JPS6225357B2

JPS6225357B2 -

Info

Publication number: JPS6225357B2
Application number: JP22748782A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Tsuzuki; Akira Nakayama; Hironori Sugai
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1982-12-28
Filing date: 1982-12-28
Publication date: 1987-06-02
Also published as: JPS59120098A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はコール酸（正しくは３α・７α・12α
−トリヒドロキシ−５β−コラン酸）から胆石溶
解剤として或いは利胆剤ウルソデオキシコール酸
（UDC）の合成原料として有用なケノデオキシコ
ール酸（CDC）の製造中間体である12−ケト−
３α・７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸）以
下、本明細書において12−ケトコール酸又は12−
ケト体と略称することがある）を微生物を用いて
製造する方法に関する。従来、コール酸を原料としてCDCを合成する
方法として、コール酸の12位のヒドロキシル基を
脱OHするために、コール酸を選択的に酸化して
12−ケト体とした後還元する方法やメシル化した
後脱メシルし水添する方法などが種々知られてい
る。しかしながら、これらの方法は当然の事乍ら
各反応段階において反応性や選択性の問題があ
り、必ずしも満足出来るものではなかつた。かか
る現状から、近年、微生物学的方法を利用してコ
ール酸から12−ケト体を製造する方法が提唱され
ている（例えば、特開昭56−29998号公報参照）。本発明者等もコール酸からその12−ケト体を微
生物を用いて製造する方法について鋭意研究を進
めた結果、ミクロコツカス属に属する微生物が12
−ケト体生産能を有することを見出し本発明をす
るに至つた。即ち、本発明に従えば、ミクロコツカス属に属
する12−ケト−３α・７α−ジヒドロキシコラン
酸生産能を有する微生物をコール酸を含む栄養培
地で培養して培養物中に12−ケト−３α・７α−
ジヒドロキシコラン酸を生成せしめ、これを採取
することから成る12−ケト−３α・７α−ジヒド
ロキシコラン酸の製造法が提供される。本発明者等は東京都大田区多摩川の土壌よりコ
ール酸を含む培地で12−ケト体を生産する能力を
有する菌を分離することに成功し、この菌株をミ
クロコツカス（Micrococcus）SD−101と命名
し、昭和57年12月17日工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託（微工研菌寄第6841号）した。土壌中よりの菌の分離は次の方法によつた。土壌を１％のコール酸ナトリウムを含む肉汁液
体培地に少量懸濁し、35℃で48時間集積培養を行
ない、得られた培養液の１白金耳量を１％のコー
ル酸ナトリウムを含む肉汁寒天平板培地に画線培
養し、菌株を純枠分離した。これらの菌株を各々
１％のコール酸ナトリウムを含む肉汁液体培地で
８〜72時間培養し、その培養液中の12−ケト体の
定量を行ない、12−ケト体の変換能の高い菌株を
得た。本菌は以下に述べる菌学的性質を有し、バージ
エイズ・マニユアル・オブ・デイタミネイテイ
ブ・バクテリオロジー第７版及び第８版によりミ
クロコツカス属に属する細菌であると同定され
た。更にその他の生理学的性質により本菌はミク
ロコツカスルテアス及びミクロコツカスヴアリア
ンスの類縁菌であると考えられた。ミクロコツカ
スSD−101、ミクロコツカスルテアスIAM1056及
びミクロコツカスヴアリアンスIAM1099の菌学
的性質を対比して列挙すると次表の通りである。
しかしながら、上記公知菌株と比較してクエン
酸、硝酸及びアンモニアの利用性、OFテスト、
糖類の酸化性並びにコール酸の資化性の点で相違
するので新菌株であると断定した。ミクロコツカスSD−101の菌学的性質１顕微鏡（含電顕）所見グラム染色：陽性形態：球菌大きさ：直径0.8μｍ内外多形性：なし運動性：なし勒毛：なし胞子：なし集合形態：２〜30個が集合して存在。２培養所見肉汁寒天平板：３日間の培養で３mm径程のコロ
ニー。濃黄色円形でわずかに盛り上がる。
全縁。光沢あり。肉汁寒天斜面：黄色。流れない。肉汁液体：白濁。黄色の沈渣。肉汁ゼラチン穿刺：ゼラチンを液化。 BCPミルク：アルカリ性。ミルクは変化な
し。３生理学的性質硝酸塩の還元：＋脱室反応：− MRテスト：− VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成（クリグラー培地）：− デンプンの加水分解：− クエン酸の利用（コーザー培地）：＋〃（クリステンセン培地）：
＋硝酸（NO⁻ _３）の利用：＋アンモニア（NH^＋ _４）の利用：＋色素の生成：− ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− カタラーゼ：＋生育の範囲（PH）：６〜12 （温度）：10℃〜38℃ 酸素に対する態度：好気的 OFテスト：Ｏノボビオシン感受性：＋リソザイム感受性：＋塩化ナトリウム存在下生育（５％）：＋〃（10％）：− 〃（15％）：− ４糖類などの酸化とガス発生並びに資化能

