JPH10287681A

JPH10287681A - 新規抗生物質ジペラマイシンとその製造方法

Info

Publication number: JPH10287681A
Application number: JP9063697A
Authority: JP
Inventors: Tomio Takeuchi; 富雄竹内; Naoki Matsumoto; 直樹松本; Isao Momose; 功百瀬; Hironobu Iinuma; 寛信飯沼; Hiroshi Osanawa; 博長縄; Tsutomu Sawa; 力澤; Masa Hamada; 雅濱田
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 1998-10-27

Abstract

(57)【要約】【課題】メチシリン耐性菌を含むグラム陽性菌に対す
る抗菌活性および抗腫瘍活性を示す新しい分子骨格を有
する抗生物質を提供する。【解決手段】次式（Ｉ）：で表わされるジペラマイシンが新規抗生物質としてスト
レプトミセス・エスピーMK393-AF2株の培養により得ら
れた。ジペラマイシンは各種の細菌に対する抗菌活性お
よび抗腫瘍活性を有する抗生物質である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗菌活性と抗腫瘍
活性または抗癌活性とを示す新規な抗生物質ジペラマイ
シンに関し、またジペラマイシンの製造法に関する。さ
らに本発明は、ジペラマイシンを有効成分とする抗菌剤
及び抗腫瘍剤に関する。また、本発明は新規な抗生物質
ジペラマイシンを生産する特性を持つ新規な微生物とし
てストレプトミセス・エスピー MK393-AF2株を包含す
る。

【０００２】

【従来の技術】種々な多数の抗菌性物質が知られてお
り、また種々な多数の抗腫瘍性物質が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】細菌感染症の化学療法
において、多剤耐性菌の出現は重大な問題である。従来
知られているまたは使用されている既知の抗菌性化合物
とは異なる化学構造を有し、且つ優れた抗菌活性を示す
新しい化合物の発見または創製をすることは常に望まれ
ており、そのための研究が行われている。また抗腫瘍性
物質は、一般に強い毒性を有するものが多く、その抗腫
瘍剤としての使用に当たって大きな制約となっている。
そこで、毒性が低く且つ新規な化学構造を有する抗腫瘍
性物質を発見または創製することが常に望まれており、
そのための研究が行われている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の要
望に応えることができる抗菌活性及び抗腫瘍活性を持つ
新規な抗生物質を提供することを目的に、従来より有用
な抗生物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その
結果、土壌試料から新規な微生物としてストレプトミセ
ス属に属する菌株を分離することに成功し、またこの菌
株が新しい構造骨格を有する抗生物質を生産しているこ
とを見い出した。この新規抗生物質を単離することに成
功し、後記の式 (I)で示される化学構造を有することを
確認し、そしてジペラマイシンと命名した。更に、この
新規抗生物質が薬剤耐性菌（メチシリン耐性菌等）を含
むグラム陽性の細菌、ならびに水産業のブリ養殖業にお
いて問題になっているグラム陽性球菌エンテロコッカス
・セリオリシダに抗菌活性を示し、また各種の癌細胞の
増殖に対して抑制活性を示すことを見い出した。

【０００５】すなわち、第１の本発明においては、次式
（Ｉ）：で表わされる化合物である抗生物質、ジペラマイシンが
提供される。

【０００６】次に、抗生物質ジペラマイシンの理化学的
性状を記載する。Ａ）外観及び性質：白色粉末、中性物質Ｂ）融点：152〜154℃ Ｃ）比旋光度 [α]_D ²³ ＋25.7゜（ｃ 1.0、メタノー
ル）Ｄ）ＴＬＣのＲf値：0.41 シリカゲル（Art. 1.05715、メルク社製）の薄層クロマ
トグラフィーで、展開溶媒としてクロロホルム−メタノ
ール（10：１）で展開して測定した場合Ｅ）ＦＡＢマススペクトル(m/z): 879（M + Na)⁺ 855（M - H)^- Ｆ）高分解能ＦＡＢマススペクトル：実験値 879.4440(M+Na)⁺ 計算値 879.4474 Ｇ）分子式：Ｃ₃₈Ｈ₆₄Ｎ₈０₁₄ Ｈ）紫外線吸収スペクトル： (i) メタノール溶液中で測定したＵＶ吸収スペクトルは
添付図面の図１に実線で示す。主な吸収ピークは次のと
おりである。 λmax ｎｍ（ε）203(34220) (ii) 0.01N NaOH−メタノール溶液中で測定したＵＶ吸
収スペクトルは添付図面の図１に波線で示す。 (iii) 0.01N HCl−メタノール溶液中で測定したＵＶ吸
収スペクトルは添付図面の図１に点線で示す。

