JPH10506526A

JPH10506526A - 内皮細胞に特異的な細胞サイクルに依存する活性化合物を用いる腫瘍の遺伝子療法

Info

Publication number: JPH10506526A
Application number: JP8508479A
Authority: JP
Inventors: ゼトラツェック，ハンス‐ハラルト; ボスレット，クラウス; ミュラー，ロルフ
Original assignee: ヘキスト、アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1998-06-30
Also published as: ATE199741T1; US6214614B1; ES2190787T3; CA2198472A1; DK0804601T3; AU711012B2; GR3033534T3; AU695458B2; ATE191507T1; JPH10505234A; FI970674A0; AU3263995A; FI970768A7; JPH10508188A; DK0802985T3; PT777739E; CN1158144A; DE69529174D1; AU3473295A; GR3033535T3

Abstract

(57)【要約】腫瘍の遺伝子治療のためのＤＮＡ配列を記載する。その本質的要素では、ＤＮＡ配列は、活性化配列、プロモーターモジュールおよび活性物質の遺伝子からなっている。活性化配列は、細胞に特異的な方法で増殖する内皮細胞またはこれらの内皮細胞に隣接する細胞中で活性化される。この活性化は、細胞サイクルに特異的な方法でプロモーターモジュールによって制御される。活性物質は、脈管形成のインヒビターまたは細胞成長抑制または細胞毒性分子である。ＤＮＡ配列をウイルスまたは非ウイルスベクターに挿入し、このベクターに活性化した内皮細胞に親和性を有するリガンドを補足する。

Description

【発明の詳細な説明】内皮細胞に特異的な細胞サイクルに依存する活性化合物を用いる腫瘍の遺伝子療法技術分野腫瘍の遺伝子治療のためのＤＮＡ配列が記載されている。その本質的要素では、ＤＮＡ配列は、活性化配列、プロモーターモジュール、および活性物質の遺伝子からなっている。活性化配列は、細胞に特異的な方法で増殖する内皮細胞またはこれらの内皮細胞に隣接する細胞中で活性化される。この活性化は、細胞サイクルに特異的な方法でプロモーターモジュールによって制御される。活性物質は、脈管形成のインヒビターまたは細胞成長抑制または細胞毒性分子である。ＤＮＡ配列をウイルスまたは非ウイルスベクターに挿入し、このベクターに活性化した内皮細胞に親和性を有するリガンドを補足する。１．腫瘍成長および脈管形成多くの抗腫瘍活性を有する化合物の活性が不十分であることを、少なくともある程度までは、腫瘍結節中の腫瘍細胞が抗腫瘍化合物、特に高分子量の活性化合物、に接近できないことによると説明することができる(Burrows et al.，Pharm ．Ther．64，155(1994)，Baxter et al.，Microvasc．Rex．41，5（1991）。このような活性化合物が、それぞれ個々の腫瘍細胞に到達するには、血管内皮および基底膜を通り、腫瘍支質および腫瘍実質を通って拡散しなければならない。この拡散の程度は、本質的には活性化合物の濃度また濃度勾配およびその物理化学的特性によって決定される。更に、腫瘍内部では高圧によって外側に向う対流が、拡散に反対する(Burrows et al.，Microvasc．41，5(1991)。腫瘍血管は高分子量の活性化合物にも触れることができるので、その結果、腫瘍によって誘導される脈管形成を用いて腫瘍の治療を行うことが初期に提案された(Denekamp，Prog．Appl．Microcirc．4，28(1984)，Denekamp，Cancer Topics ，6，6(1986)，Denekamp，Cancer Metast．Rev．9，267(1990)，Denekamp，Brit ．J．Radiol．66，181(1993))。従って、脈管形成を阻害する物質を用いて腫瘍成長を抑制することが試みられた(Bicknell et al.，Semin．Cancer Biol．3，399(1992))。動物実験による検討では、脈管形成を阻害する物質を全身投与することによって、腫瘍の増殖を抑制することもできることが示された。これは、例えばスラミン(Gagliardi et al .，Cancer Rex．52，5073(1992))、ヘパリン／ステロイド抱合体(Thorpe et al. ，Cancer Res．53，3000(1993))、Ｏ−（クロロアセチルカルバモイル）フミジロール(Yamaoka et al.，Cancer Res．53，4262(1993))、アンギオゲニンに対するモノクローナル抗体(Olson et al.，Cancer Res．54，4576(1994))およびアンギオスタチン(O´Reilly et al.，Cell 79，315(1994))に適用される。しかしながら、上記の方法は、脈管形成阻害剤の全身的な非腫瘍特異性効果、その副作用、および治療を一旦中断したときに起こる新たな腫瘍の成長の危険性といった不都合があった。代替法としては、内皮細胞に損傷を与えて、腫瘍を壊死させることによって腫瘍の血液供給を阻害する方法が考えられた(Denekamp，Brit．J．Radiol．66,181 (1993))。このアイデアを考慮した、毒素、細胞成長抑制剤または抗体に結合させる同位元素の投与が提案された。これらの抗体は腫瘍に関連した血管内皮に特異的である。抗体抱合体が、腫瘍に関連した血管を内皮に特異的な方法で破壊することによって腫瘍の壊死を誘発することを意図したものであった(Burrows et al.，Pharma Ther．64，155(1994))。また、トロンボゲン物質、サイトカインまたはケモカインを特異抗体によって腫瘍関連内皮細胞に結合させ、血液凝固、これによって誘導される炎症または免疫制御によって腫瘍成長に影響を与えることも示唆された。同様の効果が、内皮細胞を形質導入して、炎症性または免疫調節物質または腫瘍細胞の成長に影響を与える物質を分泌するＤＮＡを有する内皮細胞に特異的な抗体によって内皮細胞にＤＮＡを導入する提案によって、探索された(Burrows et al.，Pharmac．Ther ．64，155(1994))。内皮細胞の表面の膜抗原、この主の抗体に対する抗原として提案された。これらの抗原としては、例えばエンドグリン、エンドシアリン、ｐ９６二量体、ＶＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）レセプター、および各種の付着分子が挙げられる(Burrows et al.，Pharmac．Ther．64，155(19 94))。しかしながら、これら総ての膜抗原が有する特徴は、これらが非増殖内皮細胞にも、少なくとも比較的低濃度で存在することである。非増殖内皮細胞は、腫瘍に侵された生物でも増殖内皮細胞より遥かに多いので、この抗体抱合体を投与することによって求める効果の必要な腫瘍特異性が適当に確保されない。２．活性化合物の説明本発明は、活性化合物（すなわち、医薬）であって、腫瘍患者に局所および全身投与を行うことができ、かつ腫瘍成長の部位において、独占的にではないにしても支配的に、増殖する内皮細胞を生じ、比較的長期間に亙って脈管形成が抑制され、炎症が誘発されまたは細胞成長抑制物質が直接または間接的に生成し、これによって腫瘍の成長を抑制するものに関する。この活性化合物の中心成分は、下記の要素からなるＤＮＡ構築物である。（本出願の明細書では、ＤＮＡは相補性（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡ配列についての共通用語として用いる。） 2.1 活性化配列の選択活性化配列は、ヌクレオチド配列(プロモーター配列またはエンハンサー配列) であって、内皮細胞または増殖する内皮細胞の直ぐ近くにある細胞中で形成されまたは活性を有する転写因子が相互作用を行うものと理解すべきである。 a) 内皮細胞で活性化される活性化配列ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター（ＥＰ０１７３．１７７．Ｂ１）、ＳＶ４０プロモーター、または当業者に知られている任意の他のプロモーター配列またはエンハンサー配列は、活性化配列として用いることができる。