JPH10506261A - ハイブリダイジング・アーム、ステム、およびループが最適化されたものを有するリボザイム、ｔＲＮＡが包埋されたリボザイム、およびそれらの組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、開裂する標的RNAにハイブリダイズすることが可能な、触媒性化合物である改良済みハンマ−ヘッド型リボザイムに関する。この改良済み化合物は、ステム(X)m*(X)m'、ループ(X)b、およびハイブリダイゼーションアームのそれぞれが最適化したものを有する。本発明はまた、RNA開裂を促進する組成物であって、保存された触媒領域を決定するヌクレオチド、およびあらかじめ決めておいた標的配列にハイブリダイズするヌクレオチドを具備した第一の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物、並びに前記のあらかじめ決めておいた標的配列を含まず、前記の第一のオリゴヌクレオチド化合物の少なくとも一部に相補的である、第二の非天然型の合成オリゴヌクレオチドを具備した上記組成物に関する。本発明はまた、tRNAに包埋されている非天然型の合成オリゴヌクレオチド化合物に関する。本発明のリボザイムおよび組成物はin vivoまたはin vitroで使用することが可能である。これらは診断用または治療用の薬剤として使用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 ハイブリダイジング・ア−ム、ステム、およびル−プが最適化されたものを有す るリボザイム、ｔＲＮＡが包埋されたリボザイム、およびそれらの組成物 本願は、1995年6月24日に出願のU.S．シリアル番号08/265,484の一部継続出願 であり、その内容を本願で参照することにより本願に組み込む。本願全体を通じ て、種々の文献は括弧中の著者名と発行年とで引用する。参考文献の詳しい内容 は、請求項のすぐ後にアルファベット順で記載してある。これらの参考文献を、 本願で参照することにより本願に組み込む。 本研究の一部は、NSF・コ−ポレ−ティブ・アグリ−メントBIR-8920216により 補助金を受けている。よって、本発明に関して、アメリカ合衆国政府はある一定 の権利を有する。 ［発明の背景］ RNA分子が酵素として機能するという発見は、生物系の化学に関する理解を大 きく変えた。現在、RNA分子はそれ自身および他の分子の化学的変換を触媒する ことが立証されている（Castanotto，1992）。リボザイムという用語が、これら のRNA分子に与えられている。現在のところ、リボザイムは多くの器官での生化 学的な機能において重要な役割を有していることが明らかになっている。 数種類のリボザイムが生物体において同定されている。触媒性の代謝回転を示 した最初のリボザイムは、リボヌクレ−ゼＰのRNAである。リボヌクレ−ゼＰ（R NaseP）は、前駆体tRNAs(pre-tRNAs)を5’末端で開裂させて、tRNAの成熟型5’ 末端を与える。大腸菌（E.coli）および枯草菌（Bacillus subtilis）においてR Nase Pホロ酵素はそれぞれ、分子量が約14,000（119アミノ酸）の塩基性タンパ ク質サブユニット一つと、377または401ヌクレオチドの一本鎖RNA分子を一つ具 備している（Baer,1990; Altman，1987; Waugh，1989; Pace，1990; Nichols，1 988）。代謝回転が示された二番目のリボザイムは、テトラヒメナのL-19介在性 配列（IVS）である。テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila） の核内rRNA前駆体の413ヌク レオチドの介在性配列（IVS）は開裂して、タンパク質の全く存在しない条件下 で二つのエクソンを連結させることが可能である（Kruger，1982; Cech，1981） 。テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）にユニ−クな自己 スプライシング反応は、グアノシン、または5’グアノシンヌクレオチド補助因 子を要求する。ハンマ−ヘッド型自己開裂反応は、三番目のリボザイムのクラス を構成する。多くの植物病原性RNA（Symons，1989; Symons，1990; Bruening，1 989; Bruening，1990）、一種類の動物ウイルスRNA（Taylor，1990）、並びにイ モリの衛生IIのDNA（Epstein，1987; Epstein，1989）、およびアカパンカビのD NAプラスミド(Saville，1990)の転写産物は、部位特異的自己開裂反応を試験管 内で行い、2',3'-サイクリックリン酸および5’−ヒドロキシル基を有する開裂 断片を産生する。この自己開裂反応は、pre-tRNAのRNase PによるRNA開裂とは違 って、非加水分解性であり、ヌクレオチド間結合は、Mg++またはその他の二価の カチオンの存在下でホスホリル転移反応を受ける。金属カチオンはRNAの触媒作 用にとって必須である（Pyle，1993）。現在までに判明しているその他の反応か らは、リボザイムが、DNAの開裂（Robertson，1990; Hersclag，1990）、RNA鎖 の複製(Green，1992)、2'3'-サイクリックリン酸リングの開冠（Pan，1992）を 触媒すると同様に、リン酸モノエステル（Zaug，1986）および炭素中心（carbon center）（Noller，1992; Piccirilli，1992）との反応も触媒する。最後に、 新しい種類の触媒反応性を有するリボザイムが、試験管内での選択および進化を 行わせる技術により、現在創製されつつある（Joyce，1992）。 指定したRNA配列を特異的に標的にして開裂する能力は、ハンマ−ヘッド型の リボザイムを遺伝子治療作用薬または薬剤として応用することの可能性において 、多大な興味を生じさせている。疾患の治療、または開裂させるための特異的RN A若しくはDNA鎖（基質）へのタ−ゲティングを成功させるための一つの構成要素 は、リボザイム/基質複合体の最適化である。最適化は、標的のRNA若しくはDNA 上での化学活性が最大限になるまでリボザイムを試験管内で修飾して行うことが できる。タ−ゲティングと多くの指定したRNA配列の開裂を試験管内で行うこと に関してはうまくいくようになったが（Saxena and Ackerman，1990; Lamb and Hays，1991; Evans，et al.，1992; Mazzolini et al.，1992; Homann et al.， 1993）、この成功を全細胞中でのリボザイム作用へ置き換えることには制限があ る。これは植物系に関する場 合には特にそうであり、リボザイム誘導性の開裂の例がわずかに１例だけ報告さ れているに過ぎない（Steinecke et al.，1992）。故に試験管内での成功がどの 程度生体内での成功と相関しているのかは全く明らかではない。以前の報告では 、生体内での標的配列の蓄積を減少させるには、高レベルのリボザイム発現が要 求されることが証明されている(Cameron and Jennings，1989; Cotten and Birn steil，1989; Sioud and Drilca，1991; L'Huillier et al.，1992; Perriman e t al.，1993)。更に最近の論文では標的およびリボザイムが同じ細胞区画内に隔 離される必要性が示唆されている（Sullenger and Cech，1993）。いくつかの報 告の結果から、リボザイム分子は、明らかに生物系内の指定した標的RNAの特異 的開裂を誘導するが、生体内での律速段階は、活性基質/リボザイムのハイブリ ッド形成にあることが示唆されている。このように活性基質/リボザイムのハイ ブリッド形成を最適化するアプロ−チには、安定なRNA中にリボザイムを包埋す ることでリボザイム転写産物を安定化する試みが含まれる(Cameron and Jenning s，1989; Sioud et al.，1992; Cotten and Birnsteil，1989)。リボザイム転写 産物の半減期を長くすることで、標的RNAとの所望のハイブリッドの形成が最適 化される。 コッテン（Cotten）とバ−ンステイル（Birnsteil）のアプロ−チでは、tRNA モチ−フを使用してハンマ−ヘッド型リボザイムをアフリカツメガエルの卵母細 胞へ導入し、細胞質の標的RNAの蓄積を減少させた。包埋したリボザイムは、類 縁体の非包埋型リボザイムよりも効果的であった。 発明の要約 本発明は、開裂する標的RNAにハイブリダイズすることが可能な、触媒性化合 物である改良済みハンマ−ヘッド型リボザイムに関する。この改良済み化合物は 、ステム(X)m*(X)m'、ル−プ(X)b、およびハイブリダイゼ−ションア−ムのそれ ぞれが最適化したものを有する。本発明はまた、RNA開裂を促進する組成物であ って、保存された触媒領域を決定するヌクレオチド、およびあらかじめ決めてお いた標的配列にハイブリダイズするヌクレオチドを具備した第一の非天然型合成 オリゴヌクレオチド化合物、並びに前記のあらかじめ決めておいた標的配列を含 まず、前記の第一のオリゴヌクレオチド化合物の少なくとも一部に相補的である 、第二の非天然型の合成オリゴヌクレオチドを具備した上記組成物に関する。本 発明はまた、tRNAに包埋 されている非天然型の合成オリゴヌクレオチド化合物に関する。 本発明のリボザイムおよび組成物はin vivoまたはin vitroで使用することが 可能である。これらは診断用または治療用の薬剤として使用することが可能であ る。 ［図の簡単な説明］ 図１． この図は、開裂割合を時間（分）の関数でプロットして、ステムの長 さの変異体であるヘリックスII（式１および２の(X)mおよび(X)m'）の開裂効率 を示している。プロットしたデ−タは表１にまとめてあり、表１中のそれぞれの 記入事項の番号はプロット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図２． この図は、開裂割合を時間（分）の関数でプロットして、保存されたG CペアのヘリックスII（式１および２の(X)mおよび(X)m'）の開裂効率を示してい る。プロットしたデ−タは表２にまとめてあり、表２中のそれぞれの記入事項の 番号はプロット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図３A-３C． この図は、開裂割合を時間（分）の関数でプロットして、ル−プ の変異体であるヘリックスII（式１および２の(X)mおよび(X)m'）の開裂効率を 示している。プロットしたデ−タは表３にまとめてあり、表３中のそれぞれの記 入事項の番号はプロット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図４Aおよび4B. 親リボザイムRz1の開裂反応（図４A）。リボザイム/基質複 合体の構造をX線結晶学により決定し（Pley et al.，1994A）、ハ−テル（Herte l et al.，1992）らによる方法で番号付けし、ウイッシュボ−ン（wishbone）で 表した。太字のヌクレオチドは、天然型のハンマ−ヘッド自己開裂性領域の、保 存度の高い触媒性コアに一致する（Bruening，1989）。点線は非標準的な塩基対 を示している（図４B）。親リボザイムの開裂反応の経時変化を、10組の実験の 標準偏差に対応したエラ−バ−とともに表してある。 図５ステムII中に変異を有するリボザイムの比反応速度k^rel。Rz1は親配列で あり、Rz2-18はル−プのみに配列の変異を有する。フライヤ−（Frier et al.,1 986）の自由エネルギ−の計算は（kcal/mol、37℃、1M NaCl）、ワトソン・クリ ックの塩基対配列のみのものである。点線は、非標準的な塩基対を示している。 図６． この図は、開裂割合を時間（分）の関数でプロットして、配列変異体 であるヘリックスI（式１および２の(X)n'；または式３の-Ｎ-Ｎ(X)n'）の開裂 効率を 示している。プロットしたデ−タは表６にまとめてあり、表６中のそれぞれの記 入事項の番号はプロット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図７． この図は、開裂割合を時間（分）の関数でプロットして、配列変異体 であるヘリックスIII（式１および２の(X)n）の開裂効率を示している。プロッ トしたデ−タは表７にまとめてあり、表７中のそれぞれの記入事項の番号はプロ ット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図８． リボザイムに相補的なオリゴヌクレオチドが、開裂効果に与える影響 を、対照に対する10分間での開裂の割合をプロットして表したものである。プロ ットしたデ−タは表８にまとめてあり、表８中のそれぞれの記入事項の番号はプ ロット中のそれぞれのグラフ番号と一致している。 図９A-９D．非埋包型、及びtRNA埋包型リボザイム、並びにアンチセンスを試 験管内及び生体内で分析するためのプラスミド；CAT及びCM2、変異体CAT標的の 構築（９a）。SspI AccI断片としてpGEM3zf-(pGEMtRNA)中にサブクロ−ニングさ れた、266塩基対のチロシンtRNA配列。編みかけ部分は10塩基対のBamHI.SmaI.Ec oRiポリリンカ−を112位で挿入した部位を示す（pGEMtRNApoly）。これはアンチ コドンル−プの5’末端にある。クロ−バ−リ−フ型モチ−フは、ポリリンカ− の挿入部位と同様、内在性のイントロンである13塩基のル−プ突出部（loop out ）を示している（９b）。CAT遺伝子にアニ−ルして464位で開裂させるように設 計された、ハンマ−ヘッド型リボザイムRz1の配列（９c）。815塩基対のCAT配列 。矢印で示した部位は464位で、Rz12の標的のGUCトリプレットである （９d） 。リボザイム／アンチセンス、及び標的配列の生体内発現に使用したpACMVベク タ。RNAポリメラ−ゼIIコ−トタンパク質プロモ−タは、ポリリンカ領域の5'側 に、終結シグナル及びポリアデニレ−ションシグナルは3'側に示されている。全 てのリボザイム/アンチセンス及び標的配列をこの領域にサブクロ−ニングする 。670塩基対の太線部にはウイルス性の複製起点が含まれる。ClaI部位へ挿入さ れた、pUC19由来の細菌性プラスミドには、細菌性複製起点であるColEI及びクロ ラムフェニコ−ル耐性遺伝子が含まれる。 図１０A-１０B．直鎖状及びtRNA包埋型リボザイムによるin vitro開裂。（１ ０a）．30℃1時間の、in vitro開裂反応のオ−トラジオグラフィ−。リボザイム ではなく、CAT基質がこの反応中で放射性の標識がされた。1-3のレ−ンは次のと おりである： 1，単独でインキュベ−ションしたCAT mRNA；2，CAT RNA + Rz12; 3，CAT RNA + tRNARz12。RNAの種は以下とおりである：Sub，CAT基質RNA; 5’P，標的部位の5 'の開裂産物；3'P，開裂部位の3'の開裂産物。（10b）3つの独立した開裂反応に おけるCAT転写物の平均開裂率（％）を示す、in vitro開裂反応の棒グラフ。Y 軸は開裂率（％）で誤差のバ−は標準偏差の二倍を示す。 図１１A-１１B．野生型遺伝子（CAT）と変異型遺伝子（CATMUT2）の、ニコチ アナ・タバカム（Nicotiana tabacam）プロトプラスト中での相対的発現：pACMV tRNA存在下（対照）、pACMVAs24またはpACMVtRNAAs24の存在下（アンチセンス） 、pACMVRz12またはpACMVtRNARz12 の存在下（リボザイム）。図は、７つの別個 のプロトプラストの単離物での結果を示す。それぞれのバ−は、アンチセンスま たはリボザイムをtRNA包埋型で付加したときのCATまたは変異型CATの発現に対す る平均値を表す。対照のCAT、またはCATMUT2活性を100％に規準化した。それぞ れのプロトプラスト単離と、その後のエレクトロポレ−ション操作には、それぞ れの構築物の組み合わせの試料の、少なくとも３つで一組のものを用いて行った ：すなわち、CAT(またはCATMUT2)+対照、CAT(またはCATMUT2)+アンチセンス（tR NA包埋型、または非包埋型）、及びCAT(CATMUT2)+リボザイム（tRNA包埋型、ま たは非包埋型）。 図１２A-１２B．pACMVtRNA、またはpACMVtRNARz12の存在下でのCAT、またはCA TMUT2の相対的活性を示す、薄膜クロマトグラフィ−プレ−トのオ−トラジオグ ラフィ−。CAT+ tRNA、またはCM2+ tRNAに関して、３つの独立したエレクトロポ レ−ションが示されている（ラベル2-4）。CAT+tRNARz12またはCM2+tRNARz12に 関して、４つの独立したエレクトロポレ−ションが示されている（ラベル5-8） 。対照のレ−ン（１）はモック・イノキュレ−ションしたプロトプラストである 。 図１３A-13B．in vivoでのCATmRNAのレベルの分析。エレクトロポレ−ション したニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）のプロトプラストから単離し た全RNA由来のRT-PCRのサザンブロット。二つのブロット（図１１a及び11ｂ）は 、全長のCATmRNA、及びGUC開裂部位の3'側のCATmRNAの蓄積を示している。CAT及 びCM2全長CATmRNAのレ−ン：4+tRNARz12-3'CATmRNA、5，+tRNAAs24- 全長CATmRN A、６ +tRNAAs24-3’CATmRNA、7+Rz12-全長CATmRNA、8-Rz12-3’CATmRNA、9+As24-全長 CATmRNA、10+As24-3'CATmRNA。ブロットは全長CAT配列のssDNAでプロ−ブした。 