JPH10502466A - スキャニングマイクロスコピー用オートフォーカスシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多顕微鏡フィールドをスキャンできるシステムから蛍光ステイン細胞成分の正確な測定値を取得するには信頼性の高いオートフォーカスが必要である。オートフォーカスは蛍光イメージで直接的に実行することもできるが、フォトブリーチングや破壊的蛍光副産物のため、光に敏感なスペシメンや生細胞には蛍光露出を最低限度に押さえることが最良である。この露出問題は、蛍光マイクロスコピーと同じ機器を通じて実施されるフェーズコントラストマイクロスコピーで完全に回避することが可能であろう。フェーズコントラストと蛍光オートフォーカスの両方に対するファンクションは本発明を利用して評価され、蛍光マイクロスコピーに対するフェーズコントラストオートフォーカスの適正さが決定された。オートフォーカスの速度はボリュームイメージによってさらに速められる。ボリュームイメージは複数のイメージ平面の各イメージ平面でのイメージ観察体を観察することで取得され、各イメージ平面はそれぞれのイメージ平面から垂直方向に離れている。電子イメージ表示は各イメージ平面で取得される。イメージ平面はイメージ観察体上でスキャンされ、イメージはバッファで時間的にアラインされる。バッファは、バッファでアラインされたイメージ平面でのイメージを含んだボリュームイメージを保持する。最良フォーカスを有したイメージ平面が選択され、顕微鏡のオブジェクティブは選択された平面に自動的にポジションされる。

Description

【発明の詳細な説明】 スキャニングマイクロスコピー用オートフォーカスシステム マイクロフィッシュアペンディクス（Microfiche Appendix） コンピュータソースコード（computer source code）を含んだマイクロフィッ シュアペンディックスが装備されている。マイクロフィッシュアペンディックス は、１体のタイトルフレーム（title frame）を含んだ２２体のフレームを有し た１枚のマイクロフィッシュを含んでいる。 このマイクロフィッシュアペンディクスは、著作権に関係するもの含んでいる 。米国特許商標局保管の書類から判断すれば、著作権者はその利用を許可してい るようであるが、その全ての著作権は留保している。 技術分野 本発明はオートフォーカス技術（autofocusing）に関する。さらに特定するな らば、顕微鏡用のオートフォーカスシステムに関する。 従来技術 オートフォーカスはシングルフィールド以上の領域をスキャンしなければなら ない全自動顕微鏡ベースイメージ処理システムには必須である。経験によれば、 顕微鏡スライド上の２点で最良のフォーカスを決定し、３次元でそれらの間のラ インに沿ってスキャンするだけではフォーカスを維持することは不可能である。 この原因はいくつか考えられる。例えば、顕微鏡の物理的な不安定性やガラスス ライド表面の不均質性も原因となろう。また、不均質に熱を放出する光源に起因 する顕微鏡の数ミクロン単位の不安定度も関与するであろう。例えば、アルミニ ウムの熱膨張係数を考えるなら、１．０℃の増加は、顕微鏡内の観察物と載物台 との間に２５ｍｍ毎に０．６μｍの膨張を引き起こす。物理的不安定性は載物台 の可動部材間のギヤの滑りや不動状態を原因とすることもある。顕微鏡スライド 面の不均質性も誤差の原因である。標準的な光学品質の反射鏡平坦度（standard optical quality mirro flatness）は、２５ｍｍに対して約１．５μｍである 。反射鏡が研磨ガラス（ground glass）であり、顕微鏡スライドがフロートガラ ス（float glass）であるとすれば、顕微鏡スライド面の不規則性はさらに顕著 になる。フランコン（「マイクロスコピーの進歩」ロー，ピーターソン，イリノ イ州エバンストン，１９６１年）等の定義によれば、ニューメリカルアパーチャ （numrical aperture：ＮＡ）０．７５を有する観察物に対するフィールドの理 論的顕微鏡デプス（depth）は波長５００ｎｍで０．７４μｍである。最良フォ ーカスは顕微鏡スライド上の５０ｍｍの水平スキャンにおいて約２５μｍのレン ジで可変であろう。不安定性の原因が何であれ、位置変動が比較的に長時間の定 数（long time constants）を有している場合には、オートフォーカスはそれを 補正することが可能である。 たいていのオートフォーカス手法は２つのカテゴリーに入る。すなわち、ポジ ションセンサー法（position sensing）とイメージ分析法（image content anal ysis）である。インターフェロメトリ（interferometry）などのポジションセン サー法は最良フォーカス位置の独立的キャリブレーション（calibration）を必 要とし、特に、光または音を反射する１体の良好に定義された表面（well-defin ed surface）を必要とする。光マイクロスコピーにおいては、２体の反射面であ るカバースリップ（coverslip）とスライドとが多用される。さらに、組織試験 体（tissue specimens）は大きなデプスを有しており、最良フォーカスは必ずし もガラス表面では達成されない。これらの問題は光マイクロスコピーでの絶対ポ ジションセンサー法の利用を非現実的としている。一方、顕微鏡のオートフォー カスのために本発明によって利用されるようなイメージ分析ファンクション（fu nctions）は、イメージから直接的に測定される特性のみに依存する。最良フォ ーカスは、異なる垂直ポジションにて取得された一連のイメージの特性を比 較することで得られる。このオートフォーカス法は独立基準（independent refe rence）を必要とせず、第２の反射面（second reflective surface）によっても さほどに影響を受けない。その最も重要な限定要因は速度であり、これはビデオ レート（video rate）、垂直再ピジション時間、ファンクション（関数）計算時 間、及びサーチレンジに関与するものである。 イメージオートフォーカスファンクションはブライトフィールドマイクロスコ ピー（brightfield microscopy）において以前から比較されているが、蛍光マイ クロスコピー（fluorescence microscopy）またはフェーズコントラストマイク ロスコピー（phase-contrast microscopy）においては利用されていなかったよ うである。例えば、グロエン、ヤング及びリグサート（「オートフォーカスアル ゴリズムに使用するための異なるフォーカスファンクションの比較」シトメトリ (Cytometry)６：８１−９１，１９８５年）は、電子顕微鏡グリッドとメタフェ ーズスプレッド（metaphase spread）とを使用してブライトフィールドのもとで １１のオートフォーカスファンクションを比較しており、ボラス（「コレラティ ブ法(Correlative Methods)によるオートフォーカス法」マイクロスコピー誌１ ４７：２７９−２８８，１９８７年）は、パーライトスチール試験体を使用して ブライトフィールドでオートコリレーションファンクション（autocorrelation function）をテストした。グロエン他は、３つのオートフォーカスファンクショ ン、すなわち、２つのグラジエントファンクション（gradient functions）とそ のインテンシティバリアンス（intensity variance）とが最良であると結論した 。しかし、１体の試験体に対して良好にパーフォームしたオートフォーカスファ ンクションは他の試験体に対しては良好にパーフォームしなかった。よって彼ら はそれらの結果を他のイメージモードや試験体に自動的に適用しないように忠告 した。 １種の顕微鏡法から他の顕微鏡法へのオートフォーカステスト結果の適用の不 確定性は本発明を導いた。本発明の開発は蛍光ステインされた（fluorescent st ained）生物的試験体のマイクロスコピーにおけるオートフォーカスパーフォー マンスの開発を含んでいた。その蛍光信号はオートフォーカスのために直接的に 使用が可能である。しかし、フォトブリーチング（photobleaching）と、遊離基 、一重項酸素、及び熱の形成とを含んだ、チェン（「培養生細胞の蛍光マイクロ スコピーにおけるミトコンドリアの蛍光ラベル法」パートＡ，ワングとテイラー 監修，アカデミックプレス，サンディエゴ，１０３−１２３，１９８９年）等に よりまとめられた問題は、蛍光励起（fluorescent excitaion）のミニマム化が 非常に重要となるような条件を創出することであろう。おそらく、最も重要な条 件は、生細胞の分析において発生するであろう。もし信号が弱く、抗フォトブリ ーチング剤が毒性のために使用できなければ、その信号はオートフォーカスに要 する５から１０のビデオフレームの露出において容易に完全消失するかも知れな い。さらに、蛍光副産物自体は毒性であり、過剰な露出は結果を変更したり生細 胞にダメージを与えるかも知れない。よって、オートフォカスのための非破壊的 イメージ技術が嘱望されている。ブライトフィールドマイクロスコピーにおいて 、蛍光ステイン細胞は非ステインであるかのようであり、ほとんどコントラスト を示さない。一方、フェーズコントラストマイクロスコピーは非ステイン細胞の 高コントラストイメージを提供し、オートフォーカスにはさらに有用である。こ れらの理由によってオートフォーカスファンクションパーフォーマンスは、フェ ーズコントラストマイクロスコピーと蛍光マイクロスコピーとの両方に対してテ ストされた。オートフォーカスに対する異なる取り組みの詳細はジェフリーＨ． プライスの博士論文「細胞単層のスキャニングシトメトリ」（カルフォルニア大 学，サンディエゴ，１９９０年）に紹介されており、本明細書はその全内容を含 むものとする。 発明の開示 複数の顕微鏡フィールドをスキャンできるシステムにおける感光性試験体（ph otosensitive specimens）及び生細胞からの細胞成分（cellular components） の短時間で信頼性のあるオートフォーカスに関する諸問題は、処理を自動化し、 単純化し、促進し、質的改良されてデザインされたスキャニングマイクロスコピ ー用の本発明のオートフォーカスシステムで解消されよう。このオートフォーカ スシステムの目標は、顕微鏡のフォーカスポジショナーあるいはフォーカス機構 を正確で自動的にポジションさせて情報を収集させ、その情報をさらに処理させ ることである。 図面の簡単な説明 本発明の目的、利点及び特徴は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を読めば さらに容易に理解されるであろう。 図１は、本発明のオートフォーカスシステムの１好適実施例による基本的な構 成を示す略図である。 図２は、図１に示すシステムの顕微鏡を通して見られる細胞拡大図である。 図３は、図１の好適イメージプロセッサーのブロック図である。 図４は、図１のシステムによって実行されるオートフォーカスプロセスのフロ ー図である。 図５は、図１のシステムによって実行されるバイナリ（binary）サーチオート フォーカスプロセスのフロー図である。 図６は、図１のシステムによって実行されるセクエンシャルな（sequential） オートフォーカスプロセスのフロー図である。 図７Ａ，７Ｂ，７Ｃ，７Ｄ，７Ｅ，７Ｆ，７Ｇ，７Ｈ及び７Ｉは、図１のシス テムを使用した、１０体の蛍光ステイン細胞を含んだ顕微鏡フィールドに対する オートフォーカスファンクション（Ｆ₁−Ｆ₁₁）の結果を示す。 図８Ａ，８Ｂ，８Ｃ，８Ｄ，８Ｅ，８Ｆ，８Ｇ，８Ｈ及び８Ｉは、図１のシス テムを使用した、１０体の細胞を含んだフェーズコントラスト顕微鏡フィールド に対するオートフォーカスファンクション（Ｆ₁−Ｆ₁₁）の結果を示す。 図９Ａ，９Ｂ，９Ｃ，９Ｄ，９Ｅ，９Ｆ，９Ｇ，９Ｈ及び９Ｉは、図１のシス テムを使用した、１体の蛍光ステイン細胞を含んだ顕微鏡フィールドに対するオ ートフォーカスファンクション（Ｆ₁−Ｆ₁₁）の結果を示す。 図１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ，１０Ｅ，１０Ｆ，１０Ｇ，１０Ｈ及び１ ０Ｉは、図１のシステムを使用した、１体の細胞を含んだフェーズコントラスト 顕微鏡フィールドに対するオートフォーカスファンクション（Ｆ₁−Ｆ₁₁）の結 果を示す。 図１１は、図１のシステムを使用した、フォーカスポジションとズームとに対 するファンクションＦ₃のレスポンスの３次元プロットである。 図１２は、フェーズコントラスト法と蛍光法におけるオートフォーカス精度（ precision）、正確性（accuracy）及び速度（speed）の実験結果を示すチャート である。 図１３は、本発明によるボリュームイメージ法（volume imaging）を使用した 、オートフォーカスシステムのオペレーションを示す顕微鏡システムの略図であ る。 図１４Ａと１４Ｂは、ボリュームイメージ装置の第１実施例のブロック図であ る。 図１５Ａと１５Ｂは、ボリュームイメージ装置の第２実施例の略図である。 図１６は、本発明によるボリュームイメージアレイ（array）によりスキャン されている顕微鏡フィールドを示す。 図１７は、そのボリュームイメージ装置のイメージアライメント用のバッファ を示す。 図１８は、図１７のバッファに保存されたボリュームイメージの略図である。 図１９は、そのボリュームイメージ装置を使用したオートフォーカス手法を示 すフロー図である。 図２０は、ボリュームイメージ法を使用した、最良フォーカスの選択のための 光学晶質メトリック（optical quality metric）を示すプロット図である。 図２１は、光学ハイパスフィルター処理（optical highpass filtration）を 使用したボリュームイメージオートフォーカスシステムの１実施例である。 本発明を実施する最良の態様 垂直ポジショニングによるオートフォーカス 垂直再ポジショニングによるオートフォーカスの好適実施例の以下の詳細な説 明は、「請求の範囲」の理解を助けるために特定の実施例の説明を提供するもの である。しかし、本発明は、請求項にて定義され、カバーされている多数の異な る方法による実施例においても有効である。 説明の便宜のため、以下の説明は次の主要な章に分割されている。 Ｉ：材料と方法。 ＩＩ：パフォーマンスのメトリックス（metrics）；オートフォーカスファン クション。 ＩＩＩ：パフォーマンス結果。 ＩＶ：結論。 それらの詳細は以下の通りである。 Ｉ．材料と方法 Ａ．顕微鏡とイメージプロセッサーの概要 Ｂ．顕微鏡とビデオカメラ Ｃ．ポジショナー Ｄ．ランプと露出コントロール Ｅ．イメージプロセッサー、コンピュータ及びソフトウェア Ｆ．細胞とスペシメンの準備 Ｇ．オートフォーカスファンクション比較の基本 Ｈ．一般的オートフォーカスプロセス Ｉ．バイナリサーチオートフォーカスプロセス Ｊ．セクエンシャルオートフォーカスプロセス Ｋ．自動スキャニングとリアルタイムフォーカス計算 ＩＩ．パフォーマンスのメトリックス；オートフォーカスファンクション Ａ．解像度（resolution）に基づくファンクション Ｂ．コントラストに基づくファンクション Ｃ．解像度とコントラストの組み合せに基づくファンクション Ｄ．オートコリレーション（autocorrelation）に基づくファンクション ＩＩＩ．パフォーマンス結果 Ａ．選択顕微鏡フィールドのオートフォーカスファンクションの評価 １．１０体の細胞の顕微鏡フィールド ２．１体の細胞の顕微鏡フィールド ３．倍率（magnification）とサンプリングへのファンクション依存 （dependence） Ｂ．自動スキャニングのオートフォーカスパフォーマンス １．精度、正確度及び速度 ２．蛍光フォーカスの予測値としてのフェーズコントラストフォーカ ス ＩＶ．結論 Ｉ．材料と方法 Ａ．顕微鏡とイメージプロセッサーの概要 図１は本発明のオートフォーカスシステム１００の１好適実施例を図示してお り、これはフォーカス情報を取得するために垂直ポジショニングを利用している 。