｃ
ｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｔ
ＡＫＡ−アミラーゼおよびＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉ
ｅｈｅｉからのリパーゼの生産によって説明する。これ
らの酵素の遺伝子は、下記に更に詳細に説明するよう
に、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーか
ら得た。
【００３５】
【実施例】以下の実施例において出発物質として使用し
たプラスミドは次の通りである。 p285 (ATCC No. 20681) PCAMG91 Boelら、EMBO Journal、第３巻、（1984年）、1581〜1585頁。 pIC19R Marsh ら、Gene、第32巻、（1984年）、 481〜485 頁。 pSal43 Berse ら、Gene、第25巻、（1983年）、 109〜117 頁、John & Peberdy, Enzyme Microb.Technol.。
【００３６】 p3SR2 J.M.Kelly およびM.J.Hynes, EMBO Journal 、第４巻（1985年 ）、 475〜479 頁。 pBR322 Bolivar, F. ら、Gene、第２巻（1977年）、95〜113 頁。 pBR327 Covarrubias, L. ら、Gene、第13巻、（1981年）、25〜35頁。 pUC9, pUC13 およびpUC19 Vieiraら、Gene、第19巻、（1982年）、 259〜268 頁、および Messing, Meth. in Enzymology、第 101巻、（1983年）、20〜 27頁。
【００３７】使用した菌類は次の通りである。A. niger ATCC 1015, ATCC 10582 A. oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 144 88〜11491, ATCC 11601 およびATCC 12892。E. coli MC1000 (Casabadan, M.J. およびCohen, S.N., J.Mol.Bio l., 第 138巻、 179〜207 頁)(NCIB 11956) 。Rhizomucor miehei CBS 370.65
【００３８】実施例１ プロキモシン遺伝子を含むプラ
スミド２８５′ｐｒｏＣの調製 プレプロキモシン遺伝子を仔牛の胃のｃＤＮＡライブラ
リーから単離し、Ｇ−ＣテイリングによってｐＢＲ３２
２のＰｓｔＩ部位に挿入して（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１８巻、（１９７９年）、
５２９４頁およびＴｒｕｅｌｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第６巻、（１９７９年）、３
０６１頁）、ｐＲ２６を得た。
【００３９】ｐＵＣ９をＳａｌＩで切断し、切断をクレ
ノーポリメラーゼで満たし、Ｔ４リガーゼで連結した。
生成するプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断し
て、２．７kbの大きなフラグメントをプロキモシン遺伝
子のＮ末端を含むｐＲ２６からの０．４７kb ＢａｍＨ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントと連結し、ｐＵＣ９′を作
った。ｐＵＣ９′は、プロキモシン遺伝子のＮ末端にＨ
ｉｎｄIII 部位を含む。
【００４０】ｐＵＣ１３をＢａｍＨＩ−ＮａｒＩで切断
して、ＮａｒＩ−ＸａｍＩと大きなそれぞれの小型フラ
グメントをプロキモシン遺伝子のＣ末端を含むｐＲ２６
の０．６４kb ＸｍａＩ−ＢｃｌＩフラグメントと連結
して、プラスミドｐＵＣ１３′を得た。ｐＵＣ１３′
は、プロキモシン遺伝子のＣ末端にＸｂａＩ部位を含
む。ｐＵＣ１３′の０．６５kb ＸｍａＩ−ＸｂａＩフ
ラグメントを、ｐＵＣ９′の０．４６kb ＨｉｎｄIII
−ＸｍａＩおよびｐ２８５の１１kb ＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントと連結して、図３に示されるように
プロキモシン遺伝子を含むプラスミドｐ２８５′ｐｒｏ
Ｃを生成させた。
【００４１】実施例２ Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−
アミラーゼＡ遺伝子のクローニング じゃがいも澱粉上で成長させたＡ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ
３２５から、Ｋａｐｌａｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，第１８３巻、（１９７９年）、１８１〜１８
４頁）によって、ｍＲＮＡを調製した。ＴＡＫＡ−アミ
ラーゼ遺伝子の１０５０bpを含む部分ｃＤＮＡクローン
を、ｍＲＮＡをＴＡＫＡ−アミラーゼにおけるアミノ酸
２９５〜２９９についての暗号化配列に相補的な４−マ
ー・オリゴヌクレオチド混合物
【００４２】
【化２】
【００４３】で特異的に感作することによって得た（Ｔ
ｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ．，第５８
巻、シリーズＢ、（１９８２年）、２０８〜２１２
頁）。クローニング法は、Ｇｕｂｌｅｒ ＆ Ｈｏｆｆ
ｍａｎｎ，Ｇｅｎｅ、第２５巻、（１９８３年）、２６
３〜２６９頁記載の方法に準じた。ｃＤＮＡクローンの
両端および中央手での配列は、ＴＡＫＡ−アミラーゼの
アミノ酸配列に対応する配列が存在することを示した。
【００４４】ゲノムクローンの単離 Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｈｗ ３２５からの菌糸を収穫し
て、Ｂｏｅｌらの上記文献に記載のＡ． ｎｉｇｅｒに
ついて用いた方法に従ってＤＮＡを調製するために加工
した。Ｓａｕ３Ａで部分消化することによって生成した
３〜１０kbの制限フラグメントを、ＢａｍＨＩで消化し
て、脱リン酸化したｐＢＲ３２２と連結した（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。
【００４５】５０，０００個の組換体をオリゴヌクレオ
チドプローブＮＯＲ−１６８（上記）でスクリーニング
して、７個がＴＡＫＡ−アミラーゼを暗号化するＤＮＡ
を含むことを見出した。一つのクローンをｍＲＮＡ開始
２．１kb上流を有するプロモーター領域を更に使用する
のに選択した。プラスミドｐＴＡＫＡ １７についての
制限マップを図２に示す。
【００４６】Ｅ． ｃｏｌｉ株に移したｐＴＡＫＡ １
７を１９８７年２月２３日にDeutsche Sammlung von Mi
kroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400,
Goettingenに寄託され、受託番号ＤＳＭ ４０１２を与
えられた。ＤＳＭは１９７７年のブダペスト条約で認定
された国際寄託当局であり、上記の条約のそれぞれ第９
規則および第１１規則に従って、公衆による寄託および
入手の永続性を付与している。
【００４７】実施例３ Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅ
ｈｅｉ ｃＤＮＡライブラリーの構成 真菌類Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ（この菌種
の形態学的および系統学的説明については、 Shipper,
M.A.A., On the genera Rhizomucor and Parasitella,
Studies in mycology, Institute of the Royal Nethe
rlands Academyof Science and Letters, 第１７号
（１９７８年）、５３〜７１頁を参照されたい）はチー
ズ製造におけるミルクの凝固に広く用いられている酸プ
ロテイナーゼ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉプ
ロテイナーゼ、以下ＲＭＰと省略する）を分泌する。
【００４８】Ｅ． ｃｏｌｉにおいてこのタンパクのｃ
ＤＮＡ組換えクローンを得るために、全ＲＮＡをＢｏｅ
ｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第３巻、１０９７〜１１０２
頁、１９８４年）およびＣｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗａｓｈ．）、第１８巻、５２９４
〜５２９９，１９７９年）の方法によってホモゲナイズ
したＲ． ｍｉｅｈｅｉ ｍｙｃｅｌｉｕｍから抽出し
た。ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを、ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ
（ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第６９巻、１４０８〜１４１２
頁、１９７２年）によって報告されたオリゴ（ｄＴ）−
セルロース上で親和クロマトグラフィーを２サイクル行
うことによって得た。
【００４９】オリゴ（ｄＴ）で感作した相補性ＤＮＡを
合成して、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（Ｇｅｎｅ，
第２５巻、２６３〜２６９頁、１９８３年）が報告した
方法に従って二重鎖とした。二重鎖を、Ｒｏｙｃｈｏｕ
ｄｈｕｒｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，
第３巻、１０１〜１０６頁、１９７６年）によって報告
された方法によって、ｄＣＴＰおよび末端デオキシヌク
レオチジル・トランスフェラーゼと連結した。プラスミ
ドｐＢＲ３２７をＰｓｔＩで線形化して、ｄＧＴＰと連
結した。
【００５０】オリゴ（ｄＣ）を連結したｄｓｃＤＮＡ
を、Ｐｅａｃｏｃｋらが記載した方法（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第６５５巻、２４３〜
２５０頁、１９８１年）によってこのオリゴ（ｄＧ）を
連結したベクターにアニーリングして、Ｅ． ｃｏｌｉ
ＭＣ１０００のｈｓｄＲ- ，Ｍ+ 誘導体（Ｃａｓａｄ
ａｂａｎとＣｏｈｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１
３８巻、１７９〜２０７頁、１９８０年）を形質転換し
て組換えクローンを生成させるのに用いた。ＲＭＰ特異的なｃＤＮＡ組換体の同定 １６個のヘプタデカマー・オリゴデオキシリボヌクレオ
チド
【００５１】
【化３】
【００５２】の混合物であって、その一つが Tyr-Tyr-P
he-Trp-Asp-Alaを暗号化する領域においてＲＭＰ ｍＲ
ＮＡに相補的であるもの（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎ
ｎ，Ｎｅｔｈｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５巻、
２７５〜２８０頁、１９８１年）をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のＤＮＡ合成装置上で
合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精
製した。
【００５３】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃ
ＤＮＡライブラリーからの約１０，０００個のＥ． ｃ
ｏｌｉ組換体をＷｈａｔｍａｎ ５４０濾紙に移した。
コロニーを、Ｇｅｒｇｅｎらが記載した方法によってリ
ーシスして、固定した（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，第７巻、２１１５〜２１３５頁、１９７９
年）。フィルターを、Ｂｏｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊ．，第
３巻、１０９７〜１１０２頁、１９８４年）によって記
載された方法によって32Ｐ−標識したＲＭＰ特異的ヘプ
タデカマー混合物と交雑した。
【００５４】フィルターの交雑と洗浄は４０℃で行い、
次いでインテンシファイヤー・スクリーンを用いて２４
時間オートラジオグラフィーを行った。ミニプレプ（Ｍ
ｉｎｉｐｒｅｐ）プラスミドＤＮＡは、標準的な方法
（ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，第７巻、１５１３〜１５２３頁、１
９７９年）によって交雑するコロニーから単離し、ｃＤ
ＮＡインサートのＤＮＡ配列をＭａｘａｍとＧｉｌｂｅ
ｒｔの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第６
５巻、４９９〜５６０頁、１９８０年）によって確立し
た。
【００５５】ｐＲＭＰ１０１６は、ｍＲＮＡの５′未翻
訳末端の部分を含み、次いで６９個の酸の長いプレプロ
領域と３００個のアミノ酸をＲＭＰタンパクの成熟部分
に暗号化する領域中に伸びていることを示した。ｐＲＭ
Ｐ１０１６はＲＭＰ ｍＲＮＡの完全な３′末端に対応
するインサートを含まなかったので、ｃＤＮＡライブラ
リーをクローンｐＲＭＰ１０１６からの32Ｐニックが翻
訳された３′特異的制限フラグメントで再度スクリーニ
ングすることによって、クローンｐＲＭＰ２９３１を単
離した。
【００５６】このクローンは３′未翻訳領域の部分とＲ
ＭＰタンパクのカルボキシ末端部分を暗号化する２７０
個のトリプレットを有する開放読み込み枠を含む。それ
故、ｐＲＭＰ１０１６およびｐＲＭＰ２９３１は著しく
オーバーラップしており、２個のクローンの結合した配
列は、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉプレプロＲＭＰ ｃＤＮＡの
配列を与える。１４１６個のヌクレオチドの総ては、ｃ
ＤＮＡクローニング法から生成するＧ：Ｃテイルの間に
配列した。
【００５７】確立したＤＮＡ配列を図４および図５に、
ＲＭＰへの前駆体の推定アミノ酸配列と共に示す。第４
ａおよびｂ図では、水平線はｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングに用いた合成オリゴ混合物の位置を示して
いる。矢印は、元のＲＭＰの成熟において加工が起こる
位置を示している。ヌクレオチドは開始Ｍｅｔコドンに
おける第一の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟ＲＭ
Ｐにおける第一の残基から番号を付けている。
【００５８】このｃＤＮＡ配列から、ＲＭＰは６９個の
アミノ酸のプロペプチドで４３０個のアミノ酸の長い前
駆体として合成されると結論することができる。この前
駆体における推定上のシグナルペプチダーゼ加工部位
（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，第１３３巻、１７〜２１頁、１９８３年）は、Ａ
ｌａ（−４８）およびＡｒｇ（−４７）の間にあると考
えられ、成熟ＲＭＰはＧｌｕ−１およびＡｌａ（＋１）
の間での自動タンパク分解性開裂によって生成する。Ｒ
ＭＰのｃＤＮＡで推定したアミノ酸配列は、以前報告さ
れた部分的アミノ酸配列（ＢｅｃｈとＦｏｌｔｍａｎ
ｎ，Ｎｅｔｈ−Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５
巻、２７５〜２８０頁、１９８１年）と良好に一致して
いる。
【００５９】ＲＭＰ ｃＤＮＡを用いて更に構成作業を
促進するため、次のようにしてクローンｐＲＭＰ２９３
１において同定されたＴＡＡ停止コドンに対して３′の
ＢａｎＩ部位にＨｉｎｄIII リンカーを挿入した。すな
わち、２５μｇ ｐＲＭＰ２９３１をＰｓｔＩで消化し
てＲＭＰ ｃＤＮＡを得た。このインサートを１％アガ
ロースゲル電気泳動法で精製し、ゲルから電気溶出し、
フェノールおよびクロロホルム抽出によって精製し、Ｎ
ａＣｌおよびエタノールで沈澱させた。
【００６０】ＲＭＰの３′半分を暗号化するこのフラグ
メントをＢａｎＩで消化し、ＢａｎＩ付着制限部位末端
を４個のｄＮＴＰとＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントとの混合物で満たした。
これらの満たした末端にＴ４−ＤＮＡリガーゼ反応にお
いてＨｉｎｄIII リンカーを加えた。連結反応混合物を
フェノールとクロロホルムで抽出して、ＤＮＡを４Ｍ酢
酸アンモニウム／エタノールで沈澱させた。
【００６１】精製したＤＮＡを過剰量のＨｉｎｄIII 酵
素で消化して、３８０bpフラグメントを６％ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製した。ＲＭＰ開放読取り枠の３′
末端とＴＡＡ停止コドンを含むこのフラグメントを、Ｈ
ｉｎｄIII で消化してアルカリ性ホスファターゼで処理
したｐＩＣ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて
競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、形質転換体
をアンピシリン含有寒天プレート上で選択した。
【００６２】プラスミドＤＮＡを形質転換体から精製
し、正確な組換体を制限エンドヌクレアーゼ消化とアガ
ロースゲル電気泳動法によって同定した。かかる正確な
組換体、ｐＲＭＰ３′から、２１０bp ＢｇｌII／Ｈｉ
ｎｄIII フラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法によって単離した。このフラグメントはアミノ
酸２９７〜２９９でＢｇｌII部位からのＲＭＰ ｃＤＮ
Ａの３′末端を含み、ＴＡＡ停止コドン中を通って、挿
入されたＨｉｎｄIII リンカーまで伸びている。
【００６３】ＲＭＰ ｃＤＮＡの５′部分は、１％アガ
ロースゲル電気泳動法によって９９７bp ＨｉｎｄIII
／ＢｇｌIIとしてｐＲＭＰから単離した。ＨｉｎｄIII
部位は、プロセグメントにおいて残基−３６，−３５に
対応する位置においてＲＭＰ−ＤＮＡ中に配置されてい
る。９９７bp５′フラグメントをＨｉｎｄIII で消化し
てホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒ中で２１０bp
３′フラグメントに連結した。
【００６４】この連結混合物を用いて、組換体をＥ．ｃ
ｏｌｉから得て、３′部分に結合したＲＭＰの５′部分
を有する正確なプラスミドｐＲＭＰは制限酵素分析によ
って同定した。ｐＲＭＰの構成を図６に示す。ｐＲＭＰ
はＲＭＰプレ領域およびプロセグメントの５′半分を暗
号化しない。
【００６５】実施例４ 活性ＲＭＰを分泌するように設
計したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成 この実施例では、プラスミドをグルコアミラーゼプロモ
ーター、シグナルおよびターミネーター配列の制御下に
ＲＭＰを発現するように設計して構成した。グルコアミ
ラーゼプロモーターおよびターミネーター配列をベクタ
ーｐＣＡＭＧ９１でクローン化したグルコアミラーゼゲ
ノム遺伝子から誘導した。ｐＣＡＭＧ９１の構成はＢｏ
ｅｌら（ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，第３巻、１９８４
年、１５８１〜１５８５頁）によって報告されており、
プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌクレアーゼ制限マ
ップは図７に示す。
【００６６】ｐＣＡＭＧ９１をＳａｌＩおよびＰｓｔＩ
制限エンドヌクレアーゼで消化した。上記消化物から、
アガロースゲル上で６９８bpフラグメントを単離した。
このＳａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントはグルコアミラー
ゼｍＲＮＡの１４０bp ３′未翻訳部分を暗号化する領
域を含む。
【００６７】この３′フラグメントはＴ４−ＤＮＡポリ
メラーゼで処理して、ＸｂａＩリンカーの添加およびＸ
ｂａＩ制限酵素での消化の前に制限部位を「ブラント・
エンド」させた。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末
端をＸｂａＩで線形化したｐＵＣ１３に連結してグルコ
アミラーゼ遺伝子ポリ（Ａ）付加領域を含むプラスミド
ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍを生成させた。ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍ
の構成は、図８に示す。
【００６８】Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子の
３′末端は、ｐＡＭＧ／Ｔｅｒｍからの７００bp Ｘｂ
ａＩフラグメントとして得た。このターミネーターフラ
グメントを、ＸｂａＩで消化してホスファターゼ処理し
たｐＩＲ１９Ｒに連結した。この連結混合物を用いて、
Ｅ． ｃｏｌｉから組換体が得られ、正確なプラスミド
ｐＩＣＡＭＧ／ＴｅｒｍであってｐＩＣ１９Ｒの多重ク
ローニング部位のＨｉｎｄIII 部位に面するターミネー
ターフラグメントの５′末端を有するものは制限酵素分
析によって同定した。
【００６９】ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構成を、図８に
示す。ｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍから、グルコアミラーゼ
ターミネーター（ＡＭＧターミネーター）領域を１％ア
ガロースゲル電気泳動法によって、７５０bp Ｈｉｎｄ
III ／ＣｌａＩ制限フラグメントとして単離した。ｐＣ
ＡＭＧ９１から、グルコアミラーゼプロモーター（ＡＭ
Ｇプロモーター）を、グルコアミラーゼシグナルペプチ
ドを暗号化する領域、ヘキサペプチド−プロセグメント
および３．５kb ＣｌａＩ／ＢｓｓＨIIフラグメントと
してのｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ）
と共に、１％アガロースゲル電気泳動法によって単離し
た。
【００７０】合成ＢｓｓＨII／ＨｉｎｄIII リンカー
は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．
製ＤＮＡ合成装置上で合成した２種類の合成３１マー・
オリゴヌクレオチドから調製した。合成リンカーは下記
の構造を有する。
【００７１】
【化４】
【００７２】このリンカーを、３．５kbグルコアミラー
ゼプロモーターを含むフラグメントおよび７５０bpグル
コアミラーゼターミネーターを含むフラグメントとの連
結反応に用いた。連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌｉを
形質転換して、正確な組換体、ｐ６７３は制限エンドヌ
クレアーゼ消化によって同定した。単離したｐ６７３は
ＨｉｎｄIII クローニングベクターであり、この中に適
当なＨｉｎｄIII ｃＤＮＡフラグメントをグルコアミラ
ーゼヘキサペプチドプロセグメントおよびグルコアミラ
ーゼ転写ターミネーター領域の間に挿入することができ
る。
【００７３】挿入したｃＤＮＡはグルコアミラーゼプロ
モーターによって転写制御され、翻訳された融合生成物
の分泌はグルコアミラーゼシグナルペプチドとグルコア
ミラーゼヘキサペプチドプロセグメントとによって指示
される。ｐ６７３をＨｉｎｄIII で消化して、アルカリ
性ホスファターゼで処理して、ｐＲＭＰの消化物から精
製した１．２kb ＨｉｎｄIII と連結した。
【００７４】連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転
換し、ＲＭＰを発現させるために正確な位置に挿入され
たＲＭＰ ｃＤＮＡを有する組換体ｐ６８６は制限エン
ドヌクレアーゼ消化によって単離されて特徴化された。
ｐ６８６は以下の構造：グルコアミラーゼシグナルペプ
チド、グルコアミラーゼヘキサプロペプチド、ＲＭＰか
らのプロペプチドのアミノ酸−４５から−１、成熟ＲＭ
Ｐの３６１個のアミノ酸を有するＲＭＰ前駆体を暗号化
する。ｐ６８６の構成を、図９に示す。
【００７５】実施例５ 本発明の好ましい態様では、プレプロＲＭＰの開放読取
り枠を、Ａ．ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ遺伝子
またはＡ．ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺
伝子からのプロモーターの制御下において発現プラスミ
ドに挿入すべきである。これを行うために、ＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼ部位を、次の工程によってプレ
プロＲＭＰのシグナルペプチドの開始メチオニンコドン
の５′に挿入した。
【００７６】ｐＲＭＰ１０１６を、ｃＤＮＡにおいてア