更に、表１０も参照されたし：3'産物の、全長CAT産物に対する蓄積の割合。表 １０は、それぞれの構築物に対する上記産物の比率を示す。この比率は二つの独 立した実験からまとめたデ−タである。 図１４A-１４B．レ−ン１：20ngのpACMVCATまたはpACMVCM2(MboIで制限)。レ −ン２：pACMVCATまたはpACMVCM2(DpnIで制限)。レ−ン３：lugの形質移入DNA（ 時間0）。pACMVCAT/CM2導入したもののみ（DpnIで制限）。レ−ン4：lugの形質 移入DNA（時間0）、pACMVCAT/CM2導入したもののみ（MboIで制限）。レ−ン5：l ugの形質移入DNA（時間３日）、pACMVCAT/CM2導入したもののみ（DpnIで制限） 。レ−ン6：lugの形質移入DNA（時間３日）、pACMVCAT/CM2導入したもののみ（M boIで制限）。レ−ン7：lugの形質移入DNA（時間0）、pACMVCAT/CM2+pACMVtRNAR z12（DpnIで制限）。レ−ン8：lugの形質移入DNA（時間0）、pACMVCAT/CM2+pACM VtRNARz12（MboIで制限）。レ−ン9：lugの形質移入DNA（時間３日）、pACMVCAT /CM2+pACMVtRNARz12（DpnIで制限）。レ−ン10：lugの形質移入DNA（時間３日） 、pACMVCAT/CM2+pACMVtRNARz12（MboIで制限）。(14a)CAT:時間が0または３日の 細胞からのDNAでDpnIまたはMboIの何れかで処理したもののサザンブロット。複 製したDNAはいかなるものでもMboIで切断される。バンド２はCAT/CM2挿入部を表 し、MboI消化で維持されていて、DNAが複製したことを表す。バンド２は、レ− ン6及び10に等量で存在し、それぞれpACMVCATの導入物のみと、pACMVCAT/CM2+pA CMVtRNARz12を表す。バンド１は導入したDNAのみにあり、MboI 消化により消失 している。（１４ｂ）CATMUT2：時間が0または３日の細胞からのDNAでDpnIまた はMboIの何れかで処理したもののサザンブロット。複製したDNAはいかなるもの でもMboIで切断される。バンド２はCAT/CM2挿入部を表し、MboI消化で維持され ていて、DNAが複製したことを表す。バンド２は、レ−ン6及び10に等量で存在し 、それぞれpACMVCATの導入物のみと、pACMVCAT/CM2+pACMVtRNARz12を表す。バン ド１は導入したDNAのみにあり、MboI 消化により消失している。このブロットは 、レ−ン１のDNAがMboI消化に対して完全に抵抗性であることを示していない。 ［発明の詳細な説明］ 数個の態様において、標的RNA分子を開裂することが可能な化合物を提供して いる。これらの化合物は、以下の式１、２、３及び４で表してある。一般的には 、これらの化合物は、リボザイムとして知られている。より特異的には、式１、 ２、３の化合物がリボザイムとして知られていて、式４の化合物がtRNA包埋型リ ボザイムとして知られている。 式１、２、及び３の化合物において：記号Xはヌクレオチドを表し、該ヌクレ オチドは、同じでも異なっでいてもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換 または修飾されていてもよい。式１、２、及び３中の実線は、その両側に位置す るヌクレオチド間に共有結合を提供する化学的連結を表している。整数aは、0か 1であって、0の時には(X)aの5'に位置するAが(X)_aの3'に位置するXに結合するよ うな、(X)_a中のヌクレオチド数を定義する。 上記の式１、及び２の化合物において：(X)_n及び(X)_n'は、開裂する標的RNAの 配列とハイブリダイズすることが可能な、予め決めておいた配列を有するオリゴ ヌクレオチドを表している。該ヌクレオチド(X)_n及び(X)_n'は、天然には、それ ぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合しては存在せず、上記標的R NA配列は式１にも、式２にも存在しない。記号n及びn'は、n+n'の合計が14より も大きくなるような、オリゴヌクレオチド(X)_n及び(X)_n'中のヌクレオチド数を 定義する整数を表している。 式１及び３の化合物において：オリゴヌクレオチド(X)_bは存在していても存在 していなくてもよく、bは、(X)_bが存在するときには４以上の整数を表す。式２ 及び３の化合物において：記号*は、その両側に位置するヌクレオチド間での塩 基対を表している。上記の式１の化合物において：オリゴヌクレオチド(X)_m及び (X)_m'はそれぞれ、(a)3'-CUG-5'及び5'-GAC-3'、(b)3'-GCG-5'及び5'-AGC-3'、( c)3'-CGG-5'及び5'-GCC-3'、(d)3'-CGC-5'及び5'-GCG-5'、の何れかの配列を有 するオリゴヌクレオチドを表し、それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチ ド間での塩基対を表している。 上記の式２の化合物において：整数m及びm'は、２以上８以下の整数を表して いる。オリゴヌクレオチド(X)_bは、以下の配列のうち何れか一つを有するヌクレ オチドを表している：3'-AGGUU-5'、3'-AGGG-5'、3'-AAGGC-5'、または3'-GGUG- 5'。 上記の式３の化合物において：記号(X)_nは、開裂する標的RNAの配列とハイブ リダイズすることが可能な、予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチド を表している。オリゴヌクレオチド(X)_n及び(X)_n'は、天然には、それぞれが配 列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合しては存在せず、上記標的RNA配列は 式３には存在しない。セグメント-N-N-は、RNA標的配列に対して予め決めておい た配列を有するヌクレオチドである。記号n及びn'は、オリゴヌクレオチド(X)_n 及び(X)_n'中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、n+n'の合計は12よりも大 きい。整数m及びm'は、４以上である。 上記の式４の化合物において：記号Xはヌクレオチドを表し、同じでも異なっ ていてもよい。オリゴヌクレオチド(X)_t及び(X)_t'は、tRNA分子の一部から由来 した配列を有する。整数であるtおよびt'は、t+t'の合計が５０よりも大きいと いう条件の下、上記オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を定義する。記号Y は、保存された触媒性領域を定義するヌクレオチド配列と、開裂させる予め決め ておいた標的配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列とを具備 した、非天然型の合成オリゴヌクレオチド化合物を表す。 別の態様においては、上記の式４のオリゴヌクレオチド(X)_t、および(X)_t'は 、ニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana rustica）のチロシンtRNA分子由来であ る。 複数の態様においては、式２および３のmとm'のそれぞれは４である。 複数の態様においては、上記の式１または３のヌクレオチド(X)_bは存在してい る。複数の態様においては、上記の式１または３のヌクレオチド(X)_bが存在する ときには、(X)_bの整数bは４である。複数の態様においては、上記の式１または ３のヌクレオチド(X)_bは、配列5'-G-U-G-A-3'を有する。複数の態様において、 上記の式１、２、または３のヌクレオチド3'-(X)_n-は、3'-(X)_n-1-A-である。複 数の態様においては、上記の式１、２、または３のヌクレオチド3'-(X)_n-は、3' -(X)_n-2-C-A-である。複数の態様において、ヌクレオチド(X)_aは存在しない。オ リゴヌクレオチド(X)_n、(X)_n'、N-N-(X)_n'（式１、２、３、または４中の）は、 標的RNA配列のそれぞれの部分にハイブリダイズするア−ムまたはフランキング 配列を表す。該ア−ムは、標的RNAの全長またはその一部分にそってハイブリダ イズすることが可能である。式1-3の配列3'-・・・AAG-(X)_m-(X)_b-(X)_m'-(X)_a-A GXAGUC-・・・5'は、触媒性領域を表す。該触媒領域はハイブリダイズ領域の一 部を形成してもよい。該触媒性領域は、触媒活性を阻害しない、１以上の付加的 ヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような付加は、過度な実験を行うことな くリボザイム活性に関して調べることができる。 別の態様においては、式１、２、または３の何れかの化合物が受容担体に結合 し たものを具備した組成物が提供されている。複数の態様においては、転写される と式１、２、３、または４の化合物を与えるヌクレオチド配列を有するオリゴヌ クレオチド・トランスファ−・ベクタが提供されている。 複数の態様においては、上記したように、細菌プラスミド、バクテリオファ− ジDNA、コスミド、または真核性ウイルスDNAであるトランスファ−・ベクタが提 供されている。一つの態様においては、細菌プラスミド、バクテリオファ−ジDN A、コスミド、または植物ウイルスDNAであるトランスファ−・ベクタが提供され ている。一つの態様においては、上記したように、RNAポリメラ−ゼII、またはR NAポリメラ−ゼIII用のプロモ−タ配列を含んだトランスファ−・ベクタが提供 されている。複数の態様においては、上記したように、トランスファ−・ベクタ で形質転換された宿主細胞が提供されている。複数の態様においては、上記した ように、原核宿主細胞または真核宿主細胞である宿主細胞が提供されている。複 数の態様においては、原核宿主細胞は上記したように、大腸菌（E.coli）宿主細 胞である。複数の態様においては、真核宿主細胞は上記したように、サルのCOS 宿主細胞、チャイニ−ズ・ハムスタ−・卵巣宿主細胞、哺乳類宿主細胞、または 植物宿主細胞である。一つの態様においては、真核宿主細胞は上記したように、 サルのCOS宿主細胞、チャイニ−ズ・ハムスタ−・卵巣宿主細胞、哺乳類宿主細 胞、植物宿主細胞、または植物プロトプラスト宿主細胞である。 一つの態様においては、上記したように、転写されると式４の化合物を与える ヌクレオチド化合物を含んだ、パッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トラ ンスファ−・ベクタが提供されている。一つの態様においては、上記したように 、植物DNAウイルス、ジェミニウイルス、または感染性ファ−ジ粒子である、パ ッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トランスファ−・ベクタが提供されて いる。一つの態様においては、上記したように、RNAポリメラ−ゼII、またはRNA ポリメラ−ゼIII用のプロモ−タ配列を含んだ、パッケ−ジングされたオリゴヌ クレオチド・トランスファ−・ベクタが提供されている。 保存された触媒性領域を定義するヌクレオチド配列、及び開裂する予め決めて お いた標的配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を具備した、 非天然型の合成第一オリゴヌクレオチド化合物、並びに前記の予め決めておいた 標的配列を含まず、また上記の化合物の少なくとも一部に相補的である、非天然 型の合成第二オリゴヌクレオチド化合物を具備した上記組成物が、本発明の別の 側面において提供される。別の態様においては、上に検討したように、上記組成 物は受容担体に結合している。更に、上記の非天然型の合成第二オリゴヌクレオ チドは上に検討したように、表８に挙げた配列を含んでいてもよいが、これらに は限定されない。更に、上記の非天然型の合成第二オリゴヌクレオチドは、（本 発明の）リボザイムの開裂速度も促進する溶媒で置換されていてもよく、また表 ８に挙げたようないのうち一つを含んでいてもよいが、これには限定されない。 本発明の一つの側面は、上に検討したように、該オリゴヌクレオチドが、オリ ゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドであって、その糖、 塩基、またはホスホジエステル結合を置換または修飾することが可能な組成物を 提供している。よって、オリゴヌクレオチドは、糖、塩基、モノリン酸群、また はホスホジエステル結合のレベルで誘導、または修飾することができる。該オリ ゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドであることが好ましいが、エンドヌ クレア−ゼ活性が欠失しているならば、ヌクレオチド中の置換または修飾は可能 である。このような誘導体、または修飾物は以下に記載されている。 複数の態様においては、該組成物中の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物 （a）、および式４の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物（b）は以下の構造 を有する。 ここで、それぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異な っもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩が置換または修飾されたものでもよく 、それぞれのA、C、U、Gは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されているリボヌクレオチドを表し、3'-AAG ・・・ AGUCX-5'は保存されている触媒性領域を定義し、(X)_nA及び(X)_n'は、開裂する標 的RNAの配列とハイブリダイズすることが可能で、それぞれが配列3'-A-A-G-5'及 び5'-C-U-G-A3'に共有結合した状態では天然に存在しない、予め決めておいた配 列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列が該化合物中には存在 せず、それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、そ れぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する化学 的連結を表し、aは、0か1であって、0の時には(X)_aの5'に位置するAが(X)_aの3' に位置するXに結合するという条件下で、ヌクレオチドの数を定義する整数を表 し、m及びm'のそれぞれは１以上の整数を表し、(X)_bはオリゴヌクレオチドを表 し、bは４以上の整数を表している。 複数の態様においては、該組成物中の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物 （a）、および式４の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物（b）は以下の構造 を有する。 ここで、それぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異な っでもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されていてもよく 、それぞれのA、C、U、Gは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されているリボヌクレオチドを表し、3'-AAG ・・・AGUCX-5'は保存されている触媒性領域を定義し、(X)_nA及び(X)_n'は、開裂 するRNA標的配列とハイブリダイズすることが可能で、それぞれが配列3'-A-A-G- 5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合した状態では天然に存在しない、予め決めておい た配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記標的RNA配列が該化合物中には 存在せず、それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を 提供する化学的連結を表し、mは２から２０の間の整数を表し、ヌクレオチド(X)_m の何れもが、該化合物中のその他のヌクレオチドの何れともワトソン・クリッ ク塩基対を形成しない。 複数の態様においては、該組成物中の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物 （a）、および式４の非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物（b）は以下の構造 を有する。 ここでそれぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異なっ ていてもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されていてもよ く、それぞれのA、C、U、Gは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていな いか、修飾されているか、または置換されているリボヌクレオチドを表し、3'(X )_P4・・・(X)_P1-5'は保存された触媒性領域を定義し、(X)_P4及び(X)_P3はそれぞ れ、開裂するRNA標的配列にハイブリダイズすることができる、予め決めておい たオリゴヌクレオチドを表し、それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオ チド間に共有結合を提供する化学的連結を表し、F3は、３以上であるという条件 のもと、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、F4は 、３から５までであるという条件のもと、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチ ド数を定義する整数を表し、(X)_P1及び(X)_P4はそれぞれ、(X)_P4が(X)_P1の3から6 塩基と塩基対を形成するような予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチ ドを表し、P1は、3から6まででP1とP4の合計が9になるという条件のもとで、該 オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、(X)_P2及び(X)_P3 のそれぞれは、(X)_P2が(X)_P3の少なくとも３塩基と塩基対を形成するように予め 決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、それぞれの*はその両側 に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、それぞれの実線は、その両側に位 置するヌクレオチド間に共有結合を提供する化学的連結を表し、それぞれの点線 は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する化学的連結、また はそのような化学的連結がないことをそれぞれが独立して表し、(X)L2は、(X)L2 が存在するときにはL2は３以上であるという条件のもと、存在するか、または存 在しないオリゴヌクレオチドを表す。 式１、２、３、１a、および1bにおいて整数n、’およびn'は、それぞれ(X)_n、 (X)_n'のヌクレオチド数を定義し、5から200までの範囲にあり、好ましくは6から 20の範囲にある。式１、２、３、および１aにおいて、m、およびm'はそれぞれ(X )_m、(X)_m'のヌクレオチド数を定義する整数であり、4から20までの範囲にあり、 好ましくは4から5の範囲にある。式１、２、３、および１aにおいて、(X)_bのヌ クレオチド数を定義する整数bは、1から8までの範囲にあるが、好ましくは1から 4までの範囲にある。式１bでは、(X)_m中のヌクレオチド数を定義する整数mは、2 から30までの範囲にあり、好ましくは4から10までの範囲にある。式１cにおいて 、(X)_P1中のヌクレオチド数を定義する整数P１は、3から10までの範囲にあるが 、好ましくは3から6までの範囲にある。式１cにおいて、(X)_P2、および(X)_P1中 のヌクレオチド数を定義する整数P2およびP3は、それぞれ3から20までの範囲に あり、好ましくは3から10までの範囲にある。式１cにおいて(X)_P4中のヌクレオ チド数を定義する整数P4は、3から10までの範囲にあるが、好ましくは3から6ま での範囲にある。式１cにおいて、(X)L2中のヌクレオチド数を定義する整数L2は 、3から20までの範囲にあるが、好ましくは3から10までの範囲にある。式1cにお いて、(X)F3中のヌクレオチド数を定義する整数F3は、3から20までの範囲にある が、好ましくは3から10までの範囲にある。式１ｃにおいて、(X)F4中のヌクレオ チド数を定義する整数Hは、3から20までの範囲にあるが、好ましくは3から5まで の範囲にある。更に、式１、２、３、または１aの(X)_m、および(X)_m'のそれぞれ は、表１、２、および４に挙げられた配列の一つを有するオリゴヌクレオチドで あってもよいが、これには限定されない。更に、式１、２、３、または１aのオ リゴヌクレオチド(X)_bは、表３に挙げられた配列の一つを含んでいてもよいが、 これには限定されない。更に、式１、２、３、１a、または１bの(X)_n、および(X )_n'のそれぞれは、表６および７に挙げられた配列の一つを含んでいてもよいが 、これには限定されず、表中の(X)n、および(X)n'は、それぞれヘリックスIII、 およびヘリックスIである。 式１、２、３、または１a で表せられている配列(X)_m-(X)_b-(X)_m'は長さが短 くてもよく、また(X)_mと(X)_m'との間の塩基対が欠失していてもよい。便宜上、 このタイプのリボザイムをミニザイム（minizyme）と呼ぶ。式１から４の配列(X )m-(X)b-(X)m'は、 表５に挙げられてたミニザイム変異体配列の一つを含んでいてもよいが、これに は限定されない。 リボザイムのエンドヌクレア−ゼ活性は、リボザイムとその基質とをインキュ ベ−ションして、次いで基質の開裂が起こるかどうかを調べることで、すぐに、 簡単に、また定型的に試験することができる。例えば標的mRNAの開裂は、トリヌ クレオチド配列、XUX'の後で起こるが、ここでXおよびX'はいかなるリボヌクレ オチドをも表し、同じものであっても異なるものであってもよく、またUはウリ ジン塩基を有するリボヌクレオチドを表す。好ましい開裂部XUX'には、GUC，GUU ，GUA，およびUUCが含まれる。例としては、適切な反応条件は、約4℃から約60 ℃の温度（好ましくは約20℃から約55℃）、約7.0から9.0のpH、および約1から 約100mMの塩（例えばMg²⁺）（好ましくは1から20mM）である。式１‐３（4ヌク レオチドのような）の(X)_nおよび(X)_n'のそれぞれの群中の少数のヌクレオチド を含むリボザイムは、リボザイム配列中のヌクレオチド配列、(X)_nおよび(X)_n' と基質の相補的ヌクレオチド配列の二重鎖化を促進するために、一般に約20℃か ら約25℃のようなより低い温度でインキュベ−ションされる。リボザイムは、一 般的に基質に対して等量モルか、またはそれよりも過剰である。しかしながら、 リボザイムは酵素として作用することが可能であるので、消費することなく基質 を開裂し、リボザイムと基質との比は重要ではない。 GUCのような適切な開裂部位を有する標的RNAは、（式１、２、３、若しくは４ の）リボザイム、または（上記の）組成物とともにインキュベーションさせても よいが、ここで上記組成物を構成するものの一つが、リボザイム（式１、２、３ 、４、１a、１b、または１cの化合物であってもよい）であり、該リボザイムは その触媒性領域中に１以上の修飾を含んでいてもよい。式１-２のヌクレオチド 配列(X)_nおよび(X)_n'は、標的RNA中の開裂部位のフランキングヌクレオチド配列 に対して相補的（すなわち塩基対を形成することが可能）であるように選択され る。式３のヌクレオチド配列(X)nは、標的RNA中の開裂部位のフランキングヌク レオチド配列に対して相補的（すなわち塩基対を形成することが可能）であるよ うに選択されるが、一方、式３の-N-N-(X)_n'は、標的RNA中の開裂部位のフラン キングヌクレオチド配列の一部に対して相補的（すなわち塩基対を形成すること が可能）であるように選択される。リ ボザイム、またはリボザイム組成物を基質とインキュベーションすると、リボザ イムと基質との間の相補的塩基対の形成により酵素/基質複合体が形成される。 式1-3のヌクレオチド配列(X)_n及び(X)_n'、と基質中の開裂部位のフランキングヌ クレオチド配列は、塩基対形成により二本鎖を形成することが可能であり、この 塩基対形成は当該技術分野でよく知られている（例えばSambrook，1989を参照） 。相補的ヌクレオチド間での二本鎖形成を、ハイブリダイゼ−ションと呼んでも よい（Sambrook，1989）。リボザイムと基質間でのハイブリダイゼ−ション、ま たは二本鎖形成は、例えば放射性標識のようなもので、構成物の一つまたは両方 を標識し、次いで反応混合液を非変性条件下でポリアクリルアミドゲルにかける ことにより、すぐに調べることができる。リボザイムとインキュベーションして 標的が開裂するならば、それは活性であり、本発明の範囲に含まれる。よって、 ヌクレオチド誘導体を含むリボザイムに関して、定型的な方法でエンドヌクレア −ゼ活性の試験を行うこができる。 当業者らはすぐに評価するであろうが、標的RNAの開裂は当該技術分野で広く 知られた種々の方法により、すぐに調べることができる（例えばSambrook，1989 を参照）。例えば開裂は、（基質が放射性標識された）反応産物をアクリルアミ ド、アガロ−ス、またはその他のゲル系にながして、次いでゲルをオ−トラジオ グラフィ−、またはその他の分析技術にかけて開裂産物を検出することにより調 べることができる（Sambrook，1989）。 式１-４のヌクレオチド配列(X)_n、および(X)_n'は、本願で記載するように、ど のような長さであってもよく、標的RNA中のヌクレオチドとの相補的なハイブリ ダイゼーション形成をさせるのに十分な配列であればよい。該ヌクレオチドは本 願に記載するように、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシ リボヌクレオチド-リボヌクレオチド・ハイブリッド、またはこれらの誘導体で あってもよい。リボザイムを分解しないようにする安定化のための最適化に、上 記のフランキング配列(式１-４の(X)_nおよび(X)_n')を選択してもよい。例えば、 デオキシリボヌクレオチドはリボヌクレア−ゼの作用に対して抵抗性である。ヌ クレオチドの修飾した塩基、糖、またはリン酸結合、例えばヌクレオチド配列の リン酸バックボ−ン中のホスホ ラミデ−ト、またはホスホロチオエ−ト結合もまた、ヌクレア−ゼの攻撃に対し て抵抗性を与える。特異的な状況において、リボヌクレオチド、デオキシリボヌ クレオチド、またはその組み合わせの形で単独で提供することにより、結合の親 和性もまた最適化することが可能である。ある状況においては、式１-４の配列( X)_n、および(X)_n'の組成を最適化して、標的RNAの開裂を最大限にする必要があ るかもしれない。標的配列にハイブリダイズし、完全にデオキシリボヌクレオチ ドからなるフランキングヌクレオチド配列を有するリボザイムの開裂活性は、あ る状況においては、活性が減少しているかもしれない。そのような状況時の最適 化には、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの混合物を、式１-４の ヌクレオチド配列(X)_n、および(X)_n'中に提供してもよい。例えば、標的RNAの開 裂部位の近傍にある、リボザイム中のヌクレオチドはリボヌクレオチドの形態で あってもよい。 配列(X)_n、若しくは(X)_n'（式１、２、３、４、１a、1b、または１c）の3'若 しくは5'のそれぞれの末端、またはリボザイムの3'若しくは5'末端は、修飾して リボザイムを分解しないように安定化してもよい。例えば末端のヌクレア−ゼ攻 撃、特に3'-5'進行性エクソヌクレア−ゼ活性を防ぐためにブロッキング・グル −プを加えてもよい。例としては、ブロッキング・グル−プは、適宜置換したア ルキル基、適宜置換したフェニル基、適宜置換したアルカノイル基（alkanoyl） から選択してもよい。適宜の置換は、C₁-C₅アルキル基、F，Cl，またはBrのよう なハロゲン、ヒドロキシル基、アミノ基、C₁-C₅アルコキシ基および同様のもの から選択してもよい。あるいはホスホチオエ−ト、メチルホスホネ−ト、若しく はホスホラミデ−トのようなヌクレオチド、またはヌクレア−ゼ攻撃に対して抵 抗性のあるヌクレオシド誘導体（例えばリボ−ス部分のアルファアノマ−）を末 端のブロッキング・グル−プとして用いることも可能である。 あるいはリボザイム分子の、その他の分子に対する感受性を変化させるグル− プを（式１、２、３、４、１a、１b、または１cの）リボザイムの3'および/また は5'末端へ挿入してもよい。例えば、リボザイムに付加した9-アミノ-アクリジ ンは、末端ブロッキング・グル−プとして作用し、リボザイム分子へのヌクレア −ゼ攻撃に抵抗性を与え、および/またはインタ−カレ−ト剤として作用し、エ ンドヌクレオリ テイック（endonucleolytic）活性を促進する。例えばスペルミン、またはスペ ルミジンのような種々のその他の化学基を、関連した方法で使用できることはす ぐに評価できるであろう。 更に、（式１、２、３、４、１a、１b、または１cの）リボザイムを、例えば 上記の式４のようにRNA分子へ包埋させることにより、分解されないように安定 化することは可能である。リボザイム分子に包埋されているこのようなRNA分子 には、tRNA，mRNA，rRNA，またはその他のRNA分子が含まれるが、これらには限 定されない。更に、リボザイムをDNA分子に挿入することも可能である。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は親和性因 子（例えばタンパク質、ステロイド、ホルモン、脂質、核酸配列、インタ−カレ −ティング分子（例えば9-アミノアクリジンのようなアクリジン誘導体）など） と共有的、または非共有的に結合して基質の結合親和性を修飾したり、標的細胞 への親和性を増加させたり、または細胞区画などにおける局在化を行わせる。例 えば本発明のリボザイムは、ハイブリダイゼ−ションと標的配列の開裂が起きる ように、リボザイムを標的核酸を近傍に近付けるのを促進する、RNA結合性ペプ チド、またはタンパク質に結合していてもよい。式１-４の配列(X)_n、および(X)_n' のそれぞれの3'および5'末端のにヌクレオチド配列を付加してもよく、または リボザイムの3'および5'末端に付加して基質への親和性を上げてもよい。このよ うな付加したヌクレオチド配列は、標的配列と三重鎖を形成することが可能であ り、分子内で折り畳まれた基質との相互作用を可能せしめる（Strobel，1991） 。あるいは、付加したヌクレオチド配列中の修飾した塩基（Principle of Nucle ic Acid Structure（Sanger，1984）中に記載の非天然型または修飾済み塩基） で、一本鎖または二本鎖DNAの何れかと結合して基質中のヌクレオチドと塩基対 を形成して三つ組み、または四つ組を作る上記の修飾塩基を使用してもよい。適 切な塩基にはイノシン、5'-メチルシトシン、5'-ブロモウラシル、および当該技 術分野で知られる（例えばPrinciple of Nucleic Acid Structure（Sanger，198 4）に記載）その他の塩基が含まれる。 当該技術分野でよく知られ、記載されているヌクレオチド合成技術（例えば、 Carruthers，1987; Foehler，1986; Sprat，1984）により本発明のリボザイム（ 式１、２、３、４、１a、１b、または１c）を産生することができる。一般的に 、このような合成方法では、活性化したヌクレオチド塩基と保護したヌクレオチ ド塩基の連続したカップリングを行い、保護されたヌクレオチド鎖を得て、その 後で保護基を適切な処置により取り除くことが必要である。または本発明にそっ たリボザイムは、該リボザイムをコ−ドしたヌクレオチド配列を、宿主細胞内、 またはT3，SP6，若しくはT7 RNAポリメラ−ゼを使った無細胞系で転写させても 産生させることが可能である。本発明のリボザイムを産生させるその他の方法は 、以下に詳しく検討されている（Sambrook，1989）。 式１、２、３、４、１a、１b、または１cで表されるヌクレオチドは、糖、塩 基、およびモノリン酸基またはホスホジエステル結合を具備している。よって、 ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド修飾物は、糖、塩基、およびモノリン酸 基またはホスホジエステル結合のレベルで作成することが可能である。式1-4の ヌクレオチドはリボヌクレオチドであることが好ましいが、エンドヌクレア−ゼ 活性が失われないという仮定の下、その他の置換や修飾も可能である。より特異 的には、触媒性領域がリボヌクレオチドを具備していることが好ましい。本発明 の一つの側面において、ヌクレオチドの糖は、ヌクレオチドがリボヌクレオチド またはデオキシリボヌクレオチドとなるように、それぞれリボ−スでもデオキシ リボ−スでもよい。更にヌクレオチドの糖部分を当該技術分野でよく知られた方 法（例えばSanger，1984; Sober，1970）により修飾してもよい。本発明は、リ ボザイムの開裂活性が失われない限り、種々の修飾をヌクレオチドの糖部分に行 うことも包含する。修飾した糖の例には、ハロゲン、アミノまたはアジド基を有 した二次（secondary）ヒドロキシル基の置換、2'-メチル化、グリコシルC1'-N 結合に対してシスで、アラビノヌクレオシドを提供するようなＯ2'-ヒドロキシ ルのようなコンホメ−ション変異体、およびアルファ-ヌクレオシドを提供する ような炭素C1'におけるコンホメ−ションイソマ−等が含まれる。 よって、ヌクレオチドの塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、メチルシト シン、ウラシル、チミンキサンチン、ハイポキサンチン、イノシン、またはその 他の メチル化塩基であってもよい。ヌクレオチドの塩基、デオキシリボヌクレオチド の塩基、およびリボヌクレオチドの塩基は、当該技術分野でよく知られ、記載さ れている（例えばPrinciple of Nucleic Acid Structure，Sanger，1984）。更 に、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチドの誘導 体、置換体、および/または修飾物は、当該技術分野でよく知られ（例えばSange r，1984; Sober，1970を参照）、リボザイムのエンドヌクレア−ゼ活性が失われ ないという仮定の下、作成してもよい。上記したように、エンドヌクレア−ゼ活 性はすぐに、また定型的に調べることが可能である。 更に、修飾塩基が数多く、自然界で見つかっていて、また広い範囲の修飾塩基 がこれまでに合成されてきた（例えばSanger，1984; Sober，1970を参照）。