JPS58149688A - 補酵素ｑ↓１↓０の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、補酵素Ｑ１ｏの製造法に関し、更に詳しくは
、アルカリゲネスｓｐ、　Ｄ　Ｋ　−６０５またはアル
カリゲネスｓｐ、ＤＫ−５１５を用いる補酵素ＱＩＯの
製造法に関する。

補酵素Ｑ１ｏは、生体内に広く介挿し、末端電子呼吸系
の電子伝達体として重要な役割を果しており、しかして
近年これが医薬として各種疾病（たとえばうつ血性心不
全など）に対してすぐれた薬理作用、生理作用を示すこ
とが明らかにされている。従来、補酵素ＱＩＯを得る方
法としては、動物または植物の組織から抽出し精製する
方法が知られている。しかし、この方法は資源的な制約
など種々の問題を有している。この他、微生物を用いる
製法も知られている。たとえば、補酵素ＱＩＯを産生ず
る微生物には、シュードモナス・デニトリフイキャンス
、アグロバクテリウム・トウメファシエンス、グルコノ
バクタ−・サボーキシダンスなどΩ細菌、ロドスピリイ
リウーム・ルブラ、ロドシュードモナス・カプスレイタ
スなどの光合成細菌、ロドトルラ属、クリプトコツカス
属、スポの ロボロミセス属、キャンデイダ属な１母などがあり、ま
た、糸状菌ではアスペルギルス・フミガチス、タラトス
ポリウム・フルバム、ウスティラボ・ツイアー、ノイロ
スポラ・クラッナ、トレメラ属、オーレオバシデイウム
属、テイレテイオプシス属、エフソバシブイウム属など
が知られている。

さらにアルカリ土類金属に属する微生物、たとえばアル
カリゲネス・フェカリスＡＪ２５６０（微工研ｍ冨第８
４９号）により補酵素ＱＩＯを製造する方法が仰られて
いる（特公昭５１−１９０３４号公報）。しかしこれら
の方法においては補酵素Ｑ１ｏの生産性が低く、現状で
はまだ満足すべ勇ものではない。

本発明者らは、これら従来技術の有する欠点を解決すべ
く種々検討した結果、アルカリ土類金属に属するある種
の新菌株が高収率かつ高純度で補酵素Ｑ１ｏを生産する
ことを見い出し本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨は、アルカリゲネスＳＰ。

ＤＫ−６０５またはアルカリゲネスｓｐ、ＤＫ−５１５
を培養し、生成した菌体より補酵素ＱＩＯを採取するこ
とを特徴とする補酵素ＱＩＯの製造法に存する。

本発明で用いるアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ）ｉｐ、ＤＫ−６０５およびアルカリゲネスｓｐ、Ｄ
Ｋ−５１５は、共に土壌菌からスクリーニングにより分
離された新菌株であり、工業技術院微生物工業研究所に
それぞれ受託番号第６３４２号および同第６３４１号と
して寄託されている。

これら新菌株は次の菌学的性質を有する：アルカリゲネ
ス８Ｐ、ＤＫ−６０５ ■、形態学的性質 肉汁培地中３０℃で１〜２日間静置培養したものにつ含
観察を行った。

１１）細胞の大きさ、形 ０゜９〜１．２μ×１．２〜２．３μの球状桿菌（ｃｏ
ｃｃｏｂａｃｉｌｌｉ　）　　ないし短桿菌（２）集団 単独またはしばしば２連 （３）運動性 なし く４）胞子の有無 なし く５）ダラム染色性 陰性 ■、各培地における生育状態 各培地での培養は３０℃で３日間行った。

ｌｌ）肉汁液体培養 生育：中程度 皮膜：リングを形成 沈渣：あり 混濁：あり （２）肉汁寒天平板培養 形状：正円 周縁：全綴 表面隆起の形：レンズ状 表面：平滑で光沢あり 色調：乳白色 （３）肉汁寒天斜面培養 形状：糸状 表面：平滑で光沢あり 辺縁：全綴 色調：乳白色 透明性：不透明 （４）肉汁寒天斜面培養 表面および上部穿刺にそつで生育 ■、生理学的性質 Ｉｌ＋硝酸塩の還元性ニー （２）脱窒反応　　　ニー １３１　Ｍ　Ｒテスト　　　ニー ＋４１ＶＰテスト　　　−一 （５）インドール生成ニー （６）硫化水素生成　ニー （７）デンプンの加水分解ニー （８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩のみ
を窒素源として利用 （９）色素の形成：たとえばＮＨ４Ｃｌ　Ｑ、　１％、
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０３％、Ｎａ　２　Ｓ　０４
０，０５％、ＫＨ２ＰＯ４０，２１％、 Ｎａ　２ＨＰＯ４・１２　Ｈ２Ｏ１，２％、酵母エキス
０．１％、グルコース ２％および蒸留水（残部）培地 では赤褐色の色素を生産するこ とがある。