ミノ酸残基Ｓｅｒ（−６６）およびＧｌｎ（−６５）に
対応する位置で切断するＤｄｅＩと、ｃＤＮＡにおいて
アミノ酸残基Ｌｙｓ（−３６）およびＬｅｕ（−３５）
に対応する位置で切断するＨｉｎｄIII で消化した。精
製する８９bp ＤｄｅＩ／ＨｉｎｄIII フラグメントを
８％ポリアクリルアミドゲル上で精製し、フェノールお
よびクロロホルム抽出の後電気溶出し、エタノール沈澱
した。以下の配列を有する合成ＤＮＡフラグメントは、
アプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成装置上で２個
のオリゴヌクレオチドとして合成した。
【００７７】
【化５】
【００７８】このフラグメントは、開始Ｍｅｔ−コドン
に対してＢａｍＨＩ付着末端５′および３′末端にＤｄ
ｅＩ付着末端を有する。これら２個のオリゴヌクレオチ
ドは、ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキ
ナーゼ化し、互いにアニーリングして、次いでＢａｍＨ
Ｉ／ＨｉｎｄIII で消化した。ｐＵＣ１３ベクター中で
ｐＲＭＰ１０１６から精製した８９bp ＤｄｅＩ／Ｈｉ
ｎｄIII ＲＭＰフラグメントに連結した。
【００７９】連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞
を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プラス
ミド上で制限酵素消化によって同定した。正確な組換え
プラスミドを配列して、使用したオリゴヌクレオチドの
配列を証明した。かかる正確なプラスミドｐＲＭＰ５′
をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII で消化して、開始Ｍｅ
ｔコドン、ＲＭＰシグナルペプチドおよびＲＭＰプロセ
グメントの部分を有する１１０bp ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎ
ｄIII フラグメント１０％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によって精製した。
【００８０】このフラグメントを電気溶出し、フェノー
ルおよびクロロホルム抽出し、エタノールで沈澱した。
ＲＭＰ開放読み込み枠の残りおよびＡＭＧターミネータ
ー配列をＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄIII で部分消化
した後プラスミドｐ６８６から得た。これによって、
１．９kbフラグメントを放出し、このフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動法、電気溶出フェノールおよびク
ロロホルム抽出の後、エタノールで沈澱させた。この
１．９kbフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化したｐＵＣ１３ベクター中で、ｐＲＭ５′からの
１１０bp ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII に連結した。
【００８１】この連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ
細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精製プ
ラスミド上で制限酵素消化によって同定した。かかる正
確な組換体は、ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍであった。ｐＲ
ＭＰＡＭＧＴｅｒｍの構成を図１０に示す。
【００８２】実施例６ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターによってＡ．ｏｒ
ｙｚａｅ中で活性ＲＭＰを分泌するように設計されたＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発現ベクターの構成 グルコアミラーゼプロモーターを以下のようにして単離
した。２５μｇのｐＣＡＭＧ９１をＥｃｏＲＩおよびＢ
ｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼで消化した。この二重
消化の後、２７０bp ＤＮＡフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動法によって単離することができた。
【００８３】このフラグメントは、プロモーター領域の
一部分、５′未翻訳領域およびグルコアミラーゼ遺伝子
（ＡＭＧ遺伝子）のシグナルペプチドをカバーする。ア
ガロースゲルからＤＮＡを電気溶出した後、フラグメン
トをフェノールおよびクロロホルム抽出し、次いでエタ
ノール沈澱することによって精製した。次いで、２７０
bpの長いフラグメントをＳｆａＮＩで消化した。
【００８４】この酵素は、グルコアミラーゼ遺伝子の開
始ＡＴＧメチオニンコドンに対して５′に開裂部位を有
する。完全に消化した後、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ）および４個の
ｄＮＴＰ総てで処理して、ＤＮＡ上にブラントエンドを
生成させた。このＤＮＡに、ＤＮＡリガーゼを有するＢ
ｇｌIIリンカーを加えて、ＤＮＡをＢｇｌII制限酵素の
過剰量で消化した。
【００８５】１０％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡ
フラグメントを分離した後、１７５bp ＢｇｌIIフラグ
メントを電気溶出によって単離することができた。この
フラグメントは、開始メチオニンコドンに対して５′の
ＳｆａＮＩ制限部位に対応する位置に挿入されたＢｇｌ
IIリンカーを有する。このＤＮＡ切片をＢｇｌIIで消化
したアルカリホスファターゼ処理したｐＩＣ１９Ｒベク
ターに連結して、この連結混合物を用いてＥ． ｃｏｌ
ｉ細胞を形質転換した。
【００８６】生成する形質転換体の中で、正確なプラス
ミドをミニプレププラスミド上で制限酵素消化すること
によって同定した。かかる正確なプラスミドｐＢ４０
４．１をＮｓｉＩおよびＢｇｌIIで消化して、グルコア
ミラーゼ遺伝子の５′未翻訳領域をプロモーター領域の
３′部分の約１００bpと共に含む０．１６bpフラグメン
トを放出した。このフラグメントを、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法、電気溶出、フェノールおよびクロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱によって精製した。
【００８７】このフラグメントをｐＣＡＭＧ９１からの
グルコアミラーゼプロモーター領域の残りの部分に結合
させるため、以下の工程を行った。２５μｇのｐＣＡＭ
Ｇ９１をＢｓｓＨIIで消化した後、更にＮｄｅＩで部分
的に消化した。フラグメント末端を４個総てのｄＮＴＰ
およびＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント
で満たした後、１．４kb ＤＮＡフラグメントを１％ア
ガロースゲル上で単離した。
【００８８】このフラグメントは、総てのプロモーター
領域を５′未翻訳領域およびシグナルペプチド暗号化領
域と共に含んでいた。このフラグメントを電気溶出、フ
ェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱
によって、ＤＮＡを濃縮した。ＮｓｉＩで消化した後、
ＤＮＡを１％アガロースゲル上で流して、１．２kbＮｄ
ｅＩ−ＮｓｉＩフラグメントを電気溶出によって単離し
た。
【００８９】このＤＮＡは上記反応でＮｄｅＩ部位にブ
ラントエンドを生じ、これをＮｒｕＩ−ＢｇｌIIで消化
したｐＩＣ１９Ｒベクター中でのｐＢ４０１．１からの
０．１６kb ＮｓｉＩ−ＢｇｌIIフラグメントに連結さ
せた。連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質
転換し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体を
ミニプレププラスミドの制限酵素消化によって同定し
た。上記の正確な組換体、ｐＢ４０８．３をＨｉｎｄII
I およびＢｇｌIIで消化して、グルコアミラーゼ（ＡＭ
Ｇ）プロモーターを１％アガロースゲル上で１．４kbフ
ラグメントとして単離した。
【００９０】このフラグメントを電気溶出、フェノール
およびクロロホルム抽出およびエタノール沈澱した。こ
のグルコアミラーゼプロモーターフラグメントを次に、
ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９ベクタ
ー中のｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍからの２．０ＢａｍＨＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結した。連結混合物を用
いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製する形質
転換体の中から、正確な組換体をミニプレププラスミド
の制限酵素消化によって同定した。
【００９１】上記の正確な組換体の一つｐ７７８を大規
模に成長させて、組換えプラスミドを単離して、プラス
ミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によっ
て精製した。このプラスミドをグルコアミラーゼプロモ
ーターおよびターミネーター配列の制御下においてＲＭ
Ｐの合成を指示する。ｐ４０８．３の構成を図１１に示
し、ｐ７７８の構成を図１２に示す。
【００９２】実施例７ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターによる活
性ＲＭＰを分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ発現ベクターの構成 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−ア
ミラーゼゲノム遺伝子を含むプラスミドｐＴＡＫＡ １
７（実施例２を参照されたい）５０μｇをＳａｌＩで消
化した。この酵素は、成熟ＴＡＫＡ−アミラーゼのアミ
ノ酸残基２６に対応する位置においてゲノムＤＮＡでの
制限部位を有する。
【００９３】もう一つのＳａｌＩ制限部位はこの位置に
対して約１３００個のヌクレオチドだけ上流の、上流プ
ロモーター領域の５′末端に配設される。ＳａｌＩ消化
の後、この１３００bpプロモーターを含むフラグメント
をアガロースゲル電気泳動法によって精製し、ＤＮＡを
フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール沈
澱によって精製した。次いで、ＤＮＡをエクソヌクレア
ーゼIII 緩衝液中に溶解して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．
（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９頁、１９８４
年）の方法に従ってエクソヌクレアーゼIII で消化し
た。
【００９４】反応を停止して、それぞれのＤＮＡ末端に
おいて約１３０bpの欠失を得た。この方法ではＴＡＫＡ
−アミラーゼ遺伝子の暗号か領域のＳａｌＩ部位からの
約１３０bpの欠失は、開始メチオニンコドンの上流に多
重クローニング部位リンカーを導入する機会を生じる。
エクソヌクレアーゼIII で処理したＤＮＡを、Ｈｅｎｉ
ｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９
頁、１９８４年）の方法に従ってＳ１ヌクレアーゼIII
で消化し、フェノールおよびクロロホルムで抽出した後
エタノールで沈澱した。
【００９５】Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＤＮＡを補修
して連結可能なブラントエンドを得ることは、Ｈｅｎｉ
ｋｏｆｆ，Ｓ．（Ｇｅｎｅ，第２８巻、３５１〜３５９
頁、１９８４年）の方法に従って、４個のｄＮＴＰ総て
とＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを
用いて行った。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して、１３０
０bp ＳａｌＩフラグメントで切断して、２群のフラグ
メントを生成した。一つの群は約３８０bpの長さであ