システム１００のハードウェアコンポーネントには、エピ蛍光顕微鏡（epiflu orescent microscope）１０２、ＸＹモーター１０４ａとＺモーター１０４ｂで コントロールされたモーター駆動式載物台１０３、ＸＹＺ載物台コントローラ１ ０６、圧電ポジショナー（piezoelectric positioner）１０７、ビデオカメラ１ ０８、イメージプロセッサー１１０、及びホストプロセッサー１１２が含まれて い る。以下においてこれらのコンポーネントを詳細に説明する。 Ｂ．顕微鏡とビデオカメラ １好適実施例において、細胞（図２）はニコンオプチフォト（Optiphot）１０ ２（図１）に、Ｐｈ３フェーズコントラストでＣＦフルオル（Fluor）ＤＬ ２０ ｘ Ｃ，０．７５ ＮＡ観察体（objective）を通してイメージされる。このフル オライト（fluorite）観察体は高ＵＶトランスミッション（transmission）を提 供する。このエピ蛍光フィルターキューブ（epifluorescence filter cube）は 、３６５ｎｍ±１０ｎｍ（ピークの５０％）バンドパス励起（excitation）フィ ルターと、４００ｎｍダイクロイックミラー（dichroic mirror）と、無バリア フィルター（no barrier filter）とを有している。実験では、これらイメージ はニコンＣＣＴＶ ０．９−２．２５ ズームレンズを介してデージ（Dage）ＶＥ １０００ ＲＳ−１７０ ＣＣＤカメラ１０８にさらに拡大された。実験は、サ ンプル実験以外では１．０のズームで実施された。サンプル実験は一連の倍率で 実行された。フェーズコントラストに対しては、ニコン ０．５２ ＮＡ長寿命距 離コンデンサー（long working distance condenser）が使用される。 Ｃ．ポジショナー 顕微鏡載物台１０３（図１）はコンピュータのコントロール下でステッパモー ターによって横方向に移動される。この載物台１０３はシノプチックス（カルフ ォルニア州サニーベール）によって製造されており、ニューイングランドアフィ リエーテドテクノロジー（マサチューセッツ州ローレンス）によってさらに微細 なステッピングと単純なコンピュータ制御を可能にするように改良されてたもの である。最少ステップサイズは０．１２７μｍである。載物台１０３はニューイ ングランドアフィリエーテドテクノロジー １０３Ｍ マイクロステッピングドラ イバー（microstepping driver）と、オレゴンマイクロシステムズインク（オレ ゴン州ビーバートン）ＰＣＸ ＡＴ ＩＳＡ−バスコンパチブルコンピュータボー ドによってコントロールされている。 フォーカスは、圧電観察体ポジショナー（”ＰＩＦＯＣ”）１０７とＥ−８１ ０．１０ 閉鎖ループコントローラ（ポリテク ＰＩ，カリフォルニア州コスタメ サ）で変更される。この圧電ポジショナー１０７は、観察体タレット（objectiv e turret）と顕微鏡１０２の観察体との間に挟まれている。内蔵リニア可変ディ ファレンシャルトランスフォーマー（ＬＶＤＴ）センサー出力を読み取るオシロ スコープでの測定では、１μｍ以下の移動がフルオライト観察体の１０ミリ秒（ ｍｓ）以下にて発生し、そのレスポンスは観察体の質量によって決定されること が知られた。オプチフォト１０２の１６０ｍｍチューブ長を維持するため、観察 体タレットは専用（custom-machined）のアダプターで置換されている。１３ｍ ｍ厚の観察体ポジショナーは、これが実行されなければイメージ質を大きく損ね るが、１００μｍ（０．００４インチ）レンジの移動はイメージをさほどには劣 化させない。ポジションはキースレーメトラバイト（マサチューセッツ州タウン トン）のＤＡＳ−１６００ データ取得ボードのデジタル−アナログコンバータ からの出力によってコントロールされる。この１２ビットＤ／ＡコンバータはＰ ＩＦＯＣ １０７の１００μｍレンジをそれぞれ２４ｎｍである４０９６のステ ップに分割する。前述した顕微鏡自体の温度不安定性と物理的不安定性とによっ て、実際のフォーカスの正確度は長期においては数ミクロンよりも良好にはなら ないが、秒以下の要求されるフォーカスインターバルに対しては、精度は最低ス テップサイズに接近する。 Ｄ．ランプと露出コントロール 蛍光オートフォーカステストに関しては、スペシメン露出はユニブリッツモデ ルＤ１２２ ドライバー及びシャッター（ビンセントアソシエーツ，ニューヨー ク州ロチェスター）でコントロールされる。蛍光ランプは、ニコン ＨＭＸ−２ ランプハウス内のオスラム １００ｗ ＨＢＯ Ｗ／２ 水銀蒸気アークランプであ る。このランプでの３時間にわたる±３％以下の変度は、１０μｇ／ｍｌ Ｄ ＡＰＩと１ｍｇ／ｍｌ ニシン精子（Herring Sperm）ＤＮＡ（シグマ、セントル イス）の追加が施された前述の細胞ステイン溶液の照明によって測定される。こ の溶液は、シール処理されたカバースリップ下のアクリル槽（acrylic well）に 入れられる。フェーズコントラストに関しては、露出はＥＧ＆Ｇ エレクトロ− オプチックス ＰＳ ４５０ＡＣ電源（マサチューセッツ州セーレム）とＸＳＡ８ ０−３５Ｓ−３０１７１ キセノンフラッシュランプ（アドバンストラジエーシ ョンコープ，カルフォルニア州サンタクララ）でコントロールされる。ニコン ＨＭＡ−２ ランプハウスは加工されており、このキセノンフラッシュランプを 収容して、４５０ ＡＣ電源にワイヤ接続された。ストロボはデータ取得ボード のタイマー回路によってトリガーされる。ストロボのタイミングはイメージプロ セッサー１１０（図１）からの垂直ブランクハードウェアインテラプト（vertic al blank hardware interrupt）によって供給される。データ取得ボードは、観 察体ポジショナーをイメージ取得以前に確実に移動完了させるため１４ｍｓにセ ットされるプログラム可能なストロボディレイ（strobe delay）を有している。 フェーズコントラストフォーカステスト中のストロボレートは６０Ｈｚである。 このランプの平均安定度は水銀蒸気アークランプよりも優れているが、時にはイ ンテンシティスパイク現象（intensity spikes）が発生する。 リアルタイムでオートフォーカス計算を実行するためには、フォーカスポジシ ョンを１６ｍｓ（６０Ｈｚの場合）以下で移動させるか、あるいは、一定速度で 移動させ、イメージをストロボでフリーズ（frozen）させなければならない。こ こで利用される増移動（incremental movement）のパフォーマンスを得るため、 イメージは移動完了後に収集される。これはフェーズコントラストにおいては、 （ポジション変更の命令がＰＩＦＯＣ １７０に送られるとき）ビデオ信号内の 垂直ブランク（vertical blank）後にストロボを１４ｍｓディレーさせることで 実行される。このディレー処理によって、フォーカスポジションはイメージがビ デオカメラ１０８で収集される以前に確実に変化する。この１４ｍｓのディレー とストロボは、そのポジションが約１ｍｓの垂直ブランクインターバル中に変化 可能であれば必要ではないであろう。ＰＩＦＯＣ １０７のさらに良いフィード バックコントロール電子コンポーネント（feedback control electronics）は、 ストロボの必要性を排除する程度に充分に素早く移動を実行させるであろう。 Ｅ．イメージプロセッサー、コンピュータ及びソフトウェア イメージングテクノロジーインクのシリーズ １５１ イメージプロセッサー１ １０（図１）がイメージオペレーションを促進させるために使用される。この好 適なイメージプロセッサー１１０のブロック図は図３に示されている。イメージ プロセッサー１１０は一般的に本発明のオートフォーカスオペレーションを促進 するが、速度がさほど重要な要素でなければ、この計算はホストプロセッサー１ １２（図１）あるいは他のコンピュータで実行しても構わない。イメージプロセ ッサー１１０は好適には６体のファンクショナルユニット（functional units） あるいはボードで構成される。すなわち、（１）カメラ１０８によって発生され るビデオ信号のアナログ−デジタル変換のための５１２ｘ５１２ ８ビット 可変 スキャンインターフェース１３０と、（２）４のデジタルイメージの保存のため の５１２ｘ５１２ｘ３２ビットフレームバッファ１３２と、（３）１６のデジタ ルイメージの保存のための１０２４ｘ１０２４ｘ３２ビットフレームバッファ（ 図示せず。しかし、フレームバッファ１３２に関して示されるように、プロセッ サー１１０のバスに対して同様な接続が行われる）と、（４）１０ビットのイン テンシティヒストグラム（intensity histogram）を創出させるためのヒストグ ラム／フィーチャエクストラクタ（Histogram/Feature Extractor）１３４と、 （５）８ｘ８コンボリューション（convolutions）と１６ビットのルックアップ テーブル（look-up-table）のためのリアルタイムソベル（Sobel）モジュールを 備えたリアルタイムモジュラープロセッサー（ＲＴＭＰ）１３８と、（６）乗算 、減算、減算、加算及びスケーリング（scaling）のための計算／ロジックユニ ット（Arithmetic/Logic Unit）１３６とである。ＲＴＭＰ１３８はサブモジュ ールのための３のプラグイン接続部を備えた１体のボードである。このリアルタ イムソベルモジュールはこれら接続部の２つを利用し、ルックアップテーブルは 残りの接続部を利用する。これらのオペレーションの全てはビデオレートで行わ れ、 並行オペレーション（parallel operation）のためにパイプライン処理（pipelj ned）が可能である。 オートフォーカスファンクションをテストするためのこのシステムの重要なコ ンポーネントは、８ｘ８コンボルバー（ＲＴＭＰ１３８の一部）とヒストグラマ ー（histogrammer）１３４とである。たいていのオートフォーカスファンクショ ンに対しては、イメージは１つのパイプラインビデオフレームあるいはフィール ドにおいてコンボルブされ、ヒストグラムされる。ヒストグラムはインテンシテ イサム（intensity sum）、平方（squares）及び統計量（statistics）、例えば 、フィルターされたイメージ結果が８または１０ビット／ピクセルへとトランケ ート処理（truncated）されたバリアンス（variance）あるいは標準偏差（stand ard deviation）の総量（sum）を計算するのに使用される。その計算結果は、フ ォーカス値（measure）の計算にさらに活用される。１６ビット計算に関しては 、イメージはまずホストコンピュータにトランスファー（transfer）される。８ ビットと１０ビットとの結果には小さな差異が時に観測される。しかし、１６ビ ットの結果を利用してもさらなる改善は観測されない。よって、選択フィールド のオートフォーカスに対しては１０ビットデータのみが報告される。好適な６０ Ｈｚスキャニングには、フィルターイメージの絶対値（absolute value）が８ビ ットへのトランケーション（truncation）の前にとられる。ホストコンピュータ １１２（図１）は好適にはＡＴコンパチブル ３３ メガヘルツ（ＭＨｚ）インテ ル ｉ４８６パーソナルコンピュータ（ＰＣ）である。 オートフォーカスプロセス（図４）と、関連コントロールファンクションを実 行するソフトウェアプログラムは、’Ｃ’とアセンブラ（'C' and assembler） で書かれている。’Ｃ’とアセンブラ源の一部は取り付けられたマイクロフィッ シュアペンディックスに含まれている。ＣルーチンはメタウェアハイＣ（カリフ ォルニア州サンタクルス）で編集されている。ファーラップ（Phar Lap）（マサ チューセッツ州ケンブリッジ）アセンブラは、バックグランドでラン（run）し ているインテラプトサービスルーチン（interrupt service routines）に対して 使用される。全観察体コード（object code）はファーラップ ３８６ ＤＯＳ エ クステンダーとリンクしている。イメージテクノロジーシリーズ １５１ Ｃ ラ イブラリソースコードもＡＮＳＩ Ｃにポート（port）され、メタウェアハイＣ で再編集される。この組み合せで、１６ビットのＤＯＳでランするプログラムに よってｉ４８６ ＣＰＵの３２ビット能力がフルに活用される。 Ｆ．細胞とスペシメンの準備 図１のスペシメン１１４のごとき１例としてのスペシメンの一部が図２に示さ れている。図２は、細胞セットと、特に細胞核（一般的に１１６で表示）で成る 典型的なスペシメンの拡大イメージを図示している。 １実験では、ＮＩＨ ３Ｔ３ 細胞が洗浄され、オートクレーブされた＃１．５ カバースリップ上にプレート処理された。これら細胞はイーグル食塩（Earle's salts）を含んだイーグル最少エッセンシャル媒質（Eagle's minimal essential medium）内に保持され、１０％の胎児牛血清（fetal bovine serum）、１００ μｇ／ｍｌのゲンタミシン（gentamicin）及び０．２６ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタ ミン（最終濃度）を３７℃で湿度調節された５％の二酸化炭素（ＣＯ₂）インキ ュベータ（incubator）にて補充された。１日の細胞成長後、カバースリップは 燐酸バッファされたサリン（saline）（ＰＢＳ）内で洗浄され、６０％ＰＢＳ内 の４％のパラホルムアルデヒド内に１０分間固定され、１時間ステインされた。 ステイン溶液は、５０ｎｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインド ール ジヒドロクロリド（4',6-diamidino-2-phenyllindole dihydrochloride( ＤＡＰＩ),モレキュラープローブズ，オレゴン州ユージン）と、１０ｍＭ ＴＲ ＩＳと、１０ｍＭ ＥＤＴＡと、１００ｍＭ ＮａＣｌと、２％の２−メルカプト エタノールとで成っていた。これはハマダとフジタ（量式シトフルオメトリのた めに改良されたＤＡＰＩステイニング，ヒストケム８９−２９１−２２６，１９ ８３年）等が解説している。ステイン処理後に、ＤＡＰＩ溶液の２、３滴がガラ ススライドに落とされ、カバースリップは溶液上に伏せられて置かれ、余剰の溶 液はティッシュで排出され、カバースリップはネイルポリッシュでスライドにシ ール処理された。このステイン溶液は優れた抗フォトブリーチング特性（antiph otobleaching properties）を有することが発見された。フォトブリーチングは この準備で回避されたが、フォトブリーチング程度は異なる技術では大きく変動 する。このスペシメンはそれほどのオート蛍光（autofluorescence）を示すこと もなかった。もし不特定的（nonspecific）で拡散的（diffuse）であったなら、 コントラストを減少させてパフォーマンスに悪影響を及ぼすかも知れない。 Ｇ．オートフォーカスファンクション比較の基本 オートフォーカスファンクションがテスト可能な独立的基準は存在しない。よ って、パフォーマンスは比較によってレートされなければならない。グロエン他 は、オートフォーカスファンクションのパフォーマンスの比較に８の基準を提案 する。すなわち、（１）ユニモダリティ（unimodality）あるいは１の最大値ま たは最少値の存在、（２）精度あるいは極値と最良フォーカスの一致、（３）再 現性（reproducibility）あるいは明瞭な極値（extremum）、（４）レンジある いはそれに基づいてファンクションが最良フォーカス方向を明確に決定するであ ろう垂直距離、（５）一般的適用性あるいは異なるクラスのイメージに対する作 用性能（ability towork）、（６）他のパラメータに対する不感性（insensitiv ity）あるいは平均インテンシティ（mean intensity）の変化のごとき影響から の独立性、（７）ビデオ信号共立性（compatibility）あるいはイメージ分析に 利用されるものと同一のビデオ信号使用能力、及び（８）利用性（implementati on）、すなわち、そのファンクションを素早く計算する能力、である。 