【０００７】Ｉ）赤外線吸収スペクトル(KBr錠剤法）：
添付図面の図２に示す。 νmax(cm^-1）3409, 2933, 1749, 1643, 1523, 1444, 14
14, 1252, 1120,1092 Ｊ）¹Ｈ-ＮＭＲスペクトル（CDCl₃/TMS）：添付図面の
図３に示す。Ｋ）¹³Ｃ-ＮＭＲスペクトル（CDCl₃/TMS）：添付図面の
図４に示す。

【０００８】本発明による抗生物質ジペラマイシンが
（Ｉ）式で示される構造を有することは、¹Ｈ-ＮＭＲ、
¹³Ｃ-ＮＭＲ等のスペクトルを詳細に検討することによ
り決定された。

【０００９】さらに、抗生物質ジペラマイシンの生物学
的性状を次に記載する。Ａ）抗菌活性本発明による抗生物質ジペラマイシンの各種細菌に対す
る最低発育阻止濃度（μｇ／ml）は、次の表１に示す通
りである。この抗菌スペルトルは日本化学療法学会標準
法に基づき、ミュラーヒントン寒天培地(Difico)で倍数
希釈法により測定をした。

【００１０】

【００１１】Ｂ）癌細胞増殖抑制活性各種の癌細胞を用いて癌細胞の増殖を50％抑制するジペ
ラマイシンの濃度（IC₅₀値）を、ＭＴＴ法〔「Journal
of immunological Methods」65巻、55-60頁（1983年）
参照〕で測定した。その結果を表２に示す。

【００１２】Ｃ）急性毒性ＩＣＲ系雌性マウス（６週令）に腹腔内に単回投与した
ところ、75.0 mg/kgの投与量で死亡個体が見られた。

【００１３】表１の結果から明らかなように、本発明に
よる抗生物質ジペラマイシンは、各種の細菌ならびにブ
リ感染症の原因菌エンテロコッカス・セリオリシダに対
して抗菌活性を有することから抗菌剤として有用であ
る。また、表２の結果から明らかなように、ジペラマイ
シンは各種の癌細胞の増殖を抑制する抗腫瘍活性または
抗癌活性を有するから抗腫瘍剤または抗癌剤として有用
である。

【００１４】さらに第２の本発明によれば、ストレプト
ミセス属に属する、前記の式（Ｉ）のジぺラマイシンの
生産菌を栄養培地に培養し、培養物からジペラマイシン
を採取することを特徴とする、抗生物質ジペラマイシン
の製造法が提供される。

【００１５】第２の本発明の方法で使用できるジペラマ
イシンの生産菌の一例として、ストレプトミセス・エス
ピー MK393-AF2株がある。この生産菌は平成７年４月、
微生物化学研究所において、神奈川県横浜市の土壌より
分離された放線菌で、MK393-AF2 の菌株番号が付された
微生物である。

【００１６】MK393-AF2株の菌学的性状を次に記載す
る。１．形態 MK393-AF2株は、分枝した基生菌糸より、らせん形成を
有する気菌糸を伸長する。成熟した胞子鎖は、10〜50個
あるいはそれ以上の卵円形の胞子を連鎖し、胞子の大
きさは、約0.5〜0.7×0.6〜0.9ミクロンである。胞子の
表面は、平滑である。輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運
動性胞子は、認められない。

