JPS58129997A - 酵素測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発色性物質であるｐ−ニトロフェノールは酵素を含有す
る試料中における特定の酵素の存在を検出し、そして／
箇良はそれらの濃度を測定する丸めに考Ｉｌ畜れ友試慕
中で広く使用されている。そのような試薬を使用する分
光学的な検定においては酵素の濃度はつぎの式 酵素単位／リットル二ΔＡ／分ｘ７ｘｙ（喪りし式中、
−Ｆｉｐ−二トロフェノールのモル吸光率であり、そし
て１は試料および試薬の容量および光路長のＩＩ数であ
る）Ｋよシ決定される。７ｘｖなる表示部分は計算因子
と称される。

ｐＨ５〜１０の範囲内ではｐ−ニトロフェノールのモル
吸光率は温度とと４に変化し、従って計算因子も温度と
と％に変化する。この蜜化け（１）使用されえそれぞれ
の検定温度に対する因子を再度計算し、そして（２）検
定の間選ばれた温度を厳重に保持することを心機とする
。

本発明によシ発色性物質の温度依存性を実質的に除去す
るような検定試薬を提供することにより上記の不利点が
克服される。

本発明は酵素を測定するための検定試１１Ｋｍｍする。

さらに詳しくは本発明は発色性物質（ｃｈｒｏｍｏｐｈ
ｏｒ・）の温度依存性を実質的に除去する緩衝剤（ｔた
は緩衝剤の混合物）と組合わせて一色性物質であるｐ−
ニトロフェノールを使用する検定試薬に関する。発色性
物質の温度依存性を除去することによシ試験の正確さが
高められ、そして発色性物質０モル吸光率が温度ととも
に変化する場合に必ｌ！な過ＩＩな計算が省かれる。

本−―によ〉酵素を含有する試料中の酵素を測定するえ
めＯ試薬が提供され、その試薬は試料中の酵素の量に比
例する割合でｐ−ニトロフェノールを遊離することがで
きる基質およびｊｐＫａ／Ｃ＃約−（ＬＯ１０〜ＪＦＩ
−（ＬＯＳ　１　テロ　り　、　ソしてｐｘ亀が２０℃
において５〜１０Ｃ）範囲内である緩衝剤ｔたはそのよ
うな緩衝剤の混合物からなる。

本発明の好ましい態様はα−アミラーゼ、α−グルフシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、酸性ホスファターゼまた
はアルカリ性ホスファターゼを測定するための検定試薬
に関する。

発色性物質であるｐ−二トロフェノールがｐ−ニトロフ
ェニル基を含有する基質から酵素的に遊離せしめられる
場合、つぎの平衡が生起する。

ｐ−ニトクフエノキシド株（ｓｐｓｃｊθＳ）が生成ス
る割合に相応して４０５　ｎｍにおける吸光度が増大し
、吸光度は酵素活性に比例している。基質によ〉遊離せ
しめられるｐ−ニトロフェノールの総量は変化しないが
、温度が変化するにつれＸ） て平衡がシフトし、そして測定されるａｊｔ度は増加す
るかまたは減少する。このように温度の変４ｔ＝−によ
シ掬定される吸光度が変化する九めｋｐ−ニトロフェノ
ールのモル吸光率が変化する。

（１）　ｐ）！　５〜１０の範囲内で緩衝能力を有し、
（２）そル吸光率の変化を補正するような温度依存性の
ｐｌｅａを有する緩衝剤を使用することによ〉、ｐ−ニ
トロフェノール含有検定試薬中のｐ−ニド−フェノール
の温度依存性を除去するか、壇た拡低減することができ
る。このことは試験の正確さを高め、そしてそれぞれの
検定温度に対する計算因子（すなわち１／蓼Ｘ　Ｆ　）
の再計算を省略せしめる。

本発明の検定試＊において使用される基質はｐ−二トロ
フェノール管酵素的に遊離することができるものである
。そのような基質Ｋｄ単糖およびオリゴ鵬のｐ−ニトロ
フェニル誘導体カ含オれる。オリゴ糖Ｏ場合Ｋ　ｈ　ｐ
−ニトロフェニル基は末端のグルコース単位Ｋｍ合して
いる。

そのような基質は米５ｉ％Ｆ［４，１０２，７４７号、
同第４．２５５，４０５号、同第４．１４５，５２７号
、同第４，２２５，６７２号および同第４．１４″１８
６０号各明細書に記載されている。