しかしながら、本発明の意味では、好ましい活性化配列としては、特に内皮細胞（または増殖する内皮細胞の直ぐ近くの細胞）で検出することができるタンパク質をコードする遺伝子由来の遺伝子制御配列または要素が挙げられる。これらのタンパク質の幾つかは、Burrows et al.（Pharmac．Therp．64，15 5(1994)）およびPlate et al．(Brain Pathol．4，207(1994))によって記載されている。これらの内皮細胞特異タンパク質の特定の例は、下記の通りである。脳特異性内皮グルコース−１−輸送体脳の内皮細胞は、この輸送体を強力に発現させて、Ｄ−グルコースを内皮を介して脳に輸送する上で重要である(Gerhart et al.，J．Neurosci．Res．22 ，464(1989))。このプロモーター配列は、Murakami et al．(J．Biol．Chem．26 7，9300(1992))によって記載されている。エンドグリンエンドグリンは、ＴＧＦβの非シグナル伝達レセプターであると思われる(G ougos et al.，J．Biol．Chem．265，8361(1990)，Cheifetz，J．Biol．Chem．2 67，19027(1992)，Moren et al．BBRC 189，356(1992))。通常の内皮では少量存在するが、増殖する内皮では多量に発現される(Westphal et al.，J．Invest．D erm．100，27(1993)，Burrows et al.，Pharmac Ther．64，155(1994))。プロモーター配列はBellon et al．(Eur．J．Immunol．23，2340(1993))およびGe et a l．(Gene 138，201(1994))によって記載されている。ＶＥＧＦレセプター２個のレセプターが識別されている(Plate et al.，Int．J．Cancer 59， 520(1994)): ^*ＶＥＧＦレセプター１（ｆｌｔ−１） (de Vries et al.，Science 255，989（1992）（細胞質部分にｆｍｓ様チロシンキナーゼを含む）、および ^*ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｔ−２） (Terman et al.，BBRC 187，1579(1992)) （細胞質部分にチロシンキナーゼを含む）これらのレセプターは、内皮細胞上にほぼ独占的に見られるものである(S enger et al.，Cancer Metast．Rev．12，303(1993))。他の内皮特異性レセプターチロシンキナーゼ ^*ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２ (Partanen et al.，Mol．Cell Biol．12，1698(1992)，Schnuerch and Ri sau，Development 119，957(1993)，Dumont et al.，Oncogene 7，1471(1992)) ^*Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター） (Bartley et al.，Nature 368，558(1994)，Pandey et al.，Science 268，567( 1995)，van der Geer et al.，Ann．Rev．Cell Biol．10，251(1994)) Ｂ６１Ｂ６１分子は、Ｂ６１レセプターのリガンドを表す (Holzman et al.，J．Am．Soc．Nephrol．4，466(1993)，Bartley et al. ，Nature 368，558(1994)) エンドセリン、特に ^*エンドセリンＢ (Oreilly et al.，J．Cardiovasc．Pharm．22，18(1993)，Benatti et al .，J．Clin．Invest．91，1149(1993)，O´Reilly et al.，BBRC 193，834（199 3）プロモーター配列はBenatti et al.，J．Clin．Invest．91，1149（1993 ）によって記載されている。 ^*エンドセリン１ (Yanasigawa et al.，Nature 332，411(1988)) プロモーター配列はWilson et al.，Mol．Cell．Biol．10，4654（1990）によって記載されている。エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセプター (Webb et al.，Mol．Pharmacol．47，730(1995)，Haendler et al．J．Card iovasc．Pharm．20，1(1992)) マンノース−６−リン酸レセプター (Perales et al.，Eur．J．Biochem．226，225（1994）プロモーター配列は、Ludwig et al．(Gene 142，311(1994))，Oshima et a l.（J．Biol．Chem．263，2553(1988)）およびPohlmann et al．(PNAS US A 84，5575(1987))によって記載されている。 von Willebrand因子プロモーター配列はJahroudi and Lynch(Mol．Cell．Biol．14，999(1994)) ，Ferreira et al.，Biochem．J．293，641(1993)およびAird et al.，PNAS USA 92，4567(1995))によって記載されている。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１β ＩＬ−１は活性化した内皮細胞によって産生される(Warner et al.，J．Imm unol．139，1911(1987)) プロモーター配列は、Hangen et al.，Mol．Carcinog．2，68(1986)，T urner et al.，J．Immunol．143，3556(1989)，Fenton et al.，J．Immunol．13 8，3972(1987)，Bensi et al.，Cell Growth Diff．1，491(1990)，Hiscott et al.，Mol．Cell．Biol．13，6231（1993）およびMori et al.，Blood 84，1688( 1994)によって記載されている。ＩＬ−１レセプタープロモーター配列は、Ye et al.，PNAS USA 90，2295（1993）によって記載されている。血管細胞付着分子（ＶＣＡＭ−１）内皮細胞でのＶＣＡＭ−１の発現はリポ多糖類、ＴＮＦ−α(Neish et al. ，Mol．Cell．Biol．15，2558(1995))，ＩＬ−４(lademarco et al.，J．Clin． Invest．95，264(1995))，ＩＬ−１(Marni et al.，J．Clin．Invest．92，1866 (1993))によって活性化される。ＶＣＡＭ−１のプロモーター配列は、Neish et al.，Mol．Cell．Biol．15，2558(1995)，Ahmad et al.，J．Biol．Chem．270， 8976(1995)，Neish et al.，J．Exp．Med．176，1583(1992)，ladermarco et al .，J.Biol．Chem．267，16323（1992）およびCybulsky et al.，PNAS USA 88，7 859（1991）によって記載されている。合成活性化配列天然内皮特異性プロモーターの代替物として、内皮細胞中で優先的または選択的な活性を有する転写因子のオリゴマー化した結合部位からなる合成活性化配列を用いることもできる。このような転写因子の一例は転写因子ＧＡＴＡ−２であり、エンドセリン１遺伝子における結合部位は５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′である(Lee et al.，Biol．Chem．266，16188(1991)，Dorfmann et al.，J．Biol ．Chem．267，1279(1992)およびWilson et al.，Mol．Cell．Biol．10，4854(19 90))。 b) 活性化した内皮細胞に近接した細胞で活性化した活性化配列増殖する内皮では、近接している細胞が、解放している緊密な接合部を介して血液の巨大分子に接近する。