り、蒸溜領域を表わしたが、他の群は６２０bpの長さで
あり、プロモーター領域を含んでいた。
【００９６】ＥｃｏＲＩ消化生成物のこれらの群をアガ
ロースゲル上で分離して、約６２０bpの長さのＤＮＡフ
ラグメントを電気溶出して、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消
化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結混合物を用
いて、競合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、組換
体から、ミニプレププラスミドＤＮＡを単離した。これ
らの欠失変異株を制限酵素消化によって特徴化して、開
始メチオニンコドンに対して５′の欠失末端を有するプ
ラスミドを同定した。
【００９７】所望な特徴を有する数個の候補を配列さ
せ、ＡＴＧ−メチオニンコドンにおけるＡに対して９bp
を欠失した５′を有する変異株（ｐ９）を選択して、更
に構成した。ｐ９をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消
化して、フラグメントを含む６４５bp ＴＡＫＡ−アミ
ラーゼプロモーターをアガロースゲル電気泳動法、フェ
ノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈
澱によって単離した。
【００９８】ｐＴＡＫＡ １７をＳａｌＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化して、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーター上
流領域を含む５１０bpフラグメントを、アガロースゲル
電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノールでの沈澱によって単離した。これらの２個の
プロモーター領域を互いに連結させ、且つＳａｌＩおよ
びＨｉｎｄIII で消化したＩＣ１９Ｒベクターに連結さ
せた。
【００９９】連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞
を形質転換し、正確な組換体を、ミニプレプとして抽出
されたプラスミドを制限酵素で消化することによって同
定した。かかる組換体の一つｐ７１９では、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラー
ゼプロモーターフラグメントは、多数の各種制限酵素消
化液によって削除することができる１．１kbの移動可能
なフラグメントとして見出されている。ｐ７１９の構成
を図１３に示す。
【０１００】ｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒｍから、プレプロＲ
ＭＰ開放読取り枠およびグルコアミラーゼターミネータ
ー領域（ＡＭＧＴｅｒｍ）を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化した後２kbフラグメントとして単離した。こ
のフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、次いで
フェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールで
の沈澱によって精製した。
【０１０１】Ａ． ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミ
ラーゼからのプロモーターを、ｐ７１９をＳａｌＩおよ
びＢａｍＨＩで消化した後に得られる１．１kbフラグメ
ントとして単離した。このフラグメントを、アガロース
ゲル電気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出、
次いでエタノールでの沈澱によって精製した。１．１kb
プロモーターフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ
で消化したｐＵＣ１９ベクターにおいてｐＲＭＰＡＭＧ
Ｔｅｒｍからの２kb ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ
ントに連結した。
【０１０２】連結混合物を用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞
を形質転換し、精製する組換体から、正確な組換体を、
ミニプレププラスミドを制限酵素で消化することによっ
て同定した。かかる正確な組換体の一つｐ７７７を大規
模に成長させて、組換えプラスミドを単離し、プラスミ
ド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離によって
精製した。ｐ７７７の構成を図１４に示す。
【０１０３】実施例８ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターの制御下
によるＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼを
分泌させるように設計されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ発
現ベクターの構成 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリパーゼｃＤＮＡクローンの構成
および同定 特異的オリゴヌクレオチドプローブを構成させることが
できる情報を得るため、精製したＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ
ｍｉｅｈｅｉリパーゼ（Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，Ｇ．
Ｊ．ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，第２
５巻、１９７７年、１１４６〜１１５０頁）について部
分配列を決定した。
【０１０４】以下の説明では、ＲＭＬという略号をＲｈ
ｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼについて用い
た。菌糸体および低分子量物質を除去したＲｈｉｚｏｍ
ｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの培養液からの上澄液を、陰イ
オン交換クロマトグラフィーに付した。カラムからの主
要な脂肪分解性分画を、凍結乾燥する前に脱塩および限
外濾過した。次いで、凍結乾燥した粉末を、親和性クロ
マトグラフィーに付した。
【０１０５】カラムからの貯蔵したリパーゼ分画を脱塩
して、限外濾過によって濃縮した。次いで、この濃縮液
を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に付し
て、ＨＩＣ−精製からのリパーゼを用いてアミノ酸配列
を決定した。配列の決定は、元の酵素（Ｎ−末端配列）
およびリパーゼをＡｒｍｉｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａ
プロテアーゼを用いてタンパク分解性消化を行った後に
得られる選択されたフラグメントの両方について行っ
た。配列の決定は、Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、（ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．１９８７年、印刷中）によって報告されたのと
同じ方法でGas Phase Sequencer (Applied Biosystems
Model ４７０Ａ）で行った。
【０１０６】ＲＭＬを、酵素の基質に対する比率を１：
４０（モル：モル）としたことを除いてＭｏｏｄｙら
（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第１７２巻、１９８４年、１
４２〜１４８頁）によって報告されたのと同じＡｒｍｉ
ｌｌａｒｉａ ｍｅｌｌｅａプロテアーゼを用いて消化
した。得られたフラグメントをＨＰＬＣによって分離し
て、ＵＶ吸収を２８０nmおよび２１４nmで観察した。オ
リゴヌクレオチドプローブの構成のための好適なフラグ
メントを同定するには、これらのフラグメントはＴｒｙ
および／またはＴｙｒを含むので、２８０nmおよび２１
４nmの間で高い比率を示したペプチドのみを配列した。
以下のＮ−末端配列が、元のＲＭＬを使用することによ
って見出された。
【０１０７】
【化６】
【０１０８】タンパク分解性消化液から単離されたフラ
グメントの一つは、配列 Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala
-Thr-Try-Asp-X-Ile-Hisを有し、このフラグメントを特
異的オリゴヌクレオチドプローブの合成に用いた。Ｒｈ
ｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのアスパラギン酸
プロテイナーゼ（ＲＭＰ）組換体を単離するために構成
された実施例３からの上記生物のｃＤＮＡライブラリー
も用いてリパーゼに特異的な組換体を同定した。オリゴ
ヌクレオチドの混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．製ＤＮＡ合成装置で合成した。
【０１０９】
【化７】
【０１１０】を有する混合物は、アミノ酸 Gly-Ala-Thr
-Trp-Aspを暗号化する領域においてＲＭＬ ｍＲＮＡに
相補的であった。このペンタペプチドは、精製したＲＭ
Ｌタンパクのタンパク分解性フラグメントから得られる
アミノ酸配列のセグメントとして同定された（上記参
照）。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ ｃＤＮＡ
ライブラリーを、ＲＭＰ特異的混合物でスクリーニング
するのに記載した方法と同様にして３２Ｐ−キナーゼし
たリパーゼオリゴヌクレオチド混合物でスクリーニング
した。交雑およびフィルターの最初の洗浄は、４３℃で
行った。オートラジオグラフィーの後、フィルターを４
７℃で洗浄した。
【０１１１】強力な交雑を示したコロニーを単離して、
対応するプラスミドにおいて挿入されたｃＤＮＡを配列
してＲＭＬ特異的組換体を同定した。かかる２個の組換
体ｐ３５３．７およびｐ３５３．１６は、約１．２kbの
インサートを有した。これらの２種類の組換体から得ら
れるＤＮＡ配列は、シグナルペプチドの中央で開始し、
ポリＡテイルにまで伸びている。
【０１１２】この領域では、長い開放読取り枠を同定で
きた。２個の組換え体は、開始メチオニンコドンを有す
るシグナルペプチドの５′部分についての配列を含まな
いので、合成オリゴヌクレオチド（５８４） 5′CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3′ 584 を合成した。このオリゴヌクレオチド５８４は、ポリペ
プチド領域で見られるアミノ酸配列 Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg を暗号化する領域におけるＲＭＬ ｍＲＮＡに相補的で
ある。
【０１１３】オリゴ５８４をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよび３２Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて高い比活性にま
でキナーゼ処理した後、記載された方法（Ｂｏｅｌ，
Ｅ．ら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，第８０巻、２８６６〜２８
６９頁、１９８３年）によって、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ
ｍｉｅｈｅｉ ｍＲＮＡでのＡＭＶリバース・トラン
スクリプターゼとのプライマー伸長反応に用いた。プラ
イマー伸長反応生成物を１０％ポリアクリルアミド／尿
素ゲル上で電気泳動して、２個のｃＤＮＡ生成物を分割
した。
【０１１４】これらの２個のｃＤＮＡ、すなわち一つは
１５０個のヌクレオチドの長さであり、もう一方は１６
０個のヌクレオチド長さのものを、両方とも電気溶出
し、ＤＮＡ配列のための化学的分解法によって配列し
た。両者のｃＤＮＡはプライマー領域から伸びており、
開始メチオニンコドンに対して位置９のヌクレオチド
５′までの読取り可能な配列を生じた。この配列は、リ
パーゼ組換えｃＤＮＡプラスミドから得られた配列であ