【００１７】２．各種培地における生育状態色の記載について［］内に示す色の標準は、コンティ
ナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハ
ーモニー・マニュアル(Container Corporationof Ameri
caのcolor harmony manual）を用いた。 (1) シュクロース・硝酸塩寒天培地（27℃培養）無色〜黄［1 ic, Citron Yellow］の発育上に、明るい
茶灰［3 ig, BeigeBrown］の気菌糸を着生し、溶解性色
素は、かすかに黄色を帯びる。 (2) グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地５、
27℃培養）明るい茶［4 ng, Lt Brown］の発育上に、茶白[3 cb, S
and]〜明るい灰[2 fe,Covert Gray]の気菌糸を着生す
る。溶解性色素は、うすだいだいを帯びる。 (3) スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培
養）ピンク［6 ic, Coral Rose〜7 ic, Colonial Rose］の
発育上に、明るい灰［2 fe, Covert Gray］の気菌糸を
着生する。溶解性色素は、うすピンクを帯びる。 (4) チロシン寒天培地（ISP-培地７、27℃培養）うす黄茶［2 le, Mustard]〜黄茶［3 ng, Yellow Mapl
e］の発育上に、明るい灰［2 fe, Covert Gray]の気菌
糸を着生する。溶解性色素は、黄茶を帯びる。

【００１８】(5) イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地
２、27℃培養）にぶ黄だいだい［3 ne, Topaz]〜暗い黄だいだい［4 n
e, Luggage Tan]の発育上に、明るい灰［3 fe, Silver
Gray]の気菌糸を着生し、溶解性色素は、かすかに茶色
を帯びる。 (6) オートミール寒天培地（ISP-培地３、27℃培養）にぶ黄だいだい［3 ne, Topaz］の発育上に、明るい灰
［3 fe, Silver Gray]の気菌糸を着生し、溶解性色素
は、黄色を帯びる。

【００１９】３．生理的性質 (1) 生育温度範囲グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0
％、アスパラギン 0.05％、リン酸二カリウム0.05％、
ひも寒天 2.4％、pH 7.0）を用い、10℃、20℃、24℃、
27℃、30℃、37℃及び50℃の各温度で試験した結果、20
℃、50℃を除き、そのいずれの温度でも生育した。生育
至適温度は、27〜30℃付近である。 (2) スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、
ISP-培地４、27℃培養）培養後３日目頃よりスターチの加水分解を認め、その作
用は、中等度〜強い方である。

【００２０】(3) メラニン様色素の生成（トリプトン・
イースト・ブロス、ISP-培地１；ペプトン・イースト・
鉄寒天培地、ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培地
７；いずれも27℃培養）いずれの培地でも陰性である。 (4) 炭素源の利用性(プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、ISP-培地９、27℃培養) Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、シュクロース、myo-イノシトール、
ラムノース及びＤ−マンニトールを利用して発育し、ラ
フィノースは利用しない。 (5) 硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプト
ン水、ISP-培地８、27℃培養）陽性である。

【００２１】以上の性状を要約すると、MK393-AF2株
は、分枝した基生菌糸より、らせん形成のある気菌糸を
伸長する。成熟した胞子鎖に10〜50個あるいはそれ以
上の卵円形の胞子を連鎖し、その表面は、平滑である。
種々の培地で、発育は、にぶ黄だいだい〜明るい茶ある
いはピンクを呈する。気菌糸は、明るい茶灰〜明るい
灰、溶解性色素は、黄〜茶あるいはピンクを帯びる。生
育至適温度は、27〜30℃付近である。メラニン様色素の
生成は、陰性、スターチの水解性は、中等度〜強い方で
ある。なお、細胞壁に含まれる2,6-ジアミノピメリン酸
は、LL−型であり、菌体中の主要なメナキノンは、MK-9
(H₈）及びMK-9(H₆）であった。

【００２２】これらの性状より、MK393-AF2株は、スト
レプトミセス（Streptomyces）属に属すると考えられ
る。そこで、MK393-AF2株をストレプトミセス・エスピ
ー（Streptomyces sp.） MK393-AF2とする。なお、MK39
3-AF2株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申
請し、平成９年２月12日、FERM P−16079 として受託さ
れた。

