JPS597436B2 - 固定化酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は商定化酵素に関する。

酵素反応は、その基質特異性や常湛常圧での高反応性の
ために、特に食品や医薬品工業等において利用されてい
るが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解させて酵素反応
を行なわせていた。

従って、このような方法によれば、反応条件を一定に維
持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵
素を失活させることなく、生成物と酵素を分離すること
が非常に困難であって、酵素が不経済に消費されるうえ
に、反応が回分式であるので、生産性に劣る問題があっ
た。

そこで、このような問題を解決するために、酵素を水不
溶性の担体に種々の方法にて固定化し、この固定化酵素
に基質を連続的に反応させることが提案され、既に一部
では実用化されている。

酵素の固定化の方法としては、酵素を共有結合にて担体
に結合させる共有結合法が、酵素が担体から容易には離
脱しないために広く採用されているが、従来、酵素の共
有結合のための担体として一般に用いられているセルロ
ース、デキストラン、アガロース等の多糖類誘導体、ポ
リアクリルアミドゲル等は直径数ｍｍ程度の粒子であっ
て、物理的強度が十分でないために、カラムに充填して
長期間使用した場合に目詰まりが起こり、反応効率が低
下する欠点があった。

一方、物理的強度があり、比較的成形性にすぐれる再生
セルロースやエチレンービニルアルコール共重合体は膜
状担体にし得るが、酵素の固定に必要な官能基が水酸基
であるため、臭化シアン等による活性化処理に複雑困難
な操作を要し、特に担体が膜又はフイルムの場合、活性
化が非常に困難であって、酵素固定化量が少なく、且つ
、得られる固定化酵素の活性収率が低いという欠点があ
った。

本発明は上記した種々の問題を解決するためになされた
ものであって、物理的強度、成形性共にすぐれ、更に高
い活性収率を有する固定化酵素を提供することを目的と
する。

本発明は、主として一般式 （但し、Ｒは２価の有機基を示す。

）で表わされる繰返し単位からなる水不溶性ポリイミド
成形物が少なくともその表面においてイミド開環率が１
０〜１００％に開環され、かくして形成されたカルボキ
シル基に酵素が固定化されていることを特徴とする。

主として前記一般式Ｉで表わされる繰返し単位からなる
ポリイミド及びその膜の製造方法は特開昭５４−７１７
８５号公報に記載されている。

上記ポリイミドは通常、Ｎ−メチル−２−ピロリドンの
ような極性有機溶剤中で１．２，３．４−ブタンテトラ
カルボン酸と一般式 ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２ ２ （但し、Ｒは前記と同じである。

）で表わされるジアミンとをほぼ等モル比で１００〜３
００℃程度の温度に１０〜５０時間加熱し、脱水縮合さ
せることによって得られる。

１，２，３，４−ブタンテトラカルボン酸の代わりにそ
の一無水物、二無水物、ジアルキルエステル、アミド等
も用いることができる。

上記ポリイミドにおけるＲ、即ち上記ジアミンにおける
Ｒは脂肪族、芳香族又は脂環族の２価の炭化水素基、又
はこれらがーＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、一ＣＯ−
、一〇−、−ＳＯ２−、へＳ一等で結合されている２価
の有機基であるが、好ましい代表例は である。

本発明において用いるポリイミドは極限粘度（Ｎ−メチ
ル−２−ピロリドンを溶剤とする３０℃での測定値）が
０．５５〜１，００、好ましくは０６０〜０．８５であ
る。

これを平均分子量に換算すれば２００００〜１２０００
０、好ましくは３００００；８００００である。

また、ポリイミドは反応条件によってはイミド環に閉環
する前，駆構造としてアミド結合を有するが、本発明に
おいて用いるポリイミド担体は、 イミド環の数 イミド化率＝ ｘ１ｏｏ
（Ｌ：ｆＡイミド環の数＋アミド結合の数 イミド開環率 アミド結合の数 二一一一一一一７−− Ｘ １０ ０ （輪イミド環の
数＋アミド結合の数 とするとき、表面においてはイミド開環率が１０〜１０
０％であり、表面を除く実質部即ち基体層においてはイ
ミド開環率がＯ〜３０％であることが望ましい。