ることを示した。
【０１１５】２個のプライマー伸長ｃＤＮＡ生成物の長
さは、リパーゼｍＲＮＡの５′末端（ＣＡＰ−部位）が
図１５に示した第一のＡヌクレオチドに対して約５また
は１５ヌクレオチド５′に配列される。菌類からのｍＲ
ＮＡの５′末端の位置におけるマイクロヘテロゲナイェ
ティは、極めて一般的である。２個のクローン化したｐ
３５３．７およびｐ３５３．１６から得られる配列をプ
ライマー伸長分析からの配列と結合することにより、Ｒ
ＭＬ前駆体のアミノ酸配列を確立することができる。
【０１１６】ＤＮＡ配列およびＲＭＬ前駆体の対応する
アミノ酸配列を図１５に示す。図１５では、水平線はｃ
ＤＮＡ合成およびｃＤＮＡライブラリースクリーニング
に用いられた合成オリゴの位置を示している。矢印は、
元のＲＭＬの成熟において加工が起こる位置を示す。ヌ
クレオチドは、開始Ｍｅｔコドンでの最初の塩基から番
号を付け、アミノ酸は成熟した元のＲＭＬにおける最初
の残基から番号を付ける。
【０１１７】ＲＭＬを開始Ｍｅｔコドンから伸びている
開放読み込み枠によって暗号化し、次いで停止コドンに
達する前に３６３コドンを通る。この前駆体では、最初
のアミノ酸残基は、典型的な疎水性シグナルペプチドか
ら成る。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，第１１３巻、１７〜２１頁、１９８３年）の
生産則によれば、シグナルペプチドは、それぞれ、位置
−７１および−７０でのＡｌａ−およびＶａｌ残基の間
のシグナルペプチダーゼ開裂によって以下のプロペプチ
ドから開裂する。
【０１１８】Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉから
の培養液の上澄みから得られる精製ＲＭＬのＮ末端アミ
ノ酸配列分析は活性ＲＭＬ酵素のＮ末端として Ser-Ile
-Asp-Gly-Gly-Ile-Argを同定したので、ＲＭＬ前駆体の
プロペプチドは前駆体における次の７０個のアミノ酸残
基から成っていた。このＮ末端Ｓｅｒ残基から始めて、
成熟ＲＭＬは停止コドンに達するまでに２６９個の残基
を通って伸びる。
【０１１９】この成熟２９５００ダルトン酵素では、リ
パーゼ基質結合部位は、多数のリパーゼに保存されてい
る残基Ｓｅｒ（１４４）の付近に配置される。ＲＭＬ
ｍＲＮＡの３′末端では、１０４個のヌクレオチドがＴ
ＡＡ停止コドンとポリ（Ａ）テイルとの間の未翻訳領域
として配置された。このポリ（Ａ）テイルに対して２３
ヌクレオチド５′では、７ＡＴ塩基対から成る反復構造
が見出されたが、典型的な真核生物のポリアデニル化シ
グナルは同定されなかった。
【０１２０】本発明の好ましい具体例では、ＲＭＬ ｃ
ＤＮＡについて多くの変更を行った。これらの変更は、
開放読み込み枠に対して制限エンドヌクレアーゼ部位
５′および３′をクローニングおよび付加の際に、ｃＤ
ＮＡに加えたＧ：Ｃテイルの除去を含む。多くの好都合
な制限部位も、ｃＤＮＡのシグナルペプチドおよびプロ
ペプチド領域に導入された。ｐ３５３．１６をＦｎｕＤ
IIで消化して、アガロースゲル電気泳動によって８８０
bp ＤＮＡフラグメント（ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末
端）を単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェ
ノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱
した。
【０１２１】ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端を次いでＳａ
ｍＩで消化し且つアルカリ性ホスファターゼで処理した
ｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結反応を用いて、競
合するＥ． ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、精製した形質
転換体から正確な組換体をミニプレププラスミドの制限
酵素消化によって同定した。一つのかかる好適な組換体
ｐ４３５．２をＢａｎIIおよびＨｉｎｄIII で消化し、
０．６９kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で
単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱した。
ＲＭＬ ｃＤＮＡのフラグメントは、３′未翻訳領域に
結合したｐＵＣ１９多重クローニング部位の主要部分を
有していた。
【０１２２】ＲＭＬ ｃＤＮＡの５′末端を、合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて再設計して、好都合な制限部位
を導入した。合成フラグメント（ＲＭＬ５′）のＤＮＡ
配列を図１８に示す。導入した制限部位の位置および個
々に合成したオリゴヌクレオチドの結合部位を水平線乃
至垂直／水平線によって示す。精製するフラグメント
（ＲＭＬ５′）を２％アガロースゲル上で１５０bpフラ
グメントとして精製し、電気溶出し、フェノールおよび
ＣＨＣｌ3 で抽出し、更に連結反応を行う前にエタノー
ルで沈澱した。
【０１２３】ｐ３５３．７をＢａｎＩおよびＢａｎIIで
消化して、３８７bp ＲＭＬフラグメントを１０％ポリ
アクリルアミド電気泳動法によって精製した。このフラ
グメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロホルム
で抽出した後、エタノール沈澱をして、次いで合成ＲＭ
Ｌ５′フラグメントおよびＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで
消化したｐＵＣ１３ベクターにおいてｐ４３５．２から
の０．６９kb ＢａｎII／ＨｉｎｄIII フラグメントに
連結した。
【０１２４】連結反応を用いて、競合するＥ． ｃｏｌ
ｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換
体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することに
よって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐＢ５４４
では、合成部分を配列して予想した構造を確認した。ｐ
Ｂ５４４の構成を図１６に示す。ｐＢ５４４からプレプ
ロＲＭＬ ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動法によっ
て、１．２kb ＢａｍＨＩフラグメントとして単離し
た。
【０１２５】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子からのプロモーターおよび
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ
遺伝子からのターミネーターに基づく発現ベクターを、
以下のようにして調製した。ｐ７１９（実施例７参照）
刃ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化した。生成する１．
１kb ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターフラグメント
をアガロースゲル電気泳動法によって精製した。ｐＩＣ
ＡＭＧ／Ｔｅｒｍ（実施例４参照）は、ＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩで消化した。
【０１２６】生成する０．７５kb ＴＡＫＡ−アミラー
ゼターミネーターフラグメントをアガロースゲル電気泳
動法によって精製した。フェノールおよびクロロホルム
抽出の後、これらの２種類のフラグメントをエタノール
で沈澱し、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９
ベクターに連結した。連結反応を用いて、Ｅ． ｃｏｌ
ｉを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組換
体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化することに
よって同定した。一つのかかる正確な組換体ｐ７７５を
ＢａｍＨＩで消化して、アルカリ性ホスファターゼで処
理した。
【０１２７】ｐＢ５４４からの１．２kb ＢａｍＨＩ
ＲＭＬプレプロｃＤＮＡフラグメントをこのｐ７７５ベ
クターに連結して、Ｅ． ｃｏｌｉ中に形質転換した。
プロモーターとターミネーターとの間で正確な位置に挿
入されたＲＭＬプレプロｃＤＮＡを有する組換えｐ７８
７を、Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体から抽出したミニプレ
ププラスミド上で制限酵素による消化によって同定し
た。ｐ７８７プラスミドＤＮＡを大規模に成長させて、
プラスミド調製物をＣｓＣｌ／臭化エチジウム遠心分離
によって精製した。ｐ７８７の構成を図１７に示す。
【０１２８】実施例９ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅの形質転換（一般的処理法） １００mlのＹＰＤ（sherman ら、Methods in Yeast Gen
etics, Cold Spring Harbor Laboratory, １９８１年）
にＡ．ｏｒｙｚａｅ，ＩＦＯ ４１７７またはそのａｒ
ｇＢ変異株の胞子を接種して、振盪しながら３７℃で約
２日間培養した。ミラクロスを通して濾過することによ
って菌糸を回収して、０．６ＭのＭｇＳＯ4 ２００mlで
洗浄した。
【０１２９】菌糸を１５mlの１．２ＭのＭｇＳＯ4 ，１
０mMのＮａＨ2 ＰＯ4 ，pH＝５．８に懸濁させた。懸濁
液を氷で冷却し、ＮｏｖｏｚｙｍR ２３４、バッチ１６
８７を１２０ml含む緩衝液１mlを加えた。５分後、１ml
の１２mg／ml ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ２５型）を加え
て、緩やかに撹拌しながら１．５〜２．５時間３７℃で
インキュベーションし、顕微鏡下で検討した試料中にお
いて多数の原形質体が観察されるようになるまで継続し
た。
【０１３０】懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液
を無菌チューブに移して、５mlの０．６Ｍソルビトー
ル、１００mMトリス−ＨＣｌ，pH＝７．０を積層した。
１０００ｇで１５分間遠心分離を行い、原形質体をＭｇ
ＳＯ4 クッションの上部から収集した。２容量のＳＴＣ
（１．２Ｍのソルビトール、１０mMのトリス−ＨＣｌ，
pH＝７．５，１０mMのＣａＣｌ2 ）を原形質体懸濁液に
加えて、混合物を１０００ｇで５分間遠心分離した。原
形質体ペレットを３mlのＳＴＣに再懸濁して、再度成型
した。これを繰り返した。最後に、原形質体を０．２〜
１mlのＳＴＣに再懸濁した。
【０１３１】１００μｌの原形質体分散液を５〜２５μ
ｇの適当なＤＮＡを１０μｌのＳＴＣに懸濁したものと
混合した。ａｒｇＢ株からの原形質体をｐＳａｌ４３Ｄ
ＮＡ（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子を担持
するプラスミド）およびａｒｇＢ+ 株からの原形質体を
ｐ３ＳＲ２（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｒｇＢ遺伝子
を担持するプラスミド）と混合した。
【０１３２】混合物を室温で２５分間放置した。０．２
mlの６０％ＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６），１０
mMのＣａＣｌ2 および１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH＝
７．５を加えて、注意深く混合し（２回）、最後に０．
８５mlの上記溶液を加えて、注意深く混合した。混合物
を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間遠心分
離し、ペレットを再度２mlの１．２Ｍソルビトールに懸
濁した。もう一回沈降させてから、原形質体を適当なプ
レートに塗布した。
【０１３３】ｐＳａｌ４３で形質転換したａｒｇＢ株か
らの原形質体を炭素および窒素源として、それぞれグル
コースおよび尿素を有し且つ浸透圧安定のために１．２
Ｍソルビトールを含む最少限のプレート（Ｃｏｖｅ，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，第１１３