本発明による特定の検定試薬において使用される基質は
検定される酵素によるであろう。たとえばα−アイラー
ゼを検定する大めに有用な基質は式 （ただし式中、ｎ祉０〜５である）によシ表される群中
よ）選ばれたものおよびそのような基質の混合物である
。

ａ−アミラーゼを検定するために特に好ましい基質には
ｐ−ニトロフェニル−α−１ルトヘンタオシ）’（ｎ＝
３）およびｐ−ニトロフェニル−α−マルトヘキサオシ
ド（ｎ−４）およびそれらの混合物が會首れる。α−グ
ルコシダーゼを検定すゐために好着しい基質にはｐ−ニ
トロフェニル−α−グルコシトオよびｐ−ニトロフェニ
ル−α−マルトシドおよびそれらの混合物が含まれる。

−一グルコシ〆−ゼを検定するために好オしい基質ＫＦ
ｉｐ−ニトロフェニルーー−グルフシ）”＆！（Ｊ’：
ｐ−ニトロフェニルーーマルトシドおよびそれらの混合
物が含まれる。アル食り性シよび酸性ホスファターゼを
検定するえめに好ましい基質はｐ・−二ト１２フェニル
ホスフェートである。

本発明の一定試薬において上記の基質とともに使用され
ゐ緩衝剤はΔｐＫａ／Ｃが約−α０１０〜約−α０５１
であ〕、セして２０Ｃにおいて５〜１０の範囲内のｐｅ
ａを有する。そのような緩衝剤にはたとえば以下の％の
、すなわち メス（ＭＩ８）　　　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸 アメ（ＡＤＡ）　　　Ｎ　−（２−７セトアイド）アミ
ノジ酢酸 ビス−トリスプロパン（Ｂｘｔ−ＴＲＩＢ　ＰＲＯＰＡ
ＮＦｆ）１．５−ビス〔トリス（ヒドロキシ メチル）メチルア（）〕プロパン ア七ス（Ａｃｍａ）　　Ｎ　−（２−７セトアミド）−
２−ア（ノエタンスルホン酸 モプス（ＭＯＰθ）３−（Ｎ−モルホリノ）フロノ々ン
スルホン駿 テス（’ｒｌＢ）　　　Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル
）メチル−２−ア（ノエタンスルホ ン酸 ヘベス（ＨＫＰｌＢ）　Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−ｘｌ　−２１−エタンスルホン酸ヘツブス（
ＩＩＩＰＰＩＩ） Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ ン−Ｎ’−５−ｆロパンスルホン酸 トリジｙ（ＴＲＩＣＩＮＩ） Ｎ−）リス（ヒドロキシエチル） メチルダリシン トリス（テ■８）トリス（ヒドロキシエチル）アぜノメ
タン ビシン（１ｘαｍ）　Ｎ、Ｎ　−ヒス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン グリシル〆リシン（ＧＬＹＣＹＬＧＬＹＣＩＮＩ）チェ
ス（ＣＨ３Ｉ）　　シクロヘキシルア（）エタンスルホ
ン酸 ならびにそのような緩衝剤の混合物が含まれる。

特定の検定試薬中で使用される緩衝性物質のｐ）ＩＦｉ
必ＩＬ＆場合には遣轟な酸および塩基を使用することに
よｐ調節１ｉｔｔゐ、好鵞しくはそのよ５１に駒部を行
うことにより検定される酵素に最適のｐＨの±１　ｐＨ
単位０［−内のｐＨ１−有する緩衝剤が得られる。

本発明の検定試薬は（１）検定されるべき酵素に対して
選ばれた基質、（ｂ）必要な補助酵素および／または活
性化剤、および（Ｑ）必要なｐｅａおよびノｐｅａ　／
　Ｃを有する緩衝剤ま九はそのような緩衝剤の混合物を
混合することにより処方される。

本発明においてはｗＩ素の量が律速であることが必要で
ある。従って検定試薬中のそれぞれの成分鉱観測されゐ
反応速度が測定される酵素に特徴的であ〉、且つその酵
素によシ触媒される反応の速度によシ決定されることｔ
１１実にするのＫｍｍな量で存在すべきである。

本発明によ〉遣蟻な検定試薬を水に溶解すると液体状の
試薬が得られ、その液体状の試薬を酵素を含有する試料
と混合すると、その試薬中に含まれる基質が加水分解さ
れてｐ−＝）ａフェノキシトを住成し、そしてそのｐ−
二トａフェノキシトの生成速度を測定するととによシ酵
素活性が測定される。