例 えば、アミノ基、および環の窒素（ring nitrogen）はアルキル化することが可 能であり、それには以下の様なものがある：グアニン中のN₁，N₇や、シトシン中 のC₅のような環の窒素または炭素原子のアルキル化、チオケト基によるケトの置 換、炭素二重結合の飽和、プソイドウリジン中へのc-グリコシル結合の挿入。チ オケト誘導体の例は、6-メルカプトプリン、および6-メルカプトグアニンがある 。塩基は、ハロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニトロ、フェニ ル等の種々の基で置換してもよい。ヌクレオシドのリン酸塩部分、またはオリゴ ヌクレオチドのホスホジエステル結合部分もまた、当該技術分野でよく知られた 誘導または修飾に供せられる。例えば、酸素を窒素、硫黄、または炭素によって 置き換えて、それぞれホスホラミド、ホスホロチオエ−ト、およびホスホネ−ト が得られる。酸素を窒素、硫黄、または炭素によって置き換えた誘導体は、架橋 、または非架橋部分において行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチ ドの研究（Uhlmann，1990）により、ホスホジエステルおよびホスホロチオエ− ト誘導体は細胞内に効率良く入ることができることが確立されたが（特に長さが 短い時に）、これはおそらく細胞受容体との結合によるものである。メチルホス ホネ−トはおそらくその電気的中性のせいで細胞にすぐに取り込まれる。 本発明の更なる側面は、アミド、スルホナミド、ヒドロキシルアミン、チオホ ルマル、ホルムアセタ−ル、3'-チオホルムアセタ−ル、スルフィド、または通 常のホ スホジエステル結合に代わって機能するエチレングリコ−ルのような別の結合を 提供する。これらの修飾は、細胞性ヌクレア−ゼに対する抵抗性を上げたり、お よび/または薬物動態学的に改善することが可能である。 本発明に包含されている（式１、２、３、４、１a、１b、または１cの）リボ ザイムのエンドヌクレア−ゼ活性が失われないならば、糖、塩基、モノリン酸基 、またはホスホジエステル結合のレベルでの、上に挙げたヌクレオチド修飾、置 換、または誘導のいかなる組み合わせも行うことが可能である。 式１、２、３、４、１a、１b、または１cにおいて上記で検討したように、ヌ クレオチド間の塩基対形成は記号「*」を使用して表してある。塩基対はワトソ ン・クリック塩基対でも、非ワトソン・クリック塩基対でもよい。いくつかの例 では、ワトソン・クリック塩基対と、非ワトソン・クリック塩基対の混合物が触 媒活性の上昇したリボザイムを生じさせている。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は、DNA、若 しくはRNAトランスファ−・ベクタの一部、またはその組み合わせとして、本発 明のリボザイム配列の維持、複製、および転写にために細胞中に取り込んで発現 することができる。本発明のリボザイムをコ−ドするヌクレオチド配列（式１、 ２、３、４、１a、１b、または１c）は、後に発現するために真核または原核細 胞中のゲノムに組み込まれてもよい（例えばSambrook，1989）。ゲノムへの組み 込みは、宿主ゲノムヘ組み込むトランスファ−・ベクタにより行うことができる 。そのようなベクタは、例えばゲノムへの組み込みを容易にする、ウイルスや制 御起源のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。宿主ゲノムへのヌクレオチド配 列の挿入方法が記載されている(例えば、Sambrook，1989 Hogan，1986，1989)。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）をコ−ドし た、ゲノムに組み込まれた核酸配列は、一般的に本発明のリボザイムをコ−ドし たヌクレオチド配列に対して機能するように連結されて、また真核宿主細胞（動 物や植物細胞等）や、原核宿主細胞（細菌等）中で該リボザイムを発現すること が可能なプ ロモ−タを具備している。更に、本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a 、１b、または１c）は、RNA分子の合成方法で本来知られる方法で調製すること が可能である（例としてはPromega，Madison，Wis.，USA推奨のプロトコ−ル） 。特に本発明のリボザイムはT7RNAポリメラ−ゼ、またはSP6RNAポリメラ−ゼ用 のプロモ−タのようなRNAプロモ−タに対して機能するように連結された、対応 したDNA配列（転写されるとリボザイムを生じ、また本来DNAの合成方法として知 られる方法により合成されるDNA）から調製することができる。本発明のリボザ イムに対応するDNA配列は、プラスミドやバクテリオファ−ジのようなDNAトラン スファ−ベクタへ連結してもよい。トランスファ−ベクタが、リボザイムに対応 するDNAに対して機能するように連結されたRNAポリメラ−ゼプロモ−タを含んで いると、該リボザイムは、RNAポリメラ−ゼとインキュベ−ションすることで都 合よく産生される。よってリボザイムは、RNAポリメラ−ゼをリボヌクレオチド の存在下で、リボザイムに対応するDNAに対して機能するように連結されたRNAポ リメラ−ゼプロモ−タとインキュベ−ションすることにより、試験管内で産生さ せることができる。生体内では、本発明にそったリボザイムに対応する遺伝物質 を含む適切なトランスファ−ベクタで、宿主細胞内でリボザイムが転写されるよ うにRNAポリメラ−ゼポリマ−に対して機能するように連結したものを、原核、 または真核細胞（哺乳類および植物細胞を含む）に形質転換してもよい。トラン スファ−・ベクタは、細菌プラスミド、またはウイルスRNA若しくはウイルスDNA であってもよい。リボザイムに対応したヌクレオチド配列は通常、例えばlac、S V40後期、SV40初期、メタロチオネイン、またはラムダプロモ−タのような強力 なプロモ−タの制御下に置かれる。リボザイムは生体内で、トランスファ−・ベ クタから直接転写することが可能であり、またはより大きいRNA分子の一部から 転写することも可能である。例としては、リボザイム配列に対応したDNAを担体 遺伝子の3'末端、例えば翻訳終結シグナルの後に連結してもよい。より大きいRN A分子は、細胞内でのヌクレア−ゼ消化に対しての安定性を与えるのに助かる。 翻訳されると、担体遺伝子はタンパク質になりその存在は、例えば酵素反応によ り直接調べることができる。担体遺伝子は、例として酵素をコ−ドしていてもよ い。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は遺伝子治 療技術で使うことが可能であるが、ここでは例えばHIVのような疾患を有する患 者の細胞 を患者より取り出してリボザイムで処理して感染性因子を不活化し、次いで患者 に戻して標的部位に抵抗性細胞をリポピュレ−ト（repopulate）させる。HIVの 場合、HIVウイルスを不活化できる本発明のリボザイムをコ−ドしたヌクレオチ ド配列は、リンパ球のゲノムに組み込むか、または本発明のリボザイムを発現す ることが可能なトランスファ−・ベクタにより細胞中で存在させることが可能で ある。このような細胞はHIV感染に対して抵抗性となり、その子孫は、該感染に 対して抵抗性を与えるであろう。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は、DNA、若 しくはRNAトランスファ−・ベクタの一部、またはその組み合わせとして、本発 明のリボザイム配列の維持、複製、および転写にために細胞中に取り込んで発現 することができる。すなわち生体においては、細胞または器官の細胞内で、細菌 プラスミド、またはウイルスRNA若しくはウイルスDNAのようなトランスファ−・ ベクタで１以上のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）をコ −ドするものを、細胞へ形質転換させることが可能である（例:Llewllyn，1987; Hanahan，1983)。一旦細胞に入ると、トランスファ−・ベクタは複製して細胞 性のポリメラ−ゼにより転写されて、本発明のリボザイム配列を有するリボザイ ムRNAが産生されるが、産生されたリボザイムRNAは所望の標的RNAを不活化する ことが可能である。あるいは、１以上のリボザイム配列を有するトランスファ− ・ベクタを細胞に形質移入するか、またはマイクロインジェクションのようなミ クロ操作技術により、トランスファ−・ベクタ若しくはその一部が宿主細胞ゲノ ムに組み込まれるようにして、細胞内へ導入してもよい。組み込まれた遺伝子物 質が転写されると、リボザイムが生じ、これは所望の標的RNAを不活化する。 本発明のリボザイムを発現するトランスファ−・ベクタ（式１、２、３、４、 １a、１b、または１c）は、リボザイム配列の安定な発現のために宿主細胞内で 複製することが可能である。あるいは、本発明のリボザイム配列をコ−ドするト ランスファ−・ベクタは宿主細胞内で複製することができなく、そのためリボザ イム配列の一過性発現に終わることも可能である。プラスミドはウイルス構築物 のような、DNAまたはRNAトランスファ−・ベクタの調製方法は、当該技術分野で よく知られ、例えば サンブルック（Sambrook）らにより記載されている（1989）。慨してトランスフ ァ−・ベクタは、本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１ c）をコ−ドするヌクレオチド配列であって、プロモ−タ、およびその他の、発 現に必要な制御配列と、随意原核細胞および/または真核細胞での複製に必要な 制御配列とに機能するように連結されたものを具備している。植物、動物、細菌 、およびその他の細胞タイプ中で、トランスファ−・ベクタの維持および発現に 適切なプロモ−タおよび制御配列は、当該技術分野でよく知られ、またホ−ガン （Horgan）の示した例に記載されている（Hogan，1986; 1989）。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は、治療的 および生物学的に応用が広く効く。ウイルスに感染した患者に、ウイルスのRNA 転写産物にハイブリダイズしてそれを開裂させる、本発明の（式１、２、３、４ 、１a、１b、または１cに挙げたような）リボザイムを投与することで、例えば ヒトおよび動物の病原性ウイルスを不活化することが可能である。このようなリ ボザイムは、非経口的またはその他の投与方法により導入することが可能である 。あるいは、遺伝的に改変してRNAプロモ−タに対して機能するように連結され た、リボザイムに対応するDNAを含むワクシニアやアデノウイルスのような非病 原性のウイルスであって、この改変ウイルスでトランスフェクションされた宿主 細胞中でリボザイムが転写されて、該病原性ウイルスの標的であるRNA転写産物 を開裂および/または不活化するようにした上記改変ウイルスを、病原性ウイル スに感染した患者に投与することも可能である。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は、例えば 単純ヘルペスウイルス（HSV）やエイズウイルス（HIV）等によるウイルス病に対 しての、特有の適用例を有する。本発明のリボザイムで治療することが可能な、 ヒトおよび動物の疾患の別の例には、乾癬、頸部のプレ新形成（cervical prene oplasia）、パピロ−マ病、細菌および原核細胞の感染、ウイルス感染、並びに 慢性の骨髄球性白血病で起きるような異常RNAの産生に関わる異常増殖状態があ る。本発明のリボザイムで治療できる、植物の疾患または感染には、真菌感染、 （クラウンゴ−ル病のような）細菌感染、および植物ウイルス感染に関連してい る疾患がある。 治療の期間は治療する疾患により変化し、これは医者によりすぐに決定するこ とができる。慨して、治療は治療対象の疾患が改善されるまで続けられる。本発 明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）はまた、細菌、お よびその他の原核細胞、植物、および動物中でRNA転写産物を不活化するという 、特有の応用例を有している。細菌においては例えば、バクテリオファ−ジの（ 細菌細胞死を引き起こす）RNA転写産物は、本発明のリボザイムであってファ− ジDNAを不活化するものを産生することが可能なDNAトランスファ−・ベクタで、 細胞をトランスフェクションすることにより不活化することが可能である。ある いは、リボザイム自身を細菌細胞に加えて取り込まさせて、ファ−ジRNAの開裂 させてもよい。同様に、例えば培養した真核細胞および原核細胞は、マイコプラ ズマ感染、ファ−ジ感染、真菌感染等に関連した、感染症または疾患から防御す ることが可能である。 植物中のRNA転写産物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacte rium tumefaciens）のTiプラスミドのようなトランスファ−・ベクタがコ−ドし ているリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１cのような）を使用 して不活化することが可能である。このようなベクタを植物細胞へ形質移入する と、RNAポリメラ−ゼの作用によりリボザイムが産生され、特異的標的RNA配列の 開裂を行わせる。よって、RNA配列が既知の植物ウイルスまたは植物遺伝子のRNA 転写産物は、リボザイムを使用して不活化することが可能である。植物、動物、 またはその他の細胞タイプにおける内在性遺伝子転写産物は、本発明のリボザイ ム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）を使用して不活化することが可 能である。よって、望まない表現型、または特徴を修飾することが可能である。 例えば仮にそうであるならば、本発明のリボザイムを使用して果実中の種子を取 り除くことや、有害タンパク質の産生または特異的タンパク質の過剰産生により 引き起こされるヒトの遺伝疾患を治療することが可能であるかもしれない。更に 、ヒト、動物、植物、並びに真核および原核細胞において本発明のリボザイムを in vivoで適用するためには、リボザイムを細胞中に導入して、その後に標的RNA の開裂を起こさせることが必要である。in vivoへの適用は、以下で詳しく議論 するように式４のリボザイムが特に適している。 RNAおよびDNA配列を細胞へ導入する方法、およびそれらを原核および真核細胞 内で発現させる方法は、例えばコッテン（Cotten）、およびフリ−ドマン（Frie dman）が議論したように、当該技術分野でよく知られている（Cotten，1990; Fr iedman，1989）。これらの広く知られた方法を、本発明において使用することが 可能である。 本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、１b、または１c）は、直接的 細胞取り込みにより細胞内で導入することが可能であり、ここで本発明のリボザ イムは、細胞外の環境から膜又は細胞壁を横切る。リポソ−ム、親油性媒介物、 およびジメチルスルホキシドのような細胞透過性薬剤などのような、上記細胞取 り込みを促進する薬剤を使用することが可能である。本発明のリボザイム（式１ 、２、３、４、１a、１b、または１c）は、薬学的および獣医学的に許容される 担体、および賦形剤と組み合わせることが可能であるが、これらは当該技術分野 でよく知られており、その中には、例えばレミントン（Remington）著のParmace utical Sciences（17th Edition，Mack Publishing Co.，Eaton，Pa.，Edited b y Ostol et al.，;これを参照することにより本願に組み込む）中で挙げられて いる、以下のような担体が含まれる：水、食塩水、デキストロ−ス、種々の水溶 液、脂肪酸、リポソ−ム、油、皮膚貫通剤、ゲル形成剤等。 農業的に許容される担体、および賦形剤は当該技術分野でよく知られ、以下の ものが含まれる：水、界面活性剤、洗剤、特に生物分解性の洗剤、タルク、無機 および/または有機栄養溶液、鉱物土および鉱物粘土、炭酸カルシウム、石膏、 硫酸カルシウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、および尿素のような 肥料、並びに例えば穀物のつぶ（grain）、あら粉(meals)、小麦粉、樹皮のあら 粉等の植物起源の天然の産物。本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、 １b、または１c）は、例えばメルクインデックス（1989，11th editlon，Merck & Co.，Inc）に記載されているような抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗生物質、抗寄 生虫剤、抗原虫剤、または駆虫薬、除草剤、殺虫剤等の一つ以上と組み合わせて 提供することが可能である。 あくまで例であるが、本発明の治療用組成物は単純ヘルペスウイルス１型およ び２型・乾癬・頸部のプレ新形成（cervical preneoplasia）、パピロ−マ病、 細菌および原核細胞の感染に向けられている。例えばこのような治療には、疾患 部へのリボザイムの局所的に適用することが伴う。例えば、ヘルペスウイルスの 病変の治療においては、リボザイムを1nMから1mMの濃度になるようにクリ−ムに いれて製剤化することが可能である。次いで該クリ−ムを感染部位へ1から14日 間適用し、感染の症状を改善させる。ヘルペスウイルス感染の治療のための局所 的製剤を最終的に開発する前に、リボザイムおよびリボザイムを伴った製剤の効 率と毒性を、例えばマウスの切開した耳にウイルス粒子2 X10₆プラ−ク形成単位 を加えるといった、動物モデルで試験することが可能である。