機能的および解剖学的相互関係の結果、活性化した内皮細胞の隣接細胞が本発明の意味における標的細胞である。ＶＥＧＦＶＥＧＦは、特に低酸素条件下で、増殖する内皮細胞の直ぐ近くの各種細胞（例えば、平滑筋細胞および腫瘍細胞）によって形成される(Ferrara et al. ，Endoc．Rev．13，18(1992)，Berse et al.，Mol．Biol．Cell 3，211(1992)， Finkenzeller et al.，BBRC 208，432(1995)，Tischer et al.，BBRC 165，1198 (1989)，Leung et al.，Science 246，1306(1989))。ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子制御配列は、下記の通りである。 ^*ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター配列（５′−隣接領域） (Michenko et al.，Cell Mol．Biol．Res．40，35(1994)，Tischer et al .，J．Biol．Chem．266，11947(1991))または ^*ＶＥＧＦ遺伝子のエンハンサー配列（３′−隣接領域） (Michenko et al.，Cell Mol．Biol．Res．40，35(1994)、または ^*ｃ−Ｓｒｃ遺伝子 (Mukhopadhyay et al.，Nature 375，577(1995)，Bonham et al.，Oncoge ne 8，1973)，Parker et al.，Mol．Cell．Biol．5，831(1985)，Anderson et a l，Mol．Cell．Biol．5，1122(1985))、または ^*Ｖ−Ｓｒc遺伝子 (Mukhopadhyay et al.，Nature 375，577(1995)，Anderson et al.，Mol ．Cell．Biol．5，1122(1985)，Gibbs et al.，J．Virol．53，19(1985)) ステロイドホルモンレセプターおよびそれらのプロモーター要素(Truss and Beato，Endocr．Rev．14，459，(1993))、特に ^*マウス哺乳動物腫瘍ウイルスプロモーター大半の細胞において、このプロモーターは、ステロイド、例えば糖質コルチコイド(Parks et al.，Cell 8，87(1976))またはプロゲスチン(Cato et al.， EMBO J．5，2237(1986))によって活性化される。ＭＭＴＶの長期反復領域のプロモーター領域のｃＤＮＡ配列は、Chalepakis et al.，Cell 53，371(1988)およびTruss and Beato(Endocr．Rev．14，459(1993)によって記載されている。 2.2 リプレッサーモジュールの選択一例として、細胞サイクルによって制御されるプロモーターモジュールは、ヌクレオチド配列ＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒであると理解すべきである（下記参照）。このプロモーターモジュールの本質的機能は、細胞サイクルのＧ０／Ｇ１相における活性化配列の機能を抑制し、Ｓ／Ｇ２相および続いて増殖細胞における細胞サイクル特異発現を開始することである。プロモーターモジュールＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒは、ヒトｃｄｃ２５ＣプロモーターのＧ２特異性発現の詳細な研究に関連して見いだされた。出発点は、細胞サイクルのＧ１相におけるプロモーターの遮断に関与するリプレッサー要素（細胞サイクル依存性要素；ＣＤＥ）を見いだしたことであった(Lucibelloら，EMBO U．14，132(1995))。ゲノムジメチル硫酸（ＤＭＳ）フットプリント法および機能分析法(functional analyses)（第１および２図）を用いて、ＣＤＥはＧ１に特異的にリプレッサー（ＣＤＥ結合因子；ＣＤＦ）に結合することによって非増殖（Ｇ０）細胞に転写阻害を生じることを示すことができ、基底プロモーター(basal promoter)の領域に配置されているＣＤＥは、その抑制機能において、上流の活性化配列（ＵＡＳ）によって変化する。これにより、ＣＤＥ結合因子は、細胞サイクル依存的に、すなわち非増殖細胞および細胞サイクルのＧ１相において、５′に結合した活性化物質タンパク質の転写活性化作用を阻害するという結論が得られた（第３図）。この結論を更に実験によって確かめることができ、ウイルス性の非細胞サイクルによって制御される初期のＳＶ４０エンハンサーをｃｄｃ２５最小プロモーター(minimum promoter)（ＣＤＥおよび３′位の開始部位）と融合することによって、キメラプロモーターの細胞サイクルが明確に制御された（第４図）。次にｃｄｃ２５Ｃエンハンサーについて検討したところ、細胞サイクル依存的にＣＤＦによって制御される転写因子は、ＮＦ−Ｙ(同義：ＣＢＦ; Dorn et al.，Cell 5 0，863(1987)，van Hijisduijnen et al.，EMBO J．9，3119(1990)，Coustry et al.，J．Biol．Chem．270，468(1995))、Ｓｐ１(Kadonaga ら，TIBS 11，10(19 86)、および新規でありかつＣＢＳ７に結合する転写因子であることが明らかになった。この研究において得られたもう一つの興味ある知見は、ｃｄｃ２５Ｃエンハンサー内のＮＦ−Ｙのみが、少なくとも１種類の他のＮＦ−Ｙ複合体またはＣＩＦと協同して効率的に転写を活性化することが見られたことである。ＮＦ− ＹもＳｐ１も両方ともグルタミン含量の高い活性化物質のクラスに属し、抑制の機構（例えば、特定の基底転写因子またはＴＡＦとの相互作用または干渉）に対する重要な情報を提供する。ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡおよびｃｄｃ２のプロモーター配列を比較したところ、幾つかの領域で相同性が見られた（第５図）。３種類のプロモーター（含まれている多様性は機能上関連はない）総てに保存されているのは、ＣＤＥだけでなく、隣接Ｙ_cボックスも同様であった。予想されるように、これらの領域は総てイン・ビボでタンパク質結合を示し、このタンパク質結合はＣＤＥの場合には細胞サイクル依存性であった。更に、３種類のプロモーターは総て、ＣＤＥの突然変異によって制御解除されることも示された（第１表）。ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡおよびｃｄｃ２配列を比較したところ、直ちにＣＤＥの３′の領域に著しい類似性のあることも明らかになった（細胞サイクル遺伝子相同領域；ＣＨＲ）（第５図）。この領域は機能上はＣＤＥと同様に重要であるが（第１表）、それはイン・ビボでのＤＭＳフットプリント法の実験では明らかではない。これに対する可能な説明は、この因子とＤＮＡの小さな溝(minor grooves)との相互作用である。電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）実験の結果は、ＣＤＥとＣＨＲとは一緒にタンパク質複合体であるＣＤＦに結合することを示している。これらの観察は、グルタミン含量の高い活性化物質のＣＤＦによって媒介される抑制は、細胞サイクルによって制御される転写において頻繁に起きる機構であることを示している。しかしながら、ｃｄｃ２５Ｃプロモーターを制御するのに重要なものは、ＣＤＥ−ＣＨＲ領域だけでなく、基底プロモーターのヌクレオチド配列（位置＜−２０〜＞＋３０、第１図を参照されたい）内の開始部位（位置＋１）のものでもあることは明らかである。ＹＹ−１のイン・ビトロでの結合部位を含むこの領域での突然変異(Seto およびShenk，Nature 354，24 (1991)，Usheva およびShenk， Cell 76，1115(1994))により、完全に制御解除される。ＣＤＥ−ＣＨＲが基底プロモーターに近接していることを考慮すれば、その結果としてＣＤＦは基底転写複合体と相互作用すると思われる。 2.3. 抗腫瘍物質の選択 a) 増殖の阻害本発明の意味においては、抗腫瘍物質はまた、内皮細胞の増殖を阻害するタンパク質のＤＮＡ配列であると理解すべきである。これらのＤＮＡ配列の例は、下記の文献に挙げているＤＮＡ配列である。