最初の３つの基準である、ユニモダリティ、精度及び再現性は、自動スキャニ ングでは最も重要である。フォーカスは通常、最良フォーカスが計算されたばか りのフィールドに隣接したフィールドで行われるため、レンジの重要性はさらに 低い。グロエン他により実行された顕微鏡オートフォーカスファンクションの比 較は、５番目の基準である”全タイプのイメージに対する一般的適用性”が必ず しも期待できないという結論に導いた。しかしスキャニングシステムに対しては 、全顕微鏡フィールドに対する１方式の顕微鏡イメージ法（例：フェーズコント ラスト法あるいは蛍光法）に対する適用性を要求することで充分である。７番目 の基準であるビデオ信号共立性はハードウェアに依存するものであり、容易に達 成される。８番目の基準である利用性は、コンピュータ速度とファンクションコ ンプレキシティ（function complexity）に依存する。 Ｈ．一般的オートフォーカスプロセス 図４を利用して、オートフォーカスプロセス２００のハイレベルな説明を行う 。オートフォーカスはホストプロセッサー１１２（図１）でコントロールされる 。ホストプロセッサー１１２あるいはホストプロセッサーの制御下のイメージプ ロセッサー１１０はそのイメージの変換を行うことができ、フォーカス程度を表 す値を取得することができる。この値は、載物台移動の次方向を示すためにＸＹ Ｚ載物台コントローラ１０６を介して載物台が上または下に移動した後、または 、観察体がＰＩＦＯＣ１０７で調整された後に、別のイメージから取得された別 の値と比較が可能である。 スタートステート２０２で始まり、システム１００はステート２０４へと進み 、第１垂直ポジションの載物台１０３のスペシメン１１４のデジタルイメージを 取得する。このイメージはイメージプロセッサー１１０で捉えられる。ステート ２０６に移動し、システム１００はフィルターをデジタルイメージに適用し、中 間あるいはフィルターイメージを創出する。この好適実施例はデジタルフィルタ ー、さらに特定すれば、表１のファンクションＦ₇に定義されるイメージ鮮明化 変換を利用する。もちろん、アナログフィルター等の他のフィルターも使用が可 能である。ステート２０８に進行し、システム１００は測定ファンクションを中 間イメージに適用し、その大きさ（magnitude）を取得する。この好適実施例は 、イメージインテンシティのバリアンスあるいは標準偏差、またはイメージイン テンシティの平方の総計を利用するコントラスト測定ファンクションを使用する 。決 定ステート２１０に移動し、システム１００は、Ｎ番目のイメージが取得された かどうかを判定する。利用されたＮの値は、採用された特定のオートフォーカス 法に従って変動する。この説明の目的と例示とのため、Ｎを２とする。すると、 ステート２０４から２１０の最初のパス中に、第１イメージのみが取得され、フ ロー（flow）はステート２１２で継続し、載物台１０３はＺモータ１０４ｂで垂 直方向に新（第２）垂直ポジションにまで移動される。この好適実施例では２体 のフォーカス機構が存在し、よって、圧電ＰＩＦＯＣポジショナー１０７は載物 台１０３の代わりに迅速なオートフォーカスのために移動され、ＰＩＦＯＣ１０ ７と載物台１０３は共に移動され、迅速なオートフォーカスと拡張されたフォー カスレンジとが組み合わされる。 載物台１０３が新垂直ポジションに移動した後、あるいは、ＰＩＦＯＣ１０７ がオブジェクティブ（objective）を調整した後、フローはステート２０４で継 続し、デジタルイメージは第２垂直ポジションで取得される。ステート２０６と ２０８は、第２の大きさを取得するために第２イメージを使用して再度実行され る。ステート２１０に移動し、Ｎ＝２の現行例と同様にＮ番目のイメージが取得 されたとき、システム１００はステート２１４に進行する。ステート２１４で、 取得された大きさは比較され、フォーカスは比較の結果に基づいて調整される。 現行例では、もし第１垂直ポジションの大きさが第２垂直ポジションでの大きさ よりも大きければ、フォーカス機構は第１垂直ポジション方向に移動される。あ るいは、もし第１ポジションの大きさが第２ポジションの大きさより小さければ 、フォーカス機構は第２垂直ポジション方向に移動される。ＰＩＦＯＣ１０７と 垂直載物台ステッパーモータポジショナーは両方ともフォーカスポジショナーで ある。ＰＩＦＯＣはずっと迅速であるが、短いレンジ（本好適モデルでは１００ μｍあるいは０．００４インチであり、別モデルでは２００μｍ）を有している 。ステッパーモータはオブジェクティブのみでなく載物台の全質量を移動させる が、時間がかかり、リアルタイムでの計算には使用不能であるが、スペシメン及 びオブジェクティブと顕微鏡の物理的設計との間の空間によってのみ限定される レンジを有している。一方あるいは両方がオートフォーカスに使用可能である。 数秒 のフォーカス速度のスローなシステムでは、載物台は充分に速いと考えられる。 秒以下のフォーカスを要求する迅速システムでは、ＰＩＦＯＣ１０７が必要であ る。さらに大きなレンジと速いフォーカスを必要とする適用においては、載物台 がまずフォーカスされ、続く全てのフォーカス処理はレンジを越えるまでＰＩＦ ＯＣ１０７によって実行される。 載物台は、ＰＩＦＯＣ１０７をそのレンジ内に保持するため、必要に応じて調 整が可能である。フォーカスがステート２１４で調整された後、オートフォーカ スプロセス２００はエンドステート２１６で完了する。 以下において解説する多数の異なるオートフォーカスファンクションは、ステ ート２０６及び／又は２０８の一方あるいは両方を実行することもできよう。 以下の２つのセクションにて、オートフォーカスのために利用される２つの特 殊な方法であるバイナリサーチとセクエンシャルオートフォーカスとを説明する 。 Ｉ．バイナリサーチオートフォーカスプロセス 図５を利用してバイナリサーチオートフォーカスプロセス２５０を解説する。 このプロセスは図４のプロセス２００のさらに特殊な形態である。オートフォー カスプロセス２５０は、載物台１０３（図１）を移動させ、最良フォーカスの位 置を決定するため、周知なバイナリサーチアルゴリズムを使用する。サーチレン ジはフォーカスサーチインターバルの距離で固定され、レンジの中心はフォーカ スサーチインターバルの中心である。バイナリサーチオートフォーカスは２つの フォーカスポジションを定義することで実行される。それらの間にフォーカスが 存在すると考えられ、続いてそのレンジは半分に分割され、最良フォーカスに接 近される。このレンジは最良フォーカスを特定するのに必要な精度よりも小さく なるまでこのように狭められる。 バイナリサーチオートフォーカスプロセス２５０はステート２５２でスタート する。ここで、ユーザーあるいは自動スキャニングプログラムはフォーカス処理 をリクエストする。このレンジは当初値、例えば４ミクロンにセットされる。シ ステム１００はステート２５４に移動し、そこでフォーカス機構はフォーカステ ストレンジの中央にポジションされる。このフォーカス機構はＰＩＦＯＣ１０７ あるいは載物台１０３（垂直コントロールは１０４ｂであり、載物台１０３を顕 微鏡内の一連のギヤを介して移動させる）またはそれら両方である。その後にイ メージは取得され、フィルターされ、イメージプロセッサー１１０を使用するこ とでヒストグラム処理される。このヒストグラムから、１つのフォーカスファン クション結果（Ｆｃ）はそのポジション用に計算され、保存される。ステート２ ５６に移動し、フォーカス機構はレンジの開始部にポジションされ、別のイメー ジが取得され、フィルターされ、ヒストグラム処理される。別なフォーカスファ ンクション結果（Ｆａ）が前述のごとくに計算されて保存される。ステート２５ ８に進行し、フォーカス機構はレンジのエンド部にポジションされ、別のイメー ジが取得され、フィルターされ、ヒストグラム処理される。このヒストグラムか ら、１つのフォーカスファンクション結果（Ｆｂ）がそのポジション用に前述の ように計算され、保存される。ステート２５２から２５８はそのプロセスの初期 化セクエンス（initialization sequence）を含んでいる。フローチャートの残 りのステートは、フォーカスが発見されるまで狭めらるように実行されるループ を表す。 決定ステート２６０で継続し、チェック（最小以下のレンジ）が実行され、望 む精度が達成されたかどうかが調べられる。最小はユーザーと適用法とによって 決定されるものである。最小の実際的な例は、０．００１μｍから１．０μｍで あり、適用の形態によって異なる。好適なＰＩＦＯＣ１０７の最小ステップサイ ズは０．０２４μｍであり、ホストコンピュータ１１２のデジタル／アナログコ ンバータコントロールボードとＰＩＦＯＣコントローラの電子機器とによって決 定される。レンジが充分に小さければ、フォーカスは位置の決定がなされ、フロ ーはエンドステート２７２で完了する。決定ステート２６０で決定されるレンジ が最小よりも小さくなければ、システム１００はステート２６２で継続され、レ ンジは半分に減少される。決定ステート２６４に進行し、フォーカス値結果Ｆａ がＦｂよりも大きいかどうかが判定される。もしＦａ、すなわちレンジの開始部 でのフォーカス値がレンジの終了部でのフォーカス値Ｆｂよりも大きければ、フ ォーカスはレンジの開始部に近いことになる。新レンジは前の開始部と中央部と によって定義される。その逆であれば、フォーカスはレンジの終了部に近いこと になり、新レンジは前の中央部と終了部とで定義される。 もしＦａがＦｂよりも大きければ、フォーカス値が前のレンジの開始部に近い ので、システムはステート２６６に移動する。システム１００は新しい中央部を 前のレンジの中央部と開始部との間にセットし、フォーカス機構を新中央部に移 動させる。またシステムは、前の中央部のフォーカス値（Ｆｃ）をＦｂで表され る保存部に配置する。なぜなら、これはレンジの新終了部だからである。システ ム１００は新イメージのフォーカスファンクションを取得し、フィルターし、ヒ ストグラム処理して計算し、その結果をＦｃにて保存する。ステート２６６の終 了によって、システム１００は決定ステート２６０に戻り、レンジが前述のよう に最小よりも小さいかどうかを判定する。 決定ステート２６４で決定され、ステート２６８で確認されるごとくＦａがＦ ｂよりも大きくなければ、フォーカス値が前のレンジの終了部に近いのでシステ ムはステート２７０に移動する。ステート２７０で、システムは新中央部をレン ジの前の中央部と前の終了部との間のポジションにセットし、フォーカス機構を 新中央部に移動させる。またシステムは前の中央部のフォーカス値（Ｆｃ）をＦ ａで表される保存部に配置する。なぜなら、これはレンジの新開始部だからであ る。システム１００は新イメージのフォーカスファンクション値を取得し、フィ ルターし、ヒストグラム処理して計算し、その結果をＦｃに保存する。ステート ２７０の完了によってシステム１００は前述のように決定ステート２６０に戻る 。 Ｊ．セクエンシャルオートフォーカスプロセス 図６を利用してセクエンシャルオートフォーカスプロセス３００を解説する。 セクエンシャルオートフォーカスプロセス３００はオートフォーカスプロセス２ ００（図４）のさらに特殊な形態であり、スタートステート３０２でスタートす る。ここで、ユーザーあるいは自動スキャニングプログラムはフォーカス処理を リクエストする。レンジは当初値、例えば４ミクロンにセットされる。システム １００はステート３０４に移動し、ここでスタートポジションはレンジの開始部 の当初値にセットされ、ポジション番号ｎは０にセットされる。ステート３０６ に移動し、システム１００はフォーカス機構をポジションするループ（ステート ３０６から３１０）を開始し、各ポジションにてフォーカスファンクションを計 算する。このフォーカス機構は’スタートポジションプラス（ステップサイズの ｎ倍）’にポジションされる。このステップサイズは図１２の実験表の”フォー カスインクレメント（focus increment）”と同じである。フォーカスインクレ メント０．１０２、０．１９５、０．２４４、０．１４６、０．２２０及び０． ０７３μｍがこれらの実験で使用された。次にイメージが取得され、フィルター され、ヒストグラム処理され、そのフォーカスファンクションが計算された。そ の結果は後の最良フォーカスの計算のために保存される。決定ステート３０８に 進行し、システム１００は、’（現行ポジション）−（スタートポジション）≦ （レンジ）’であるかどうか、すなわち、フォーカスポジションセクエンスは終 了しているかどうかを判定する。そうであれば、システムはステート３１２に移 動し、最良フォーカスを計算する。そうでなければ、システム１００はステート ３１０に移動し、ポジション番号ｎを１だけ増分させ、ステート３０６に戻るこ とで移動を継続し、フォーカスファンクションの結果を計算する。 決定ステート３０８で決定されるところの、フォーカスポジションセクエンス が終了していれば、システム１００はステート３１２に移動し、最良フォーカス を計算する。パワー加重平均式（power weighted average equation）（等式１ ）が使用され、ポジション０からｚのＦ₀．．．Ｆｚでのフォーカスファンクシ ョン値から最良フォーカスが計算される。最良フォーカスの計算の完了で、シス テ ムは決定ステート３１４に前進し、その結果がレンジの開始部あるいは終了部に 近すぎないかを判定する。近すぎる１例は、レンジの１／４以内である。フォー カスサーチレンジが４μｍであり、フォーカス結果がレンジのいずれか端部から １μｍ以内であれば、レンジの中央部は再ポジションされ、フォーカスは反復さ れるであろう。実際の値は適用（スペシメン、必要速度等）によって変動する。 その場合、実際のフォーカスはレンジの外側に存在するであろう。システム１０ ０はステート３１６に進行し、計算されたフォーカスに最も近いレンジの端部に 中央部を変化させ、前述のようにステート３０４に戻ることでフォーカスセクエ ンスを反復する。レンジは同じままであるが、このプロセスはフォーカス値が最 良フォーカスに向かって増加する限り継続される。このレンジは自動的に拡張が 可能であり、最良フォーカスの発見を加速させる。この特徴は、スタートポジシ ョンに関係なくフォーカスする一般の顕微鏡フォーカス機能の場合等の隣接フィ ールドでのフォーカスが知られていない場合に重要である。最良フォーカスは、 決定ステート３１４で判定されるように、その結果が中央部に近ければ達成され る。よって、システム１００はステート３１８に進行し、そこでフォーカス機構 は最良フォーカスにポジションされる。セクエンシャルオートフォーカスプロセ ス３００は、エンドステート３２０で完了する。 Ｋ．自動式スキャニングとリアルタイムフォーカス計算 システム１００の一連のテストは自動的にラスタパタンの１０００以上の顕微 鏡フィールドのスキャニング領域に関与した。各新フィールドにて、先行フィー ルドの最良フォーカスがテストフォーカスレンジの中央部に対して使用される。 顕微鏡は、計算された最良フォーカスがテストレンジの内側半分に入るまで、各 フィールドのテストセクエンスの開始部にて再フォーカスされる。これにより、 最良フォーカスが当初テストレンジの外側であってもベストフォーカスを達成さ せることができる。実際には、テストレンジは再フォーカスの場合がほとんどな いほど充分に広かった。オートフォーカスに先行して、蛍光イメージのインテン シティが総計され、少なくとも１細胞の存在が確認される。細胞が全く存在して いなければ、そのフィールドはスキップされる。新しい列（row）の開始部で、 先行の列の開始部からの最良フォーカスはテストレンジの中央部となる。各実験 の開始以前に、スペシメンは顕微鏡上に置かれ、スキャニング用レクタングル（ rectangle）が選択され、その角部がチェック処理されてフォーカスが１００μ ｍレンジ内に存在するかどうかが確認される。第１フィールドにおいて、フォー カスは手動で実行される。