αωウレアーゼ　ニー ｔｍオキシダーゼ：＋ ０２１カタラーゼ　：＋ ＋１３１　酸素に対する態度：好気性 −ゼラチンの液化ニー （１５）リドマスミルク：変化なし く１６）生育温度　　　＝２５〜３５℃最適生育温度　
：３０℃ （１η生育ｐＨ：５．Ｑ〜７．３ 最適生育ｐＨ：６．Ｑ〜７．０ ＤＩ糖頌からの酸およびガスの生成ニ ゲルコース、ガラクトース、マルトース、スクロース、
ラクトース、ラフィノース、グリセロールからの酸およ
びガスの生成は認められない ＩＩＩ炭素源の資化性 グルコース　　＋、マンニット　　　　　＋、ガラクト
ース　＋、ソルビット　　　　　　＋、マンノース　　
＋、イノジット　　　　　＋、フルコース　　士、ｍｅ
ｓｏ−エリトリット−、ソルボース　　士、グルコノ−
δ−ラクトン＋、アラビノース　＋、２−ケト−ローグ
ルコネート−、キシロース　　　＋、５−ケト−ローグ
ルコネート　−、リボース　　　＋、クエン酸ナトリウ
ム　−、マルトース　　−、コハク酸ナトリウム　＋、
ラクトース　　＋、アスパラギン酸　　　＋、スクロー
ス　　＋、アスパラギン　　　　＋、トレハロース　＋
、ヒスチジン　　　　　＋、メリビオース　＋、プロピ
オン酸　　　　−、メレジトース　−、酪酸　　　　　
　　　−、ラフィノース　＋、酢ｒ浚ナトリウム　　　
＋、イヌリン　　　−、フェノール　　　　　−、可溶
性テンプンー、エタノール　　　　　＋、グリセリン　
　＋、メタノール　　　　　＋。

■ビタミン要求性：なし く２１１ｃｃコンテント：６５．８モル％■、形態学的
性質 肉汁培地中３０℃で１〜２日間靜置装養したものにつき
観察を行った。

１１）細胞の大きさ、形 ０９〜１２μ×１．２〜２．３μの球状桿菌（ｃｏｃｃ
ｏｂａｃｉｌ　ｌｉ）ないし短桿醒（２）東回 単独またはしばしば２連 （３）運動性 なし く４）胞子の有無 なし く５）ダラム染色性 陰性 ■各培地における生育状態 各培地での培養は３０℃で３日間行った。

Ｉｌｌ肉汁液体培養 生育：中程度 皮膜：リングを形成 沈渣：あり 混濁：あり （２）肉汁寒天平板培養 形状：正円 周縁：金縁 表面隆起の形：レンズ状 表面：平滑で光沢あり 色調：乳白色 （３）肉汁寒天斜面培養 形状：糸状 表面：平滑で光沢あり 辺縁：金縁 色調：乳白色 透明性：不透明 （４）肉汁寒天穿刺培養 表面および上部穿刺にそって生育 ■、生理学的性質 １１）硝酸塩の還元性ニー （２）脱窒反応　　　ニー ＋３１　Ｍ　Ｒテスト　　ニー ＋４１ＶＰテスト　　ニー （５）インドール生成ニー （６）硫化水素生成　ニー （７）デンプンの加水分解ニー （８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩のみ
を窒素源として利用 １９）色素の形成：たとえばＮ）（４Ｃｌ　Ｏ，１％、
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０３％、Ｎａ　２　Ｓ　０４
０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４０，２１ ％、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２Ｏ１，２％、酵母エキス
０１％、グルコ− ス２％および蒸留水（残部） 培地では赤褐色の色素を生産 することがある。