網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）またはその類似体ｐ１０７およびｐ１２０タンパク質(La Thangue，Curr．Opin．Cell Biol．6，443(1994) )、ｐ５３タンパク質（Privesら，Genes Dev．7，529(1993)）、ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質(El-Deiryら，Cell 75，817(1993))、ｐ１６タンパク質(Serranoら，Nature 366，704(1993)，Kambら，Science 264，436(1994)，Norboriら，Nature 368，753(1994))、他のｃｄＫインヒビター(Review in Pines，TIBS 19，143(1995))、ＧＡＤＤ４５タンパク質(Papathanasiouら，Mol．Cell．Biol．11，1009( 1991)，Smith ら，Science 266，1376(1994))、ｂａｋタンパク質(Farrow ら，Nature 374，731(1995)，Chittendenら，N ature 374，733(1995)，Kieferら，Nature 374，736(1995))。これらの細胞サイクルインヒビターが細胞内で速やかに不活性化されるのを防止するには、発現したタンパク質の不活性化部位に突然変異を有し、それによってこれらのタンパク質機能は損なわれない遺伝子を用いるのが好ましい。網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）および関連のｐ１０７およよびｐ１３０タンパク質は、リン酸化によって不活性化される。従って、ｐＲｂ／ｐ１１０ｃＤＮＡ配列、ｐ１０７ｃＤＮＡ配列またはｐ１３０ｃＤＮＡ配列であって、コードしたタンパク質のリン酸化部位をリン酸化することができないアミノ酸で置換する方法で点突然変異したものを用いるのが好ましい。 Hamel et al．(Mol．Cell Biol．12，3431(1992))によれば、２４６、３５０、６０１、６０５、７８０、７８６、７８７、８００および８０４位のアミノ酸を置換してしまうと、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）はリン酸化することができないが、これらの置換はラージＴ抗原との結合活性は損なわない。例えば、ｐＲｂ／ｐ１１０タンパク質では、アミノ酸Ｔｈｒ−２５６、Ｓｅｒ−６０１、Ｓｅｒ−６０５、Ｓｅｒ−７８０、Ｓｅｒ−７８６、Ｓｅｒ−７８７およびＳｅｒ−８００はＡｌａで置換され、アミノ酸Ｔｈｒ−３５０はＡｒｇで、アミノ酸Ｓｅｒ−８０４はＧｌｕで置換される。ｐ１０７タンパク質またはｐ１３０タンパク質のＤＮＡ配列は、同様なやり方で突然変異される。ｐ５３タンパク質は、細胞においてＭＤＭ２のような特殊なタンパク質に結合することによって、または脱リン酸化したＣ−末端セリン３９２によってｐ５３をオリゴマー化することによっても不活性化される(Schikawa ら，Leukemia and Lymphoma 11，21（1993）およびBrown，Annals of Oncology 4，623(1993))。従って、セリン３９２を除去することによってＣ−末端で切断されたｐ５３タンパク質のＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。 b) 脈管形成阻害剤抗腫瘍物質は、脈管形成を阻害するタンパク質のＤＮＡ配列であるとも理解すべきである。これらのタンパク質の特定の例（関連ＤＮＡ配列を文献に示す）は、下記の通りである。プラスミノーゲン活性化物質インヒビター（ＰＡＩ−１） (Reilly et al．J．Biol．Chem．265，9570(1990)，Bosma et al.，J．B iol．Chem．253，9219(1988)) ＰＡＩ−２ (Steven et al.，Eur．J．Biochem．196，431(1991)) ＰＡＩ−３ (Steven et al.，Eur．J．Biochem．196，431(1991)) アンギオスチチン (O´Reilly et al.，Cell 79，315(1994)，Bicknell et al.，Semin．Can cer Biol．3，399(1992)) インターフェロン (Dorr，Drugs 45，177(1993)，Drugs of Today 22，597(1986)，US 45 18 5 84，US 45 88 585)、特に ^*ＩＦＮα (Henco et al.，J．Mol．Biol．185，227(1985)，Pestka et al.，Ann．R ev．Biochem．56，727(1987)，Weismann et al.，Phil．Trans．R．Soc．Lond． B299，7(1982)，Goeddel et al.，Nature 290 20(1981)) ^*ＩＦＮβ (Sen et al.，J．Biol．Chem．267，5017(1992)，Mark et al.，EP 192 811， EP 234 599，US 45 88 585) ^*ＩＦＮγ (Gray et al.，Nature 295，503(1982)，Yip et al．PNAS USA 79，1820( 1982)，Rinderknecht et al.，J．Biol．Chem．259，6790(1984)) 血小板因子４ (McManus et al.，J．Immunol．123，2835(1979); Brindley et al.，J．Cl in．Invest．72，1218(1983); Deuel et al.，Proc Natl．Acad．Sci．USA 78， 4584，1981)) ＩＬ−１２ (Voest et al.，N．Natl．Cancer Inst．87，581(1995)，Wolf et al.，J． Immunol．146，3074(1991)，Gubler et al.，PNAS USA 88，4143(1991)，Kobaya shi et al.，J．Exp．Med．170，827(1989)，Gabler et al.，PNAS 88，4143(19 91)，Gately et al.，J．Immunol．147，874(1991)，Schoenhaut et al.，J．Im munol．148，3433(1992)，Wolf et al.，J．Immuno．146，3074(1991)) ＴＩＭＰ−１ (Kolkenbrock et al.，Eur．J．Biochem．198，775(1991)，Faucher et al. ，Path．Biol．37，199(1989)) ＴＩＭＰ−２ (Kolkenbrock et al.，Eur．J．Biochem．198，775（1991）ＴＩＭＰ−３ (Wick et al.，J．Biol．Chem．269，18953(1994)) 白血病抑制因子（ＬＩＦ） (Pepper et al.，J．Cell Science 108，73(1995)，Gough et al.，Ciba Fo und．Symp．167，24(1992)，PNAS USA 85，5971(1988)，Stahl et al.，J．Biol ．Chem．265，8833(1990)，Rathjan et al.，Cell 62，1105(1990)) c) 細胞成長抑制性または細胞毒性タンパク質しかしながら、抗腫瘍物質は、腫瘍に対して細胞成長抑制効果を直接または間接的に示すタンパク質のＤＮＡ配列であるとも理解すべきである。これらのタンパク質としては、特に下記のものが挙げられる。ペルホリン(perforin)(Linら，Immunol．Today 16，194(1995))、グランチーム(granzyme)(Smyth ら，Immunol．Today 16，202(1995))、ＩＬ−２ (Fletscher et al.，Lymphok．Res．6，45(1987)，Matsui et al.，Lymph okines 12，１(1985)，Tanaguchi et al.，Nature 302，305(1983)) ＩＬ−４ (Lee et al.，PNAS 83，2061(1986); Paul，Blood 77，1859(1991)，Yoko ta et al.，PNAS USA 83，5894(1986)，van Leuven et al.，Blood 73，1142(19 89)，Arai et al.