JPS5820192A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素番と関する。

酵素反応は、その基質特異性や常温常圧での高反応性の
ために、特に食品や医薬品工業等において利用されてい
るが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解させて酵素反応
を行なわせていた。従って、このような方法によれば、
反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給したり
、また、反応後に酵素を失活させることなく、生成物と
酵素を分離することが非常に困難であって、酵素が不経
済に消費されるうえに、反応が回分式であるので、生産
性に劣る問題があった。

そこで、このような問題を解決するために、酵素を水不
溶性の担体に種々の方法にて固定化し、この固定化酵素
に基質を連続的に反応させることが提案され、既に一部
では実用化されている。酵素の固定化の方法としては、
酵素を共有結合にて担体に結合させる共有結合法が、酵
素が担体から容易には離脱しないために広（採用されて
いるが、従来、酵素の共有結合のための担体として一般
に用いられているセルロース、デキストラン、アガロー
ス等の多糖類誘導体、ポリアクリルアミドゲル等は直径
数酩程度の粒子であって、物理的強度が十分でないため
に、カラムに充填して長期間使用した場合に目詰まりが
起こり、反応効率が低下する欠点があった。一方、物理
的強度があり、比較的成形性にすぐれる再生セルロース
やエチレン−ビニルアルコール共重合体は膜状担体にし
得るが、酵素の固定に必要な官能基が水酸基であるため
、臭化シアン等による活性化処理に複雑困難な操作を要
し、特に担体が膜又はフィルムの場合、活性化が非常に
困難であって、酵素固定化量が少な（、且つ、得られる
固定化酵素の活性収率が低いという欠点があった。

本発明は上記した種々の問題を解決するためになされた
ものであって、物！的強度、成形性共にすぐれ、更に高
い活性収率を有する固定化酵素を提供することを目的と
する。

本発明は、主として一般式 （但し、Ｒは２価の有機基を示す。ン で表わされる繰返し単位からなる水不溶性ポリイミド成
形物が少なくともその表面に右いてイミド開環率が１０
〜１００％に開環され、か（して形成されたカルボキシ
ル基に酵素が固定化されていることを特徴とする。

主として前記一般式！で表わされる繰返し単位からなる
ポリイミド及びその膜の製造方法は特開昭５４−７１７
８５号公報に記載されている。上記ポリイミドは通常、
Ｎ−メチル−２−ピロリドンのような極性有機溶剤中で
１．２，３．４−ブタンテトラカルボンやと一般式 ％式％ （但し、Ｒは前記と同じである。） で表わされるジアミンとをほぼ等モル比で１００〜３０
０℃程度の温度に１０〜５０時間加熱し、脱水縮合させ
ることによって得られる。１．２，３．４−ブタンテト
ラカルボン酸の代わりにその一無水物、二無水物、ジア
ルキルエステル、アミド等も用いることができる。

上記ポリイミドにおけるＲ１即ち上記ジアミンにおける
Ｒは脂肪族、芳香族又は脂環族の２価の炭化水素基、又
はこれらが−ＧｙＨｓ−１−ＣｆＨ（ＣｆＨｓ）−１−
ｃｏ−、−ｏ−１−８αｍ−、−８−　等で結合されて
いる２価の有機基であるが、好ましい代表例はである。

本発明において用いるポリイミドは極限粘度（Ｎ−メチ
ル−２−ピロリドンを溶剤とする３０℃での測定値）が
０．５５〜１．００、好ましくは０．６０〜０．８５で
ある。これを平均分子量に換算すれば２００００〜１２
００００、好まシ（ハ３ｏｏｏｏ〜８ｏｏｏ。

である。また、ポリイミドは反応条件によってはイミド
環に閉環する前駆構造としてアミド結合を有するが、本
発明において用いるポリイミド担体は、 イミド開環率＝ とするとき、表面においてはイミド開環率が１０〜１０
０％であり、表面を除く実質部即ち基体層に、おいては
イミド開環率が０〜３０％であることが望ましし−０即
ち、イミド化率が７０％以上、好ましくは９０％以上、
特に好ましくは９８〜１ｏｏ％である。このように、本
発明において好ましく用い得る担体は、表面がイミド開
環率が１０〜１ｏ。