次いで、治療後の 耳の、感染性ウイルス粒子の力価を決定して、治療の効果や、必要なヌクレア− ゼの量等を調査する。例えば乾癬、パピロ−マ病、頸部のプレ新形成（cervical preneoplasia）、並びにHIV感染および細菌または原核細胞の感染、ウイルス感 染、および有害なRNA種を伴う腫瘍性状態のような疾患に関しては、ヒトに適用 する前に動物モデルで同様の調査を行うことも可能である。 局所的に適用する組成物は通常、クリ−ム状であり、本発明のリボザイムは粘 性の組成物と混合してもよい。本発明のリボザイム（式１、２、３、４、１a、 １b、または１c）は、リポソ−ムや、ヌクレア−ゼやその他の分解剤（リボザイ ムやUV光のような有害な環境条件）からリボザイムを遮蔽するバリア−型の調製 物中に挿入することが可能である。組成物は、カプセル（例えばゼラチンカプセ ル）、錠剤、坐薬等の単位投薬量で提供することもできる。注射可能な組成物は 、生理食塩水、デキストロ−ス、またはその他のミディア中のリボザイムの無菌 溶液の形態をとることが可能である。経口的投与のための組成物は懸濁液、溶液 、シロップ、カプセル、錠剤等の形態をとることが可能である。リボザイムは持 続性放出物、しみこませた絆創膏やパッチ等の形態で提供することが可能である 。本発明で使用することが可能な薬学的組成物は、例えばレミントン（Remingto n）のPharmaceutical Sciencesに記載されている。 本発明は更に、植物用のDNAカセットであって、遺伝的配列、および該遺伝的 配列 の発現を行わせることが可能なプロモ−タを具備し、該遺伝的配列が発現すると 、ウイロイドに関連した(-)RNAまたはその一部に対する、アンチセンスRNAまた はリボザイムRNAを提供する、上記のDNAカセットに向けられている。上記DNAカ セットは更に、植物細胞へのDNAカセットのトランスファ−や植物ゲノムへの挿 入に適切なDNAトランスファ−・ベクタの一部であることが可能である。本発明 の好ましい態様のほとんどにおいて、上記DNAカセットは、宿主域が広く、アグ ロバクテリウム（agrobacterium）を使った植物細胞への形質転換を行うことが 可能なプラスミドpGA470により導入されている。しかしながら本発明は、遺伝的 弾丸（例:DNAコ−ティングタングステン粒子、高速度ミクロ発射砲撃（high-vel ocity microprojectilebombardment））や、とりわけ電気穿孔法のようなトラン スファ−方法にまで伸展している(Maliga，1993; Bryant，1992; またはShimamo to，1989)。 ウイルス抵抗性のトランスジェニック植物は、転写されると上記した核酸にな る配列をゲノム中に含むことで特徴付けられる。このトランスジェニック植物（ 果実を含む）、およびその種子はアルファルファ、リンゴ、マメ、カノラ（ナタ ネ）、カンタル−プ、トウモロコシ、ズッキ−ニ、キュウリ、メロン、パパイヤ 、コショウ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、カボチャ、イチゴ、ヒマワリ、ピ−マ ン、タバコ、トマト、またはクルミ由来であってもよい。更に含まれるものには 、上記のトランスファ−・ベクタで形質転換した植物細胞と同様、原核若しくは 真核細胞、植物若しくは動物であって、転写されると核酸分子となるようなヌク レオチド配列を具備したものがある。 本発明は、以下の例および図を参照し、例のみにより例示されるが、これらの 例および図には限定されない。 例1-3を通して、種々の表（1-8）を数字で参照する。これらの表は、数字で参 照して本願に組み込む。表1-8は参考文献のすぐ前にある。 以下の例1-3において：対照（タバコ輪点ウイルスのサテライト、satTobRSV） と比較したときの、リボザイム変異体の開裂効率を調べた。リボザイムは、試験 管内 T7RNAポリメラ−ゼ転写物として産生され、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により精製した。標準的な反応条件は、50mM Tris-HCL pH8.0，10mM MgCl₂， リボザイム：基質＝10：１であった。反応は1-4ngの基質を、緩衝液で前混合し たリボザイムに加えて、37℃でインキュベーションして開始した。反応停止は、 EDTA含有ホルムアミドロ−ディング緩衝液を加えて行った。産生物をホスホイメ −ジング（phosphorimaging）により定量した。標的RNAは21塩基の合成基質RNA （5'-UUCCCCCUUUCGCCAGCUCCC-3'(配列認識番号XX)）であり、LacZ遺伝子の一部 に基づいている。 例１ A．ヘリックスII変異体（表1-5）：satTobRSVヘリックスII配列のリボザイム 変異体の多くは、開裂速度が遅くなっている。例外には以下のクラスのものがあ る：ステム形成の速度と安定性をおそらく上昇させるル−プ配列変異体、より安 定でないステムを与えるステムの長さが二倍の変異体。 i)ヘリックスIIステム長の変異体の開裂効率 ヘリックスII中部の2塩基対を0-6-A-U塩基対で置換して、その変異体を開裂効 率に関して調べた（表1）。二つの外側のG-C塩基対は、全ての場合において維持 されていた。内部のA-U塩基対は、ステムの安定性上昇を最小限にするようにし て選択した。 最も注目すべき特徴は、ステム長と開裂効率との間に簡潔な相関関係が全くな いことである（2-3塩基対＞対照＞4塩基対=7塩基対=8塩基対＞5塩基対=6塩基対 ；図１）いくつかの競合因子が開裂効率に影響を与えるようである。：- ii)開裂効率を上昇させるステム長の変異体（表1）： ２塩基対ステム変異体G-C、およびC-G（表1、#1）は開裂開始速度が対照より も速かったが、開裂産物の最終的な割合は減少していた。３塩基対変異体G-C，A -U，C-G（表１、#2）はより速く開裂し、その程度はsatTobRSVに基づいたリボザ イムのものと同じであった。しかしながら、３塩基対ステムG-C，C-G，G-C（表 １、#3）が開裂効率を減少させたように、ステムの配列が重要のようである。 iii)ヘリックスII中の保存されたG-C塩基対の変異（表２）： 触媒性コアの近傍のG-C塩基対は、天然型のハンマ−ヘッド型リボザイム配列 中で高く保存されている。しかしながら、ほとんどの変異体は中程度の効率で基 質を開裂することが可能であって、その中には対照と同様の開裂速度を有する変 異体が一つ（A-G，表２、＃１）含まれていた。興味深いことにこの変異体は、 ルッフィナ−（Rufiner）らの報告した系では（Rufiner，1990）、無視できるほ どの開裂しか与えなかった。 A．ヘリックスII変異体（表1-5）： i)ヘリックスIIステム長の変異体の開裂効率： ヘリックスII中部の２塩基対を0-6-A-U塩基対で置換して、その変異体を開裂 効率に関して調べた（表1）。二つの外側のG-C塩基対は、全ての場合において維 持されていた。内部のA-U塩基対は、ステムの安定性上昇を最小限にするように して選択した。 最も注目すべき特徴は、ステム長と開裂効率との間に簡潔な相関関係が全くな いことである（2-3塩基対＞対照＞4塩基対=7塩基対=8塩基対＞5塩基対=6塩基対 ；図１）いくつかの競合因子が開裂効率に影響を与えるようである。：- １）ステムの安定性、7および8塩基対のステムは、5および6塩基対のステムよ りもより速く開裂する； ２）ステムの柔軟性、最も速いリボザイムは2または3塩基対のものである（し かし、2塩基対のステム変異体は、開裂産物の割合は全体としてはより低かった ）； ３）配列の前後関係、同じ塩基数を有するか、同様の熱力学的安定性を有する リボザイムが、異なる速度で開裂する。 多分、４塩基対のステムが自然では最適な解決である。しかしながら明らかに 、いかなる特別の場合や状況においても、より速く開裂する変異体を発明するこ とが可能である。他の標的に対する、より速い３塩基対変異体（表１、＃２）の 強健さを試すことには価値がある。 ii)ヘリックスII中の保存されたG-C塩基対の変異（表２）： 触媒性コアの近傍の5'G-C3'塩基対は、自然界で高く保存されている。ルッフ ィナ−（Ruffiner）らは（Ruffiner，1990）、このリボヌクレオチド対を過度に 変異させて、開裂速度が中程度であるが低い幾つかの例を発見した。ここに記載 した結果はその発見とよく相関し（表２）、これには5'G-C3'塩基対の開裂活性 の消失が含まれている（表２、＃１０）。一つの注目すべき例外は、シトシンか らアデニンへの置換であった。実際に、5'G-A3'ヌクレオチド対は、対照に匹敵 する開裂効率を与えたが（表２、#1）、一方で、このヌクレオチド対にはほとん ど活性がないことが報告されている（Ruffiner，1990）。 5'G-C3'塩基対が開裂活性を消失しているのに対して、その他の全てのヌクレ オチド対が、低から中程度の開裂効率を有するので、ヘリックスIIのこれらの２ ヌクレオチドは、活性型リボザイムのコンフォメ−ション中では塩基対を形成し ていないかもしれない。この知見はミニザイム活性と一致する。 iii)ヘリックスIIル−プ変異体の開裂効率（表３）： 配列およびサイズが異なるヘリックスIIル−プを開裂効率に関して試験した。 RNAテトラル−プの構造は、in vitroでかなり研究されていて、コンホメ−ショ ンとステムの安定性における差異が示されている。主としてリボソ−ムRNA配列 に基づくと、自然界では最も一般的に好まれているテトラル−プは5'-UUCG-3'お よび5'-GNRA-3'であり、これらはともにステム安定性を促進する。satTobRSVの ヘリックスIIのル−プ（5'-GUGA-3'）は、この後者に一致している。予期しなか ったことではないが、開裂効率が改善したテトラル−プ変異体の一つ（5'-GGGA- 3'，表３、＃１）もまた、このパタ−ンにあっている。 興味深いことに、二つのペンタル−プもまた、開裂速度を上昇させた（5'-CGG AA3'、表3、＃１４；5'-UUGGA-3'、表3、#15）。残念ながら、ペンタル−プがス テムの安定性に与える影響は、構造的、熱力学的のどちらにおいても正式には検 討されていない。 全てのトリル−プ（tri;oop）変異体は、開裂効率を減少させたが、これはお そらく近傍の塩基対形成を阻害し、A-U塩基対が結合したペンタル−プになり、 安定性が減少したステムが生じることによるものである。 まとめると、ル−プ配列は開裂活性には余分であるが、変異体は開裂効率に関 して顕著に変化する（表3）：２、３のものは開裂速度を実際に上昇させるが、 多くは開裂速度を減少させるようだ。 iv)ヘリックスIIステムのミスマッチの開裂効率： ミスマッチをヘリックスIIのステムヘ導入すると開裂効率が低下した（表4） 。ステムの安定性と開裂効率の間にはよい相関関係があるようだ（表4）。 v)ミニザイム変異体の開裂効率： 試験した７つのミニザイム変異体のうち、UUUU変異体（表5、＃１）のみが、 中程度の効率で開裂した。リボザイムと、シスに配列した基質とを使用した以前 の実験では、一つのミニザイム5'-GCGC-3'が、UUUUミニザイムに比較して、1時 間後の開裂産物の割合が高かった。トランスでは、GCGCミニザイムでの開裂は、 いくつかの実験のうちの一回目のみにおいて起きた。この特異的リボザイムは配 列を再度決定する必要があるだろう。 ミニザイム間での開裂効率の多様性、およびGCGC変異体での以前結果を考慮す ると、UUUU（表5、＃１）ミニザイムよりも速い開裂速度を有するミニザイムは 可能である。興味深いことに、UUUU(表5、＃１)、およびGCGCミニザイムの5'お よび3'ヌクレオチドもまた、全長ヘリックスIIの非常に好ましいヌクレオチド対 に対する位置および配列において一致している（A．iiおよび表２；更にRuffine r，1990）。 例1A ステムII変異体の付加的なリボザイムアッセイ ステムIIは、触媒性コアの近傍のよく保存されたタンデムな（アンチ）-A（ア ンチ）塩基対、および標準的なワトソン-クリック塩基対を有する螺旋状の延長 物からなる（Haseloff et al.，1988）。多くのハンマ−ヘッド自己開裂領域に おいて、ステムIIは、3ないし5のヌクレオチドル−プで連結されている（Hertel et al.，1992）。ステムの延長物およびル−プのヌクレオチド配列は、非常に 多様である。ステムIIの可変領域が開裂効率にとって重要であるかを調べるため に、ル−プ中の一方のステムにおいて、ヌクレオチドの置換、付加、または欠損 による変異体を作成した（図４）。 5または6塩基対の短いステムを有する変異型のリボザイム（Rz 2-5；図４）は 、7塩基対の親配列と比較して、最高で4.4倍の速度定数の増加があった。より短 いステムのリボザイムの低下した安定性は、速度定数の上昇に寄与しているよう だが、さらに不安定化すると開裂速度が大きく低下する。例えば、5または6塩基 対のリボザイムのステムII変異体（Rz 6-12;図4）の、より大きくなったル−プ のサイズは、時として相対的に非常に低い速度定数を与える（例：Rz 7-10）。 同様に、タッシェル（Tuschel）とエクスタイン（Eckstein）は、一つの5塩基対 ステムIIリボザイムにおいて、中程度の1.5倍の速度上昇があったが、この変異 体の異なるル−プ配列は、より低い開裂効率をリボザイムに与えることを報告し ている（1993）。更に、3塩基対のミニザイム（McCall，1992）におけるステムI Iの低安定性は、速度定数において20倍の減少を引き起こしたが（図2、Rz 13） 、これはタッシェル（Tuschel）とエクスタイン（Eckstein）（1993）、および ロング（Long）とウ−レンベック（Uhlenbeck）(1994)の報告と同様である。 安定性以外では、ステムIIの配列およびサイズは開裂効率に影響を与える付加 的効果を有するようである。例えば、ステムIIの長さをA-U塩基対で増加させた が（図4:Rz 14-18）、ステムの長さと速度定数との間には線形の関係は何もなか った。10塩基対のリボザイム（Rz 17）は8（Rz 15）、9(Rz 16)、および11(Rz 1 8)塩基対の変異体に比較してより速い開裂速度を有していたが、7塩基対型（Rz 1，14;図4）よりは遅い速度定数を有していた。 ル−プのサイズおよび配列に関しての変異体もまた、親のテトラル−プ配列5' -GUGA-3'(図4；Rz 19-38)をランダムに3、4、または5ヌクレオチドで置き換える ことで調べた。リボザイムのル−プ変異体の大部分は速度定数が低くなっていた が、テトラル−プを有する二つのリボザイム（Rz 22,23）とペンタル−プを有す る二つのリボザイム(Rz 33,34)とにおいては開裂速度が上昇していた。 リボザイムRNA中の天然のステム・ル−プ構造は、保存配列5-GNRA-3'を有する テトラル−プを最も好む（N，何れかのヌクレオチド；R，プリン；25）。親リボ ザイム5'-GUGA-3'のテトラル−プ配列は、最も速く開裂する変異体の一つである Rz 22,5'-GGGA-3'と同様に、このパタ−ンに適合する。しかしながら、二番目に 速く開裂するテトラル−プ配列Rz 23,5'-GUGG-3'は、上記の5-GNRA-3'パタ−ン とは幾分異なる。開裂速度が低い変異体は、（Rz24-32の全ては）何れも5'-GNRA -3'のパタ−ンには適合しない。同様に、タッシェル（Tuschel）とエクスタイン （Eckstein）は（1993）ル−プ変異体5'-GAAA-3'は他の二つの非5'-GNRA-3'変異 体よりも、開裂速度が速いことを報告している。ル−プ変異体である5'-GNRA-3' が生物学的に好ましいのは、隣接しているステムの安定性が上昇しているためで あるか（Uhlenbeck 1990）、または特異的な3次元のコンホメ−ションのためで ある（SantaLucia et al.，1992）と示唆されている。別の可能性としては、5'- GNRA-3'配列が三次的な相互作用をする能力により長けているというが考えられ る（Biou et al.，1994; Pleyet al.，1994B）。興味深いことに、リボソ−ムRN A中においても頻出し（Woese et al.，1990）、5'-GNRA-3'テトラル−プと同様 のコンホメ−ションをとる（Cheong，C et al.，1990; Heus et al.，1991）テ トラル−プ配列の一つである5'-UUCG-3'は、調べたテトラル−プ変異体の中で最 も低い速度定数を有するリボザイム変異体（Rz32）を与える（図4）。 RNAトリル−プおよびペンタル−プに関しての系統だった構造-機能研究は、ま だ報告されていない。しかしながら、我々の行った、６つのペンタル−プ変異体 のランダムなサンプリング（1024の可能な組み合わせの中からの）において、33 ％が速度定数が上昇していた。試験した３つのトリル−プ変異体の全てにおいて 、速度定数が低くなっていた。 例2 B．ヘリックスIおよびIIIの変異体（それぞれ表6および表7） i)ヘリックスI（表6）変異体は、開裂したリボヌクレオチド残基のすぐ隣の安 定な塩基対を維持することが、好まし開裂速度にとって重要であることを証明し ている。 ii)連続した塩基対がわずかに３塩基対しかないヘリックスI変異体の一つ（表 6、#1）は、開裂速度が顕著に上昇していた。 iii)触媒コアの近傍の塩基対が維持されている限り、ヘリックスIIIのステム の安定性が上昇すると、それと相関して開裂速度も上昇する。 B ヘリックスIおよびIII変異体（表6および7）： 表6はヘリックスI変異体の開裂効率を表している。二つの最も重要な発見は、 開裂部位近傍の塩基対の重要性と、ステムの安定性を低下させることで開裂速度 を顕著に改善させる可能性である。 開裂部の近傍の塩基対において、C残基をAまたはGで置き換えることで、開裂 活性が消失した（表6、7、および8）。C残基をUに変異させてG-U結合を形成させ ると、開裂効率が大幅に低下する（表6、#2）。