【００２３】第２の本発明の方法を実施するに当って
は、ストレプトミセス属に属するジペラマイシンの生産
菌を栄養培地に接種し、この培地中で培養する。ここで
用いる栄養培地は、前記の生産菌が資化できる炭素源と
窒素源を栄養成分として含有するものである。

【００２４】その栄養源としては、通常、微生物の栄養
源として使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機
塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶど
う糖、麦芽糖、糖密、デキストリン、グリセリン、澱粉
などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごと
き炭素源を使用でき、またペプトン、肉エキス、綿実
紛、大豆紛、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・
リカー、ＮＺ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源を使用できる。
さらに、燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸
カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無
機塩が添加でき、必要により微量金属例えばコバルト、
鉄などを添加することができる。栄養源としては、その
他、抗生物質ジペラマイシンを生産するのに使用する菌
が利用しうるものであればいずれの公知の栄養源でも使
用できる。

【００２５】培地における上記のごとき栄養源の配合割
合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変える
ことができ、使用するジペラマイシン生産菌によって、
最適の栄養源の組成及び配合割合は、当業者であれば簡
単な小規模実験により容易に決定することができる。ま
た、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺
菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のpHを
６〜８の範囲、特にpH6.5〜7.5の範囲に調節するのが有
利である。

【００２６】かかる栄養培地でのジペラマイシン生産菌
の培養は、一般の放線菌による抗生物質の製造において
通常使用されている方法に準じて行なうことができる。
通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常攪拌
しながら及び／又は通気しながら行なうことができる。
また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪
拌をともなう液内培養のいずれも使用可能であるが、液
体培養がジペラマイシンの大量生産に適している。

【００２７】使用しうる培養温度はジペラマイシン生産
菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産しう
る範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用す
る生産菌に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは
25〜30℃の範囲内の温度を挙げることができる。培養は
通常はジペラマイシンが十分に蓄積するまで継続するこ
とができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使
用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常３〜10
日間の培養で目的の抗生物質を得ることができる。

【００２８】培養中の新規抗生物質ジペラマイシンの蓄
積量はスタヒロコッカス・アウレウス・スミスを使用し
て、通常の抗生物質の定量に用いられる円筒平板法によ
り定量することができる。

【００２９】かくして、培養物中に蓄積されたジペラマ
イシンは、これを培養物から採取する。培養後、必要に
より、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法に
よって菌体を除去した後、その濾液を有機溶媒、特に酢
酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着やイオン交換能
を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を
利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わ
せて使用することにより単離精製して採取することがで
きる。吸着やイオン交換能を有するクロマトグラフィー
用担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチ
レン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換
樹脂を用いることができる。また、分離した菌体から
は、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕によ
る溶出法によって菌体から目的の抗生物質を抽出し、上
記と同様に単離精製することができる。かくして、前記
した特性を有する新規抗生物質ジペラマイシンが得られ
る。

【００３０】さらに、第３の本発明では、前記の式
（Ｉ）で表わされるジペラマイシンを有効成分とする抗
菌剤が提供される。さらに、第４の本発明では、前記の
式（Ｉ）で表わされるジペラマイシンを有効成分とする
抗腫瘍剤が提供される。

【００３１】本発明による抗菌剤または抗腫瘍剤におい
ては、有効成分としてのジペラマイシンは製薬学的に許
容できる常用の固体または液体担体、例えばエタノー
ル、水、デンプン等と混和されている形の組成物である
ことができる。

【００３２】また、第５の本発明では、新規な微生物と
して、上記の式（Ｉ）のジペラマイシンを生産する特性
をもつストレプトミセス・エスピー MK393-AF2株が提供
される。

【００３３】

【発明の実施の形態】次に実施例により本発明を更に詳
細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるも
のではない。