％、内部が実質的に前記一般式で表わされるイミド繰返
し単位から構成される。このように表面と内部とが異な
る構造の担体は、実質的に前記一般式Ｉで表わされるポ
リイミドを粒子、フィルム、多孔性膜等所要の形状に成
形後、この成形物の表面を加水分解することによって得
られる。イミド構造の前駆構造又はイミド環の加水分解
により生じるアミド酸構造を有する繰返し単位として次
のような例が挙げられよう。

実質的に前記一般式Ｉで表わされるポリイミド構造は物
理的強度、化学的特性にすぐれているので、非多孔性の
フィルムや限外ｐ過性又は逆浸透性の辺択的透過性能を
有する多孔性の膜形状に担体を成形した場合、担体表寧
は酵素固定化のためのカルボキシル基密度が高く、この
担体表面が物理的強度、化学的特性にすぐれるポリイミ
ド構造で一体的に補強されているので、実用上すぐれた
担体を得ることができる。成形物の表面を加水分解する
条件は担体の形状にもよるが、多孔性膜の場合には、通
常、ｐＨ１０〜１２、好ましくは９ｌ−ｆｌＯ１５〜１
１．５の範囲のアルカリ水浴液に１０分乃至数１０時間
、好ましくは３０分〜５時間、３５〜４０℃の温度で浸
漬すればよい。非多孔性のフィルムの一合には、多孔性
膜に比べて苛酷な条件で処理すればよい。成形物表面の
加水分解の程度、即ち、イミド開環率は所要のカルボキ
シル基密度、得られる固定化酵素の活性、担体の強度等
を考慮して適宜に選ばれる。また、物理化学的には成形
物表面の赤外線吸収スペクトルにおけるカルボニル基の
吸光度の変化により加水分解の程度を知ることができる
。尚、このようにして加水分解されたポリイミドは主鎖
が切断されていないため、物理的強度は殆ど低下しない
。

しかしながら、本発明においては、担体が比較的強度を
要しない場合には、担体全体が一様なイミド開環率を有
していてもよい。このような担体のためのポリイミドは
、好ましくは１，２，３．４−ブ　。

タンテトラカルボン酸二無水物を前記したＮ−メチル−
２−ピロリドンのような極性有機溶剤中、前記ジアミン
と３０〜１００℃の温度で反応させてイミド１ｌｌｊ　
Ｆ、Ｖｌ　１００％、即ちイミド構造を含まないポリア
ミド酸を得、この後、加熱温度を１００〜３００℃の範
囲で調整し、イミド化率を任意に制御することにより得
られる。従って、イミド化率を例えば３０〜７０％とし
たポリイミドを得れば、加水分解を要せずして直ちに担
体として用いることができる。

本発明において担体に酵素を結合させる方法は、共有結
合法、イオン結合法のいずれでもよい。本発明において
用いる担体はカルボキシル基を有するため、例えばカル
ボジイミド試薬或いはウッドワード試薬と共に酵素を担
体に反応させれば容易に共有結合にて酵素が固定化され
るが、これらの方法に限定されるものではない。また、
酵素を担体にイオン結合させるには、担体を酵素の水溶
液に浸漬すればよい。

また、！！１１素を共有結合にて担体に結合させる場合
、カルボキシル基にヘキサメチレンジアミンやキシリレ
ンジアミン等、従来からスペーサとして用いられるもの
をスペーサ基として結合し、このスペーサ基の遊離のア
ミノ基に酵素を共有結合させることもでき、本発明にお
いて担体のカルボキシル基に酵素を結合させるとはかか
る場合をも含むものとする。