（１０１ウレアーゼ　二十 （１１）オキシダーゼ：＋ （１２カタラーゼ　：十 （１３）酸素に対する態度：好気性 （１４１ゼラチンの液化ニー ｌｌ５）リドマスミルク：微アルカリ ０６）生育温度　　　＝２５〜３７℃ 最適生育温一度　：３０〜３３℃ ｔｉｌｌ生育ｐＨ：５．０〜７．３ 最適生育ｐＨ：６，０〜６５ （１８１糖頃からの酸およびガスの生成ニゲルコース、
ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、
ラフィノース、グリ七ロールからの酸およびガスの生成
は認められない （１９１炭素源の資化性 グルコース　　＋、マンニット　　　　　＋、ガラクト
ース　＋、ソルビット　　　　　　＋、マンノース　　
＋、イノジット　　　　　＋、　　　　゛フルコース　
　士、ｍｅｓｏ−工ＩＪ）ｌＪツ）−、ソルボース　　
士、グルコノ−δ−ラクトン　＋、アラビノース　＋、
２−ケト−ローグルコネート　−、キシロース　　　＋
、　５−ゲトーＤ−グルコネート　−、リボース　　　
＋、クエン酸ナトリウム　＋、マルトース　　−、コノ
・り＃す）ＩＪウム　＋、ラクトース　　＋、アスパラ
ギン酸　　　＋、スクロース　　＋、アスパラギン　　
　　＋、トレハロース　＋、ヒスチジン　　　　　＋、
メリビオース　士、プロピオン酸　　　　−、メレジト
ース　−、酪酸　　　　　　　　−、ラフィノース　＋
、酢酸ナトリウム　　　士、イヌリン　　　−、フェノ
ール　　　　　−、可溶性デンプン−、エタノール　　
　　　＋、グリセリン　　＋、メタノール　　　　　＋
。

■ビタミン要求性：なし これら両菌株の創製方法については同日出願の特許Ｉａ
ｎ＋および（２）に詳細に記載されている。

これら菌株の培養に際し、培地には使用する微生物が資
化しうる炭素源（たとえばグルコース、糖蜜、酢酸、コ
ハク酸、エタノール、メタノールなど）、同化しうる窒
素源（たとえば酵母エキス、ペプトン、コーンスチープ
リカー、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ウムなど）および生育に必要な各種無機塩などを含有さ
せる。

培養は、培地をｐＨ５〜８、好ましくは６〜７−こ調節
し、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃において、
少くとも約２日間、好ましくは２〜６日間、好気的に振
とうまたは攪拌して行う。培養後、培、養液から常法（
たとえば遠心分離、ｐ過など）により菌体を分離する。

得られた菌体中には補酵素Ｑ１ｏが豊富に蓄積されてい
るので、菌体を適当に処理し、菌体に含有されたままの
補酵素を栄養剤、医薬、飼料などに供することができる
。

また、補酵素ＱＩＯを菌体から分離するために、菌体は
、生菌体、乾燥菌体または菌体処理物のいずれでも使用
でべろ。

補酵素Ｑ１ｏの単離は、常套の方法で行うことができる
が、その−例を示せば次の通りである：まずケン化する
ためにメタノール、水酸化ナトリウムおよびピロガロー
ルの混液を画体含有液に添加し、６０〜９０℃で１〜２
時間還流加熱抽出する。次いで、抽出液をｎ−ヘキサン
などの溶媒で抽出し、溶媒相を水洗し、脱水した後、濃
縮する。濃縮物をシリカゲルなどのカラムに添加し、ベ
ンゼンなどの溶媒で展開すると補酵素Ｑ１ｏが溶出する
。補酵素Ｑ１ｏを含む両分を濃縮乾固し、エタノール可
溶部分を冷却放置すると赤黄色の補酵素Ｑｌｏ粗結晶が
得られる。さら（ζエタノールから再結晶をくり返すと
補酵素Ｑ１ｏの純結晶が得られる。このほか、包接化合
物による分離、分子蒸留などを行うことも効果的である
。