【００３４】実施例１抗生物質ジペラマイシンの製造グリセリン２％、デキストリン２％、バクト−ソイトン
１％、粉末酵母エキス0.3 ％、硫酸アンモニウム 0.2
％、炭酸カルシウム 0.2％、シリコンオイル１滴を含む
液体培地（pH 7.0に調整）を三角フラスコ(500ml容）に
110 ml分注し、常法により120 ℃で20分滅菌したもの
に、寒天斜面培地に培養した MK393-AF2株(FERM P-1607
9）を接種し、その後、27℃で２日間回転振とう培養し
た。これにより種母培養液を得た。グリセリン２％、デ
キストリン２％、バクト−ソイトンｌ％、粉末酵母エキ
ス0.3 ％、硫酸アンモニウム 0.2％、炭酸カルシウム
0.2％，プロナール 1.5ccを含む液体培地（pH 7.4に調
整）をジャーファーメンター（30リットル容）に12リッ
トル入れ、常法により120℃で20分間滅菌後、上記の種
母培養液を110 ml接種し、攪拌数 200r.p.m.、27℃、７
日間通気攪拌条件下で培養した。

【００３５】このようにして得られた培養液を遠心分離
し、菌体を分離した。ろ別した菌体をアセトン３リット
ルで２回抽出した後、減圧下で 2.5リットルまで濃縮し
た。これを、酢酸エチル 2.5リットルで抽出し、酢酸エ
チル層は無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、減圧下
で濃縮乾固した。得られた残渣を、シリカゲル(Art.1.0
7734.1000、メルク社製、25 g）のクロマトグラフィー
にて、クロロホルム−メタノール（50：１）で展開し、
同展開溶媒にてＲf値0.41の物質を主成分として示す画
分を濃縮すると、淡赤色シロップ状残渣 1.32gを得た。

【００３６】この残渣をセファデックス LH-20（300 m
l）によるクロマトグラフィーに供しメタノールで溶出
し、クロロホルム−メタノール(50：１）の展開溶媒に
てＲf値0.41の物質を主成分として示す画分を濃縮する
と、淡赤色シロップ状残渣 450mgが得られた。この残渣
を分取用液体クロマトグラフィー（移動相：CH₃CN／H₂O
＝65／35、流速：10ml／min)、(カラム：SHISEIDO、ODS
、Capcell Pak UG120Å20mmφ×250mm)にて精製する
と、ジペラマイシンが融点 152〜154 ℃の白色粉末とし
て100.9mgの収量で得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】実線：ジペラマイシンのメタノール溶液中の紫
外線吸収スペクトルである。波線：ジペラマイシンの0.01N NaOH-メタノール溶液中
の紫外線吸収スペクトルである。点線：ジペラマイシンの0.01N HCl-メタノール溶液中の
紫外線吸収スペクトルである。

【図２】ジペラマイシンのKBr錠剤法で測定した赤外線
吸収スペクトルである。

【図３】ジペラマイシンの重クロロホルム溶液（内部標
準：トリメチルシラン）にて測定したプロトン核磁気共
鳴スペクトル（500MHz）である。

【図４】ジペラマイシンの重クロロホルム溶液（内部標
準：トリメチルシラン）にて測定した炭素13核磁気共鳴
スペクトル（125MHz）である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者飯沼寛信神奈川県横浜市緑区白山４丁目61番17号 (72)発明者長縄博東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者澤力神奈川県綾瀬市綾西四丁目６番７号 (72)発明者濱田雅東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデンス405号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）：で表わされる化合物である抗生物質ジペラマイシン。
【請求項２】ストレプトミセス属に属して次式
（Ｉ）：で表されるジペラマイシンを生産する菌を栄養培地に培
養し、培養物からジペラマイシンを採取することを特徴
とする、抗生物質ジペラマイシンの製造法。
【請求項３】抗生物質ジペラマイシンを有効成分とす
る抗菌剤。
【請求項４】抗生物質ジペラマイシンを有効成分とす
る抗腫瘍剤。
【請求項５】抗生物質ジペラマイシンを生産する特性
を持つストレプトミセス・エスピー MK393-AF2株。