本明細書中で使用する場合「酵素」という用語はｐ−ニ
トロフェノールを遊離することがで自る基質の加水分解
を触媒するポリにプチドを表わす。

本尭−をさらによく膳解せしめるために以下Ｋｌ！施例
をあけて説明するが、本発明はそれらによシ限定される
もので線ない。

実施例　！ つぎの緩衡剤は王妃のようにして製造される。

トリス（ＴＲＩＢ）　（α０５Ｍ）−蒸留水４０〇−中
トリＪ＆０２５ｆＯ１１１［１２２℃”ｔ”ｐＨ８，９
７１１”ｔ’１２Ｎ塩酸で滴定し、そしてつぎに希釈し
て５００−となす。

トリス（Ｑ、ＩＭ）−蒸留水４０〇−中トリス４０５０
Ｆの溶液ｔ２２ＣでｐＨ８，９７盲で１２Ｎ塩酸で滴定
し、そしてつぎに希釈して５０〇−となす。

トリス（α５Ｍ）−蒸留水４０〇−中トリス５α２５０
１（Ｄｆ＃液を２２℃でｐＨ９，０１１で１２Ｎ塩酸で
滴定し、そしてつぎに希釈して５０〇−となす。

へ、？！　（ＨＩＰＰＢ）　（ＣＬＯ５Ｍ）　−蒸留水
１０〇−中へイス１１９ｔの溶液ｔ２２℃でへＲスナト
リウム塩の１１９１ｗ（１３０２／１０（ｌｄ）て滴定
り、テｐＨ４９０となす。

ｒ　ＩＪ　Ｖルｌｌ　’Ｊ　Ｖ７　（ＧＬＹＣＹＬＧＬ
ＹＣＩＮＩＸ　Ｑ、０２Ｍ）−蒸留水２０〇−中グリシ
ルグリシン２．４４２Ｆの溶ｌｌＷを２２℃において１
Ｎ水酸化ナトリウムで滴定してｐＨａ３１となし、そし
てつぎに希釈して１ｔとなす。

ダリシルグリシン（０，２０Ｍ）−ＩＩ留水２０〇−中
グリシルグリシン４６ｆの溶１１ｔ２２℃において１Ｎ
水酸化ナトリウムで滴定してｐＨ８，５４となし、そし
てつぎに希釈して２５０−となす。

ホスフェート（ＰＨ０８ＰＨＡＴｌ）　（［１１０Ｍ）
−蒸留水　−１００−中ｘ２ａｐｏ４　ｔ　７４２　ｆ
の溶ｌ１ＩＩを２２℃においてＫＨ２ＰＯ４０ｓｓ　（
ｔ５６１ｔ／１ｏ　Ｏ−）で滴定してｐＨ７，４２とな
す。

１１１にはｐ−ニトロフェノールを含有する４種の緩衝
剤に対する程々の温度での吸光度測定（Ａｄｏ！りが豐
釣されている。Ｉ！に示されたデータに関してイオン化
された種（すなわちｐ−ニトロフェノキシド）の濃度は
１１の容器中の浴液の４０５　ｎｍにおける吸光度に比
例している。

表　　　１ （１）　　　α０５Ｍ　　　８．９７　　　　［ＬＯ５
（Ｌ８，６３　０−８６９　０８７２（２）　　　（１
０５Ｍ　　　１Ｌ９０　　　　（１１０ＱＪ３０８　　
Ｑ、８１３　　Ｑ、８１４（５）　　　１０２Ｍ　　　
＆５１　　　０．１０　　１６５８　１６６１　１６５
４（４）　　　α１０Ｍ　　　７．４２　　　　　［１
１００，５０５肪３０　肪７１（１）ニドリス（ＴＲｌ
８　）、伐）＝ヘペス（）ｌｌＰｌｌＢ）、（３）＝ダ
リシルグリシン（ＧＩ、ＹＣ’ＹＴｊ）Ｉ、ＹＣＩＮＩ
）、（４）＝ホスフェート（ＰＨ０８ＰＨＡＴ］ｅ）表
１に示された吸光度測定に基づけばｐＨの温度依存性が
無視できるような緩衝液（すなわち燐酸緩Ｓ液）中での
ｐ−ニトロフェノキシトの濃度すなわち吸光度は２２℃
〜５７℃の間で約１５−増大すゐことが容易にわかる。