従って、本発明においては種々の酵素を担体に固定化す
ることができ、具体例としてアミノ酸オキシダーゼ、カ
タラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコース′・オ
キシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシ
ダーゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオ
キシダーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アス
パラギン酸アセチルトランスフェラーゼ、アスパラギン
酸アミノトランスフェラーゼ、グリシンアミノトランス
フェラーゼ、グルタミン酸−オキザロ酢酸アミノトラン
スフェラーゼ、グルタミン酸−ピルピン酸アミノトラン
スフェラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミン
メチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラ
クトキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルト
ランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのよう
な転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステ
ラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルギナーゼ
、Ｌ−アラニンラセマ−ゼ、インベルターゼ、ウレアー
ゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダー
ゼ、パパイン、ヒヤクロニダーゼ、プラスミン、ペクチ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ペプシン、ぺ二シリナーゼ、
ペニシリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファター
ゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニ
ンのような加水分解酵素、アスパラギン拳デカルボキシ
ラーゼ、アスパルターゼ、クエン醐リアーゼ、グルタミ
ン酸デｐルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアー
ゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ
、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテターゼのよ
うなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコースイソメ
ラーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、グルタ
ミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマ
ーゼのような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ビルヒン酸シンターゼのような
りガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は、以上のように、酵素固定化
のための官能基としてカルボキシル基を有するため、担
体の形状を問わず酵素の固定化が簡単−行なえて、しか
も得られる固定化酵素の活性収率が高い。更に、本発明
においては、前記一般式で表わされるポリイミドを基体
とする担体を用いるため、粒子、選択性透過性能を有す
る多孔性膜或いは非多孔性のフィルム等任意形状に成形
でき、特に実質的に前記一般式で表わされるポリイミド
からなる成形物の表面を加水分解して得られる担体は、
担体の基体層が実質的にポリイミドから構成されるため
、物理的強度及び化学的特性にすぐれた固定化酵素が得
られる。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれらに限
定されるものではない。尚、以下に＄いて部は重量部を
示す。

実施例１ 特開昭５４−７１７８５号公報に記載されている方法に
従って、極限粘度〔η〕が０．７６　（３０”ｅ　）イ
ミド化率が９９噂以上であり、前記一般式に詔いてチル
−２−ピロリドン溶液を得た（固形分２５−１Ｂ型粘度
計による３０℃での測定値１８０ポイズ）。

乳鉢で微粉砕した硝酸リチウムをポリイミド１００部当
り１００部の割合て上記ポリイミド溶液に加え、１００
℃で５時間攪拌して均一な溶液とした。この゛溶液をア
ルミニウム板上に厚み３２０μに塗布し、直ちに５０℃
の水浴中に投入、１２０分間浸漬して厚み２５０μの選
択透過性多孔性膜を得た。この膜を５Ｃ１１Ｘ５ｍに切
断し、Ｎａ＠ｍ’０４−ＮａＯＨ緩衝液（０，１５Ｍ　
　Ｎａ５ＨＰＯ４，０，ＩＭ　　ＮａＯＨ％　ｐＨ１１
，０ン　に浸漬し、４０℃で９０分間振とうしながら加
水分―シた。この後、膜を蒸留水で十分に洗浄し、担体
とした。

３００ｄ容量のビーカーに水５０　ｄと上記担体を入れ
、室温で攪拌しながら液状グルコースイソメラーゼ（ナ
ガセ生化学工業社製、６３００　Ｕ／ｉｄ　）　１ｄを
添加後、直ちにｌ−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボシイ、ミド塩＃塩１５０１１９を添加し
、次に０．１Ｎ填酸又は０．Ｉ　Ｎ水酸化ナトリウム水
溶液を逐次添加してｐＨを５．０に調整した。２時間後
、４℃に冷却し、−夜装置して、酵素の固定化を完結さ
せた。この後、トリス−マレイン酸緩衝液（０，１Ｍ）
リス（ヒドロキシメチル）゛アミノメタン、０．１Ｍマ
レイン酸、２ｍＭＩＩ化コバルト、０．１Ｍａｌ！マグ
ネシウム、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で７．５
に調整）で数回洗浄し、本発明による固定化酵素を得た
ー １００ｍ１ｊ容量ビーカーに１Ｍグルコースのトリス−
マレイン酸緩衝液２５−と、上記膜状固定化酵素２．５
　ＣＩＩＸ　２．５　ｅｌｉｔを入れ、振とうしながら
６０”ｅで３０分間反応させた後、０．５Ｍ過塩素酸水
溶液２５　ｍｌを添加して反応を終了させた。この固定
化酵素の活性をシスティン−カルバゾール法により生成
したフラクトース量から測定したところ、２７７．８　
ＴＴ／ｆ−担体であった。但し、１分間に１部モルの７
ラクトースを生成する酵素活性をＩＵとした。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた膜状担体４Ｃ１１Ｘ４Ｃ
Ｉ１１を水５０耐と共に３００ｄ容量ビーカーに入れ、
次に１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩１００ｓＳＦとキシリレンジアミン
１％水溶液３．６ｄを添加し、室温で攪拌下に０．１Ｎ
ｊ！！酸又は０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を添加し
、ｐＨを４，８〜５．５に調整した。３．５時間後、４
℃に冷却し、−夜装置した。この後、蒸留水で十分に洗
浄して、キシリレンジアミンをスペーサとする担体を得
た。