第１フィールドの後では、スキャンが完了するまで人 の介在は不要である。 フォーカスは、各フィールドのフェーズコントラストと蛍光との両方に対して ２０回計算され、再現性の統計的分析と正確度の比較とが実施される。精度は全 スキャンからの全フォーカステストの組み合わされた標準偏差によって評価され る。組み合わされた標準偏差は平均バリアンスの平方根を計算することで得られ る。各フォーカステストセクエンスはインテラプトサービスルーチンコントロー ル（interrupt service routine control）によって６０Ｈｚで実行される。イ ンテラプトは、シリーズ １５１ イメージプロセッサーの可変スキャンインター フェースボードによって各垂直ブランク（６０Ｈｚ）の開始部にて開始される。 インテラプトサービスルーチンはストロボをコントロールし、ＣＣＤチップのイ メージインテグレーション（オブジェクティブポジショナー移動）とイメージプ ロセッサーのヒストグラム取得との間の２垂直ブランクディレー（vertical bla nk delay）を提供する。ポジショニングとイメージ安定化との間のデレーの提供 は、ビデオレートでの再ポジショニングと測定とを可能にする。イメージプロセ ッサーを通過する通路は、コンボルバーを通過する可変スキャンインターフェー スのデジタルイメージからヒストグラマーへと延びている。ヒストグラマーイン プットは、６０Ｈｚのポジショニングとファンクション計算のための奇数と偶数 のフィールドを分離するのに使用される２バンク（bank）の１０ビットルックア ップテーブルを含んでいる。ヒストグラマールックアップテーブルバンク ０ は 偶数フィールドを変化させずに通過させるようにプログラムされており、バンク １ は奇数フィールドに２５６を加えるようにプログラムされている。インテラ プトサービスルーチンは交互垂直ブランク（alternate vertical blanks） のバンクをスイッチ処理する。各奇数フィールドのエンド部で、インテラプトサ ービスルーチンは得られた９ビットヒストグラムをトランスファー処理し、独立 的に奇数と偶数の総計、平方の総計、及びピクセルカウントを計算する。これら の値は最良フォーカスポジションの最終計算のために’Ｃ’ルーチンにアクセス 可能なアレイに配置される。ファンクション結果もまたそのピクセル数でノーマ ル化される。 各フォーカスセクエンスの後で、複数のポジションでのファンクション評価に より、最大と加重平均とが最良フォーカスを発見するために使用される。もしそ の細胞が顕微鏡のフィールドのデプス及びフォーカスファンクションの識別レン ジ（discrimination range）よりも薄かったならば、最大は好適に振舞うと予期 できたであろう。しかし実際には、その細胞はフィールドのデプスよりも厚く、 解像ファンクションの識別レンジよりもずっと厚い（以下の結果セクション参照 ）。この条件により、ファンクション結果は対応ポジションのフォーカス度の予 想値であると考えられる。データの標準適合度（fit）あるいは加重平均はテス ト中に実施された。フォーカスデータの理想的な形状に基づき、ガウスに対する 曲線適合度、２次及び３次多項式（second and third order polynomials）がテ ストされた。各場合に、データは、曲線標準適合度を非常に劣悪に行わせる比較 的に”外れた”形状で発見された。異常な形状の曲線は、恐らく、一連の局部的 最大値を提供する垂直方向の細胞成分のディスクリートな頒布によって創出され たものであろう。これらの理由により、以下の加重平均 （ｗ_aは加重平均ポジション、ｚは垂直ポジション（以下で多用される特殊ファ ンクションとは異なる）、Ｆは１ポジションで取得されたイメージから計算され る所定のオートフォーカスファンクション、ｎは加重（weighing）の累乗数（po wer）を表す）が使用される。この累乗数はピーク値を強調する。増分（increme nts）がフィールドのデプスよりも相当に小さい場合の狭サーチレンジの１ま たは２μｍにわたってファンクション値は類似しており、低い累乗数は平均ｚに 非常に近い最良フォーカスを提供する。ピーク値に対する感度（sensitivity） を改善するため、累乗数’ｎ’は、最大に対する合理的感度が達成される前に４ と８とに増加される。これらのステップは図６のフローチャートに示されており 、前記で説明されている。 セクエンシャルオートフォーカスはバイナリオートフォーカスよりも優れた点 を有している。テストされた各フォーカスポジションはフォーカスルーチンが開 始する前に定義される。先行ポジションでのフォーカスファンクション値には全 く依存しない。よって、ビデオカメラ１０８のイメージのインテグレーション（ integration）と、イメージプロセッサー１１０のデジタル化との間のようなデ ィレーは、バイナリサーチでのようにはフォーカスルーチンの実行を遅延させな い。 セクエンシャルオートフォーカスにおいて、フォーカスポジションは一連の位 置に移動される。各位置においてイメージは取得され、フィルターされ、ヒスト グラム処理される。このヒストグラムに基づき、１つのフォーカス値が計算され て保存される。フォーカステストセクエンスが完了すると、フォーカスファンク ション値の累乗加重平均（power-weigted average）は最良フォーカスの計算に 使用される。バイナリオートフォーカスとは異なり、その計算された最良フォー カスポジションはテストされたポジションの中間に入るであろう。 これら両オートフォーカス法はフォーカスが所定レンジ内であることを想定し ている。たいていの場合、これはスキャニングマイクロスコピーでは真である。 なぜなら、各新フィールドは先行フィールドに隣接するからである。最良フォー カスがレンジの両エンド部に、あるいはそれらの近辺に位置するのであれば、そ れが実際にはレンジの外側に存在する確率は高い。セクエンシャルオートフォー カス法においては、もし最良フォーカスが両エンド部に接近して存在するなら、 そのレンジは移動され、オートフォーカスプロセスは反復される。 ＩＩ．パフォーマンスのメトリックス；オートフォカスファンクション イメージ内容オートフォーカスファンクションは、フォーカスが改善するとイ メージのコントラストと解像度（縁部の鮮明度）が改善することを想定している 。明暗領域で成るイメージを有したコントラストモデルにおいては、装置がフォ ーカスから離れるにつれて明領域は暗くなり、暗領域は明るくなる。このコント ラスト変化はピクセルインテンシティのバリアンスあるいは標準偏差の変化で数 学的に記述が可能である。解像度モデルにおいては、イメージがフォーカスから 外れるに従ってイメージの詳細は不鮮明となる。解像度はフーリエ周波数スペク トル（Fourier frequency spectrum）の分析で、あるいは、グラジエントの適用 で、または高周波数を分離するハイパスフィルターの適用で測定が可能である。 この高周波あるいはグラジエントの大きさは解像度の測定値として使用が可能と なる。これを最良フォーカスの最大値として定義される。光トランスファーファ ンクション（optical transfer function）に対するデフォーカス処理（defocus ing）の影響は、例えば、ボーンとウルフ（「光の原理」第６版，パーガモンプ レス，ニューヨーク，１９８９年）、エルテザ（「鮮明度インデックスとフォー カスコントロールへのその応用」応用光学，１５：８７７７−８８１，１９７６ 年；「鮮明度インデックスオートフォーカスシステムのコンバージェンスのデプ ス」応用光学，１６：２２７３−２２７８，１９７７年）、グッドマン（「フー リエ光学の基礎」マクグローヒル，ニューヨーク，１９６８年）、グロエン他と ホプキンズ（「デフォーカスされた光学システムの周波数レスポンス」プロック ロイ協会Ａ ２３１：９１−１０３，１９５５年）等が解説している。ボラ（１ ９８７年）（ドイツ特許第２，９１０，８７５号 Ｃ２，米国特許第４，３５０ ，８８４，１９８２年，欧州特許第００１７７２６号）は、オートコリレーショ ンに基づいて追加的なオートフォーカスファンクションを導き出し、ノイズの影 響を減少させる改良を提案した。 テストされた１１のオートフォーカスファンクションは、使用されたコンピュ ータハードウェアに対する基準値と計算回数と共に表１に掲載されている。これ らファンクションは次のグループに分割されている。すなわち、（１）ハイパス フィルター結果の平方の総計である解像度の測定値（Ｆ₁−Ｆ₄）、（２）インテ ンシティバリアンスあるいは標準偏差により表されたコントラストの測定値（Ｆ₅ ，Ｆ₆）、（３）解像度とコントラストの組み合せ測定値（Ｆ₇，Ｆ₈）、（４） 解像度及び／又はコントラストの成分をも含んだオートコリレーションファンク ション（Ｆ₉−Ｆ₁₁）である。基準ファンクション（referenced functions）を 支持する理論は、それぞれの研究者によって説明されている。これらファンクシ ョンの数学的説明のため、イメージをｇ_ijで表わす。このｉとｊは空間座標（sp atial coordinates）であり、ｇはピクセルインテンシティであり、全総計はｉ とｊでダブルである。これら等式において、イメージとオートフォーカスファン クションの垂直ポジションへの依存が想定されている（すなわち、ファンクショ ン値は各ポジションのイメージから計算される）。 これら全てのファンクションは細胞だけでなく全イメージを利用する。蛍光に おいては、細胞または観察像はしきい値（threshold）及び観察ピクセルのみか ら計算されたフォーカスを使用して大まかに特定が可能であろう。しかしこれに よって複雑化が増し、オートフォーカスがスローになるであろう。ポジショニン グはファンクション計算の２フィールド手前なので、その特徴（features）をし きい値処理（threshold）し、マスク（mask）を構築するのに必要な条件を介在 させると、少なくとも数フレームのディレーが発生するであろう。他の問題も発 生するかも知れない。明瞭で明るい核は最良フォーカスから離れると不鮮明な塊 状となる。この不鮮明な塊が肉眼でやっと確認できる程度のとき、最良フォーカ ス方向は使用されるアルゴリズムによって容易に決定が可能である。これは、し きい値処理が信頼性の高い観察像を提供するようなインテンシティよりずっと低 い場合でも真である。また、見かけの観察像サイズはフォーカスを外れて増加す るので、１ポジションでのしきい値処理は別ポジションでのしきい値処理と同じ セットの観察ピクセルを提供しないであろう。フェーズコントラストにおいては 、イメージ背景からの細胞の特徴の分割は、単純なしきい値の場合よりも一層に 困難であろう。このことは、特にフォーカスを外れたイメージの場合に当てはま る。予備実験では、フィールド内に細胞が存在しないときでさえ、少量の細胞破 片の存在はシステムをフォーカス状態に保つのに充分であった。これは恐らく多 数のピクセルが信号−ノイズ比を大きく改善するからであろう。これらの理由に より、フォーカス計算には全イメージの利用が有利である。 照明の変化に影響を受けないことが望ましい。フェーズコントラストに対して は、各ポジションでの結果は、インテンシティの平均、あるいは平均の平方で割 られ、インテンシティに依存するファンクションの累乗数をマッチさせ、ランプ のフラクチュエーション（fuctuations）が補整された。蛍光に対しては、その ようなスケーリング（scaling）は望ましくない。なぜなら、平均インテンシテ ィはフォーカスから離れていない０に接近し、ランプインテンシティよもさらに 優れたフォーカス測定値だからである。よって、これらファンクションは蛍光オ ートフォーカスでは同様にはスケールされなかった。蛍光でのランプのフラクチ ュエーションを補整するためには、ランプインテンシティの独立した測定値が要 求される。 テストされたオートフォーカスファンクションは他の研究者による評価及び利 用可能なコンピュータハードウェアに基づいて選択された。メンデルソン及びメ イオール（「ヒトの染色体のコンピュータ利用分析−ＩＩＩフォーカス」コンピ ュータバイオメディカル ２：１３７−１５０，１９７２年）によるしきい絶対 グラジエント（threshold absolute gradient）としきいビデオ信号内容（thres hold video-signal content）とのごときファンクションはテストされなかった 。なぜなら、パフォーマンスはグレオン他により、部分的にはしきい値の随意選 択に影響されることが証明されているからである。シャノン（「コミュニケーシ ョンの数学理論」ベルシステムズテクノロジー ２７：３７９−４２３，６２３ −６５６，１９４８年）によって説明されたようなエントロピーファンクション （entropy function）は、ファイヤーストーン他（「自動マイクロスコピーのオ ートフォーカス法の比較」シトメトリー１２：１９５−２０６，１９９１年）に よって、マルチモーダル（multimodal）であることが証明されている。ファイヤ ーストーン他はログスペクトルモーメント（log spectral moment）と、ハード ウェアの問題で選択されなかった２つの細胞ロジックファンクション（cellular logic functions）をもテストした。ログスペクトルモーメントはフーリエ変換 を要するが、リアルタイムでの計算には費用がかさみ、一方、細胞ロジックファ ンクションは迅速適用のために利用されるものとは異なるハードウェアを必要と する。ハイパスフィルター処理のバリエーションも他者によってアナログ回路で 試験されている。例えば、ヂュー、キング、ミグドル（「異なる白血球カウ ンティングの自動顕微鏡システム」ヒストケム，シトケム２２：６８５−６９６ ，１９７４年）とジョンソン及びゴフォース（「閉鎖回路テレビを使用したメタ フェーズスプレッド検出及びフォーカス」ヒストケム，シトケム ２２：５３６ −５４５，１９７４年）が実験した。 Ａ．解像度に基づくファンクション グロエン他は、Ｆ₁、Ｆ₂及びＦ₅が、明フィールドマイクロスコピー（bright field microscopy）に対してテストされた１１のファンクション中で最良である と報告した。Ｆ₁、すなわちブレナー他（「シトロジック研究のための自動顕微 鏡」ヒストケム，シトケム２４：１００−１１１，１９７６年）、エルテザ、ミ ュラー、バフィントン（「イメージ鮮明化を通じた自動的にデグレードされたテ レスコープイメージのリアルタイム修正」オプトソサイエティＡＭ ６４：１２ ００，１９７４年）等の他者によって解説された平方グラジエントファンクショ ン（squared gradient function）は、イメージインテンシティのファーストデ リバティブ（first derivative）の適用である。スペクトルの観点では、これは イメージの最大値の真下にある周波数を増強（enhance）させるバンドパスフィ ルターである。総計の平方はファンクション値間の相違を際だたせる。 Ｆ₂はエルテザとミュラーとバフィントンによって解説された１Ｄラプラシア ン（1D Laplacian）である。このフィルターはイメージデンシティのセカンドデ リバティブ（second derivative）の測定値である。隣接するピクセルに対して 実行すると、Ｆ₂はＦ₁よりもさらに支配的なハイパス周波数特性を有し、さらに 小さなスケールで解像度を測定する。肉眼での横方向インヒビション（lateral inhibition）に基づくラプラシアンのバリエーションも、ハームズとアウス（「 ＴＶ顕微鏡システムのデジタルフォーカス基準の比較」シトメトリ ５：２３６ −２４３，１９８４年）等によって評価された。Ｆ₃はエルテザ、ミュラー、バ フィングトンによって解説されたディファレンスフィルター（difference filte r）の平方の総計である。両方の隣接するピクセルに対して利用すると、Ｆ₃ は最小スケールで最も支配的なハイパス周波数特性と測定解像度を有する。同様 なデリバティブフィルターの使用は、シャゼールとハリス（「デジタルイメージ プロセシングのためのアーキテクチャーとアルゴリズムにおけるシーン内容を使 用したデジタルオートフォーカス」ＩＩ ＳＰＩＥ ５３４：１５０−１５８，１ ９８５年）等の他者によって開発されている。