これとＬ対照的にΔｐＫａ／℃が−０，０１［１〜−０
，０３１であｐ％そしてｐＫａが５〜１０の範囲内であ
るような緩衝液中でのｐ−ニトロフェノキシドの濃度す
なわち吸光度は１！Ｊ６よシも小さい変化しか示さない
、゛表２ＫＦｉｐ−二トロフェノールを含有する種種の
満腹の２８［の緩ＩＩｉ濠の種々のａ度における吸光度
測定（Ａ４６５）が要約されている。表に示されたデー
タに関してはイオン化された種（すなわちｐ−ニトロフ
ェノキシト）の濃度は１ａｌの容器中の溶液の４０　Ｓ
　ｎｍ　Ｋおける吸光度に比例している。

表　　　２ （１）　［１０５Ｍ　８．９７αＯ５（Ｌ８６３０１１
６９μｓ７２α１０Ｍ　８．９７　ＱＪ］５０．８７９
０．８８４０Ｊ３８７［１５０Ｍ　？、０１　（ＬＯ５
ＣＬ８７１　ＣＪ−８７６０Ｊ７？（９叩２Ｍ部１　（
Ｌｌｏ　’Ｌ６５８　ｔ６６１１４５４Ｑ２０Ｍ部４α
１０　ｔ６４２１６４５　ｔ６５７（１）＝　）リス（
’ｒＲＩｌｌ）、（３）ニグリン）ｍｙグリシン（Ｇ■
α辺ＬＹＣＤｊｍ）表２に示され友歇党度測定に基づけ
ば使用盲れる緩衝剤が−α０１０〜−α０５１のΔｐＫ
ａ／℃および５〜１０の範囲内のｐｅａ　ｆ有する場合
には、ｐ−二トロフエノキシドの濃度すなわち吸光度嬬
緩衝剤の濃度の変化によシ影響されないことが害鳥にわ
かる。

実施例　■ ２２℃において６．９０のｐＨｔ有するα−アイラーゼ
の検定試薬線表示された濃度を与えるようにつぎの成分
を蒸留水に溶解すゐことによ）製造される。

塩化ナトリ６ム　　　　　　５．０Ｘ１０−”モル／ｌ
ヘペス（ＨＩＰＩＣＢ）　　　　　　　５．ＯＸ　１０
−２モＶｔα−グルコシダーゼ　　　　五３×１０　　
剰Ｖｔ未知の濃度のα−アイラーゼを含有する試料溶液
５０ａｌｔ選ばれた検定温度て検定試薬２−に加え、そ
してつぎに生成する検定溶液を選ばれた温度でインキユ
ベートする。５分後にその検定溶液の吸光度を１　ａｘ
　Ｏ＠話中で４０５ｎｍにおいて測定する。その俵１分
間間隔で吸光度關定を行い、そして１分間あ喪ヤの測定
された吸光度の変化（ΔＡ／分）を計算する。

試料中のα−アイラーゼの濃度は１分間あえシの吸光度
Ｏ賓化に式 ％式％ （ただし式中、ａはそル吸光率であり、そして１は試料
および試薬の容量および光路長の関数である因子である
）から誘導される計算因子（ＣＰ）をかけることによｐ
計算される。５つの興なる検定温＊においてｐ−ニトロ
フェノール　　　１０モル吸光率を測定するとつぎの倣
が得られる。

モル吸光率 ２２℃　　　　　　　８．０８Ｘ１０”５０℃　　　　
　　　８．１３Ｘ１０’６７℃　　　　　　　Ｂ、１４
Ｘ１０ｓ計算因子はモル吸光率の逆数（１／＃）Ｋ式か
ら誘導される因子Ｆをかけることによシ２２℃、３０℃
および３７℃における検定に対して誘導される。

計算因子に対して得られた値はつぎのとおシである。

２２℃　　　　　５０７４ ３０℃　　　　　５０４５ ３７℃　　　　　５０３７ 上鮎の表に示された計算因子に基づけばその因子の変動
線無視できる。すなわち２２Ｃ〜３７℃の間でその変動
は、わずかＣＬ７１１であることが害鳥にわかる。