，J．Immunol．42，274（1989）ＩＬ−１２ (Kobayashi et al.，J．Exp．Med．170，827(1989)，Gabler et al.，PNA S 88，4143(1991)，Gately et al.，J．Immunol．147，874(1991)，Schoenhaut et al.，J．Immunol．148，3433(1992)，Wolf et al.，J．Immunol．146，3074( 1991)) インターフェロン、例えば ^*ＩＦＮ−α (Henco et al.，J．Mol．Biol．185，227(1985)，Pestka et al.，Ann．R ev．Biochem．56，727(1987)，Weissmann et al.，Phil．Trans．R．Soc．Lond ．B299，7(1982)，Goeddel et al.，Nature 290，20(1981)) ^*ＩＦＮ−β (Sen et al.，J．Biol．Chem．267，5017(1992)，Mark et al.，EP 192 8 11，EP 234 599，US 45 88 585) ^*ＩＦＮγ (Gray et al.，Nature 295，503(1982)，Yip et al．PNAS USA 79，1820( 1982)，Rinderknecht et al.，J．Biol．Chem．259，6790(1984)) ＴＮＦ(Porter，TibTech 9，158 Sidhu et al.，Pharmc．Ther．57，79(199 3))、特に ^*ＴＮＦα(Beutler et al.，Nature 320，584(1986)，Kriegler et al.， Cell 53，45(1988)、 ^*ＴＮＦβ(Gray et al.，Nature 312，721(1984)，Li et al.，J．Immuno l．138，4496(1987)，Aggarwal et al.，J．Biol．Chem．260，2334(1985)。オンコスタチンＭ (Brown et.al.，J．Immunol．147,2175(1991); Grove et al.，J．Biol．Ch em．266，18194(1991); Hmilton et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．180 ，652(1991)，Manlik et al.，Mol．Cell．Biol．9，2847(1989)，Kallstad et al.，J．Biol．Chem．266，8940(1991)) d) 炎症誘発剤抗腫瘍物質は、抗腫瘍効果の他に、適宜、炎症を促進することによって腫瘍細胞を除去するのに寄与するタンパク質のＤＮＡ配列であると理解すべきである。これらのタンパク質の特定の例は、下記の通りである。ＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ−２） (Schall et al.，J．Immunol．141，1018(1988)，Cell 61，361(1990)) 単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ） (Zachariae et al.，J．Exp．Med．171，2177(1990); Rollins et al.，Blo od 78，1112(1991); Murakaida et al.，J．Immunol．146，1212 a(e1991)；Sic a et al.，J．Immunol．144，3034(r1990)) ＩＬ−８ (Lotz et al.，J．Immunol．148，466(1992); Clore et al.，Biochemistry 29，1689(1990)，Matsushima et al.，J．Exp．Med．167，1883(1988)，Baglio ni et al.，J．Clin．Invest．84，1045(1989)，Int．J．Immunol．17，103(199 5)，Carre et al.，J．Clin．Invest．88，1802(1992)) マクロファージ炎症タンパク質１（ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β） (Broxmeyer et al.，J．Immunol．147，2586(1991); Oh et al.，J．Immuno l 147，2978(1991); Graham et al.，Nature 344，442(1990)) 好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−２） (Walz，Rheum．Arthr.．London(1991)，Chang et al.，J．Biol．Chem．269 ，25277(1994)) ＩＬ−３ (Otsuka et al.，J．Immunol．140，2288(1988)，de Vries et al.，Stem C ells 11，72(1993)，Yang et al.，Blood 71，958(1988)，Cell 47，3(1986)，P hillips et al.，Gene 84，501(1989)) ＩＬ−５ (Azuma et al.，Nucl．Acid Res．14，9149(1986); Yokota et al.，PNAS 8 4，7388(1987); Campbell et al.，PNAS 84，6629(1987)，Azuma et al.，Nucl ．Acids Res．14，9149(1986)) ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ） (Gough et al.，Ciba Found．Symp．167，24(1992)，PNAS USA 85，5971(19 88)，Stahl et al.，J．Biol．Chem．265，8833(1990)，Rahtjan et al.，Cell 62，1105(1990)) ＩＬ−７ (Matzuda et al.，Leuk．Lymp．5，231(1991)，Lupton et al.，J．Immunol ．144，3592(1990)，Goodwin et al.，PNAS USA 86，302(1989)，Swatherland e t al.，Hum．Genet．82，371(1989)) ＩＬ−１１ (Paul et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，7512(1990)，Teramura et al.，Blood 79，327(1992)，Kawashima et al.，FEBS Lett．283，199 (1991)) ＩＬ−１３ (McKenzie et al.，J．Immunol．150，5436(1993)，Muzio et al.，Blood 8 3，1738(1994)，McKenzie et al.，PNAS 90，3735(1993)，Minty et al.，Natur e 362，248(1993)) ＧＭ−ＣＳＦ (Wong et al.，Science 228，810(1985)，Gough et al.，Nature 309，763( 1984)，Nicola et al.，J．Biol．Chem．254，5290(1979)) Ｇ−ＣＳＦ (Nagata et al.，EMBO J．5，575(1986)，Nagata et al.，Nature 319，415 (1986)，Souza et al.，Science 232，61(1986)) Ｍ−ＣＳＦ (Welte et al.，PNAS 82，1526(1985)，Lu et al.，Arch．Biochem．Biophy s．268，81(1989)，Kawasaki et al.，Science 230，291(1985)，Suzu et al.， J．Biol．Chem．267，4345(1992)，Wong et al.，Science 235，1504(1987)) 一方では、上記のサイトカインと、他方ではヒト免疫グロブリンのＦｃ残基との間に形成する融合タンパク質のＤＮＡ配列を、本発明において活性物質として用いることもできる。この種のＤＮＡ配列およびその調製は、ＥＰＡ０４６４６３３Ａ１号明細書に記載されている。 