以前にテストされていない通常の ２ＤラプラシアンであるＦ₄は比較のために追加された。正方形ピクセルに関し ては、Ｆ₄は水平及び垂直に隣接するピクセルに対応した最高周波数と、斜めに 隣接するピクセルに対応した次の最高周波数との混合だったであろう。しかし、 方形ピクセルと、ＲＳ−１７０カメラのさらに大きな垂直サンプリング期間に関 しては、このフィルターはさらに低い周波数内に混合され、Ｆ₃よりも高い周波 数レスポンスを有していなかった。 Ｂ．コントラストに基づくファンクション コントラストの測定値としてのインテンシティの統計バリアンスであるＦ₅は 、例えば、ケルンフォルシュングズチェントラムカールスルーヒ（特許明細書 ＰＬＡ ７９０７，１９７９年）によって提案された。Ｆ₆はインテンシティの標 準偏差あるいはＦ₅の平方根である。条件によっては、コントラストは最良フォ ーカスにて最大値ではなく局部的最小値を提供する。これを引き起こす干渉縞（ interference fringes）はトランスミッション電子マイオクロスコピー（transm ission electron microscopy）にてさらに普通に観測される。光顕微鏡の場合に は、この現象を観測する１方法は、マイクロメータ（例：０．８５ ＮＡ ４０ｘ オブジェクティブと１０μｍスペース）をイメージ処理させるフェーズコント ラストを使用することである。最良フォーカスは局部的コントラスト最小値（lo cal contrast minimum）にあり、干渉はフォーカスが変化する際に一連のコント ラストマキシマ（maxima）とミニマ（minima）とを創出する。よって、フォーカ スの測定値としてのコントラストは、明フィールド顕微鏡モードで観測される非 ランダムスペーシング（nonrandom spacing）でのスペシメンにおいては注意し て利用されなければならない。 Ｃ．解像度とコントラストの組み合せに基づくファンクション Ｆ₇とＦ₈はバリアンスと標準偏差それぞれと、３ｘ３鮮明化フィルター（shar pening filter）とを組み合せる。ボラス（「自動フォーカスアルゴリズムの作 用に対するシーンパラメータとノイズの影響」マイクロスコピー １５２（２） ：１３３−１４６，１９８８年）等によって指摘されたように、周波数スペクト ルはバリアンスに影響されない。すなわち、バリアンスはレラティブフーリエパ ワースペクトル（relative Fourier power spectrum）を変更せずにインテンシ ティをスケールすることで変更が可能である。コンバース（converse）は真では ない。イメージのフィルター処理はコントラストを変更させるであろう。従って 、イメージ統計（image statistics）はフーリエスペクトルとは根本的に異なる 特性、あるいはイメージ鮮明度を測定する。すなわち、基本的オートフォーカス 測定値としてのバリアンス（あるいは標準偏差）の使用と、イメージの予備フィ ルター処理による周波数の影響の変更とを提案している。ビデオレートでのフィ ルターされたイメージのバリアンスの計算能力を備えたハードウェアは普通のも のになっているという事実は、このクラスのオートフォーカスファンクションの 考察を適正なものとしている。 Ｄ．オートコリレーションに基づくファンクション コリレーションは、イメージを異なるレラティブシフト（relative shifts） でかけ算（multiply）し、得られたピクセルを総計することでイメージをアライ ンさせるのに使用が可能である。イメージが適正にアラインされたとき、最大値 が発生する。オートフォーカスに対しても同様に、イメージがそれ自身によって かけ算され、シフトされたＤ_i、Ｄ_jであれば、コリレーションファンクションの 最大値はＤ_i＝０、Ｄ_j＝０で発生する。ボラスは１９８７年と１９８２年に、イ メージがそれ自身、例えば、Ｄ_i＝０、Ｄ_j＝０に関してシフトされているコリレ ーションファンクションと、Ｄ_i＝１、Ｄ_j＝０でのコリレーションファンクショ ンがと比較されれば、その相違はイメージコントラストが増加するにつれて増加 すると指摘した。よって、コリレーションファンクションの最大値（Ｆ₈）は最 良フォーカスにて発生するであろう。ボラスは１９８８年にＦ₉とＦ₁₀とを得る ためにＦ₈とそのバリアンスであるＦ₃との間にアナロギー（analogies）を創出 させた。これらコリレーションファンクションはバイオロジー顕微鏡イメージ（ biologic microscope images）では今までテストされたことがないようである。 ＩＩＩ．パフォーマンス結果 図６のセクエンシャルオートフォーカスプロセスを使用した多様なファンクシ ョンの適正さを判定するため、各々はフェーズコントラストと蛍光マイクロスコ ピーの両方に対し、選択された顕微鏡フィールドでまずテストされた。予備実験 では、フォーカスファンクションのプロット形状はそのフィールド内の細胞数に 影響されることが知られた。特に、１つの小細胞を含んだフィールドが、いくつ かの細胞を含んだフィールドとは大きく異なる結果を創出することが発見された 。この理由により、テストは両タイプのフィールドに対して実施された。その結 果は、同一のオブジェクティブを使用する場合でさえも、倍率に影響されること も発見された。よって、テストはリレーレンズ（relay lens）のズームを変更し た一連の倍率で行われた。選択されたフィールドのこれらの実験から、ファンク ションはフェーズコントラストと蛍光オートフォーカスに対して選択され、正確 性、精度、信頼性、及び速度のために、多くのフィールドをスキャンする実験で 比較評価された。 Ａ．選択された顕微鏡フィールドに対するオートフォーカスファンクションの 評価 １．１０体の細胞を有した顕微鏡フィールド オートフォーカスファンクションは１０体の細胞を含んだ顕微鏡フィールドで まずテストされた。フォーカスは０．０９８μｍ増分（１００μｍレンジ内の４ ０９６デジタルステップのうち４）で変化し、次のポジションに移動する前に各 ポジションでファンクションはフェーズコントラストと蛍光とに対して評価され た。図７は蛍光に対するスケールされたファンクション値とポジションとの関係 のプロットを示す。ピークの幅と鮮明度とには明確なバリエーションが存在する が、これらファンクションは基本的にはユニモーダルである。統計測定値に影響 されるファンクション（図７ｅ、７ｆ、７ｉ）のみがサイドピーク（side peaks ）を示す。これらは恐らく、アルゴリズムを不正確にフォーカスさせる程度には 大きくはないであろう。これら小さなサイドピークは平均密度にも現れる（図７ ）。これらピークの反復パターンは、恐らくそれらがランプのフラクチュエーシ ョンではなく、干渉に影響されているであろうことを示している。 表２は蛍光に対する各ファンクションのピーク幅と最良フォーカスを掲載して いる。最大値の９０％の幅はそのファンクションの周波数特性に対する明確な依 存を示している。ファンクションＦ₁、Ｆ₂及びＦ₃は最低から最大までの周波数 エンハンスメントで並べられており、ピーク幅はさらに高い周波数で狭まり、Ｆ₃ を最狭ピークとしている。スペースフィルター（spatial filter）に関しては Ｆ₂と類似したＦ₉も非常に類似した５０％と９０％の幅を有している。解像ファ ンクションは非常に狭いピークを有しており、コントラストファンクションはず っと幅広いピークを有している。コンビネーションファンクションであるＦ₇と Ｆ₈はコントラストファンクションよりも狭いピークと、解像ファンクションよ りも幅広いレンジとの交換を申し出る。基本的には統計的なファンクションであ るＦ₅、Ｆ₆及びＦ₁₁のマキシマあるいは最良フォーカスは、他とは１．０７μｍ だけ異なる。１フィールドだけではこの相違の大きさを決定するには不十分であ るが、コントラストと解像度の測定値は同じフォーカスを提供しない可能性はで てくる。 １０体の細胞を有したフィールドに対する同一実験からのフェーズコントラス トの結果は図８と表３とに示されている。図８において、ピークは鮮明ではなく 、プロットはさらに不規則であることが直ちに分かる。全プロットにおいてサイ ドピーク側の傾向が存在する。これは図８ｅと８ｉの統計ファンクションにおい ては特に目立っている。サイドピークの傾向はさらに高い周波数レスポンスフィ ルターで減少されており、図８ａ、８ｂ及び８ｃのＦ₁からＦ₂とＦ₃への最初の 肩部で進行的に減少していることも観察できる。蛍光の場合と同じ傾向はピーク 幅で観察できる。すなわち、最高周波数レスポンスフィルターＦ₃とＦ₄も最狭ピ ークを有しており、コントラストファンクションは非常に幅広いレンジを有して いる。 ２．１体の細胞の顕微鏡フィールド 次の実験は１体の細胞を含んだ顕微鏡フィールドに対して同一方法で実施され た。図９と表４とに示される蛍光データから、ピークはさらに狭いことが分かる 。これは恐らく、垂直方向の細胞成分の減少した配分によって引き起こされたも のであろう。細胞数が多ければ、そのポーションはオーバースリップからさらに 遠くにまで延び出ることであろう。このことは核ステイン（nuclear stain）に おいてはさらに真であろう。なぜなら、核はたいていは球形細胞膨張（spherica lly shaped cellular bulge）を引き起こし、細胞膜のようにガラスに直接的に 接着しないからである。フィールドのデプスが細胞厚とほとんど同じであれば、 フ ォーカスファンクションの幅はスペシメン厚に依存することであろう。さらに、 ファンクションＦ₂とＦ₃とは表４に示すようにたった０．１２μｍである９０％ のピーク幅を示すだけである。これは０．７４μｍであるフィールドの理論値よ りも相当に小さい。なぜなら、各結果は平方処理されることとなる大きなピクセ ル数の総計だからであろう。大きなピクセル数（２４５，７６０）を総計すると 、信号−ノイズ比が大きく増加する。平方処理はピークをさらに狭める。ボーン とウルフ（４４１ページ）によるフィールドのデプス偏差は、中央イメージパッ チのアテニュエーション（attenuation）によって測定されるように、そのフォ ーカスセクションの最端部（extremes）での垂直解像度において２０％のロスを 想定している。明らかに、この適用での信号−ノイズ特性は、２０％の変化より もずっと優れた識別を許容する。 表４から、マキシマあるいは最良フォーカス間には差異が存在し、最大のもの は統計ファンクションとハイパスフィルター間であったことが分かる。しかし、 これらの差異は１０体の細胞フィールドからのものよりも小さく、スペシメン厚 が何らかの役割を果たした可能性を秘めている。 １体の細胞による実験からのフェーズコントラストデータは図１０と表５とに 示されている。図１０から、１体の細胞のフィールドのフェーズコントラストフ ォーカスが最もシビアなオートフォーカスチャレンジ（autofocus challenge） を示したようであることが知られる。全プロットは明確なサイドピークを示し、 いくらかは非常にノイジー（noisy）である（ノイジーとは本発明の説明用の用 語である：イメージノイズがこの現象を引き起こしたとは恐らく言えないであろ う）。図１０ｅと１０ｉの統計ファンクションＦ₅、Ｆ₆及びＦ₁₁はノイジーであ り、最大のサイドピークを有している。図１０ｄのＦ₄もまたノイジーであるよ うに思われる。最初は、Ｆ₄のノイジーな外見がハイパスフィルターの周波数特 性に起因するように見えた。しかし、前述のように、方形ピクセルを有したカメ ラの周波数レスポンスは垂直周波数を低下させ、その原因の説明を複雑化してい る。図１０ｆのＦ₇とＦ₈、すなわち解像ファンクションとコントラストファンク ションとの混合もノイジーに見える。図１０ａ、１０ｂ及び１０ｃの単純なハイ パスフィルターＦ₁、Ｆ₂及びＦ₃はスムーズであり、益々高くなる周波数レスポ ンスで先に観測されたサイドピークの減少を示す。表５から、最良フォーカスに はいくらかの相違が存在するが、これらの相違は小さいことが知られる。 フェーズコントラストのランプフラクチュエーションに対するファンクション 感度のいくらかの表示は図８と１０において見られる。これらの対応実験の双方 において、インテンシティスパイク（intensity spikes）が存在した。図８ｅに おいて、約８７μｍのポジションで平均インテンシティスパイクが存在し、図１ ０ｅにおいては５５μｍ付近に１つ、そして８５μｍに別なスパイクが存在する 。図８ｅの平均インテンシティスパイクは、図８ｄと８ｆのＦ₄、Ｆ₇及びＦ₈に 現れ、図８ｅと８ｉのＦ₅、Ｆ₆及びＦ₁₁に多少現れた。図８ａから８ｃの解像フ ァンクションＦ₁からＦ₃、及び図８ｇと８ｈのオートコリレーションファンクシ ョンＦ₉とＦ₁₀はこのランプフラクチュエーションには影響を受けなかったよう に見える。この同じパターンは図１０に示されている。Ｆ₅の例外を除けば、こ れ らランプフラクチュエーションに敏感な高いファンクションはバリアンスまたは 標準偏差のコントラスト測定値に依存していることは特記に値する。 ３．倍率とサンプリングへのファンクション依存 １体の細胞のフェーズコントラストフォーカスのデータは、そのフォーカスフ ァンクションの周波数レスポンスがサイドピークの形成において重要な役割を果 たすことを示した。これらサイドピークは最良フォーカスの真上あるいは真下の 干渉から発生するであろう。干渉は低い周波数で発生すると考えられる。なぜな ら、最良フォーカスから離れると、顕微鏡のモジュレーショントランスファーフ ァンクション（ＭＴＦ）を劣化させ、低周波カット（lower frequency cut off ）をするからである。フォーカスファンクションが最高周波数のみを測定したな ら、それはこれらからは影響を受けないであろう。しかし、フォーカスファンク ションは周波数レスポンスの唯一のソース（source）である。顕微鏡とカメラも またフォーカスファンクションに先行して作用する特徴的な周波数レスポンスを 有している。（Nyquist）ニクイストサンプル基準によれば、理想的には、カメ ラは光信号（optical signal）の最大周波数の少なくとも２倍でサンプルすべき である。レイライ解像度予想値（Reyleigh resolution estimate）は、イノウエ （「ビデオマイクロスコピー」プレナムプレス，ニューヨーク，１９８６年）等 によって説明されている。 ここでのλは光の波長であり、ＮＡはニューメリカルアパーチャ（numerical aperture）である。０．５２ＮＡコンデンサー、０．７５ＮＡオブジェクティブ 、及び、使用されるデイライトフィルター（daylight filter）のピークトラン スミッタンスに対応する５４０ｎｍのピーク波長で、解像度は０．５１８μｍで あった。よって、イメージが拡大され、隣接するピクセルに投影されたスペシメ ンの成分間の距離がそのスペシメンで約０．２５μｍに対応するようにされな ければならない。これらの光学機器での１．０のズームで、投影距離は０．６０ ７μｍであった。これはアンダーサンプリング（undersampling）の条件であり 、アリアシング（aliasing）を引き起こす。ニクエストサンプリングの達成は、 最大可能なズーム２．２５を越える０．６０７／０．２５０＝２．４３のズーム を必要としたであろう。 しかしながら、蛍光マイクロスコピーの限定された輝度（brightness）は、ニ クエストサンプリングを非常に非現実的とし、あるいは不可能とする。インテン シティは倍率の逆平方（inverse square）と比例し、ここでの明るい準備（brig ht preparation）の場合でさえも、２．２５のズームはカメラとイメージプロセ ッサーの操作をケインの上限に強制し、非常にノイジーな信号を提供する。限定 された蛍光インテンシティは、アンダーサンプリングの問題を増幅させる高ＮＡ 、低倍率オブジェクティブの使用を促す。倍率の増加による信号ロスのため、蛍 光のオートフォーカスを理想的にサンプルすることは非現実的である。アンダー サンプリング条件はこの実験に対して維持された。 