【表】ミクロコツカス・ルテアスIAM1056の菌学
的性質１顕微鏡（含電顕）所見グラム染色：陽性形態：球菌大きさ：直径0.8μｍ内外多形性：なし運動性：なし勒毛：なし胞子：なし集合形態：単一なものは少ない。双連、四連
が多い。多数の集合もあり。鎖状はなし。２培養所見肉汁寒天平板：４日間で１mm、１週間で３mm
のコロニー。淡黄色で盛り上がる。光沢あ
り。円形で全縁。肉汁寒天斜面：黄色。肉汁液体：うすく白濁。白色の沈渣肉汁ゼラチン穿刺：孔にそつて糸状に生育、
表面でも生育、ゼラチンを液化せず。 BCPミルク：アルカリ性。ミルクは変化な
し。３生理学的性質硝酸塩の還元：± 脱室反応：− MRテスト：− VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成（クリグラー培地）：− デンプンの加水分解：− クエン酸の利用（コーザー培地）：− クエン酸の利用：± （クエステンセン培地）硝酸（NO⁻ _３）の利用：− アンモニア（NH^＋ _４）の利用：− 色素の生成：− ウレアーゼ：＋オキシダーゼ：− カタラーゼ：＋生育の範囲（PH）：７〜9.5 （温度）：10℃〜40℃ 酵素に対する態度：好気的 OFテスト：− コール酸の資化能：− ４糖類などの酸化とガス発生

【表】ミクロコツカス・ヴアリアンスIAM1099 １顕微鏡（含電顕）所見グラム染色：陽性形態：球菌大きさ：直径１μｍ内外多形性：なし運動性：なし勒毛：なし胞子：なし集合形態：単一あるいは双連、四連、数十個
の集合。鎖状はなし。２培養所見肉汁寒天板：48日間で２mm程のコロニー。濃
黄色。盛り上がる。円形で全縁。光沢あり
湿潤。肉汁寒天斜面：黄色。肉汁液体：白濁。黄色の沈渣肉汁ゼラチン穿刺：糸状に生育、ゼラチンを
液化、表面での生育良好。 BCPミルク：アルカリ性。ミルクは変化な
し。３生理学的性質硝酸塩の還元：± 脱室反応：− MRテスト：− VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成：（クリグラー培地）：− デンプンの加水分解：− クエン酸の利用（コーザー培地）：＋〃（クリステンセン培地）：＋硝酸（NO⁻ _３）の利用：＋アンモニア（NH^＋ _４）の利用：＋色素の生成：− ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− カタラーゼ：＋生育の範囲（PH）：６〜10 〃（温度）：10℃〜40℃ 酵素に対する態度：好気的 OFテスト：Ｏコール酸の資化能：− ４糖類などの酸化とガス発生