カルボジイミドの存在下に上記担体にグルコースイソメ
ラーゼを実施例１と同様に反応させて固定化した。この
固定化酵素の活性は３０８．８　ＵＮＩ　−担体であっ
た。

実施例３ 極限粘度〔η〕が０．７３、イミド化率が９９％以上で
あり、前記一般式においてＲが ルー２−ピロリドン溶液（固形分１８％、粘度５７ボイ
ズ）を調製した。硝酸カリウムの１５重ｉｔ％Ｎ−メチ
ルー２−ピロリドン溶液を硝酸カリウムがポリイミド１
００部当り５部の割合になるように上記ポリイミド溶液
に加え、均一に混合した。この溶液をガラス板上に厚さ
２５０μに塗布した後、直ちに２５℃のｔ−ブチルアル
コール中に投入、１０秒間浸漬した後、２０秒後ＫＩＯ
℃の水中に投入、１２０分間浸漬した。

得られた膜を実施例１と同様にして加水分解して担体と
し、実施例１と同様にしてグルコースイソメラーゼを固
定化した。この固定化酵素の活性は２５６　ＵＮＩ−担
体であった。

実施例４ 実施例３で得たポリイミドのＮ−メチル−２−ピロリド
ン溶液をガラス板上に厚み１■に塗布し、１２０℃で３
０分間乾燥し、更に１６０℃で１時間乾燥した。冷却後
、水中に一夜浸漬して非多孔性フィルムを得た。このフ
ィルムを実施例１と同Ｓ１にしてｐＨ１１のＮａ　１Ｈ
ＰＯ４−ＮａＯＨ緩衝液に浸漬し、４０℃で４時間振と
う、加水分解し、担体を得た。

この担体に１−シクロ＾キシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミドメト−ｐ−）ルエンスルホン酸
の存在下にジャック脅ビーン由来のウレアーゼを固定化
し、本発明による固定化酵素を得た。活性収率は６８襲
であった。

実施例５ 実施例４で得たフィルム状担体に同様にしてバクテリア
由来のα−アミラーゼを固定化した。活性収率は８２％
、であった。

実施例６ 実施例１で得た担体を室温で０．ＩＮＩ酸中に３０分間
浸漬した後、蒸留水で十分に洗浄した。５０１１４７ｙ
ｄ濃度のα−アミラーゼ水溶液に上記担体を接触させ、
α−アミラーゼをイオン結合にて固定化した。活性収率
は７０％であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）主として一般式 （但し、Ｒは２価の有機基を示す。） で表わされる繰返し単位からなる水不溶性ポリイミド成
   形物が少なくともその表面においてイミド開環率が１０
   〜１００％に開環され、かくして形成されたカルボキシ
   ル基に酵素が固定化されていることを特徴とする固定化
   酵素。
2. （２）ポリイミド成形物の基体層のイミド開環率が０〜
   ３０襲であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   戦の固定化酵素。
3. （３）一般式においてＲが であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の固定化酵素。