しかし、オートフォーカスへのサンプリングの影響を理解することは重要であ る。なぜなら、多くのオブジェクティブと、異なる倍率とＮＡを有する顕微鏡が 存在するからである。サイドピークの倍率への依存をさらに研究するため、１細 胞の顕微鏡フィールドの実験が、３７から９３％のアンダーサンプリングのレン ジに対応する一連のズーム０．９から２．２５で実施された。ファンクションＦ₃ のレスポンスとフォーカスポジション及びズームの関係を表す３Ｄプロットは 図１１に示されている。０．９のズームでサイドピークは充分に大きく、オート フォーカスアルゴリズムに、何らかの条件で見かけの最良フォーカスの位置を決 定させることができる。予想されるように、倍率をほぼ理想のサンプリングであ る２．２５に増加させると、サイドピークは消滅する。この実験は、光学機器と カメラの選択がフォーカスファンクション特性の決定には非常に重要であるとい う事実を確認させる。解像度あるいは倍率を変更させるいかなるものも同様な変 化を引き起こすであろう。 例えば、スライドの代わりにカバースリップで細胞を増殖させることは、サイ ドピークのサイズを増加させることが観測された（データは図示せず）。これは 、オブジェクティブアベレーション（objective aberrations）が最良に修正さ れる位置に細胞を配置することで得られる解像度のゲインのおかげである。この ことは、ギブソン（「蛍光ランプ顕微鏡の３Ｄイメージ特性のモデル化」カーネ ギーメロン大学，ペンシルベニア州ピッツバーグ，１９９０年）等によって解説 されている。搭載媒体（mounting media）の屈折率、カバースリップの厚み、光 通路の汚れ、照明波長、及びカメラとイメージプロセッサー電子機器は、イノウ エによって解説されたようにシステムＭＴＦを変化させる可能性があり、フォー カスファンクションの形状を変化させる別要素である。 Ｂ．自動スキャニングにおけるオートフォーカスパフォーマンス 最後に、フェーズコントラストと蛍光オートフォーカスは１０００フィールド 以上の方形領域のスキャニングをする一連の実験でテストされた。これらの実験 の目的は、加重平均が、最良フォーカスの良好な予想値であるという仮説をテス トし、オートフォーカス精度を測定し、最大速度を達成する試みで精度を犠牲に せずにどれだけ少ない数のフォーカスポジションが利用可能であるかを決定させ 、フェーズコントラストと蛍光との間の最良フォーカスを比較することであった 。 異なるスペシメンに対していくつかの方形領域がラスタパターンでスキャンさ れた。再フォーカスは蛍光で２０回、そしてフェーズコントラストで２０回実施 された。Ｆ₃は全実験でフェーズコントラストに使用され、フィルターが［−１ ２．５ −１］であるときＦ₃あるいはＦ₇のバリエーションは蛍光に使用された 。これらの選択はピーク鮮明度（peak sharpness）とユニモダリティとの考慮に 基づいていた。スキャニング顕微鏡において、大きな垂直レンジの操作はそれほ ど重要ではない。なぜなら、隣接フィールドの最良フォーカスはたいていはあま り離れていないからである。さらに、大きなレンジとなるこれらのファンクショ ン もフェーズコントラストの１細胞に対してユニモダリティの問題を有していた。 よって、最高周波数レスポンスフィルターはフェーズコントラストのために選択 された。蛍光に対して、Ｆ₃はスキャニングマイクロスコピーに対しても問題で ある、１細胞の充分に狭いレンジ（表５より１．０３μｍ ５０％ピーク幅）を 提供した。よって、Ｆ₇とＦ₃は良好な候補であると考えられた。リアルタイムの 適用はインターレースされたカメラ信号を利用したので、２Ｄフィルターを１Ｄ 鮮明化フィルター（sharpening filter）で置き換えるＦ₇のバリエーションが使 用された。 １．正確性、精度及び速度 ２０回のオートフォーカステストで成る各セットに対して、平均と標準偏差と が最大と最良フォーカスの加重平均に対して計算された。マキシマの平均と加重 平均との差異も、加重平均が最良フォーカスの比較的に正確な予想値であるかど うかを決定するために計算された。 図１２にはこれらのテスト結果が示されている。組み合わされた標準偏差から 、フェーズコントラストのオートフォーカス精度は最大での０．１５４μｍと、 加重平均での０．０６９μｍに平均された。蛍光においては、精度は最大での０ ．２３μｍと、加重平均での０．１５９μｍとに平均された。これは２０ｘ、０ ．７５ＮＡオブジェクティブのフィールドの０．７４μｍのデプスよりも相当に 優れている。最初の実験以外はすべて、精度は蛍光よりもフェーズコントラスト において優れていた。この差異の原因にはいくつかの要素が存在すると考えられ る。フェーズコントラストにおいては、イメージは、圧電フォーカスが新ポジシ ョンで停止した後にビデオフィールドのエンド部付近でストロボされた。蛍光に おいては、各フィールドは、フォーカスが変化している（フィールドデュレーシ ョン(duration)の３０から５０％）ときにＣＣＤにインテグレート（integrate ）していた。前述のように、細胞成分と核成分とは相違状態に配分されていたか も知れない。 マキシマと加重平均の差異からの統計は最良フォーカスの２つの予想値と非常 に良好に合致した。フェーズコントラストにおいては、この差異は−０．０２５ から０．０１４μｍの範囲であり、最大標準偏差は０．０７１μｍであった。蛍 光では、この差異は−０．００２から０．０４４μｍで、最大標準偏差は０．０ ８８μｍであった。これら２つの予想値の合致と、組み合わせた標準偏差の改善 とで、加重平均は最良フォーカスのさらに優れた測定値であることが明かである 。 前述のパフォーマンスはフェーズコントラストではほんの０．２５秒のフォー カス時間で得られた。テストされた１１のフォーカスポジションにおける０．２ ５秒でのフォーカス精度には劣化は発生しないようであった。よって、さらに迅 速なオートフォーカスも可能であろう。 ２．蛍光フォーカスの予想値としてのフェーズコントラスト フェーズと蛍光とにおける各セットのフォーカステストの平均間の差異は表６ に示されている。蛍光オートフォーカスがスキャンの一部の追跡ができなかった 実験２以外は、２つの顕微鏡モード間の差異は−０．３９４と０．７４５μｍの 間で変化し、マキシマと加重平均との良好な合致が見られた。フォーカスのこの 差異の原因はいくつか存在しよう。例えば、顕微鏡アライメントや、フォーカス サンプリングインターバルや、核とシトプラズマ成分（cytoplasmic component ）の配分の差も原因となろう。これらの結果は２つの顕微鏡モードの差異の測定 と補整が重要な改善を提供するであろうことを示している。しかし、１つのスペ シメンと別のスペシメンとの差異を予想することが可能とは考えられなかった。 実験２を除外して、平均標準偏差は最大で０．３４７μｍであり、加重平均で０ ．３４２μｍであった。よって、この差異の標準偏差はオブジェクティブのフィ ールドデプスの約１／２であった。これは蛍光測定の精度における小ロスの原因 となるかも知れないが、フェーズコントラストオートフォーカスが蛍光オートフ ォーカスの良好な予想値を提供することを示している。 ＩＶ．結論 本発明のオートフォーカスシステムの好適実施例による実験は、蛍光イメージ 処理のための露出を最低限にするようにフェーズコントラストオートフォーカス を使用して顕微鏡スライドの大きな領域をスキャンすることが可能であることを 示した。これによって生細胞のイメージ処理が最低の毒性で可能となり、敏感な 蛍光準備物の分析がフォーカス最中にフォトブリーチングを発生させずに可能に なるであろう。フェーズコントラストと蛍光の最良フォーカスには相当な相違が 存在したが、この差異は補正が可能な程度にコンスタントであった。さらに、オ ートフォーカスは、フィールドのデプスよりも良好な大きさの順序で、０．２５ 秒以内に高精度で実施できることが示された。改善された精度は加重平均を使用 して達成された。これにはテストされた全フォーカスポジションからのデータが 利用された。 パワー−加重平均はポジションの平均であり、各々はそのポジションでのフォ ーカス値のパワー値によってウェイト処理（weighted）された。加重平均はフォ ーカスファンクション結果のアレイから計算された。各フォーカスファンクショ ン結果は、１ポジションでの全イメージフレーム（２４５，７６０ピクセル）あ るいはフィールド（１２２，８８０ピクセル）にわたるファンクションの計算か ら得られた大きさ（magnitude）である。全ポジションでのファンクション値を 平均することで加重平均なら可能であるが、最大は隣接ポジションでの値の大き さを提供しない。 このパフォーマンスは最も顕著なハイパスフィルター特性を有したオートフォ ーカスファンクションを選択することでアンダーサンプリングの影響を最小化し た後に達成された。アンダーサンプリングの問題は、低倍率、高ＮＡオブジェク ティブ、及びさらに高いＮＡコンデンサーではさらにシビアであろう。マルチモ ダリティは、解像度にさほど依存しないファンクションにとってはさらにシビア であり、コントラスト測定においては特にシビアであった。フェーズコントラス トオートフォーカスにおけるインテンシティバリアンス（あるいは標準偏差）で のユニモダリティの欠如は、コントラストベースのファンクションの使用をさら に懐疑的にする。この問題を引き起こすような干渉は全形態のトランスミットさ れマイクロスコピーにおいて存在するかもしれない。ここでのイメージエレメン ト（element）は数が少なく、あるいは規則的に間隔が開けられている。 蛍光において、輝度も最良フォーカスからの距離に直接に関係するという事実 は、不都合な干渉コントラストエクストレマ（extrema）を圧倒するかもしれな い。テストされた全オートフォーカスファンクションは、減少しているイメージ インテンシティと共にその大きさが減少する。アテニュエートされた蛍光はフォ ーカスのコトラスト測定値のマルチモダリティを減少あるいは排除する。ハイパ スフィルターファンクションは、このインテンシティ依存のためにさらに狭いレ ンジを有している。統計と解像度測定値を組み合わせることでレンジは比較的に 狭いピークを維持しながら拡張が可能である。このような組み合せは、まばらな 細胞スペシメンのスキャニングに重要であろうし、さらに大きなオペレーション レンジを必要とするオートフォーカスへの適用には必要であろう。 オートフォーカスの信頼性と、ここで達成された速度のレベルは、フローシト メトリ（flow cytometry）に共通な測定値をスキャニングシトメトリでの実用レ ベルに近づける重要なステップである。このような測定値は形態論（morphology ）のごときインシツ分析（in situ analyses）や、フローシトメトリでは不可能 な関係とポジションとに関係する利点を有するであろう。ポジションは、細胞単 位のトラッキング（tracking）が短スキャンインターバルで可能であろう生細胞 の時間を費やす分析にとって特に有利であろう。 連続スキャニングによるボリュームイメージングを使用したオートフォーカス 本発明のオートフォーカス技術の速度は、顕微鏡で観察されているイメージ観 察体のボリュームイメージを連続的に取得するボリュームイメージ装置で速まる であろう。このイメージは垂直方向に並んだそれぞれの２次元イメージ平面にて 取得されたイメージセットを含む。以降、このようなイメージを”ボリュームイ メージ”あるいは”３次元イメージ”と呼称する。 この実施例は、顕微鏡で検査されているイメージ観察体の一部のボリュームイ メージが、（１）複数のイメージ装置であって、各々は複数の実質的に平行なイ メージ平面のそれぞれのイメージ平面に配置されており、各イメージ平面は互の イメージ平面に関して特定な寸法で離れているも装置と、（２）複数の電子イメ ージ表示を形成する前記複数のイメージ装置にカップリングされたイメージ形成 装置であって、各々の電子イメージ表示は複数のイメージ平面のそれぞれのイメ ージ平面でイメージを表す装置とを含んだ装置によって取得が可能であるという 重要な発見に基づいている。 各電子イメージ表示はイメージ観察体の一部を表し、そのイメージ観察体の他 の全部分から特定の寸法だけ離れている。 スキャニング顕微鏡でのオートフォーカスをサポートするため、このボリュー ムイメージ装置はスペシメンイメージ装置に先だって連続的にスキャンされる。 ボリュームイメージ装置とスペシメンイメージ装置の両方は同じ顕微鏡光学装置 で同じイメージ観察体を観測している。よって、オートフォーカスは図１から１ ２で解説した前述のオートフォーカス技術の分析方法によって実施が可能である 。ボリュームイメージ装置はボリュームイメージを取得するのにＺディメンショ ンの顕微鏡の増分ポジショニング（incremental positioning）を必要とはしな い。よって、顕微鏡載物台をＺディメンションに増分的にポジショニングするこ とでイメージセットを取得するための各顕微鏡フィールドでの停止は必要としな い。従って、この実施例は図１から１２に示すオートフォーカス技術を加速する 非常に重要な目的を達成する。 図１３は、ハイブリッドブロック図／略図で、顕微鏡３９０の連続スキャニン グオートフォーカス処理を全自動化する本発明のシステムを図示している。顕微 鏡３９０は２体のオーバーラップする光学システム、すなわち、ボリュームイメ ージ用と、蛍光イメージ用とを有している。好適には、顕微鏡３９０は、フェー ズコントラスト光学機器を有したエピ蛍光直立顕微鏡（図１に示すようなもの） である。この蛍光イメージ光学システムは、コレクターレンズ４１２とリレーレ ンズ４１４とを有した、イメージ観察体を照射するエピ照射光源（epi-illumina tion light source）４１０と、そのエミッション干渉フィルターが外されて４ ４８に配置された蛍光フィルターブロック４１５と、矢印４１９に沿って２方向 に調整可能な圧電ポジションされた対物レンズ４１８とを含んでいる。光源によ って提供されるエピ照射は、イメージ観察体（この場合、細胞を有した顕微鏡フ ィールド４２０）を蛍光させ、蛍光発光は対物レンズ４１９とフィルターブロッ ク４１５を通過して、干渉フィルター４４８とリレーレンズ４３２を介してＣＣ Ｄカメラ４３３に蛍光発光を反射させるジクロイックミラー（dichroic mirror ）４３０に到達する。カメラ４３３の出力はシトメトリプロセッサー４３４に提 供され、顕微鏡フィールド４２０の細胞の蛍光イメージが処理される。 このボリュームイメージ光学システムは、フェーズコントラスト光学機器用の イメージ観察体の照明を提供するトランス照明光源（trans-illumination light source）４００を含む。これはコレクターレンズ４０２と、リレーレンズ４０ ４と、蛍光励起と発光波長（典型的には、ＤＡＰＩに対して３６５ｎｍと４８０ ｎｍ）からオートフォーカス用の光を分離する幅広バンドパス干渉フィルター４ ０７（例えば、６００ｎｍ±５０ｎｍバンドパスフィルター）を介してトランス 照明を反射するミラー４０６とを含んでいる。明らかに、このトランス照明波長 は容易に変更が可能であり、他の蛍光波長に対応する。トランス照明光はジクロ イックミラー４３０によって発光された蛍光から分離され、ボリュームイメージ アレイ４３６とカメラのアレイ４３７とを含むボリュームイメージ装置でリレー レンズ４３５を通過させてイメージされる。アレイ４３７のカメラは、例えば、 時間ディレーインテグレーション（time-delay-and-integration：ＴＤＩ）ＣＣ Ｄカメラを含むこともできる。好適には、アレイ４３７のカメラは、その出力（ 以下では”電子イメージ表示”）がＡ／Ｄ回路４４０を介したアナログ−デジタ ル（Ａ／Ｄ）フォーマットに変換された状態で、並行（in parallel）に操作さ れる。この並行変換電子イメージ表示は、Ａ／Ｄ回路４４０からボリュームイメ ージプロセッサー４４２（保存装置４４３を含む）に提供され、カメラアレイ４ ３７の電子イメージ表示から最良フォーカスが計算される。ボリュームイメージ プロセッサー４４２の最良フォーカス出力は、圧電オブジェクティブポジショナ ー４４７を操作する圧電オブジェクティブポジショナーコントローラ４４６に提 供される。