e) 細胞成長抑制剤の前駆体を活性化するための酵素しかしながら、抗腫瘍物質は、抗腫瘍性の活性化合物の前駆体を抗腫瘍活性を有する化合物に転換できる酵素のＤＮＡ配列であるとも理解すべきである。この種の酵素は、不活性な前駆体物質（プロドラッグ）を開裂することによって、活性な細胞成長抑制剤（薬剤）を形成し、それぞれの場合に関連のあるプロドラッグおよび薬剤は既にDeonarain et al．(Br．J．Cancer 70 786(1994) )、Mullen，Pharmac．Ther．63，199（1994）、およびHarris et al.，Gene The r．1，170(1994))によって概説されている。例えば、下記の酵素の一つに対するＤＮＡ配列を用いる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ (Garapinら，PNAS USA 76，3755(1979)，Vileら，Cancer Res．53，3860( 1993)，Wagner ら，PNAS USA 78，1441(1981)，Moelten ら，Cancer Res．46，5 276(1986)，J．Natl．Cancer lnst．82，297(1990))、帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ (Huberら，PNAS USA 88，8039(1991)，Snoeck，Int．J．Antimicrob．Age nts 4，211(1994))、細菌性ニトロレダクターゼ (Michaelら，FEMS Microbiol．Letters 124，195(1994)，Bryant ら，J． Biol．Chem．266，4126(1991)，Watanabe ら，Nucleic Acids Res．18，1059(19 90))、細菌性β−グルクロニダーゼ (Jeffersonら，PNAS USA 83，8447(1986))、 Secale cereale由来の植物性β−グルクロニダーゼ (Schulz ら，Phytochemistry 26，933(1987))、ヒトβ−グルクロニダーゼ (Bossletら，Br．J．Cancer 65，234(1992)，Oshimaら，PNAS USA 84，68 5(1987))、ヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば ^*肥満細胞ＣＢ−Ａ (Reynolds ら，J．Clin．Invest．89，273(1992))、 ^*膵臓ＣＢ−Ｂ (Yamamoto ら，J．Biol．Chem．267，2575(1992)，Catasusら，J．Biol． Chem．270，6651(1995))、細菌性カルボキシペプチダーゼ (Hamilton ら，J．Bacteriol．174，1626(1992)，Ostermanら，J．Protei n Chem．11，561(1992))、細菌性β−ラクタマーゼ (Rodriguesら，Cancer Res．55，63(1995)，Hussainら，J．Bacteriol．1 64，223(1985)，Conque ら，Embo J．12，631(1993))、細菌性シトシンデアミナーゼ (Mullen ら，PNAS USA 89，33(1992)，Austinら，Mol．Pharmac．43，380( 1993)，Danielson ら，Mol．Microbiol．6，1335(1992)、ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ (Ezurum ら，Nucl．Acids Res．21，1607(1993))、ホスファターゼ、特にヒトアルカリホスファターゼ ^*ヒトアルカリホスファターゼ (Gumら，Cancer Res．50，1085(1990))、 ^*ヒト酸性前立腺ホスファターゼ (Sharieff ら，Am．J．Hum．Gen．49，412(1991)，Song ら，Gene 129，2 91(1993)，Tailorら，Nucl．Acids Res．18，4928(1990))、 ^*５型酸性ホスファターゼ (Gene 130，201(1993))、オキシダーゼ、特に ^*ヒトリシルオキシダーゼ (Kimi ら，J．Biol．Chem．270，7176(1995))、 ^*ヒト酸性Ｄ−アミノオキシダーゼ (Fukuiら，J．Biol．Chem．267，18631(1992))、ペルオキシダーゼ、特に ^*ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ (Chadaら，Genomics 6，268(1990)，Ishidaら，Nucl．Acids Res．15，10 051(1987))、 ^*ヒト好酸性ペルオキシダーゼ (Tenら，J．Exp．Med．169，1757(1989)，Sahamaki ら，J．Biol．Chem． 264，16828(1989)）、 ^*ヒトチロイドペルオキシダーゼ (Kimura，PNAS USA 84，5555(1987))。引用した酵素の分泌を促進するため、それぞれの場合にＤＮＡ配列に含まれる相同シグナル配列を、細胞外分泌を改良する異種シグナル配列に代えることができる。従って、β−グルクロニダーゼのシグナル配列(ＤＮＡ位置＜２７〜９３；Oshimaら，PNAS 84，685(1987))を、例えばヒト免疫グロブリンのシグナル振幅（ＤＮＡ位置＜６３〜＞１０７；Riechmann ら，Nature 332，323(1988)）に代えることができる。また、点突然変異の結果として、リソソームでは余り保存されない酵素のＤＮＡを選択する方が好ましい。この種の点突然変異は、例えばβ−グルクロニダーゼについて記載されている(Shipleyら，J．Biol．Chem．268，12193(1933)) 。 2.4. 数種類の抗腫瘍物質の組合せ本発明は、活性化合物であって、幾つかの同一な活性物質（Ａ，Ａ）または異なる活性物質（Ａ，Ｂ）のＤＮＡ配列の組合せが含まれているものにも関する。２個のＤＮＡ配列の発現のためには、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡは、制御要素として挿入するのが好ましい。この種のＩＲＥＳは、Mountford およびSmith（TIG 11，179（1995）、Kaufma n ら，Nucl．Acids Res．19，4485(1991)、Morganら，Nucl．Acids Res．20，12 93(1992)、およびDirks ら，Gene 129，247(1993)、Pelletier およびSonenberg ，Nature 334，320（1988）、Sugimotoら，BioTech．12，694（1994）によって記載されている。従って、ポリオウイルスのＩＲＥＳ配列のｃＤＮＡ(５′ＵＲＴの位置＜１４０〜＞６３０；Pelletier and Sonenberg，Nature 334，320(1988))を用いて、抗炎症物質ＡのＤＮＡ（３′末端）および抗炎症物質ＢのＤＮＡ（５′末端）を連結することができる。組み合わせ（Ａ＋Ａ，Ａ＋Ｂ１）によっては、この種の活性化合物は本発明の意味において相加的または相乗的効果を示す。 2.5. ベクターの構築新規ＤＮＡ構築物を、当業者に慣用されている方法で完全なベクターとする。このベクターはウイルスまたは非ウイルス性のものであることができる。例えば、新規なＤＮＡ構築物をウイルスベクターに挿入し（この場合には、D.Jolly，C ancer Gene Therapy 1，51（1994）を参照されたい）、またはプラスミドとして用いる。ウイルスベクターまたはプラスミドをコロイド状分散液、例えばリポソームと複合体を形成し(Farhood et al.，Armals of the New York Academy of Sci ence 716，23(1994))、またはポリリシン／リガンド抱合体または他の慣用されている補助物質と共に医薬品として処方することもできる(Curiel et al.，Anna ls of the New York Academy of Science 716，36(1994))。 2.6. リガンドの選択ウイルスおよび非ウイルス性ベクターは、リガンドを補足することができる。増殖する内皮細胞の表面に結合する物質は、例えばポリリシン／リガンド抱合体におけるリガンドとして好ましい。これらの物質としては、例えばBurrows et a l．(Pharmac．Ther．