即ち、イミド化率が７０係以上、好ましくは９０楚以上
、特に好ましくは９８〜１００％である。

このように、本発明において好ましく用い得る担体は、
表面がイミド開環率が１０〜１００係、内部が実質的に
前記一般式で表わされるイミド繰返し単位から構成され
る。

このように表面と内部とが異なる構造の担体は、実質的
に前記一般式■で表わされるポリイミドを粒子、フイル
ム、多孔性模等所要の形状に成形後、この成形物の表面
を加水分解することによって得られる。

イミド構造の前１駆構造又はイミド環の加水分解により
生じるアミド酸構造を有する繰返し単位として次のよう
な例が挙げられよう。

実質的に前記一般式■で表わされるポリイミド構造は物
理的強度、化学的特性にすぐれているので、非多孔性の
フイルムや限外沖過性又は逆浸透性の選択的透過性能を
有する多孔性の膜形状に担体を成形した場合、担体表面
は酵素固定化のためのカルボキシル基密度が高く、この
担体表面が物理的強度、化学的特性にすぐれるポリイミ
ド構造で一体的に補強されているので、実用上すぐれた
担体を得ることができる。

成形物の表面を加水分解する条件は担体の形状にもよる
が、多孔性膜の場合には、通常、ｐＨ１０〜１２、好ま
しくはｐＨ１０．５〜１１．５の範囲のアルカリ水溶液
に１０分乃至数１０時間、好ましくは３０分〜５時間、
３５〜４０゜Ｃの温度で浸漬すればよい。

非多孔性のフイルムの場合には、多孔性膜に比べて苛酷
な条件で処理すればよい。

成形物表面の加水分解の程度、即ち、イミド開環率は所
要のカルボ，キシル基密度、得られる固定化酵素の活性
、担体の強度等を考慮して適宜に選ばれる。

また、物理化学的には成形物表面の赤外線吸収スペクト
ルにおけるカルボニル基の吸光度の変化により加水分解
の程度を知ることができる。

尚、このようにして加水分解されたポリイミドは主鎖が
切断されていないため、物理的強度は殆ど低下しない。

しかしながら、本発明においては、担体が比較的強度を
要しない場合には、担体全体が一様なイミド開環率を有
していてもよい。

このような担体のためのポリイミドは、好ましくは１，
２，３，４−ブタンテトラカルボン酸二無水物を前記し
たＮ−メチル−２−ピロリドンのような極性有機溶剤中
、前記ジアミンと３０〜１００℃の混度で反応させてイ
ミド開環率１００％、即ちイミド構造を含まないポリア
ミド酸を得、この後、加熱淵度を１００〜３００℃の範
囲で調整し、イミド化率を任意に制御することにより得
られる。

従って、イミド化率を例えば３０〜７０％としたポリイ
ミドを得れば、加水分解を要せずして直ちに担体として
用いることができる。

本発明において担体に酵素を結合させる方法は、共有結
合法、イオン結合法のいずれでもよい。

本発明において用いる担体はカルボキシル基を有するた
め、例えばカルボジイミド試薬或いはウツドワード試薬
と共に酵素を担体に反応させれば容易に共有結合にて酵
素が固定化されるが、これらの方法に限定されるもので
はない。

また、酵素を担体にイオン結合させるには、担体を酵素
の水溶液に浸漬すればよい。

また、酵素を共有結合にて担体に結合させる場合、カル
ボキシル基にヘキサメチレンジアミンやキシリレンジア
ミン等、従来からスペーサとして用いられるものをスペ
ーサ基として結合し、このスペーサ基の遊離のアミノ基
に酵素を共有結合させることもでき、本発明において担
体のカルボキシル基に酵素を結合させるとはかかる場合
をも含むものとする。