実施例　墓 ２５℃で７．１のｐＨを有するα−アイラーゼの検定試
薬は表示された濃度を与えるようにつぎの成分を蒸留水
に溶解することにより製造される。

塩化ナトリウム　　　　　　ａＯＸｌｏ−ｓモル／Ｌ燐
酸ナトリウム　　　　　　＆０Ｘ１０−２モＶｔα−グ
ルコシダーゼ　　　　五ＯＸ１０４単、４１ｊｌ未知の
濃度のα−アンラーゼを含有する試料溶液５０＃ｔを選
ばれた検定温度で検定試薬２−に加え、そしてつぎに生
成する検定溶液を選ばれ九温度でインキユベートする。

３分ｖｋＫ検定溶液の＠光度を１ｍ１の容器中で４０５
ｎｍにおいて測定する。その後１分間間隔で吸光度の測
定を行い、１分間あたシの測定された吸光度の変化（Δ
Ａ／分）を計算する。

試料中のα−ア（ラーゼＯｉ１度は式 ％式％ （ただし式中、ｄはモルｒｉｋｊｔ、率であｐ、セして
νは試料および試薬の容量および光路長の関数である因
子である）を使用して実施例１に記載されたようにして
計算される。

３つの異なる検定温度でｐ−二）ｍフェノールのモル吸
光率を測定するとつぎの値が得られる。

２５Ｃ９，０Ｘ１０’ ３０℃　　　　　　　９．５Ｘ１０’ ３７℃　　　　　　１α６×１０６ 計算因子はモル吸光率の逆数（１／ｇ）Ｋ因子νをかす
ることによ如２５℃、３０℃および５７℃における検定
に対して導かれる。計算因子に対する値祉つぎのとおｐ
である。

温　度　　　　計算因子 ２５℃　　　　　１４６４７ ｓＯ℃　　　　　１２，９４７ ３７℃　　　　　１１，６０４ 上記０１ｉ１に示され九計算因子に基づけば因子の変動
は有意である、すなわち変動は２５Ｃ〜３７℃の間で１
＆１１ｉであることが害鳥にわかる。

レイション

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料中の酵素の量に比例する割合でｐ−二トロフェ
   ノールを遊離することができる基質。 および約−α０１０〜約−α０５１のΔｐｌ［ａ　／　
   ℃および２０℃ＫｔｒいてＳ　〜１００１ｉ１！Ｉ内の
   ｐＫａを有する緩衝剤およびそのような緩衝剤の混合物
   からなる、酵素を含有する試料中の酵素を一定するため
   の試薬。 ２）上記の酵素がα−アイラーゼであ夛、そして上記の
   基質が弐　　　　− （ただし式中、ｎは０〜５である）によシ表わ１れる％
   Ｏおよびそのような基質の混合物から選ばれる。４１Ｉ
   許請求の範■纂１項記載Ｏ試薬。 ３）さらＷｃ−ｖルターゼを含む特許請求の範Ｉ！第２
   項記載Ｏ試薬。 ４）マルターゼがα−グルコシダーゼである特許請求０
   ＠ＩＩ第５項記載の試薬。 ５）緩衝剤がトリメ（ヒＶｌｌキシメチル）アミツメタ
   ン、Ｎ−２−ヒト謬キシエチルピ（ラジンーＮ’−２−
   エタンスルホン酸、ダリシルグリシンおよびそれら０ｉ
   ｌ１合物からなる群中よ勤選ばれる　４１許請求の範Ｉ
   ！第２、Ｓまえ社４項記載の試薬。 ６）−嵩がα−ダルコシ〆−ゼであｐ、そして基質が式 によシ表わされるものおよびそれらの混合物から選ばれ
   る、特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ７）　　ＩＩ嵩がβ−グルコシダーゼであシ、そして基
   質が式 によシ表わされるものおよびそれらの混合物から遺ばれ
   る、特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ８）緩衝剤がトリス（ヒドロキシメチル）ア（ツメタン
   、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピイラジンーＮ１−２−エ
   タンスルホンＷＩ１．り’）シルダリシンおよびそれら
   の混合物からなる群中よｐ選ばれる、特許請求の範囲無
   ７また社８項記載Ｏ試薬。 ？）酵素がアルカリ性ホスファターゼでｉｂ、−ｔＬ、
   ？基質がｐ−ニトロフェニルホスフェートである。特許
   請求０＊匪第１項記載の試薬。 １０）　　＠嵩が酸性ホスファターゼであシ、そしてｔ
   ｉ　Ｉｆ　ＩＩ　ｐ−ニトロフェニルホスフェートであ
   ゐ、特許請求の範囲第１項記載の試薬。