64，155(1994))，Hughes et al．(Cancer Res．49，6214(1 989)およびMaruyama et al．(PNAS USA 87，5744（1990）によって記載されているように、内皮細胞の膜構造に対する抗体または抗体断片が挙げられる。これらの物質としては、特にＶＥＧＦレセプターに対する抗体が挙げられる。ネズミモノクローナル抗体は、人体に適用される形態で用いるのが好ましい。人体への適用は、Winter et al．(Nature 349，293(1991))およびHoogenbooms e t al.（Rev．Tr．Transfus．Hemobiol．36，19(1993)）によって記載された方法で行われる。抗体断片は、当該技術分野の状況に従って、例えばWinter et al． (Nature 349，293(1991))、Hoogenbooms et al.（Rev．Tr．Transfus．Hemobiol ．36，19(1993)）、Girol（Mol．Immunol．28，1379(1991)およびHuston et al. （Int．Rev．Immunol．10，195(1993)）によって記載された方法で調製される。更に、リガンドとしては、内皮細胞の表面上の膜構造または膜レセプターに結合する総ての物質が挙げられる。これらの物質としては、例えば、末端にマンノースを含む物質、およびＩＬ−１または成長因子、またはそれらの断片またはそれらの構成配列であって、内皮細胞によって発現されるレセプター、例えばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦβに結合するものが挙げられる(P usztain et al.，J．Pathol．169，191(1993))。更に、それらとしては、活性化したおよび／または増殖する内皮細胞に結合する付着分子が挙げられる。この種の付着分子、例えばＳＬｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬＥＣＡＭ−１またはＶＬＡ−４は、既に記載されている(Augustin-Voss et al.，J．Cell Biol．119 ，483(1992)，Pauli et al.，Cancer Metast．Rev．9，175(1990)およびHonn et al.，Cancer Metast．Rev．11，353(1992))。 2.7. 活性化合物の調製（実施例）新規な活性化合物の調製を、下記の実施例によって更に詳細に説明する。 a) キメラプロモーターエンドセリン１−ＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒの構築ヒトヒトエンドセリン−１プロモーター（位置＜−１７０〜＞−１０）またはＴＡＴＡボックスを除去することによって切断した変異体（位置＜−１７０〜＞ −４０）をその３′末端で、ヒトｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒモジュール（位置＜−２０〜＞＋１２１）の５′末端に連結する（第６図）。この連結は、当業者に知られておりかつ市販されている酵素を用いて行われる。 b) 活性化合物の中心成分を含むプラスミドの構築上記のキメラエンドセリン−１プロモーターモジュール／転写単位を、その３′末端で、ヒトβ−グルクロニダーゼの完全コード領域を含むＤＮＡ［ｌａｃｕｎａ］の５′末端に連結する（位置＜２７〜＞１９８２; Oshima et al.，P NAS USA 84，685(1987)）。このＤＮＡは、分泌に必要なシグナル配列（２２個のＮ−末端アミノ酸）をも含んでいる。細胞からの分泌を促進するため、このシグナル配列を、免疫グロブリンシグナル配列（位置＜６３〜＞１０７；Riechman n ら，Nature 332，323(1988)）で置換するのが好ましい。転写制御単位および β−グルクロニダーゼのＤＮＡを、次にｐｕｃ１８／１９またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のプラスミドベクターにクローニングして、これを直接またはコロイド分散液系でイン・ビボでの投与に用いることができる。或いは、キメラ遺伝子をウイルスベクターまたは他の好適なベクターに移して、注射することができる。 2.8. 活性化合物の活性例えば腫瘍の部位で局所投与の後、または頭蓋内またはクモ膜下投与、または全身、好ましくは静脈内または動脈内投与の後、本発明の活性化合物は、組織特異性活性化配列（ＵＡＳ）および細胞サイクルによって制御されるリプレッサーモジュールの組み合わせによって、独占的にではないにしても主に増殖する内皮細胞だけまたはこれらの増殖する内皮細胞の隣接細胞である内皮細胞が、それ自身の増殖を阻害するまたは抗増殖または細胞成長抑制効果を有する物質の形成を誘発する物質を分泌できるようになる。内皮細胞の増殖の抑制および／または細胞成長抑制物質の放出により、腫瘍の成長が阻害される。この活性化合物は、抗腫瘍物質の形成が新規な化合物によって腫瘍成長および主要によって引き起こされる脈管形成の部位に限定されるので、良好な耐性を有する。活性化合物の細胞特異性およびその細胞サイクル特異性により高度の安全性が約束されるので、これを高投与量で用い、必要ならば、数日または数週間の間隔で繰り返し用いて、腫瘍疾患の治療を行うこともできる。第１図〜第７図の説明第１図：イン・ビボで見いだされたタンパク質結合部位を有するｃｄｃ２５Ｃプロモーター領域のヌクレオチド配列（ゲノムＤＭＳフットプリント法；●（黒丸）：完全な構成上の保護；○（白丸）：部分的な構成上の保護；＊（星印）：細胞サイクルによって制御されたＧ１に特異的な保護）。ＣＢＳ：構成結合部位；ＣＤＥ：細胞サイクル依存性要素。灰色に下塗した領域は、Ｙ_cボックス（ＮＦ−Ｙ結合部位）を示している。開始部位は、黒四角形で示す。第２図：ｃｄｃの突然変異によるＧ₀における特異的なｃｄｃ２５Ｃプロモーターの抑制解除。第３図：ＣＤＥによるｃｄｃ２５Ｃエンハンサーの制御を模式的に表したもの。第４図：ＣＤＥによるＳＶ４０エンハンサーのＧ₀／Ｇ₁特異的抑制。右の数値はＧ２での誘導を示す（コントロール＝１との比較）。第５図：ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡおよびｃｄｃ２プロモーターでのＣＤＥ−ＣＨＲ領域および５′Ｙｃボックスにおける相同性。第６図：ヒトエンドセリン−１プロモーター、ＣＤＥおよびＣＨＲリプレッサー要素を含む３′融合プロモーターモジュール、およびエフェクターとしてのヒトβ−グルクロニダーゼのＤＮＡ（完全コード領域、位置≦２３９〜≧２１９４：Oshima et al.，PNAS USA 84，685(1987)）の様々な残基からなるキメラ構築物。位置の表示は、それぞれ、エンドセリン１遺伝子に対するWilson et al.，Mol．Cell ． Biol．10，4854（1990）の表示、およびLucibello et al.，EMBO J．15，132(19 95)によって使用されたｃｄｃ２５Ｃに対する系を表す。第７図免疫グロブリン（ＨｕＶＨＣＡＭＰ）のシグナル配列（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴ）に対する位置の表示はRiechmann et al.，Nature 332，(1988)によるものである。代替：β−グルクロニダーゼの細胞外分泌を向上させるためのＩｇシグナルペプチドの挿入（第７Ｂ図）。ＨＩＨ３Ｔ３細胞での遷移トランスフェクションの結果は、ＲＬＵｓ／１０００として表す。ｍＣＤＥ：突然変異したＣＤＥ（位置：−１３：Ｇ→Ｔ）；ｍＣＨＲ：突然変異したＣＨＲ位置：−６〜−３）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/44 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 38/55 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/64 37/66 48/00 ＡＤＵ 37/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍疾患の予防または治療のための活性化合物であって、活性化配列と、プロモーターモジュールと、抗腫瘍物質をコードするＤＮＡ配列とからなるＤＮＡ構築物を含んでなる、活性化合物。２．