巻、１９６６年、５１〜５６頁）に拡げた。
【０１３４】ｐ３ＳＲ２で形質転換したａｒｇＢ+ 株か
らの原形質体を、１．０Ｍスクロース、pH＝７．０、窒
素源として１０mMのアセタミド、およびバックグラウン
ド成長を抑制する２０mMのＣｓＣｌを含む最少限のプレ
ート（Ｃｏｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ，第１１３巻、１９６６年、５１〜５６頁）に塗
布した。３７℃で４〜７日間インキュベーションした
後、胞子を回収して、滅菌水に懸濁し、塗布して単一コ
ロニーとした。この処理法を繰り返して、２回の再分離
の後、単一コロニーの胞子を定義した形質転換体として
保存した。
【０１３５】実施例１０ 野生型Ａ．ｏｒｙｚａｅにお
けるＴＡＫＡ−アミラーゼの発現 ｐＴＡＫＡ １７を、実施例９に記載したようにＡ．
ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄＳ遺伝子を含むｐ３ＳＲ
２で共形質転換することによって、Ａ．ｏｒｙｚａｅ
ＩＦＯ ４１７７中に形質転換した。上記のように調製
した原形質体を等量のｐＴＡＫＡ １７およびｐ３ＳＲ
２であってそれぞれ約５μｇを用いた混合物とインキュ
ベーションした。単一窒素源としてアセタミドを用いる
ことができる９個の形質転換体を、２回再度単離した。
【０１３６】ＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９８１年）
上で３日間成長させた後、培養液上澄みをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した。ゲルを、コマージー・ブリリア
ント・ブルーＲで染色した。最良の形質転換体は、形質
転換していないＩＦＯ ４１７７の１０〜２０倍のアミ
ラーゼを生成した。一つの形質転換体を更に研究するた
めに選択して、２リットルＫｉｅｌｅｒ醗酵装置中で４
％大豆ミール上で成長させ、成長中にグルコースを供給
した。醗酵中に、培養液を激しく撹拌した。
【０１３７】これらの条件下では、ＩＦＯ ４１７７は
約１ｇ／ｌを生じ、形質転換体は酵素活性として測定し
たところ約１２ｇ／ｌのアミラーゼであった。酵素活性
を澱粉を分解する能力として測定した（Ｃｅｒｅａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１６巻、１９３９年、７１２〜
７２３頁）。使用した澱粉はＭｅｒｃｋ Ａｍｙｌｕｍ
ｓｏｌｕｂｉｌｅｅｒｇ Ｂ．６であり、分析はpH
４．７および３７℃で行った。外部からβ−アミラーゼ
を加えなかった。
【０１３８】実施例１１ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲ
ＭＰの発現 実施例７からのｐ７７７または実施例６からのｐ７７８
を、実施例９に記載の処理法によってｐ３ＳＲ２と共に
共形質転換することによってＩＦＯ−４１７７中へ形質
転換した。形質転換体を選択して、実施例９に記載のよ
うに再度単離した。
【０１３９】形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、
上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩＳＡを行って分析した。ｐ７
７７およびｐ７７８からの形質転換体の上澄液は、ＲＭ
Ｐ抗体と反応するタンパク５０〜１５０mg／ｌを含んで
いた。プロテイナーゼは、Ｒ． ｍｉｅｈｅｉで生成し
たプロテイナーゼと比較して過剰にグリコシル化した。
２つの形状のうち、一方はプロ型であり、他方は加工さ
れた成熟プロテイナーゼであると思われた。
【０１４０】ｐ７７８の２種類の形質転換体およびｐ７
７７の３種類の形質転換体を、上記ＴＡＫＡ−アミラー
ゼ形質転換体と同様に醗酵装置中で成長させた。ｐ７７
８の２種類の形質転換体は、Ｋｕｎｉｔｚ法（Ｋｕｎｉ
ｔｚ，Ｍ．，Ｊｏｕｒ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，第
１８巻、１９３５年、４５９〜４６６頁）によるミルク
凝固活性として測定したところ、約０．２ｇ／ｌおよび
０．４ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、ｐ７７７の３種類の形質
転換体は約０．５ｇ／ｌ，２．４ｇ／ｌおよび３．３ｇ
／ｌのＲＭＰを生じ、組換えＲＭＰの特異的活性はＲｈ
ｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの活性と同じであると
考えられた（これについては、後で確認した）。
【０１４１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＤＡ−ＰＡＧＥ
の後にＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよびＥＬＩ
ＳＡを行ったところ、大規模で培養する場合には、１つ
の形状のＲＭＰのみが存在することが判った。ＲＭＰは
これらの成長条件下でも、過剰にグリコシル化した。ゲ
ル上にみられるタンパクの量は、酵素活性から予測され
た量とよく相関を有した。
【０１４２】ＲＭＰを親和性クロマトグラフィーおよび
寸法排除クロマトグラフィーによって培養液の上澄みか
ら精製した。精製した組換えＲＭＰのＮ−末端配列を、
Ｔｈｉｍら（ＴＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９８７年、印刷
中）によって報告されたのと同様に気相配列装置を用い
て、測定した。
【０１４３】組換えＲＭＰの２つの形状はＮ−末端にお
ける加工が不均一であることを示した。一つの形状はAl
a-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-のＮ−末端配
列を有し、もう一方はGly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Ty
r-Tyr-Asp-のＮ−末端配列を有した。Ｎ−末端でのかか
る不均一加工も、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからの元の
ＲＭＰについて記載されている（Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．
ら、Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，第３５
巻、１９８１年、３５８〜３６０頁）。組換えＲＭＰの
不均一加工は元のＲＭＰの不均一加工と良好な相関を有
し、Ａ．ｏｒｙｚａｅは本発明によれば正確な領域で組
換えＲＭＰを加工することができることが判った。
【０１４４】実施例１２ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプ
ロキモシンの産生に就いての発現単位の構成 この構成は、Ａ．ｏｒｙｚａｅアミラーゼプロモーター
の制御下でＡ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡ−アミラーゼ遺
伝子からのシグナルペプチド配列がすぐ先行するプロキ
モシン遺伝子を含む。この構成は更に、Ａ．ｎｉｇｅｒ
グルコアミラーゼ遺伝子とＥ．ｃｏｌｉ複製体からのタ
ーミネーターを含む。ｐ２８５′ｐｒｏＣ（実施例１参
照）からの約４３０bp ＢａｍＨＩ／ＸｍａＩフラグメ
ントおよび以下の配列
【０１４５】
【化８】
【０１４６】を有する合成オリゴマーをＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｍａＩ切断ｐＵＣ１９プラスミド中に挿入して、プラス
ミドｐＴｏＣ５０ａを生成した。ｐＴｏＣ５０ａをＥｃ
ｏＲＩ−ＳａｃIIで切断し、ｐＵＣ１９を含む大きなフ
ラグメントとプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の
５′部分を単離した。このフラグメントをｐＴＡＫＡ
１７からの０．６kb ＥｃｏＲＩ−ＢａｎＩフラグメン
トおよび以下の合成オリゴマーと連結した。
【０１４７】
【化９】
【０１４８】形質転換の後、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫ
Ａ−アミラーゼ遺伝子（プレＴＡＫＡ）からのシグナル
配列に融合し且つ約５００bp上流のＴＡＫＡ−アミラー
ゼ配列が先行するプロキモシン遺伝子（プロキモシ
ン′）の５′部分を含むプラスミドｐＴｏＣ５１を単離
した。ｐＴｏＣ５１の構成を図１９に示す。
【０１４９】ｐＲ２６をＨｉｎｆＩで切断して、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩおよび４個のｄＮＴＰの大きなフラグメ
ント（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、ＸｍａＩで切断した。
プロキモシン遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメ
ントを単離した。このフラグメントの３′末端でのＨｉ
ｎｄIII を挿入するために、ｐＵＣ９をＸｍａＩ／Ｈｉ
ｎｃIIで切断して、大きなフラグメントをプロキモシン
遺伝子の３′末端を含む７５０bpフラグメントに連結し
た。
【０１５０】ｐＴＡＫＡ １７からの５．６kb Ｅｃｏ
ＲＩ−ＣｌａＩフラグメントを単離して、同じプラスミ
ドからの２．６kb ＣｌａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメン
トおよびＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子ターミ
ネーターおよびポリＡ部位を含むｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒ
ｍ（実施例４参照）からの０．７kb ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄIII と連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５
２として図２０に示す。
【０１５１】ｐＴｏＣ５２をＨｉｎｄIII で切断し、Ｅ
ｃｏＲＩで部分的に切断し、６．４kbフラグメントを単
離した。これをｐＴｏＣ５１からの０．９kb ＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｍａＩフラグメントおよびプロキモシン遺伝
子（′プロキモシン）の３′部分を含むｐＵＣ９′ＰＣ
からの０．７kb ＸｍａＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
と連結した。生成するプラスミドはｐＴｏＣ５６と呼ば
れ、図２０に示す。
【０１５２】実施例１３ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるプ
ロキモシンの発現 ｐ３ＳＲ２（ａｍｄＳ遺伝子）またはｐＳａｌ４３（ａ
ｒｇＢ遺伝子）と共形質転換することによって、ｐＴｏ
Ｃ５６をＡ．ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ４１７７またはａ
ｒｇＢ変異株に形質転換した。選択的培地で成長する形
質転換体を、実施例９と同様に２回再度単離した。
【０１５３】形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、
上澄液のプロキモシン含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後Ｗｅｓ
ｔｅｒｎブロット上でＥＬＩＳＡによって分析した。形
質転換体は、上澄液中に１〜１０mg／ｌのプロキモシン
の寸法免疫反応性タンパクを産生した。他の免疫反応性
タンパクは上澄液中に検出されなかった。
【０１５４】実施例１４ Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるＲ
ＭＬの発現 実施例８からのｐ７８７を、実施例９に記載の方法によ
ってｐ３ＳＲ２で共形質転換することによってＩＦＯ−
４１７７中に形質転換した。形質転換体を実施例９と同
様に選択して、再度単離した。３日間成長させた形質転
換体のＹＰＤ培養液からの上澄液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の後にＷｅｓｔｅｒｎブロットおよびＥＬＩＳＡを行っ
て分析した。最良の形質転換体は、タンパク１リットル
当り２mgの成熟ＲＭＬの寸法を産生した。上澄液におけ