次に実施例を示し、本発明方法を具体的に説明する。

実施例１ 容量７ｔのジャーファーメンタ−に、グルコース２重量
％、ペプトン１重量％、酵母エキス１重量％および残り
の水からなる培地（ｐＨ６，５）３ｔを加え、これに同
組成の培地１５０　ｍｌ中で４８時間前培養したアルカ
リゲネスｓｐ、ＤＫ−５９５の培養液を種菌として接種
し、３０℃において、空気を３ｔ／分で通気して７２間
攪拌培養した後、遠心分離により湿陣体ペーストを得た
。これは乾燥菌体として２２．５９であり、この菌体に
は乾燥重量１ｆ当り補酵素Ｑ１０２．Ｏｇｇが含まれて
いた。

得られた湿菌体を水１００　ｍｌ　、メタノール２ロ０
４０９と混合し、８５℃で１時間加熱還流した。

放冷後、ｎ−ヘキサン１ｔで２回抽出した。ｎ−へキサ
ン抽出液を合し、これに無水芒硝を加えて脱水し、次い
で減圧下に濃縮し、残渣をアセトン２０ｍ１に溶解し、
不溶物を沢去した。アセトン溶液を濃縮し、残渣をアセ
トンｓｍｔに再び溶解してシリカゲルカラムに流し、ベ
ンゼンで溶出した。

補酵素Ｑ１ｏを含む両分を合し、濃縮した。残渣をエタ
ノールに溶解して放置すると補酵素Ｑ１ｏの黄色粗結晶
４０ｍｇが析出した。粗結晶をエタノールから再結晶し
て得た純品の逆相薄相クロマトグラフィのＲｆ値、高速
液体クロマトグラフィのリテンションタイム、融点、Ｎ
ＭＲスペクトル、元素分析値、赤外吸収スペクトル、紫
外吸収スペクトルは補酵素ＱＩＯの標品のものと一致し
た。

実施例２ 培地として、グルコース２重量％、ＫＨ２ＰＯ４０、２
１重量％、Ｎａ２ＨＰＯ４−１２Ｈ２０　　１，２重量
％、Ｎ０４Ｃ１　０．５重量％、Ｍ　ｇ　ＮＯ　４　・
７Ｈ２００．０３重量％、”２Ｓ０４　　０．０５重量
％、酵素エキス０．１％および残りの水からなる培地を
用いる以外は実施例１と同様の手順を繰り返して補酵素
Ｑ１ｏの粗結晶３９ｗ９を得た。

実施例３ アルカリゲネスｓｐ．ＤＫ−６０５の代りにアルカリゲ
ネスｓｐ．ＤＫ−５１５を用いる以外は実施例１と同様
の手順で培養を行った。乾燥重量２１ｔの菌体を得た。

この菌体には乾燥菌体１ｆ当り１、４■の補酵素Ｑ１ｏ
が含まれていた。この菌体から補酵素ＱＩＯの粗結晶２
６１ｑを得た。

実施例４ アルカリゲネスｓｐ，　ＤＫ　−　６　０　５の代りに
アルカリゲネス５Ｐ−ＤＫ−５１５を用いる以外は実施
例２と同様の手順を繰り返して補酵素ＱＩＯの粗結晶２
４■を得た。

特許出願人　ダイキン工業株式会社 代理人升理士青山　葆（ほか２名） 手　続　補　正　書（自発） １、事件の表示 昭和５７年特許願第２６５９２号 ２、発明の名称 補酵素Ｑ　の製造法 ０ ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪府大阪市北区梅田１丁目１２番３９号新阪急
ビル 名称　（２８５）　　ダイキン工業株式会社代表者　山
　１）　稔 ５、補正命令の日付：　（自　発） ６、補正の対象二　　　明細書の「発明の詳細な説明」
の欄７、補正の内容 明細書中、次の個所を補正します。

１０発明の詳細な説明の欄 （１）３頁末８行、「フルカリデネル」を「アルカリゲ
ネス」と訂正。

（２）７頁末３行および１２頁９行、［フルコース］を
［フルクトース］と訂正。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリゲネスＳａｐ、ＤＫ−６０５またはアルカ
   リゲネスｓｐ、０Ｋ−５１５を培養し、生成した函体よ
   り補酵素Ｑ１ｏを採取することを特徴とする補酵素Ｑ１
   ｏの製造法。 ２、アルカリゲネスｓｐ、ＤＫ−６０５を用いる特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。 ３、アルカリゲネス８Ｐ、ＤＫ−５１５を用いる特許請
   求の範囲第１項記載の製造法。