プロモーターモジュールがＣＤＥ−ＣＨＲ−Ｉｎｒ要素を有し、かつｃｄｃ２５Ｃプロモーター領域（ヌクレオチド配列：ＧＧＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧ）の位置＜−２０〜＞＋３０を含んでなるものであり、ここで、ＣＤＥが細胞サイクル依存性要素（ヌクレオチド配列：ＴＧＧＣＧＧ）からなり、ＣＨＲが細胞サイクル遺伝子相同領域（ヌクレオチド配列：ＧＴＴＴＧＡＡ）からなり、Ｉｎｒが開始部位（位置＋１）および開始に重要な隣接配列を表すものである、請求の範囲第１項に記載の活性化合物。３．内皮細胞または増殖する内皮細胞の直近の細胞において形成される転写因子によって制御される活性化配列（プロモーター配列またはエンハンサー配列）を含んでなる、請求の範囲第１項に記載の活性化合物。４．ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶエンハンサーまたはＳＶ４０プロモーター、または内皮グルコース−１−輸送体、エンドグリン、ＶＥＧＦレセプター１または２、レセプターチロシンキナーゼｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２、Ｂ６１レセプター、Ｂ６１リガンド、エンドセリン、特にエンドセリンＢまたはエンドセリン１、マンノース−６−リン酸レセプター、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１β、ＩＬ−１レセプター、ＶＣＡＭ−１またはvon Willebrand因子、またはＧＡＴＡ−２のような結合部位が５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′である内皮細胞中で優先的または選択的に活性である転写因子のオリゴマー化した結合部位からなる合成活性化配列、またはＶＥＧＦのプロモーター配列、またはＶＥＧＦのエンハンサー配列、またはｃ −ＳＲＣまたはｖ−ＳＲＣのｃＤＮＡ配列であってＶＥＧＦ遺伝子を制御するもの、またはマウス哺乳動物腫瘍ウイルスのプロモーター配列またはステロイドレセプターのプロモーター配列を含んでなる、請求の範囲第３項に記載の活性化合物。５．抗腫瘍活性化合物のＤＮＡ配列が、網膜芽細胞腫タンパク質ｐ１１０、またはｐ１０７およびｐ１３０タンパク質、またはｐ５３タンパク質、またはｐ２１タンパク質、Ｐ１６タンパク質または別のサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄＫ）インヒビター、またはＧＡＤＤ４５タンパク質、またはｂａｋタンパク質、または脈管形成を阻害するタンパク質、または細胞成長抑制効果を示すタンパク質、または炎症を刺激するタンパク質、または細胞成長抑制剤の前駆体を開裂して細胞成長抑制剤を形成する酵素をコードするものである、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の活性化合物。６．網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）が、２４６、３５０、６０１、６０５、７８０、７８６、７８７、８００および８０４位のアミノ酸の置換の結果、リン酸化することができず、しかしながらアミノ酸Ｔｈｒ−２４６、Ｓｅｒ−６０１、Ｓｅｒ−６０５、Ｓｅｒ−７８０、Ｓｅｒ−７８６、Ｓｅｒ− ７８７およびＳｅｒ−８００がＡｌａで置換されたもの、アミノ酸Ｔｈｒ−３５０がＡｒｇで置換されたものおよびＳｅｒ−８０４がＧｌｕで置換されたもののように、大型のＴ抗原との結合活性を喪失しないもの、またはｐ１０７タンパク質が、ｐＲｂ／１１０と同様にして突然変異されたものである、請求の範囲第５項に記載の活性化合物。７．ｐ５３タンパク質が、セリン３９２を除去することによってＣ末端で切断されたものである、請求の範囲第５項に記載の活性化合物。８．抗腫瘍物質が、プラスミノーゲン活性化物質インヒビター１（ＰＡＩ− １）、ＰＡＩ−２、ＰＡＩ−３、アンギオスタチン、血小板因子４、ＴＩＭＰ− １、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−３である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の活性化合物。９．抗腫瘍物質が、ペルフォリン、グランチーム、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα またはＴＮＦβ、オンコスタチンＭ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＮＡＰ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＬＩＦ、ＩＬ−１１またはＩＬ−１３である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の活性化合物。１０．抗腫瘍物質が免疫グロブリンのＦｃ断片からなる融合タンパク質である、請求の範囲第９項に記載の活性化合物。１１．抗腫瘍物質が酵素であり、この酵素が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ、ニトロレダクターゼ、β−グルクロニダーゼ（特に、ヒト、植物または細菌性β−グルクロニダーゼ）、カルボキシペプチダーゼ、（好ましくはシュドモナス由来のもの）、ラクタマーゼ（好ましくは、Bacillus cereus 由来のもの）、ピログルタメートアミノペプチダーゼ、Ｄ−アミノペプチダーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ヒドロキシニトリルリアーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼまたはグリコシダーゼである、請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に記載の活性化合物。１２．酵素のＤＮＡ配列の点突然変異の結果、リソソーム保存が減少され、細胞外分泌が増加された、請求の範囲第１１項に記載の活性化合物。１３．酵素のシグナル配列を非相同シグナル配列で置換して、細胞外分泌が向上された、請求の範囲第１１項に記載の活性化合物。１４．数個の同一または異なる抗腫瘍物質のＤＮＡ配列を含み、それぞれの場合に２個のＤＮＡ配列が互いに内部リボソームエントリー部位のＤＮＡ配列によって連結されてなる、請求の範囲第１〜１３項のいずれか１項に記載の活性化合物。１５．ベクターに挿入された、請求の範囲第１〜１３項のいずれか１項に記載の活性化合物。１６．ベクターがウイルスである、請求の範囲第１５項に記載の活性化合物。１７．ウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスである、請求の範囲第１６項に記載の活性化合物。１８．プラスミドに挿入された、請求の範囲第１〜１４項のいずれか１項に記載の活性化合物。１９．コロイド分散系で調製される、請求の範囲第１５〜１８項のいずれか１項に記載の活性化合物。２０．リポソームがコロイド分散系である、請求の範囲第１９項に記載の活性化合物。２１．ポリリシン／リガンドがコロイド分散系である、請求の範囲第２０項に記載の活性化合物。２２．内皮細胞の膜構造に結合するリガンドが補足された、請求の範囲第１５〜２１項のいずれか１項に記載の活性化合物。２３．リガンドが、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはその抗体断片であって、その可変ドメインによって、細胞膜に特異的に結合するものであるか、またはサイトカインまたは成長因子、またはその断片または構成配列であって、平滑筋細胞上のレセプターに結合するものであるか、またはＳＬｅＸ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬＥＣＡＭ−１またはＶＬＡ−４のような付着分子である、請求の範囲第２２項に記載の活性化合物。２４．内皮細胞の膜構造が、マンノースのレセプター、ＩＬ−１または成長因子、例えばＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦまたはＴＧＦβである、請求の範囲第２３項に記載の活性化合物。２５．静脈内、動脈内または体腔内注射、組織中または組織間隙中への注射、または局所投与のための製剤とされた、請求の範囲第１〜２４項のいずれか１項に記載の活性化合物。