るリパーゼ活性を、トリブチリンを開裂する能力として
計測した（ＮＯＶＯ法ＡＦ ９５．１／３−ＧＢ）。こ
の測定によって上澄液に２mg／ｌの活性リパーゼが存在
することが判った。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＴＡＫＡ−アミラーゼプロモーターお
よび上流プロモーター領域のＤＮＡ−配列を示す図であ
る。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡＫＡ １７のエンド
ヌクレアーゼ制限マップを示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐ２８５′ｐｒｏＣの構成
を示す図である。
【図４】図４は、３文字省略によって与えられる推定ア
ミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍ
ｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼのＤＮＡ配列
を示す図である。
【図５】図５は図４の続きの図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＲＭＰの構成を示す図で
ある。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＡＭＧ９１のエンドヌ
クレアーゼ制限マップを示す図である。
【図８】図８はプラスミドｐＩＣＡＭＧ／Ｔｅｒｍの構
成を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドｐ６８６の構成を示す図で
ある。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＲＭＰＡＭＧＴｅｒ
ｍの構成を示す図である。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＢ４０８．３の構成
を示す図である。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＢ７７８の構成を示
す図である。
【図１３】図１３は、プラスミドｐＢ７１９の構成を示
す図である。
【図１４】図１４は、プラスミドｐ７７７の構成を示す
図である。
【図１５】図１５は、３文字省略によって与えられる推
定アミノ酸配列を有するプレプロＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ
ｍｉｅｈｅｉリパーゼｃＤＮＡの配列を示す図であ
る。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＢ５４４の構成を示
す図である。
【図１７】図１７は、プラスミドｐ７８７の構成を示す
図である。
【図１８】図１８は、合成フラグメントＲＭＬ５′のＤ
ＮＡ配列を示す図である。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＴｏＣ５１の構成を
示す図である。
【図２０】図２０は、プラスミドｐＴｏＣ５６の構成を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 トベー クリステンセン デンマーク国，2800 リュンクビュ，１. テーホー．ボーレバーデン 10 (72)発明者 ヘレ ファブリシウス ウォルデケ デンマーク国，3540 リュンゲ，ステンデ ュッセベイ 12

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇ
    ｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）によるタンパク生成物の発
    現および分泌方法であって、アスペルギルス・オリザ
    （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）宿主のゲノ
    ム中に１個以上のコピーを組込み可能であり、かつ、遺
    伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列と形質
    転換細胞の選択に好適なマーカーと培養基への発現生成
    物の分泌を提供するためのプレ配列と所望のタンパク生
    成物を暗号化するＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮ
    Ａクローニングベクター系により、選定された選択マー
    カーについての機能的遺伝子を有しないアスペルギルス
    ・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を
    工程（ａ）からの組換えＤＮＡクローニングベクター系
    で形質転換して得られる宿主を適当な培養基中で培養し
    て、前記タンパク生成物を分泌せしめる工程を含んで成
    る方法。
  2. 【請求項２】 遺伝子発現を促進する機能を暗号化する
    ＤＮＡ配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに転
    写ターミネーターおよびポリアデニル化機能を有する、
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】 プロモーターに対して、上流活性化配列
    が先行する、特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】 選択マーカーが、Ａ．ニドランス（Ａ．
    ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）ａｒｇＢ，Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎ
    ｓ）ｔｒｐＣ，Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎ
    ｓ）ａｍｄＳ、ニューロスポラ・クラザーエ（Ｎｅｕｒ
    ｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａｅ）Ｐｙｒ４またはＤＨＦ
    Ｒに由来する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 選択マーカーがＡ．ニドランス（Ａ．ｎ
    ｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）
    に由来するＡｒｇＢ遺伝子またはＡ．ニドランス（Ａ．
    ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するａｍｄＳ遺伝子である、
    特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】 プロモーターおよび上流活性化配列がア
    ミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
    ゼ、セルラーゼまたは解糖酵素のような細胞外あるいは
    細胞内タンパクを暗号化する遺伝子に由来する、特許請
    求の範囲第３項記載の方法。
  7. 【請求項７】 プロモーターおよび上流活性化配列が、
    Ａ．オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、
    リゾムコール マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉ
    ｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガー
    （Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー
    （Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼまたはリゾムコー
    ル マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）
    リパーゼの遺伝子に由来する、特許請求の範囲第６項記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 プロモーターがＡ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡ
    ＫＡアミラーゼプロモーターまたはその機能性部分であ
    る、特許請求の範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】 プロモーターおよび上流活性化配列が以
    下の配列 GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】 プロモーターおよび上流活性化配列が
    以下の配列 AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCC ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 特許請求の範囲第１０項記載の配列に
    対して、プラスミドｐＴＡＫＡ １７における位置０〜
    １．０５の１．０５kb無配列上流領域が先行する、特許
    請求の範囲第１０項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 プレ領域がアスペルギルス（Ａｓｐｅ
    ｒｇｉｌｌｕｓ）の種からのグルコアミラーゼあるいは
    アミラーゼ遺伝子、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種
    からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコール マイヘイ（Ｒ
    ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）からのリパーゼも
    しくはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ．セレビゼ（Ｓ．ｃｅ
    ｒｅｖｉｓｉａｅ）からのα−因子の遺伝子または仔牛
    のプロキモシン遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  13. 【請求項１３】 プレ領域がＡ．オリザ（Ａ．ｏｒｙｚ
    ａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）の酸に安定なα−アミラーゼ、Ｂ．リケニフォルミ
    ス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、α−アミラー
    ゼ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ １１８３
    ７マルトース生成アミラーゼ、Ｂ．ステロサーフィラス
    （Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−ア
    ミラーゼまたはＢ．リケニホルミス・ズブチリシン
    （Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
    ｉｎ）の遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１２項記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 プレ領域が以下の配列 ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaProAlaLeuAla を有するＴＡＫＡ−アミラーゼプレ領域である、特許請
    求の範囲第１３項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ベクター系が２個のベクターを含んで
    成り、一方が選択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を
    促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列と所望のタンパク
    生成物を暗号化するＤＮＡ配列を有する、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒ
    ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）によるタンパク生成物の
    製造方法であって、アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅ
    ｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）宿主のゲノム中に１個
    以上のコピーを組込み可能であり、かつ、遺伝子発現を
    促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列と形質転換細胞の
    選択に好適なマーカーと培養基への発現生成物の分泌を
    提供するためのプレ配列と所望のタンパク生成物を暗号
    化するＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡクローニ
    ングベクター系をにより、選定された選択マーカーにつ
    いての機能的遺伝子を有しないアスペルギルス・オリザ
    （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を工程
    （ａ）からの組換えＤＮＡクローニングベクター系で形
    質転換して得られる宿主を、適当な培養基中で培養して
    タンパク生成物を分泌せしめ、次いで培地から生成物を
    回収する、ことを特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒ
    ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）による真菌類タンパク生
    成物の発現および分泌方法であって、アスペルギルス・
    オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）宿主
    のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であり、か
    つ、遺伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列
    と形質転換細胞の選択に好適なマーカーと培養基への発
    現生成物の分泌を提供するためのプレ領域と所望のタン
    パク生成物を暗号化するＤＮＡ配列とを含んで成る組換
    えＤＮＡクローニングベクター系により、選定された選
    択マーカーについての機能的遺伝子を有しないアスペル
    ギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
    ｅ）を工程（ａ）からの組換えＤＮＡクローニングベク
    ター系で形質転換して得られる宿主を適当な培養基中で
    培養して、前記真菌類タンパク生成物を分泌せしめる工
    程を含んで成る方法。
  18. 【請求項１８】 遺伝子発現を促進する機能を暗号化す
    るＤＮＡ配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに
    転写ターミネーターおよびポリアデニル化機能を有す
    る、特許請求の範囲第１７項記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記プロモーターが真菌類プロモータ
    ーである、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 プロモーターに対して、上流活性化配
    列が先行する、特許請求の範囲第１８項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 選択マーカーが、Ａ．ニドランス
    （Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉ
    ｇｅｒ）ａｒｇＢ，Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａ
    ｎｓ）ｔｒｐＣ，Ａ．ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎ
    ｓ）ａｍｄＳ、ニューロスポラ・クラザーエ（Ｎｅｕｒ
    ｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａｅ）Ｐｙｒ４またはＤＨＦ
    Ｒに由来する、特許請求の範囲第１７項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 選択マーカーがＡ．ニドランス（Ａ．
    ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）に由来するＡｒｇＢ遺伝子またはＡ．ニドランス
    （Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来するａｍｄＳ遺伝子で
    ある、特許請求の範囲第２１項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 プロモーターおよび上流活性化配列が
    アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
    ゼ、セルラーゼまたは解糖酵素のような細胞外あるいは
    細胞内タンパクを暗号化する遺伝子に由来する、特許請
    求の範囲第２０項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 プロモーターおよび上流活性化配列
    が、Ａ．オリザ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラー
    ゼ、リゾムコール マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ
    ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニ
    ガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガ
    ー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼまたはリゾムコ
    ール マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅ
    ｉ）リパーゼの遺伝子に由来する、特許請求の範囲第２
    ３項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 プロモーターがＡ．ｏｒｙｚａｅ Ｔ
    ＡＫＡアミラーゼプロモーターまたはその機能性部分で
    ある、特許請求の範囲第２４項記載の方法。
  26. 【請求項２６】 プロモーターおよび上流活性化配列が
    以下の配列 GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第２５項記載の方法。
  27. 【請求項２７】 プロモーターおよび上流活性化配列が
    以下の配列 AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCC ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第２５項記載の方法。
  28. 【請求項２８】 特許請求の範囲第１０項記載の配列に
    対して、プラスミドｐＴＡＫＡ １７における位置０〜
    １．０５の１．０５kb無配列上流領域が先行する、特許
    請求の範囲第２７項記載の方法。
  29. 【請求項２９】 プレ領域がアスペルギルス（Ａｓｐｅ
    ｒｇｉｌｌｕｓ）の種からのグルコアミラーゼあるいは
    アミラーゼ遺伝子、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種
    からのアミラーゼ遺伝子、リゾムコール マイヘイ（Ｒ
    ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）からのリパーゼも
    しくはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ．セレビゼ（Ｓ．ｃｅ
    ｒｅｖｉｓｉａｅ）からのα−因子の遺伝子または仔牛
    のプロキモシン遺伝子に由来する、特許請求の範囲第１
    ７項記載の方法。
  30. 【請求項３０】 プレ領域がＡ．オリザ（Ａ．ｏｒｙｚ
    ａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅ
    ｒ）の酸に安定なα−アミラーゼ、Ｂ．リケニフォルミ
    ス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、α−アミラー
    ゼ、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ １１８３
    ７マルトース生成アミラーゼ、Ｂ．ステロサーフィラス
    （Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−ア
    ミラーゼまたはＢ．リケニホルミス・ズブチリシン
    （Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
    ｉｎ）の遺伝子に由来する、特許請求の範囲第２９項記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】 プレ領域が以下の配列 ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaProAlaLeuAla を有するＴＡＫＡ−アミラーゼプレ領域である、特許請
    求の範囲第３０項記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ベクター系が２個のベクターを含んで
    成り、一方が選択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を
    促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列と所望のタンパク
    生成物を暗号化するＤＮＡ配列を有する、特許請求の範
    囲第１７項記載の方法。
  33. 【請求項３３】 アスペルギルス・オリザ（Ａｓｐｅｒ
    ｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）による真菌類タンパク生
    成物の製造方法であって、アスペルギルス・オリザ（Ａ
    ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）宿主のゲノム中
    に１個以上のコピーを組込み可能であり、かつ、遺伝子
    発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列と形質転換
    細胞の選択に好適なマーカーと培養基への発現生成物の
    分泌を提供するためのプレ領域と所望のタンパク生成物
    を暗号化するＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡク
    ローニングベクター系により、選定された選択マーカー
    についての機能的遺伝子を有しないアスペルギルス・オ
    リザ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を工程
    （ａ）からの組換えＤＮＡクローニングベクター系で形
    質転換して得られる宿主を、適当な培養基中で培養して
    真菌類タンパク生成物を分泌せしめ、次いで培地から生
    成物を回収する、ことを特徴とする方法。
  34. 【請求項３４】 遺伝子発現を促進する機能を暗号化す
    るＤＮＡ配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに
    転写ターミネーターおよびポリアデニル化機能を有す
    る、特許請求の範囲第３３項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記プロモーターが真菌類プロモータ
    ーである、請求項３４に記載の方法。
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