【表】本発明方法に従えば、ミクロコツカス属に属す
る12−ケト−３α・７α−ジヒドロキシコラン酸
生産能を有する微生物をコール酸を含む栄養培地
で培養することにより12−ケト−３α・７α−ジ
ヒドロキシコラン酸を生成せしめる。栄養培地中
のコール酸濃度には特に限定はないが、目的12−
ケト体の収量、培養条件及び経済的観点から一般
には５〜500ｇ／、好ましくは40〜300ｇ／の
濃度とする。本発明方法において使用することのできる培地
としては、前記微生物が培養により増殖し得るも
のであれば任意のものでよく、例えば、炭素源と
しては、コール酸塩、リボース、グルコース、フ
ラクトース、シユクロース、酢酸、エチルアルコ
ール、グリセリンなど窒素源としては、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー等の有機窒素、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素が用いら
れる。また、このほかにリン酸２水素カリウム、
リン酸水素２カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ンなどの無機塩が添加される。本発明方法における培養は好気的条件下に、例
れば通気撹拌や往復振盪方法によつて培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一
般的に言えば、温度25〜38℃、PH6.0〜9.0及び８
〜96時間程度の条件で実施する。培養液又は培養物からの目的の12−ケト体の採
取方法は慣用方法に従つて行うことができる。例
えば、培養液を遠心分離し、上清を希塩酸で酸性
にした後、酢酸エチルで抽出する。溶媒を留去し
て生成物を集め、メチルアルコールに溶解後、加
熱還流してメチルエステル化し、冷却して結晶
化、再結晶化する。得られたメチルエステルは常
法に従つて加水分解して目的物を得ることができ
る。以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。実施例１下記組成の培地を500mlの三角フラスコに100ml
加え、120℃で20分間オートクレーブ中で滅菌
し、予め同一培地中で33℃で24時間試験管振盪機
で前培養したミクロコツカスSD−101の培養液５
mlを接種し、33℃で24時間ロータリー振盪培養機
で培養した。培地組成 DIFCO製ニユートリエントブロス 0.4％酵母エキス 0.1％コール酸ナトリウム 1.06％純水に溶解しPHを7.0に調整８時間毎に培養液10mlを採取し、遠心分離
（8000G×５分）し、その上清を1NHClでそのPH
を1.5に調整した。等容の酢酸エチルで３回抽出
し、抽出酢酸エチル層を集め、溶剤を留去する。
次いでメタノール：水＝75：25（容積比）に
0.02Mリン酸を添加した溶媒（以下溶媒Ａとい
う）10mlを加え、残渣を溶解し、高速液体クロマ
トグラフイー用の試料とした。高速液体クロマトグラフイー（島津製LC−
3A、カラムODS−PAK F411）を用い、これに
24時間培養した試料20μｌを注入し、溶媒Ａを１
ml／分の速度で流し、屈折率検出器RID−2Aを
用いて各ピークの検出を行つた。得られたクロマ
トグラムは３つのピークから成つていた。コール
酸及びその誘導体の標準品について同一条件で液
体クロマトグラフイーを行つた結果、第一のピー
クは12−ケト−３α・７α−ジヒドロキシ−５β
−コラン酸と一致し、また第三のピークは原料の
コール酸と一致した。第二のピークは標準品と一
致しなかつた。次に標準品のピークの高さから各時間の抽出物
中のコール酸と生成12−ケト−３α・７α−ジヒ
ドロキシ−５β−コラン酸（12ケト酸と略称）を
定量した。結果は下表に示す通りであつた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１ミクロコツカス属に属する12−ケト−３α・
７α−ジヒドロキシコラン酸生産能を有する微生
物をコール酸を含む栄養培地で培養して培養物中
に12−ケト−３α・７α−ジヒドロキシコラン酸
を生成せしめ、これを採取することを特徴とする
12−ケト−３α・７α−ジヒドロキシコラン酸の
製造法。