圧電オブジェクティブポジショナー４４７は対物レンズ４１８をボ リュームイメージプロセッサー４４２によって決定された現行の最良フォーカス ポジションにポジションさせる。 顕微鏡３９０はｘｙ平面でのスキャニングと、軸４３９で示されるＺ軸上の移 動のために移動手段（図示せず）によって動かされる。この点で、顕微鏡３９０ は図１の顕微鏡１０２と同一である。 本発明のボリュームイメージ処理の光学原理は、図１４Ａと図１４Ｂを参照す れば理解されよう。ボリュームイメージ処理は、イメージ形成顕微鏡平面（”イ メージ観察体平面”）での最良フォーカスの合理的な垂直距離（数ミクロン）内 に、隣接光学平面で成るフォーカスボリュームが存在するという考えに基づいて いる。これは、ビデオカメラとディスプレーとを備えた顕微鏡にての単純な実験 で証明が可能である。まず、イメージ観察体がフォーカスされ、ディスプレーに 表示される。そして、ビデオカメラは光軸（optical axis）に沿って短距離を移 動される。これでイメージはフォーカスを離れる。次に、ビデオカメラの新ポジ ションを維持し、顕微鏡のフォーカスノブが調整され、シャープなフォーカスが 再度得られる。このイメージ観察体−オブジエクティブフォーカス距離はこの最 後のステップで数ミクロンだけ変化される。よって、オブジェクティブ面と相対 的に新光平面がフォーカスされる。合理的な垂直距離で、これは光学的なパフォ ーマンスの劣化をもたらさない。このようなイメージボリュームの並行取得手段 は図１４Ａと１４Ｂとに示されている。 図１４Ａにおいて、光パイプ（光ファイバー）のアレイ４７０が示されている 。アレイ４７０の光パイプはＣＣＤカメラのアレイ４７４にカップリングされて いる。この点で、各光パイプは２端、すなわち、図１４Ｂにて拡大されているス テップアレイ（stepped array）の他の光パイプの対応第１端部と共に束ねられ ている第１端部と、それぞれのＣＣＤカメラ４７５に接続された第２端部とを有 している。光パイプ４７２は第１端部４７７と第２端部４７８とを含んでおり、 第２端部４７８はＣＣＤカメラ４７９に接続されている。光パイプ４７２と４７ ６ の第１端部４７３と４７７は図１４Ｂに示すステップアレイで共に束ねられてい る。図１４Ｂに示すように、光パイプの第１端部は端部４７３と４７７とを含み 、実質的に軸方向のアレイに配置され、それぞれの第１端部は複数のイメージ平 面のそれぞれのイメージ平面にポジションされている。例えば、端部４７３はイ メージ平面Ｚ₁にポジションされており、端部４７７は第２イメージ平面Ｚ₂にポ ジションされている。図１４Ｂは、ｎ本の光パイプに対して、光パイプ第１端部 のステップされて実質的に軸方向であるアレイが、他のイメージ平面に対して各 イメージ平面が特定の方向（この実施例ではＺディメンション）に離れているよ うな対応するイメージ平面のアレイを定義する。よって、イメージ平面Ｚ₁はイ メージ平面Ｚ₂から垂直上方向に離れている。イメージ平面Ｚ_nはイメージ平面Ｚ₁ とＺ₂から垂直下方向に離れている。第１端部のステップアレイはイメージ観察 体（例えば、ステイン細胞）が留まるイメージ観察体平面（例えば、顕微鏡スラ イド表面）からＺ方向に離れてセットされている。 すなわち、各光パイプはイメージ装置を構成しており、各カメラはイメージ形 成装置である。図１３に戻ると、光パイプのアレイ４７０は図１３のボリューム イメージアレイ４３６に対応しており、ＣＣＤのアレイ４７４は図１３のカメラ アレイ４３７に対応する。 図１５Ａと１５Ｂは本発明の複数のイメージ装置の第２実施例を、フォトエレ メント（photo element）４８５のごときアクティブフォトエレメント（active photo elements）のリニアアレイ（linear array）４８２を有したリニアイメー ジセンサー４８１の形態で示している。イメージセンサー４８０はイメージ観察 体平面４８８に対して傾斜しており、イメージ観察体は、各フォトエレメントが 互のイメージ平面に対して垂直ディメンションで離れているそれぞれのイメージ 平面とインターセクトするように配置されている。よって、図５Ｂのイメージ平 面Ｚ_iはフォト電気エレメント４８５によってインターセクトされており、垂直 距離ｄだけ離れたイメージ平面Ｚ_i+1は別フォト電気エレメント４８６でインタ ーセクトされている。このイメージ装置の実施例で、イメージはＣＣＤカメラ 電子機器で形成され、これらは図１３のアレイ４７４のカメラの電子機器と同様 に作動する。 図１３、図１４Ａ及び図１４Ｂに関して、顕微鏡３７０は顕微鏡スライド４３ ８が搭載される従来式載物台を含んでいる。顕微鏡スライド４３８は前述のよう に蛍光シトメトリ用に準備され、前述のように自動的にラスタパターンで複数の 顕微鏡フィールドにわたってスキャンされる。このようなスキャニングは軸４３ ９のｘｙ平面である。載物台がｘにて定速で移動すると、隣接イメージ平面は小 さな連続時間ディレーでＣＣＤカメラアレイ４７４のカメラによってサンプルさ れる。これらのディレーはバッファ処理で排除される。分析のために取得された 蛍光イメージは図５に示すようなさらに長いディレーで収集され、例えば、最大 １０ミリ秒、あるいは２０ｘ対物（objective）の５００μｍ平方フィールドで １００μｍトラベル以下である圧電再ポジショニング時間に対応する。フォーカ スは分析のために取得された蛍光イメージと、フォーカスのために取得されたボ リュームイメージとの間の差異の測定によりキャリブレーションが可能である。 この点で、最良蛍光とボリュームイメージフォーカスとの間の差異は、蛍光イメ ージから直接的にフォーカスを計算するため、少々異なるフォーカスレベルでの 反復的スキャンによって測定されるであろう。蛍光フォーカスポジションは、続 くスキャンのための、蛍光での最良フォーカスとボリュームイメージとの差異を 排除するようにセットが可能である。 図１６に示すように、光パイプアレイ４７０のステップ端部は、フィールド４ ９０のような顕微鏡フィールドの一部をスキャン方向にスキャンするボリューム イメージャーフィールドのビュー（volume imager field of view：ＦＯＶ）を 形成する。ボリュームイメージャーＦＯＶのトレーリングは蛍光イメージャーＦ ＯＶである。ボリュームイメージャーＦＯＶに関して、端部４７３と４７７とを 含んだ光パイプ端部のステップアレイの方形第１端部の各々のものに略対応する アスペクト比を有したフィールドのスライス（slice）を考慮してみる。このス ライスは図１６の△_iで表示されている。イメージ平面Ｚ_l−Ｚ_nはこのスライス でスキャンされるので、このスライスの２Ｄイメージは各光パイプ／ＣＣＤカメ ラの組み合せで捕捉（capture）される。このイメージは１個あるいはそれ以上 のピクセルを含むことができる。各イメージＰは図１７に示すようにこのスライ スに対応するバッファに保存される（電子イメージ表示として）。よって、スラ イス△_i（”△_iバッファ”）のためのバッファ内の連続バッファ位置のセットに 対して、図１４Ｂに示すステップエンドフェースアレイ（stepped end face arr ay）の各第１エンドフェースはスライス上でスキャンされるので、エンドフェー スのイメージ平面の２Ｄイメージを表す電子イメージ表示はそのエンドフェース に対応する保存位置にて保存される。よって、光パイプ４７２のエンドフェース ４７３に対応するイメージ平面Ｚ₁で形成されたイメージＰ₁は、イメージ平面Ｚ_l に対応するポジションで△_iバッファに保存される。このように、光パイプアレ イ４７０のステップエンドフェースはスライス上でスキャンされるので、複数の 電子イメージ表示Ｐ_jは△_iバッファにて保存される。図１７が示すように、スラ イスのアレイに対してバッファが提供されている。図１８は、それぞれにイメー ジ平面Ｚ₁−Ｚ_nを介して取得された２ＤイメージＰ₁−Ｐ_nの電子イメージ表示に よって形成された△_iバッファに保存されたボリュームイメージを示す。 ボリュームイメージが、顕微鏡スライドを直接的に傾斜させず、イメージ平面 で”傾斜（tilt）”させることで（イメージ平面を垂直方向に離す）取得される とき、利点が発生することが理解されよう。この利点は、垂直拡大（magnificat ion）が横方向拡大の平方であるという事実によるものである。例えば、図１か ら１２に図示された実施例において、ビデオカメラＣＣＤチップの倍率は約３０ ｘである。よって、垂直倍率は約９００ｘであり、スペシメンの４μｍ厚ボリュ ームはイメージ平面で３．６ｍｍに拡大されるであろう。この大きな垂直倍率は 、必要な光セクション（optical sections）の正確なサンプリングを単純化する 。 イメージ観察体のディメンションと利用可能なＣＣＤカメラ技術とに関する想 定に基づき、図１４Ｂに示された光パイプ端部のステップアレイのディメンショ ンを計算した。このアレイ（図１４Ｂに示す）のディメンションは、２０ｘ対 物と、０．９ｘ−２．２５ｘズームリレーレンズ（ニコン製）とを介して、１３ ｘ１３μｍピクセルの１０２４ピクセルｘ９６ライン ＴＤＩ ＣＣＤアレイに４ μｍ厚スペシメンボリュームが拡大されたと想定して計算された。しかし、デザ イン、特定適用条件、及び光学技術並びにカメラ技術の変更により、これらの想 定はもちろん変更される。それでも、比較的に剛性な光パイプを想定すれば、光 パイプをＣＣＤカメラに取り付ける充分な強度を備えた１体のパッケージが図１ ４Ａと１４Ｂに示される実施例には必要である。このパッケージは図示されてい ないが、例えば、ＣＣＤカメラと光パイプとの両方に取り付けられる方形アルミ フレームで構成が可能である。比較的に小さなリモート式ＣＣＤカメラ（ダルサ 製の２．０インチｘ２．０インチｘ０．７５インチのカメラ等）を想定すれば、 これらのコンポーネントは便利なサイズのパッケージに収納が可能であろう。 図１４Ｂに示すディメンションは、製造の容易化のために光パイプエンドフェ ース間に０．０１７インチの垂直ステップを含んでいる。これは２９．３８７ｘ 横方向倍率と、８６３．６ｘ 垂直倍率とに相当する。前記のズームレンズを使 用すると、この倍率はズーム１．０４ｘ（可能なレンジ０．９ｘ−２．２５ｘか ら）に相当する。５０２μｍインスクライブド平方フィールド（inscribed squa re field）用の７１０μｍ直径を有するフィールドビューを有した２０ｘ フェ ーズ／フルオライトオブジェクティブが使用可能であろう。このようなフィール ドはプロポーズされた横方向倍率にて１４．７５ｍｍ（０．５８インチ）平方に 拡大されるであろう。これで、蛍光イメージを取得するトレーリング（trailing ）ＣＣＤのための充分なスペースが確保される。ＣＣＤカメラはＴＤＩタイプの ものとして紹介されており、光感度を増加させるものであり、これは連続スキャ ニングのためにドエル時間（dwell time）を減少させる。 もちろん、光パイプインターフェースを通過する際には光ロスが発生する。し かし、これは通常のトランスミットされた顕微鏡ランプ（transmitted microsco pe lamps）の明レンジで充分に補償される。ＴＤＩカメラの使用は、光パイプイ ンターフェースでは普通である光ファイバーのランダムアレンジをも少々減少 させ、不適性な光ファイバーのマッチングでカメラアレイにて発生するかも知れ ないモアレパターン（Moire patterns）の問題を軽減させる。周知のごとく、ど のモアレセットもＴＤＩカメラで平均化（averaged out）されるであろう。ＴＤ Ｉカメラの２：１ビンニング（binning）は、蛍光とフェーズコントラストの双 方において、効果的なニューメリカルアパーチャ（ＮＡ）の限定の通常方法に付 随する光ロスなく、アンダーサンプリングとアリアシングをも排除することであ ろう。 図１９は本明細書にインコーポレートされている前記の特許出願にて開示され たオートフォーカスファンクションに従ってイメージ表示を処理することで、光 学品質メトリック（optical quality metric）を決定するのに使用されるプロセ スを示す。好適には、このファンクションは解像ファンクションであり（表１で 解説）、ハイパスフィルター（ＨＰＦ）の結果の平方を合計するものである。ま た、電子イメージ表示の平方値は増大したインテンシティ値を提供する。図１９ が示すように、それぞれのイメージ平面でイメージを表示する電子イメージ表示 は、ステップ５０１にてＣＣＤカメラの出力部で取得され、ステップ５０３でデ ジタル化され、ステップ５０４でバッファされる。セクエンス（sequence）５０ １、５０３、５０４は、複数のイメージ平面の各イメージ平面に対する電子イメ ージ表示が取得されてバッファされるまで継続される。解像度の測定値は、ステ ップ５０５と５０６でデジタル化されたイメージのハイパスフィルター処理の結 果の平方を合計することで取得される。フォーカスメトリック（focus metric） はステップ５０７で構築され、そのフォーカスメトリックで示されるような最良 フォーカスが発生するイメージ平面はステップ５０８にて選択され、必要であれ ば、顕微鏡はオートフォーカスメカニズム（autofocus mechanism）によって再 フォーカス（refocused）される。代表的なフォーカスメトリックは、各イメー ジ平面での解像度の測定値を表示する鮮明度インデックス（sharpness index） のプロットとして図２０にて図示されている。 光学品質メトリック（解像度あるいは鮮明度）の計算はイメージ表示の処理を 必要とする。図１４Ｂのステップエンドフェースで取得されるような９枚のイメ ージ平面を想定すると、９の並行電子イメージ表示が処理されなければならない であろう。組み合わされると、これは並行に処理されなければならない９０ＭＨ ｚピクセルレートを創出するであろう。好適には、各電子イメージ表示に対して １ｘ３コンボリューション（convolution）（−１ ２ −１）がハイパスフィル ターに適用され、その平方の合計の計算が続く。明らかに、ボリュームイメージ プロセッサー（図１３の４４２）はこのイメージ表示を並行に処理できなければ ならない。このような並行処理は、イメージングテクノロジーＭＶＣ ４０ＭＨ ｚイメージプロセッサーのごときパイプラインイメージプロセッサー（pipeline image processors）によって支持されている。このようなシステムはマザーボ ード（mother boards）のセットを含んでいる。各々は３チャンネル、８ビット Ａ／Ｄコンバータ、イメージバッファ、及び処理パイプラインを有している。例 えば、９のイメージストリーム（image streams）であれば、３セットのマザー ボードによりイメージングテクノロジープロセッサーにおいて処理が可能である 。 本発明のボリュームイメージ処理は、ハイパスフィルターファンクションを位 置替え（relocation）することでさらに改善が可能である。例えば、図２１に示 すオートフォーカスシステムの実施例では、このハイパスフィルターファンクシ ョンは、バックフォーカス、フーリエあるいはピューピルプレーン（backfocal, Fourier or pupil plane）で顕微鏡３９０の光学機器内に配置されている。この 実施例では、これら複数のイメージ装置は、図１５Ａと１５Ｂにて示す高感度フ ォト電気エレメント（high sensitivity photo electric elements）の傾斜リニ アアレイ（tilted linear array）に対応するフォトエレメントのアレイ６１０ を含む。この場合、フォト電気エレメントのアレイ６１０は、カメラ電子部６２ ０にカップリングされている。図２１に示すオートフォーカスシステムの実施例 （図１３のものと同じ参照番号を使用）では、ボリュームイメージプロセッサー ４４２はハイパスフィルターされた電子イメージ表示を処理し、光学品質メトリ ックを創出する。このプロセッサーは単純化されており、カメラ電子部６２０ で出力された電子イメージ表示は図２１に示すインテグラル（integral）Ｉ_{x(t) z} の形態を有している。