ヘリックスII中で厳密に保存さ れているG-C対でさえも、簡単に修飾することが可能である（表2）。 しかしながらヘリックスIの他の場所におけるステムのミスマッチは、時とし て開裂速度を上昇させる。開裂部位の近傍の最初の３塩基対のみが、ミスマッチ 形成前に維持されているということが、最も注目に値する例である（表６、＃１ ）。 開裂効率の顕著な改善がこの修飾済みヘリックスI変異体の構造的特徴、また は低下したステムの安定性によるものであるかどうかは、定かではない。簡単な 試験の一つは、標的としてより短い基質を利用することであろう。 ヘリックスIとは違い、ヘリックスIIIのステムミスマッチは全て、開裂速度を 低下させた。開裂効率は、ステムの安定性の上昇と最も密接に相関しているよう に見える；特に開裂部位の近傍の塩基対の維持が重用視される。一つの小さな例 外は、塩基対形成能が低いが中程度の開裂効率を有するとおもわれる配列5'-AAU UGUGGGA-3'であるようだ。 結論すると、ヘリックスIIIはヘリックスIよりもより高い配列特異性を有する ようである。しかしながら、これはその他の基質配列に当てはまるかどうかは定 かではない。現在のところ、最も短いア−ムを有するリボザイムは、標的の両側 の、等しい数の塩基対を標的にしている。不規則な塩基対分布が、最適であるこ とを証明できるかもしれない。 例3 C．相補的オリゴヌクレオチドによる開裂速度の促進（表８）： i)触媒性コアまたはハイブリダイジングア−ムの何れかに相補的な、8-10残基 のDNAオリゴヌクレオチドは、開裂速度を上昇させる。 ii)この開裂効率の促進は、6残基の相補的RNAオリゴヌクレオチドで模倣する ことが可能であるが、遊離ヌクレオチド、スペルミン若しくはポリエチレングリ コ−ル、またはホルムアミド若しくは尿素のような変性剤では模倣できない。 C．相補的オリゴヌクレオチドによる開裂速度の促進（表8）： サイズの異なる一連のオリゴヌクレオチドを工夫してリボザイムの異なる領域 に相補的になるようにした。これはリボザイム中のどの領域が、競合オリゴヌク レオチドによる干渉に最も感受性があるかを調べることを目的とした。オリゴヌ クレオチドを、5X過剰のリボザイムと100℃/1’でプレ・インキュベーションし 、氷で急冷したオリゴヌクレオチドのリボザイムに対する特異的結合を、RNaseH 消化により試験した。驚くことに、これらの基質類縁体は典型的な酵素阻害剤と して作用するのではなく、開裂効率を実際に上昇させた（表8、#1-11）。しかし ながらオリゴヌク レオチド-リボザイム相互作用の最適の安定範囲、すなわち結合させるだけの高 さを有するが、基質によって取って代わられるだけの低さ、があるようだ。開裂 効率を改善することは、相補的オリゴヌクレオチドによっても成し遂げることが 可能である（表8、#12-16）。一つの可能な説明としては、該オリゴヌクレオチ ドは不活性なリボザイムコンホマ−の形成、または安定化を防ぐということであ る。 開裂効率の促進は、遊離デオキシヌクレオチド残基、スペルミン若しくはポリ エチレングリコ−ルの付加、または尿素若しくはホルムアミドのような変性剤に よって成し遂げることはできない（表8、＃17-28）。 リボザイム転写産物の一部としてシスに加えられたときには、相補的オリゴヌ クレオチド配列が、活性を促進するかどうかを決定することは有益であろう。 例4 式４のリボザイムに関するin vivoでの研究 本発明は、レポ−タ−遺伝子、クロラムフェニコ−ル・アセチル・トランスフ ェラ−ゼ（CAT）に対するアンチセンスRNAおよびハンマ−ヘッド型のリボザイム を、アフリカ・キャッサバ・モザイク・ジェミニウイルス（ACMV，Stanley et a l.）由来のベクタを使用して、植物のプロトプラストへ導入するための、植物の チロシンtRNA（Stange and Beier，1988）に関する。ジェミニウイルスは、複製 を宿主の構成物に依存する植物DNAウイルスであり、核内に位置して、高レベル で複製する。このために、ジェミニウイルスは植物遺伝子発現のアッセイのため の、優秀なベクタ系の基礎を提供する。 コッテン（Cotten）とバ−ンスタイン（Birnstein）の研究と比較すると、本 発明はいくつかの点において異なっている。まず、本発明ではニコチアナ（タバ コ）由来のチロシンtRNAを、メチオニンtRNA-アフリカツメガエルの代わりに使 用されている。次に、本発明はin vivoで合成される（核/細胞質）、CAT mRNA標 的を使用している。コッテン（Cotten）とバ−ンスタイン（Birnstein）は、in vitroで合成して、 次いで（細胞質へ）マイクロインジェクションしたU7snRNAを使用した。標的RNA 分子上の標的部位も同様に異なっていた；すなわちGuC（本発明中の）とCUC（コ ッテンとバ−ンスタイン）。本発明は、tRNAが包埋されたリボザイムの活性を試 験するために、標的変異体と同様に、アンチセンスの対照も使用した。コッテン とバ−ンスタインはこのような対照を使用しなかった。最後に、本発明の活性型 のtRNARz 12転写産物の多くは、RNAポリメラ−ゼIII由来である。 本発明は、in vitro(a)，およびin vivo(b)での改良型ハンマ−ヘッドリボザ イムの設計に関する。 (a) in vitro 本発明では、タバコ輪点ウイルス（sTobRSV）の衛生RNAで行った実験から、新 規のハンマ−ヘッド型リボザイムを設計した。開発したリボザイムのうちのいく つかは、天然のsTobRSVリボザイムと比較して、in vitroでの開裂速度が高くな っている。本発明はまた、一部がこの新規のハンマ−ヘッド型リボザイムからな る組成物に関する。 (b) in vivo 本発明は更に、tRNAが包理されたハンマ−ヘッド型リボザイムに関する。tRNA が包埋されたハンマ−ヘッド型リボザイムはハンマ−ヘッド型リボザイムをtRNA 分子へ包埋して創製する。このtRNAが包埋されたハンマ−ヘッド型リボザイムは 、その活性を非包埋型リボザイムと比較すると、in vitroでは効率が低下してい るが、in vivoでは顕著に上昇している。これらの結果は、標的のCATmRNA分子の in vivo開裂に基づいている。対照の実験では更に、観察されたCAT活性の減少は 、tRNA包埋型ハンマ−ヘッドリボザイムのin vivo機能によるということを支持 している。対照にはアンチセンス分子の使用が含まれていた。 実験材料と実験方法 プラスミドの構築 全てのオリゴデオキシリボヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズの モ デル392DNA合成機（アプライド・バイオシステムズ）で合成した。分子クロ−ニ ングおよび関連技術は、本質的にはサンブルック（Sambrook、1989）らが記載し たようにして行った。 (i)チロシンtRNA． チロシンtRNAは、ヒルドベルグ・ベイア−（Hildberg Beier）の研究室（Stan ge and Beier，1986; 図9a）から入手して、消化したpGEM3zf-(Promega)のよう なものへAccI/SspI断片としてサブクロ−ニングして、pGEMtRNAを作成した。３ つの制限酵素認識部位（BamHI、SmaI、EcoRI）を有する短いオリゴデオキシリボ ヌクレオチドを部位特異的突然変異導入法（Kunkel，et al.，1987）によりtRNA のアンチコドンル−プへ挿入して、pGEMtRNApolyを作成した。この部位がまさに 、後にリボザイムおよびアンチセンス配列の両方を挿入する部位である。 (ii)リボザイム/アンチセンス（図9ｂ）． リボザイムRz 12をコ−ドしている、オ−バラップしたオリゴデオキシリボヌ クレオチドは、ハンマ−ヘッドのモチ−フと、このモチ−フの上流および下流の 12塩基とを含んでいた。二本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドを、EcoRIとP stIとで消化したpGEM4zへクロ−ニングしてpGEMRz12を作成した。このリボザイ ムは、図9cに示されるように、CATmRNAを464位で開裂するように設計されている 。リボザイム配列としてのCAT mRNA都への等価なハイブリダイゼ−ションを表す アンチセンス対照は、すでに記載されているものである（Cameron and Jennings ，1989）。このリボザイムを、末端を埋めたEcoRI-PstI断片として、SmaIで消化 したpGEMtRNApoly へサブクロ−ニングし、クロ−ンpGEMtRNARz12を作成した。 このアンチセンス配列をBamHI SnaBI断片として、BamHIとSmaIで消化したpGEMtR NApolyへサブクロ−ニングし、クロ−ンpGEMtRNA As24を作成した。 (iii)CAT基質． CAT基質は、記載されているものであった（Haseloff and Gerlach，1988; Per riman，et al.，1993）。配列の長さおよびリボザイムの標的部位は、図9cに示 されている。 (iv)変異型のCAT基質． CAT遺伝子上の464位におけるGUC標的部位を、特別に設計したオリゴデオキシ リボヌクレオチドを使って、部位特異的突然変異導入法（Kunkel，et al.，1987 ）により、GUGへ変異させた。この変異では、コドンの用法が維持され、in vivo のCAT活性には影響がない。変異型のCAT配列を有するプラスミドはpGEMCM-2と命 名する。 (v)ジェミニウイルスの構築． ジェミニウイルスであるアフリカキャッサバモザイクウイルス（ACMV）のA構 成物の感染性クロ−ンは、スタンレ−（Stanley，et al.，1988）らから提供さ れたものである。このベクタへの修飾には、pUC19由来プラスミドが有する、細 菌性複製起点、およびクロラムフェニコ−ル耐性遺伝子を挿入することが含まれ ていた（Chay and Feldstein，未発表；図9d）。この構築では、pUC-19由来ポリ リンカであるant T7およびSP6 RNAポリメラ−ゼ認識部位を、コ−トタンパク質 のタンパク質読み取り枠の場所に挿入した。この領域へ、野生型（pACMVCAT）、 および変異型(pACMVCM2)、の標的と同様に、非包埋型（pACMVRz12，pACMV As24 ）、およびtRNA包埋型(pACMVtRNARz12，PACMVtRNAAs24)のリボザイムおよびアン チセンス配列をサブクロ−ニングした。全ての配列の上流には、内在性のコ−ト タンパク質プロモ−タが存在し、一方下流には、コ−トタンパク質終止シグナル およびポリアデニレ−ションシグナルが存在する。 in vitro開裂アッセイ： in vitroアッセイ用のRNAは、以下のようなin vitiro 転写により調製した：1 -2mgの直鎖状テンプレ−トDNA、40mMトリス-HCl(pH7.5)、6mM MgCl²、2mMスペ ルミジン、10mM NaCl、10 mM DTT、8単位RNasin(Promega)、1 mM rATP，rGTP，r UTP，および0.25mM rCTP(Pharmasia)、最終容積50ml。CATおよびCM2標的RNAを60 pmolの［a-³²P］CTP(Amersham；400Ci/mmol)の存在下で、25単位のT7 RNAポリ メラ−ゼ(Bethesda Reseach Labs)を使用して転写させた。リボザイム配列、pGE MRz12およびpGEMtRNARz12を、1mMのCTP、およびDNAテンプレ−ト除去のための25 単位のRQ-1DNasel（Promega）の存在下で転写させた。転写の収量、並びにRNAの サイズおよび 忠実度を、７Ｍ尿素中の6％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（変性PAGE）で 確かめた。 CATまたはCM2標的RNA、およびリボザイム（Rz 12、またはtRNARz12）は、緩衝 液（10 mM MgCl₂、50mM トリス-HCl（pH 7.4））を加える前に、氷中で混合した 。反応は、すぐに30℃にして1時間行わせた。反応は、EDTAを最終濃度50mMにな るまで加えて終結させ、ついでエタノ−ル/酢酸ナトリウムで沈殿させた。開裂 速度は、AMBISのイメ−ジ・アクイジション・分析器（AMBIS，Inc.）を使用して 定量した。 in vivo発現の分析： (i)形質移入． ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）（cv．Xanthi）の細胞培養を使 用して、プロトプラストの単離を、本質的にホワ−ド（Howard，et al.，1987） らが記載したようにして行った。プロトプラストを、1.2 X 10⁶/mlの濃度になる ように懸濁して、700mlのアリコットを形質移入ごとに使用した。形質移入はHoe fer PG200プロジェニタ−II装置（Hoefer Scientific Instruments，SanFrancis co，California）を使用して、電気穿孔法により行った。それぞれの電気穿孔操 作においては、標的構築物（pACMVCATまたはpACMVCM2）を以下の(a)，または(b) ,もしくは(c)と共に形質移入して、それぞれの電気穿孔操作で等量のDNAが挿入 されるようにした：(a)対照のpACMVtRNA、(b)アンチセンス構築物（pACMVAs24， pACMVtRNAAs24）、(c)リボザイム構築物（pACMVRz12，pACMVtRNARz12）。アンチ センス、またはリボザイム対照構築物に対する標的の量、および対比は1：3であ った（5mg、pACMVCAT，またはpACMVCM2: 15mg、pACMVtRNA，pACMVAs24，pACMVt RNAAs24，pACMVRz12，またはpACMVtRNARz12）。これは、標的分子に対してtRNA 包埋型アンチセンス/リボザイムが、モル濃度でおおよそ6倍だけ過剰となる。そ れぞれのプロトプラスト単離において、それぞれの構築物の組み合わせで少なく とも３回繰り返した。電気穿孔法用チャンバ−中で0.4mm離れた電極を使用して 、以下の条件で電気穿孔法を行った：490mFのキャパシタンス、330ボルト、単一 の8msecパルス。電気穿孔の後、細胞を培養皿へ移して、3mlの増殖培地中で、26 ℃で3日間インキュベーションした（5% ココナッツ水、95％MS オルガニックス （organics）(GIBCO-BRL)、265mM マンニト−ル、 0.1mg/mlケラチン、0.2mg/ml 2-4-D、1.5mM KH₂PO₄、ニコチン酸、ピロキシジン （pyroxidine）、およびチアミンをそれぞれ0.5mg/ml）。この時期に、細胞を回 収してCAT活性、ACMV DNAの複製、およびmRNAレベルに関してアッセイした。 (ii)CATアッセイ． インキュベーション後、0.5mlの細胞懸濁液を、CATアッセイ用に回収した。残 りの2.5mlは、核酸分離のために使用した。細胞を80Xg、10分間で回収して、1.5 mlのエッペンドルフ管へ移す前に、200mLの0.25Mトリス-HCl（pH7.4）に再懸濁 した。細胞を超音波処理にかけ、抽出物を14,000 X gで10分間遠心して、細胞細 片を除去した。タンパク質濃度を、ブラッドフォ−ド・アッセイ・キット（Bior ad）を使用して決定した。それぞれの抽出物に関して、等量のタンパク質を、50 mlの10mMアセチルコエンザイム A(Sigma)、および18pmolのＣ¹⁴クロラムフェニ コ−ル(Amersham)の存在下で、37℃で60分間インキュベーションした。反応は、 700mlの酢酸エチルを加えて終結した。酢酸エチル相を乾燥させ、5％メメタノ− ル/95％クロロホルム中でのシリカゲル薄膜クロマトグラフィ−での分離するた めに、10mlの酢酸エチルに懸濁させた。放射性産物を、オ−トラジオグラフで検 出し、次いでAMBISイメ−ジ・アクイジション分析器を使用して定量し、アセチ ル化したC¹⁴クロラムフェニコ−ルの比率を決定した。アセチル化の平均速度を ロ−タス・フリ−ランス・グラフィックス（Lotus，Cambridge，MA）を使用して プロットした。 (iii)DNA分離 CATアッセイ用のようにして、細胞を回収し、200mlのTEに再懸濁した。等量の 2 X SDS抽出緩衝液（0.1mM トリスpH7.4，2mM EDTA，2% SDS）を加えて、溶液を 混合した。プロテネ−スK(Boehringer Mannheim）を100mg/mlまで加えて、溶液 を37℃で30分間インキュベ−ションした。この後に試料をフェノ−ル/クロロホ ルムで抽出して、次いで核酸をエタノ−ル/酢酸ナトリウムで沈殿させた。核酸 試料を10mgのRNア−ゼ（Sigma）で処理して、混入していたRNAを、制限酵素消化 前に除去した。DNAを0.5mb/mlの濃度で懸濁した。定型的に、1-2mgの全DNAをDpn IまたはMboIの何れかで消化して、サザンブロットで解析した。 (iv)RNA単離 トリゾ−ル（Trizol）溶液を製造者が推奨するようにして使用して、全RNAを 細胞より単離した。RNAを最終濃度1mg/mlの濃度で懸濁し、非変性1％アガロ−ス の電気泳動で分析した。 (v)逆転写PCR．in vivoのCATmRNAのRT-PCR分析。 第一鎖cDNAの合成は、5mgの全RNAを200単位のス−パ−スクリプト逆転写酵素 （GIBCO-BRL）とともに使用して行った。cDNA合成は45℃で行い、RNAの二次構造 の干渉を最小限にした。第一鎖のプライマは、5'末端に18塩基のユニ−クな配列 （"TAG"，Lincoln & Karrer，未発表）を有するオリゴdTであった。このTAG配列 を使用して次のPCT増幅のプライマに用いた。反応試料に、二重の（dual）PCR反 応を行った。CAT配列の198位から216位でプライムするプライマ１は、CATの全長 を増幅するように設計した。プライマ２は、リボザイム開裂部のすぐ3'の470位 から488位にアニ−ルし、開裂した、若しくは開裂していないCAT RNAの存在に対 する陽性対照となる。