図１３のボリュームイメージの実施例と比較すると、こ のインテグラルはオートフォーカス計算の実施コストを減少させている。図１３ のボリュームイメージプロセッサー４４２は３次元イメージを提供する多数の２ 次元イメージ表示を処理しなければならない。図２１に示されるようにハイパス ファンクションが光学的に実行され、電子イメージ表示処理が軽減される。投射 されたピューピル平面（projected pupil plane）（フーリエ変換平面）を創出 するフーリエリレー光学機器（Fourier relay optics）６０２の使用で、光ハイ パスフィルター６０５はアテニュエーション（アンプリチュード）フィルターあ るいはフェーズフィルターとして利用が可能である。光フィルター処理に関して は”光学情報処理”（リー，スプリンガー−ベルラグ，ニューヨーク，１９８１ 年）を参照。実際の使用では、光ハイパスフィルター６０５はイメージの低周波 数部をブロックする。高周波あるいはエッジ情報（edge information）は保持さ れ、高周波情報のインテンシティはフォーカスと比例する。よって、特定のイメ ージ平面でのインテンシティは鮮明度の直接的測定値を提供し、図２０のフォー カスメトリックはインテンシティ（鮮明度として）とイメージ平面との関係を単 純にプロットすることで導くことが可能である。多数の異なるイメージ平面での インテンシティ（鮮明度）は傾斜高感度フォト電気エレメントアレイ６１０を使 用して測定される。これには、電子イメージ表示をバッファし、そのディレーを 排除し、最良フォーカスを計算する１体のイメージプロセッサーのみが必要であ る。本質的には、図２１のオートフォーカスシステムの実施例は、３体のイメー ジ処理ボード、９体のＣＣＤカメラ、及び１体の光パイプアレイを、１体のイメ ージ処理ボード、１体の傾斜フォト電気エレメントアレイ、及び１セットのカメ ラ電子機器と置換することで実施コストを軽減させる。 継続的ボリュームイメージ処理は、スリット式あるいはスポット式コンフォー カスアパーチャ（confocal apertures）の場合のように、コンフォーカス顕微鏡 原理を利用してボリュームを急速にスキャンすることもできよう。スリットアパ ーチャの場合、イメージ平面でイメージを形成するＣＣＤカメラの軸方向（lon gitudinal）ＣＣＤアレイは、スリットコンフォーカスアパーチャを介して照明 が可能である。幅方向にて１個のピクセルである各カメラのリニアＣＣＤアレイ を想定すると、各リニアＣＣＤアレイは１平面をイメージするであろう。しかし 、イメージ観察体は各リニアＣＣＤアレイに対して対応コンフォーカススリット 光で照明され、高解像が得られよう（特に垂直方向に、しかし横方向でも）。よ って、各々がそれぞれのイメージ平面を照射する固定スリットのアレイは、１方 向定速度での顕微鏡載物台の移動と組み合わされてリアルタイムのボリュームイ メージ処理コンフォーカス顕微鏡を創出するであろう。このコンフォーカススリ ットのアレイの場合と同様に、米国特許第５，２３９，１７８号に開示されたも ののごときコンフォーカススポットのアレイもまた、異なるイメージ平面ポジシ ョンにてアレンジが可能であり、さらに高い解像度を提供するために載物台スキ ャニングとの組み合せが可能であろう。 もちろん、当業者であれば、以上の説明から本発明の他の実施例と改良を容易 に着想することができるであろう。よって、本発明はそのような実施例と改良と を包含する「請求の範囲」によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】 スキャンされ、イメージはバッファで時間的にアライン される。バッファは、バッファでアラインされたイメー ジ平面でのイメージを含んだボリュームイメージを保持 する。最良フォーカスを有したイメージ平面が選択さ れ、顕微鏡のオブジェクティブは選択された平面に自動 的にポジションされる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．フォーカス機構を有した顕微鏡用のオートフォーカス方法であって、 （１）第１垂直ポジションで顕微鏡載物台上のスペシメンのデジタルイメー ジを取得するステップと、 （２）該デジタルイメージにデジタルフィルターを適用し、フィルターイメ ージを取得するステップと、 （３）該フィルターイメージに測定ファンクションを適用し、大きさ（magn itude）を取得するステップと、 （４）前記フォーカス機構を第２垂直ポジションにまで垂直方向に移動させ 、ステップ（１）から（３）を反復するステップと、 （５）前記第１垂直ポジションと第２垂直ポジションで取得されたフィルタ ーイメージの大きさを比較し、その比較に基づいて顕微鏡のフォーカスを調整す るステップと、 を含んでいることを特徴とするオートフォーカス方法。 ２．前記デジタルフィルターはイメージ鮮明化変換を実行することを特徴とす る請求項１記載の方法。 ３．前記測定ファンクションはコントラストを測定することを特徴とする請求 項１記載の方法。 ４．前記測定ファンクションはフィルターイメージインテンシティの総計を計 算するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。 ５．前記測定ファンクションは平方されたフィルターイメージインテンシティ の総計を計算するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載の方法。 ６．前記比較ステップは、その第１ポジションでの大きさがその第２ポジショ ンでの大きさよりも大きい場合に前記フォーカス機構を第１垂直ポジション方向 に移動させ、その第１ポジションでの大きさがその第２ポジションでの大きさよ りも小さい場合に該フォーカス機構を第２垂直ポジション方向に移動させて顕微 鏡のフォーカスを調整するステップを含んでいることを特徴とする請求項１記載 の方法。 ７．ボリュームイメージを発生させる装置であって、 複数のイメージデバイスであって、少なくとも１のイメージデバイスが複数 のイメージ平面のそれぞれのイメージ平面に配置され、各々のイメージ平面は相 互が３次元的に離れているイメージデバイスと、 イメージ形成装置であって、該複数のイメージデバイスにカップリングされ ており、それぞれのイメージ平面におけるイメージを表示する複数の電子イメー ジ表示を形成するイメージ形成装置と、 を含んでいることを特徴とするボリュームイメージ発生装置。 ８．前記イメージ形成装置にカップリングされており、電子イメージ表示を組 み合わせることで光学品質メトリックを決定する処理手段をさらに含んでいるこ とを特徴とする請求項７記載の装置。 ９．前記複数のイメージ装置は複数の光コンダクターを含んでおり、各光コン ダクターはそれぞれのイメージ平面に配置された第１エンドフェースと、前記イ メージ形成装置にカップリングされた第２エンドフェースとを有していることを 特徴とする請求項７記載の装置。 １０．前記複数のイメージデバイスは実質的に長形であるアレイに提供されてい ることを特徴とする請求項７記載の装置。 １１．前記イメージ形成装置は複数のチャージカップリングされたデバイス（Ｃ ＣＤ）カメラを含んでいることを特徴とする請求項７記載の装置。 １２．前記複数のイメージデバイスは複数の光コンダクターを含んでおり、各光 コンダクターは複数のイメージ平面のそれぞれのイメージ平面に配置された第１ エンドフェースと、それぞれのＣＣＤカメラにカップリングされた第２エンドフ ェースとを有していることを特徴とする請求項１１記載の装置。 １３．各前記第１エンドフェースはそれぞれの前記第２エンドフェースから離れ ていることを特徴とする請求項１２記載の装置。 １４．前記複数のイメージデバイスはフォト電気デバイスの長形アレイを含んで いることを特徴とする請求項７記載の装置。 １５．前記フォト電気デバイスの長形アレイはイメージ観察体平面に対して傾斜 しており、複数のイメージ平面の各イメージ平面はフォト電気デバイスの長形ア レイの少なくとも１のフォト電気デバイスでインターセクトされていることを特 徴とする請求項１４記載の装置。 １６．前記処理手段は、 各々がイメージの少なくとも一部の複数の電子表示を保存する複数のイメ ージバッファと、 それぞれのバッファにカップリングされており、フィルター電子表示を提 供するハイパスフィルターと、 該ハイパスフィルターにカップリングされており、光学品質メトリックを 創出するために複数のフィルター電子表示を組み合わせる手段と、 を含んでいることを特徴とする請求項８記載の装置。 １７．前記組み合わせる手段は、 フィルター電子表示の増大インテンシティ値を取得する手段と、 該増大インテンシティ値に基づいて各イメージの光学品質メトリック値を 表示する手段と、 を含んでいることを特徴とする請求項１６記載の装置。 １８．前記複数のイメージデバイスとイメージ観察体平面との間に配置された光 学ハイパスフィルターと、 前記イメージ形成装置にカップリングされており、電子レンジイメージ表 示を組み合わせることで光学品質メトリックを決定する処理手段と、 をさらに含んでいることを特徴とする請求項７記載の装置。 １９．前記処理手段は、 各々がイメージの少なくとも一部の複数のフィルター電子表示を保存する 複数のイメージバッファと、 該複数のイメージバッファにカップリングされており、光学品質メトリッ クを創出するために複数のフィルター電子イメージ表示を組み合わせる手段と、 を含んでいることを特徴とする請求項１８記載の装置。 ２０．前記光学品質メトリックはイメージ鮮明度であることを特徴とする請求項 １９記載の装置。 ２１．複数のイメージデバイスを使用したボリュームイメージ方法であって、少 なくとも１のイメージデバイスが複数のイメージ平面の１イメージ平面に提供さ れており、各イメージ平面は相互が３次元的に離れており、本ボリュームイメー ジ方法は、 前記複数のイメージデバイスをイメージ観察体平面のイメージ観察体が観 察できるように配向するステップと、 前記複数のイメージデバイスを使用して該イメージ観察体の複数のイメー ジを取得するステップであって、該複数のイメージの各イメージはそれぞれのイ メージデバイスで取得されるステップと、 該複数のイメージを複数の電子イメージ表示に変換するステップと、 該複数の電子イメージ表示を保存するステップと、 を含んでいることを特徴とするボリュームイメージ方法。 ２２．前記複数のイメージデバイスは複数の光コンダクターを含んでおり、各光 コンダクターはそれぞれのイメージ平面に配置された第１エンドフェースを有し ており、前記配向ステップは、各イメージ平面がイメージ観察体と実質的に並行 で、垂直に離れるように該第１エンドフェースを前記イメージ観察体平面に関し て設置するステップを含んでいることを特徴とする請求項２１記載の方法。 ２３．前記複数のイメージデバイスは軸方向のディメンションを有した長形アレ イに提供された複数のフォト電気デバイスを含んでおり、前記配向ステップは該 フォト電気デバイスの長形アレイを、前記軸方向ディメンションの延長が非直角 で前記イメージ観察体平面とインターセクトするように設置するステップを含ん でいることを特徴とする請求項２１記載の方法。 ２４．フォーカス機構を有した顕微鏡をオートフォーカスするオートフォーカス 装置であって、 複数のイメージデバイスであって、その少なくとも１のイメージデバイス が複数のイメージ平面の各それぞれのイメージ平面に提供されており、各イメー ジ平面は相互が３次元的に離れている複数のイメージデバイスと、 該複数のイメージデバイスにカップリングされて複数の電子イメージ表示 を形成するイメージ形成装置であって、各該電子イメージ表示は前記複数のイメ ージ平面のそれぞれの２次元でのイメージを表示しているイメージ形成装置と、 該イメージ形成装置にカップリングされており、前記電子イメージ表示に 測定ファンクションを適用することでフォーカス位置信号を発生させるプロセッ サーと、 前記フォーカス機構に、該フォーカス位置信号に対応して顕微鏡のフォー カスを調整させる手段と、 を含んでいることを特徴とするオートフォーカス装置。 ２５．前記複数のイメージデバイスは複数の光コンダクターを含んでおり、各光 コンダクターはそれぞれのイメージ平面に配置された第１エンドフェースと、前 記イメージ形成装置にカップリングされた第２エンドフェースとを有しているこ とを特徴とする請求項２４記載のオートフォーカス装置。 ２６．前記イメージ形成装置は複数のチャージカップルされたデバイス（ＣＣＤ ）カメラを含んでいることを特徴とする請求項２４記載のオートフォーカス装置 。 ２７．前記複数のイメージデバイスは複数の光コンダクターを含んでおり、各光 コンダクターは前記複数のイメージ平面のそれぞれのイメージ平面に配置された 第１エンドフェースと、それぞれのＣＣＤカメラにカップリングされた第２エン ドフェースとを有していることを特徴とする請求項２６記載のオートフォーカス 装置。 ２８．前記複数のイメージデバイスはフォト電気デバイスの長形アレイを含んで いることを特徴とする請求項２４記載のオートフォーカス装置。 ２９．前記フォト電気デバイスの長形アレイはイメージ観察体が位置するイメー ジ観察体に対して傾斜しており、前記複数のイメージ平面の各イメージ平面は前 記フォト電気デバイスの長形アレイの少なくとも１のフォト電気デバイスによっ てインターセクトされていることを特徴とする請求項２８記載のオートフォーカ ス装置。 ３０．前記プロセッサーは、 複数のイメージバッファであって、各イメージバッファはイメージの少な くとも一部の複数の電子表示を保存し、各電気表示は複数のイメージ平面のそれ ぞれのイメージ平面での該一部のイメージを表示する複数のイメージバッファと 、 イメージバッファにカップリングされており、複数のフィルター電子イメ ージ表示を提供するハイパスフィルター手段と、 該ハイパスフィルター手段とカップリングされており、フォーカスメトリ ックを創出するために複数のフィルター電子イメージ表示を組み合わせる手段と 、を含んでいることを特徴とする請求項２４記載のオートフォーカス装置。 ３１．前記複数のイメージデバイスとイメージ観察体平面との間に配置された光 フィルターをさらに含んでいることを特徴とする請求項２１記載のオートフォー カス装置。 ３２．処理手段は、 各々がイメージの少なくとも一部の複数のフィルター電子イメージ表示を 保存する複数のイメージバッファと、 該複数のイメージバッファにカップリングされており、光学品質メトリッ クを創出するために複数のフィルター電子イメージ表示を組み合わせる手段と、 を含んでいることを特徴とする請求項３１記載のオートフォーカス装置。 ３３．前記光学品質メトリックはイメージ鮮明度であることを特徴とする請求項 ３２記載のオートフォーカス装置。 ３４．前記組み合わせる手段は、 前記フィルター電子イメージ表示の増大インテンシティ値を取得する手段 と、 該増大インテンシティ値に基づいて各イメージのフォーカスメトリック値 を表示する手段と、 を含んでいることを特徴とする請求項３０記載のオートフォーカス装置。 ３５．フォーカス機構を有した顕微鏡用のオートフォーカス方法であって、 イメージ観察体平面のイメージ観察体の複数の電子イメージ表示を取得す るステップであって、各電子イメージ表示は複数のイメージ平面のそれぞれのイ メージ平面でのイメージ観察体のイメージを表示し、各イメージ平面は相互が３ 次元的に離れている電子イメージ表示取得ステップと、 前記複数の電子イメージ表示をハイパスフィルターに適用し、複数のフィ ルター電子イメージ表示を取得するステップと、 該複数のフィルター電子イメージ表示に測定ファンクションを適用し、複 数のイメージ鮮明度値を取得するステップと、 該イメージ鮮明度値をイメージ平面ポジションに関連させることで該イメ ージ鮮明度値を組み合わせるステップと、 該組み合せるステップで高イメージ鮮明度に関連されたイメージ平面ポジ ションを選択するステップと、 該選択されたイメージ平面ポジションに基づいて顕微鏡のフォーカスを調 整するステップと、 を含んでいることを特徴とするオートフォーカス方法。