PCR反応の条件は、増幅の線形範囲（linear range of amp lification）内にあることを確認し、以下のとおりであった：52℃ 22分、72℃ 40分；94℃ 40秒、52℃ 2分、72℃ 3分を30サイクル；次いで72℃ 15分。 増幅は、1+TAGまたは2+TAGのプライマの組の何れかを使用して行った。PCR反応 物の1/6をアガロ−スゲルにロ−ドしサザンブロットを行い、二つのプライマに よるCAT配列の増幅の度合いを調べた。サザンブロットは、記載されているよう にして行った（Sambrook et al.，1989）。フィルタはオ−トラジオグラフィ− で分析し、全カウントは、AMBISイメ−ジ・アクイジション分析器で決定した。 結果： 直鎖状、およびtRNA包埋型リボザイムによるin vitroでの開裂の効率： in vitro開裂アッセイを行い、直鎖状およびtRNA包理型リボザイム構築物の 、CAT転写産物を開裂する効率を調べた。図１０aに示されているように、CAT RN Aの開裂は、直鎖状物、またはtRNA包埋物のリボザイム配列付加に依存した。図1 0aに示されているように、非包埋型のリボザイム（直鎖状）は、tRNA包埋型に比 べて、より効率良く開裂したが、両方の構築物はともに、CAT RNAを効率良く開 裂した。この例 にいては、基質の減少を、このin vitroアッセイにおける開裂の指標として使用 した。この量は、30℃、1時間のインキュベーション後に、図10aで見られる2つ の開裂産物バンドになった基質の割合を、転写産物のバンドと二つの開裂産物の バンドの放射能に基づいて計算したものである。 ３つの独立した実験において、直鎖状リボザイムとインキュベーションしたと きに、CAT RNAは平均して75％開裂した。tRNA包埋型リボザイムでは、CAT RNAの 開裂は平均してわずか38％であった。以上の結果を、標準偏差を含めて図１０b に示した。CAT転写産物を直鎖状、またはtRNA包埋型のアンチセンス転写産物と インキュベーションしても、この開裂産物は生じなかった。更に、標的転写産物 CM2の変異体を二つのリボザイム転写産物とインキュベーションしてもまた、開 裂産物の蓄積はおこらなかった（デ−タは非掲載）。 tRNARz12リボザイムの存在下での、in vitro CAT活性レベルの顕著な減少： 両方のリボザイムが、基質RNAをin vitroで開裂できることが示されたので、 ザンチ・タバコ（Xanthi tabacco）の懸濁細胞からのCAT遺伝子発現にあたえる 、これらの相対的影響を調べた。異なるプロトプラスト調整物を使用した７つの 別個の実験において、tRNA包埋型リボザイム遺伝子構築物を加えると、非包埋型 もしくはtRNA包埋型アンチセンスを発現している構築物、または非包埋型リボザ イムを有する構築物を加えたときに比べて、CAT活性の抑制がより大きくおきた （図10b）。以上の結果は、非包埋型のリボザイムがCAT転写産物を開裂するのに より効率がよかったことを示したin vitroアッセイでの結果とは対照的である。 CAT標的の変異体CM2は、野生型のCAT標的で見られたCAT遺伝子抑制の促進は示さ なかった。tRNARz12転写産物のCM2活性に与える影響と比較した、CAT活性への影 響を示すCATアッセイを、図１２aおよび図１２ｂに示した。pACMVtRNAが存在す るときと、いかなるアンチセンスまたはリボザイム構築物も存在しないときの、 pACMVCATまたはpACMVCM2の発現に対して100％の値を与えて、それぞれの実験で 得られた結果を標準化した（図11aおよび１１ｂ）。 図１１aおよび１１bに示されているように、アンチセンス遺伝子構築物が非包 埋 型配列として導入されるときには、CAT遺伝子発現の減少の平均は、対照の値の 約60％までである。これと比較して、非包埋型及びtRNA包埋型のリボザイムの場 合は、それぞれ対照のCAT活性の40％、及び15％まで減少させることができた。 標的配列が、CATの標的であるCM2であるときには、４つの構築物全てはCAT活性 を60％レベルまで減少させた。表９は、リボザイム構築物またはアンチセンス構 築物の何れかの存在下でのCAT活性と、CAT及びCM2標的とを組にして比較したT検 定による分析を示す。このT検定は、図１２a及び12ｂで示された平均を構成する それぞれのデ−タ点を含んでいる。それぞれの構築物の組に対して、これは２４ の別個の電気穿孔を表している。＞99％の信頼性において、以下のことがいえる ： １．tRNARz12構築物は、CAT構築物を標的にしたときには、アンチセンス、ま たは非包埋型のリボザイム配列よりも、顕著により低いCAT活性を生じさせた。 ２．tRNARz12構築物存在下でのCAT構築物のCAT活性は、CM2変異体標的構築物 のものよりも顕著に低く、これは上記のリボザイム構築物が顕著に異なったCAT の活性レベルを生じさせたためである。 ３．CM2標的に対しては、二つのアンチセンス構築物、及び二つのリボザイム 構築物の何れも顕著に異なるレベルのCAT活性を産生しなかった。 pACMV標的、アンチセンス、及びリボザイム構築物の複製の分析 観察されたCAT活性の減少が、tRNARz12リボザイム存在下でのpACMVCATまたはp ACMVCM2の複製の阻害によるためではないことを確かめるために、tRNARz12リボ ザイムの存在及び非存在下での形質移入後、1日目及び3日目にDNAを調べた。メ チル化感受性アイソシゾマ−であるDpnI、及びMboIを使用して、複製したpACMV 配列を、形質移入に使用したものと区別した。図１４a及び14bに示されているよ うに、CAT及びCM2構築物の双方は、tRNARz12が存在しても、また、存在しなくて も、等レベルにまで複製した。更に、リボザイム及びアンチセンス構築物を発現 する４つのpACMVは、全て複製した。CAT mRNAの蓄積レベルの減少は、CAT活性の 減少と相関している。CATmRNAの細胞内蓄積に与えるリボザイムの影響を、図１ ３a及び １３bを使用して調べたが、この図はCAT標的と、二つのアンチセンス 構築物または二つのリボザイム構築物のうち何れかとで電気穿孔法により形質移 入されたプロトプラストから単離した全RNA由来の、二つのPCR増幅産物のサザン ブロットを示している。このブロットは、CAT配列でプロ−ブされていて、CAT及 びCM2標的配列の両方の増幅産物を示している。この二つの増幅産物は全長型（ プライマ１+TAG）または切断型（プライマ２+TAG）のCATmRNAを表している。切 断型はGUC標的部位の下流のCATメッセ−ジの増幅産物由来であり、よってリボザ イム仲介性開裂を見るための内部対照を提供する。表１０に示されているように 、これら二つの産物の増幅は、アンチセンス/リボザイム構築物の存在下で、CAT 及びCM2標的に対しておおよそ1：1の比率となっていたが、CAT+tRNARz12の場合 は例外であった。tRNARz12 の場合は、下流産物の全長産物に対する割合は3.3で あった。よって、開裂部の下流の増幅産物は、全長産物の3倍以上増幅されたこ とになる。10サイクルおきに一定分量を取り除いて10サイクル目から40サイクル 目の経時変化を調べることにより、増幅が線形の範囲であることを確かめた（デ −タ非掲載）。この増幅は、単離したRNA試料のそれぞれの中に存在しているCAT mRNAの実際の量を表していると確信できる。 考察： 本発明は、タバコのプロトプラストを、標的配列であるCAT、及びCATmRNAを開 裂することができるtRNA包埋型のリボザイムの両方を発現する自己複製ベクタで 形質移入すると、CAT活性が顕著に低下することを示しているが、これは以前のi n vivoリボザイム仲介性の基質配列の分解が細胞で起きるのとは異なる（Camero nand Jennings，1989; Cotten and Birnsteil，1989; Sioud et al.，1992; Ste ineck et al.，1992; Periman etal.,1993）。ここで内部対照（CATmRNA上のGUC 標的部位が変異してGUGになっている）より得られた結果は、野生型CAT配列に対 して見られた減少が、実際にリボザイム仲介性のものであることを示唆している 。すなわち、変異体の標的CM2は、tRNARz12配列の存在下で、アンチセンス構築 物に対して見られたものに匹敵する阻害を示したが、これは野生型標的に対して みられたより大きな低下が、CATmRNAのリボザイム開裂によるためであることを 示唆している。 この結論はまた、エレクトロポレ−ションしたプロトプラスト中のCATmRNAの 蓄積の分析からも支持される。形質移入したタバコの細胞から得たRNAの逆転写P CRは、全長産物に対する下流PCR産物の割合が顕著に上昇していることを示して いて、細胞内開裂を示唆している。ここで報告している3.3の比率は、カンタ− （Cantor，et al.，1993）、及びドロピュリック（Dropulic，et al.，1992）が 、HIVに対するリボザイムを使ったアッセイで得たものと同様である。全長のCAT mRNAの減少を観察するのは可能であるが、RNア−ゼ保護アッセイを使用して開裂 産物を検出するのは不可能である。CATmRNAの安定性に関する報告からは、安定 に形質移入された細胞内では半減期は70分位でありことが示唆される。一過性の 形質移入細胞内では、半減期はより短い（Gallie et al.，1991）。開裂産物が エクソヌクレア−ゼ活性に対してより感受性が高いであろうということを考慮す ると、保護する可能性は低く、よって開裂産物が細胞内で蓄積される。開裂産物 の不安定さはまた、tRNARz12リボザイム存在下でのRT-PCR増幅で見られた比率が 、もし開裂産物の全てが検出されるならば、属したものよりも大きくなりえるこ とを示唆する。3'開裂産物の多くは、切断型のPCR産物で表され（プライマ+TAG ）、一旦細胞内で産生されると、おそらくすぐに分解される。 コッテン（Cotten）とバ−ンスタイン（Bornstein）の結果（1989）とは異な り、非包埋型リボザイムに比べてtRNA包埋型リボザイムのin vitroでの開裂レベ ルは低下していた。このin vitroでのレベルの低下にも関わらず、本発明のtRNA 包埋型リボザイムは、in vivoで顕著にCAＴ活性を低下させた。tRNA構築物は、 二つの仮のプロモ−タ配列が存在するように設計した。一番目の方は内在性RNA ポリメラ−ゼを下基にするコ−トタンパク質で、二番目の方はtRNA配列の内部の RNAポリメラ−ゼIIIプロモ−タである。コッテンとバ−ンスタインは、野生型の tRNA配列に比べてtRNARzの転写が減少していることを観察したのにも関わらず、 そのような減少が起きたことについて言及していない。ここに記載するキメラ系 における優勢な転写は、RNAポリメラ−ゼIIIの転写物である（投稿準備中）。こ れは、上流のRNAポリメラ−ゼIIプロモ−タを有する酵母細胞ヘチロシンtRNAを 導入した時に、キンゼイ（Kinsey）とサンドマイヤ−（Sandmeyer）（1991）が 得た結果と同様である。更に、tRNARz12及びtRNAAs24転写物のプロセッシング速 度が、野生型tRNAのコムギ胚抽出 物中での速度と匹敵することを見出した（投稿準備中）。以上の結果より、活性 型のtRNARz12転写物の多くはRNAポリメラ−ゼIII由来であると結論づけられる。 ハンマ−ヘッド型リボザイムが、植物系及び動物系の両方において、in vivo で特異的なmRNA配列を標的にして開裂することができることを論証するには限界 がある。単一の非包埋型リボザイムを動物系に導入するのに成功した例はあるが （Sarver，et al.，1990; Dropulic，et al.，1992; L'Huiier，et al.，1992; Cantor，et al.，1993; Zhao，et al.，1993）、目標の標的にアニ−ルして開裂 させるために、リボザイムには安定化配列を5'及び/または3'に更に有している 必要がある。スレンジャ−（Sullenger）とチェック（Cech）は、標的とリボザ イムを同じ分子内で隔離したときに、リボザイムの効果が促進されることを示し た（1993）が、この方法は、多くの治療状況には応用できないことは確かである 。標的配列が植物若しくは動物由来であるか、またはウイルス起源である場合が 特にそうである。 tRNA分子は、in vivoでのリボザイムの効果を促進させるのに非常によい候補 であると考えるであろう。アフリカツメガエルの卵母細胞で得られたコッテンと バ−ンスタインの結果（1989）を、ここに示した植物細胞での結果と組み合わせ ると、tRNA導入系はこれまでの遺伝子安定性の方法と比べて数多くの利点を有す ることが示唆される。まず、tRNAは小型の偏在性の配列である。次に、RNAポリ メラ−ゼIIIは細胞内で高レベルに転写されることが可能であり、よって所望の 転写物を多量に産生させる方法が提供される。最後に、tRNAの植物系内での安定 性の測定により、半減期が45時間のオ−ダ−であることが推定され（Karanail a nd Wasternack，1992）、それらをリボザイム配列の導入にとって理想的なもの にしている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (72)発明者 スタッパー、メーリアン オーストラリア国、エーシーティー 2614、スカリン、カーパー・ストリート 29 (72)発明者 ペリマン、ローンダ オーストラリア国、エーシーティー 2601、オコナー、ベラー・ストリート ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 以下の式を有する化合物。 ここでそれぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異なっ たものでもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されていても よく、 (X)_n及び(X)_n'は、 開裂する標的RNAの配列とハイブリダイズすることが可能で、 天然には、それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合しては 存在しない、 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列 が該化合物中には存在せず、 n及びn'のそれぞれは、n+n'の合計が14よりも大きくなるような、上記オリゴ ヌクレオチド中のヌクレオチド数を定義し、 (X)_m及び(X)_m'はそれぞれ、(a)3'-CUG-5'及び5'-GAC-3'、(b)3'-GCG-5'及び5' -AGC-3'、(c)3'-CGG-5'及び5'-GCC-3'、または(d)3'-CGC-5'及び5'-GCG-5'、の 何れかの配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、それぞれの*はその両側に位 置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 aは、0か1であって、0の時には(X)_aの5'に位置するAが(X)_aの3'に位置するXに 結合するという条件の下、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し、 (X)_bは、(X)_bが存在する場合には、bが4以上の整数を表すという条件の下、オ リゴヌクレオチドを表し、該オリゴヌクレオチドは、存在しても存在しなくても よい。 ２． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が、3'-(X)_n-1-A-である、請求項1 に記載の化合物。 ３． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が、3'-(X)_n-2-C-A-である、請求項1 に記載の化合物。 ４． (X)_aが存在していない、請求項１に記載の化合物。 ５． (X)_bが存在している、請求項１に記載の化合物。 ６． (X)_bの整数bが4である、請求項５に記載の化合物。 ７． 前記のオリゴヌクレオチド(X)_bが、配列5'-G-U-G-A-3'を有する、請求項 １に記載の化合物。 ８． 以下の式を有する化合物。 ここでそれぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異なっ ていてもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されていてもよ く、 (X)_n及び(X)_n'は、 開裂するRNA標的の配列とハイブリダイズすることが可能で、 天然には、それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合しては 存在しない 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記標的RNA配列 が該化合物中には存在せず、 n及びn'のそれぞれは、n+n'の合計が14よりも大きくなるような、上記オリゴ ヌク レオチド中のヌクレオチド数を定義し、 それぞれの*は、その両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 aは、0か1であって、0の時には(X)_aの5'に位置するAが(X)_aの3'のXに結合する という条件の下、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し、 m及びm'のそれぞれは、２以上８以下の整数を表し、 (X)_bは以下の配列のうち何れか一つを有するヌクレオチドを表す：3'-AGGUU-5 '、3'-AGGG-5'、3'-AAGGC-5'、または3'-GGUG-5'。 ９． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が3'-(X)_n-1-A-である、請求項８に 記載の化合物。 １０． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が3'-(X)_n-2-C-A-である、請求項 ８に記載の化合物。 １１． (X)_aが存在していない、請求項８に記載の化合物。 １２． m及びm'のそれぞれが４である、請求項８に記載の化合物。 １３． 以下の式を有する化合物。 ここでそれぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異なっ ていてもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されたものでも よく、 (X)_n及び(X)_n'は、 開裂する標的RNAの配列とハイブリダイズすることが可能で、 天然には、それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合しては 存在しない、 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列 が該化合物中には存在せず、 -N-N-は、標的RNA配列に対して予め決めておいた配列を有するヌクレオチドで あり、 n及びn'は、n+n'の合計が12よりも大きくなるような、上記オリゴヌクレオチ ド中のヌクレオチド数を定義し、 それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 aは、0か1であって、0の時には(X)_aの5'に位置するAが(X)_aの3'に位置するXに 結合するという条件の下、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し、 m及びm'のそれぞれは４以上の整数を表し、 (X)_bは、(X)_bが存在する場合には、bが4以上の整数を表すという条件のもと、 存在するかまたは存在しないオリゴヌクレオチドを表す。 １４． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が、3'-(X)_n-1-A-である、請求項 １３に記載の化合物。 １５． 前記のオリゴヌクレオチド3'-(X)_n-が、3'-(X)_n-2-C-A-である、請求 項１３に記載の化合物。 １６． (X)_aが存在していない、請求項１３に記載の化合物。 １７． (X)_bが存在している、請求項１３に記載の化合物。 １８． (X)_bの整数bが４である、請求項１３に記載の化合物。 １９． m及びm'のそれぞれが４である、請求項１３に記載の化合物。 ２０． 前記のオリゴヌクレオチド(X)bが、配列5'-G-U-G-A-3'を有する、請求 項１３に記載の化合物。 ２１． 受容担体と結合している請求項１の化合物を具備した組成物。 ２２． 受容担体と結合している請求項８の化合物を具備した組成物。 ２３． 受容担体と結合している請求項１３の化合物を具備した組成物。 ２４． 転写されたときに、請求項１３に記載の何れかの化合物を与えるヌク レオチド配列を有する、オリゴヌクレオチド・トランスファ−・ベクタ。 ２５． 前記のトランスファ−・ベクタが、細菌プラスミド、バクテリオファ −ジDNA、コスミド、または真核性ウイルスDNAである、請求項２４のトランスフ ァ−・ベクタ。 ２６． 請求項２４のトランスファ−・ベクタで形質転換した宿主細胞。 ２７． 前記の宿主細胞が原核宿主細胞、または真核宿主細胞である、請求項 ２６に記載の宿主細胞。 ２８． 前記の原核宿主細胞が大腸菌（E.coli）宿主細胞である、請求項２７ に記載の原核宿主細胞。 ２９． 前記の真核宿主細胞が、サルのCOS宿主細胞、チャイニ−ズ・ハムスタ −・卵巣宿主細胞、哺乳類宿主細胞、または植物宿主細胞である、請求項２７に 記載の真核宿主細胞。 ３０． RNA開裂促進のための組成物であって、 保存された触媒性領域を定義するヌクレオチド配列、及び 開裂する予め決めておいた標的配列にハイブリダイズすることができるヌク レオチド配列を具備した、 非天然型の合成第一オリゴヌクレオチド化合物、並びに 前記の予め決めておいた標的配列を含まず、また上記の化合物の少なくとも一 部に相補的である、非天然型の合成第二オリゴヌクレオチド化合物、 を具備した上記組成物。 ３１． 以下の構造を有する、請求項３０に記載の非天然型の合成オリゴヌク レオチド化合物： ここで、それぞれのXはヌクレオチドを表し、該ヌクレオチドは同じでも異な っていてもよく、その糖、塩基、またはリン酸塩は置換または修飾されいてもよ く、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されていてもよい、リボヌクレオチドを表し 、 3'-AAG・・・AGUCX-5'は保存されている触媒性領域を定義し、 (X)_nA及び(X)_n'は、 開裂する標的RNAの配列とハイブリダイズすることが可能で、 それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A-3'に共有結合した状態では天然 に存在しない、 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列 が該化合物中には存在せず、 それぞれの*は、その両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化 学的連結を表し、 aは、0か1であって、0の時には(X)_aの5'に位置するAが(X)_aの3'に位置するXに 結合するという条件の下、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し、 m及びm'のそれぞれは１以上の整数を表し、 (X)_bはオリゴヌクレオチドを表し、bは４以上の整数を表す。 ３２． 以下の構造を有する、非天然型の合成オリゴヌクレオチド化合物。 ここでそれぞれのXはリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドを 表し、該ヌクレオチドは同じでも異なっていてもよく、その糖、塩基、またはリ ン酸塩は置換または修飾されていてもよく、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されていてもよい、リボヌクレオチドを表し 、 3'-AAG・・・AGUCX-5'は保存されている触媒性領域を定義し、 (X)_nA及び(X)_n'は、 開裂する標的RNAの配列とハイブリダイズすることが可能で、 それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A3'に共有結合した状態では天然 に存在しない 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記標的RNA配列 が該化合物中には存在せず、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 mは２から２０の間の整数を表し、 ヌクレオチド(X)_mの何れも、該化合物中のその他のヌクレオチドの何れともワ トソン・クリック塩基対を形成しない。 ３３． 以下の構造を有する、請求項３０に記載の非天然型合成オリゴヌクレ オチド化合物。 ここでそれぞれのXはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表 し、該ヌクレオチドは同じでも異なっていてもよく、その糖、塩基、またはリン 酸塩は置換または修飾されていてもよく、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されていてもよいリボヌクレオチドを表し、 3'(X)_P4・・・(X)_P1-5'は保存された触媒性領域を定義し、 (X)_P4及び(X)_P3はそれぞれ、開裂するRNA標的配列にハイブリダイズすること ができる、予め決めておいたオリゴヌクレオチドを表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 F3は、３以上であるという条件の下、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド 数を定義する整数を表し、 F4は、３から５までであるという条件の下、該オリゴヌクレオチド中のヌクレ オチド数を定義する整数を表し、 (X)_P1及び(X)_P4はそれぞれ、(X)P４が(X)P１の3から6塩基と塩基対を形成する ような予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、 P1は、3から6までで、P1とP4の合計が9になるという条件の下、該オリゴヌク レオチド中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、 (X)_P2及び(X)_P3のそれぞれは、(X)_P2が(X)_P3の少なくとも３塩基と塩基対を形 成するようにして予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、 それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 それぞれの点線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結、またはそのような化学的連結がないことをそれぞれが独立して表し 、 (X)_L2は、(X)_L2が存在するときにはL2は３以上の整数であるという条件の下、 存在するか、または存在しなくてもよいオリゴヌクレオチドを表す。 ３４． 前記の組成物が受容担体と結合している、請求項３０に記載の組成物 。 ３５． 以下の式であらわせられるものを有する、植物tRNA包埋型化合物。 ３’−（Ｘ）_t−Ｙ−（Ｘ）_t'−５’ ここでそれぞれのXは同じか、または異なっていてもよいヌクレオチドを表し 、 (X)_t及び(X)_t'のそれぞれは、tRNA分子の一部の配列を有するオリゴヌクレオ チドを表し、 t及びt'のそれぞれは、t＋t'の合計が５０寄りも大きいという条件の下、該オ リゴヌクレオチド中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、 Yは、非天然型合成オリゴヌクレオチド化合物であって、 配列が、保存された触媒性領域を定義するヌクレオチド、及び 配列が、開裂する予め決めておいた標的配列にハイブリダイズすることがで きるヌクレオチド、 を具備した上記化合物である。 ３６． 以下の構造を有する、請求項３５に記載の非天然型合成オリゴヌクレ オチド化合物。 ここでそれぞれのXは、同じまたは異なったヌクレオチドで、その糖、塩基、 またはリン酸塩は置換または修飾されていてもよいものを表し、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されているリボヌクレオチドを表し、 3'-AAG・・・AGUCX-5’は保存された触媒性領域を定義し、 (X)_nA及び(X)_n'は、 開裂するRNA標的配列とハイブリダイズすることが可能で、 それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A-3'に共有結合した状態では天然 に存在しない、 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列 が該化合物中には存在せず、 それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 aは、0か1であって、0の時には(X)aの5'に位置するAが(X)aの3'に位置するXに 結合するという条件の下、ヌクレオチドの数を定義する整数を表し、 m及びm'のそれぞれは、１以上の整数を表し、 (X)bはオリゴヌクレオチドを表し、bは４以上の整数を表す。 ３７． 以下の構造を有する、請求項３５に記載の非天然型合成オリゴヌクレ オチド化合物。 ここでそれぞれのXはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表 し、該ヌクレオチドは同じであるか異なっていて、その糖、塩基、若しくはリン 酸塩は 置換または修飾されていてもよく、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されていてもよい、リボヌクレオチドを表し 、 3'-AAG・・・AGUCX-5'は保存されている触媒性領域を定義し、 (X)_nA及び(X)_n'は、 開裂するRNA標的配列とハイブリダイズすることが可能で、 それぞれが配列3'-A-A-G-5'及び5'-C-U-G-A-3'に共有結合した状態では天然 に存在しない、 予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、上記RNA標的配列 が該化合物中には存在せず、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 mは、２から２０の間の整数を表し、 ヌクレオチド(X)_mの何れも、該化合物中のその他のヌクレオチドの何れともワ トソン・クリック塩基対を形成しない。 ３８． 以下の構造を有する、請求項３５に記載の非天然型合成オリゴヌクレ オチド化合物。 ここでそれぞれのXはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを表 し、該ヌクレオチドは同じか異なっていて、その糖、塩基、若しくはリン酸塩は 置換または修飾されていてもよく、 A、C、U、Gのそれぞれは、その糖、塩基、またはリン酸塩が修飾されていない か、修飾されているか、または置換されていてもよい、リボヌクレオチドを表し 、 3'(X)_P4・・・(X)_P1-5'は保存された触媒性領域を定義し、 (X)_P4及び(X)_P3はそれぞれ、開裂するRNA標的配列にハイブリダイズすること ができる、予め決めておいたオリゴヌクレオチドを表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 F3は、３以上であるという条件の下、該オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド 数を定義する整数を表し、 F4は、３から５までであるという条件の下、該オリゴヌクレオチド中のヌクレ オチド数を定義する整数を表し、 (X)_P1及び(X)_P4はそれぞれ、(X)_P4が(X)_P1の3から6塩基と塩基対を形成するよ うな予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、 P1は、3から6まででP1とP4の合計が9になるという条件の下、該オリゴヌクレ オチド中のヌクレオチド数を定義する整数を表し、 (X)_P2及び(X)_P3のそれぞれは、(X)_P2が(X)P３の少なくとも３塩基と塩基対を 形成するようにして予め決めておいた配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、 それぞれの*はその両側に位置するヌクレオチド間での塩基対を表し、 それぞれの実線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結を表し、 それぞれの点線は、その両側に位置するヌクレオチド間に共有結合を提供する 化学的連結、またはそのような化学的連結がないことをそれぞれが独立して表し 、 (X)_L2は、(X)_L2が存在するときにはL2は３以上であるという条件の下、存在し ても、存在しなくてもよいオリゴヌクレオチドを表す。 ３９． 前記のオリゴヌクレオチド(X)_t及び(X)_t'がニコチアナ・ルステイカ（ Nicotiana rustica）のチロシンtRNA分子由来である、請求項３５に記載の化合 物。 ４０． 転写されると請求項３５に記載の化合物を与えるヌクレオチド配列を 有する、オリゴヌクレオチド・トランスファ−・ベクタ。 ４１． 前記のトランスファ−・ベクタが、細菌プラスミド、バクテリオファ −ジDNA、コスミド、または植物ウイルスDNAである、請求項４０に記載のトラン スファ −・ベクタ。 ４２． 前記のトランスファ−・ベクタが、RNAポリメラ−ゼIIまたはRNAポリ メラ−ゼIII用のプロモ−タを含む、請求項４１に記載のトランスファ−・ベク タ。 ４３． 請求項４１のトランスファ−・ベクタで形質転換した宿主細胞。 ４４． 前記の宿主細胞が原核宿主細胞、または真核宿主細胞である、請求項 ４３に記載の宿主細胞。 ４５． 前記の原核宿主細胞が大腸菌（E.coli）宿主細胞である、請求項４４ に記載の原核宿主細胞。 ４６． 前記の真核宿主細胞が、サルのCOS宿主細胞、チャイニ−ズ・ハムスタ −・卵巣宿主細胞、哺乳類宿主細胞、植物宿主細胞、または植物プロトプラスト 宿主細胞である、請求項４４に記載の真核宿主細胞。 ４７． 転写されると請求項３５に記載の化合物を与えるヌクレオチド配列を 有する、パッケ−ジングされた、オリゴヌクレオチド・トランスファ−・ベクタ 。 ４８． 前記のパッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トランスファ−・ ベクタが、植物DNAウイルス、ジェミニウイルス、または感染性のファ−ジ粒子 である、請求項４７に記載のパッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トラン スファ−・ベクタ。 ４９． 前記のパッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トランスファ−・ ベクタがRNAポリメラ−ゼII、またはRNAポリメラ−ゼIII用のプロモ−タを含む 、請求項４８に記載のパッケ−ジングされたオリゴヌクレオチド・トランスファ −・ベクタ。