従って、本発明においては種々の酵素を担体に固定化す
ることができ、具体例としてアミノ酸オキシダーゼ、カ
タラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、クルコース・オキ
シダーゼ、グルコース−６ーリン酸デヒドロゲナーゼ、
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、チトクロムＣオキシダ
ーゼ、チロシナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ベルオキ
シダーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アスパ
ラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、アスパラキン酸
アミノトランスフエラーゼ、グリシンアミノトランスフ
エラーゼ、グルタミン酸一オキザ口酢酸アミントランス
フエラーゼ、グルタミン酸一ピルビン酸アミントランス
フエラーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメ
チルトランスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラク
トキナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトラ
ンスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのような
転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、アミノアシラーゼ、アミラーゼ、アルキナーゼ、
Ｌ−アルギニンデイミナーゼ、インベルターゼ、ウレア
ーゼ、ウリカーゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−
ガラクトシダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、ト
リプシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダ
ーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミン、ペク
チナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシン、ペニシリナー
ゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホスホリ；パーゼ、ホスフ
ァターゼ、ラククーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、
レンニンのような加水分解酵素、アスパラキン酸デカル
ボキシラーゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニア
リアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマ
ラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リンゴ酸シンテター
ゼのようなリアーゼ、アラニンラセマーゼ、グルコース
イソメラーゼ、グルコースホスフエートイソメラーゼ、
グルタミン酸ラセマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニン
ラセマーゼのような異性化酵素、アスパラギンシンター
ゼ、グルタチオンシンターゼ、ピルヒン酸シンターゼの
ようなりガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は、以上のように、酵素固定化
のための官能基としてカルボキシル基を有するため、担
体の形状を問わず酵素の固定化が簡単に行なえて、しか
も得られる固定化酵素の活性収率が高い。

更に、本発明においては、前記一般式で表わされるポリ
イミドを基体とする担体を用いるため、粒子、選択性透
過性能を有する多孔性膜或いは非多孔性のフイルム等任
意形状に成形でき、特に実質的に前記一般式で表わされ
るポリイミドからなる成形物の表面をＤ口水分解して得
られる担体は、担体の基体層が実質的にポリイミドから
構成されるため、物理的強度及び化学的特性にすぐれた
固定化酵素が得られる。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれらに限
定されるものではない。

尚、以下において部は重量部を示す。

実施例 １ 特開昭５４−７１７８５号公報に記載されている方法に
従って、極限粘度〔η〕が０．７６（３０℃）イミド化
率が９９％以上であり、前記一般式においてＲが００《
巨ｘであるポリイミ ドのＮ−メチル−２−ピロリドン溶液を得た（固形分２
５％、Ｂ型粘度計による３０゜Ｃでの測定値１８０ポイ
ズ）。

乳鉢で微粉砕した硝酸リチウムをポリイミド１００部当
り１００部の割合で上記ポリイミド溶液に加え、１００
℃で５時間檀拌して均一な溶液とした。

この溶液をアルミニウム板上に厚み３２０μに塗布し、
直ちに５０℃の水浴中に投入、１２０分間浸漬して厚み
２５０μの選択透過性多孔性膜を得た。

この膜を５ｃｆｒＬ×５ｃｒＩ′Ｌに切断し、Ｎａ２Ｈ
ＰＯ４ − ＮａＯＨ緩衝液（０．１５ＭＮａ２ＨＰＯ
４、０．１Ｍ ＮａＯＨ１ｐＨ１ １．０）に浸漬し
、４０℃で９０分間振とうしながら加水分解した。

この後、膜を蒸留水で十分に洗浄し、担体とした。

３００ｒｎｌ容量のビーカーに水５０ｍｌと上記担体を
入れ、室淵で攪拌しながら液状グルコースイソメラーゼ
（ナガセ生化学工業社製、６３００Ｕ／ｍｌ）１麻を添
加後、直ちに１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩１５０ｍ９を添カロし、次
に０，ＩＮ塩酸又は０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を
逐次添加してｐＨを５．０に調整した。

２時間後、４°Ｃに冷却し、一夜放置して、酵素の固定
化を完結させた。

この後、トリス− マＬ／ イン酸緩衝液（ ０．１
Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、０，Ｉ
Ｍマレイン酸、２Ｔ７ＬＭ塩化コバルト、０．１Ｍ硫酸
マグネシウム、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で７
．５に調整）で数回洗浄し、本発明による固定化酵素を
得た。

１００ｍｌ容量ビーカーにＩＭグルコースのトリスーマ
レイン酸緩衝液２５ｍｌと、上記嘆状固定化酵素２．５
ｃｆｒＬＸ２．５ＣｒｒＬを入れ、振とうしながら６０
゜Ｃで３０分間反応させた後、０．５Ｍ過塩素酸水溶液
２５ｍｌを添加して反応を終了させた。

この固定化酵素の活性をシステインー力ルバゾール法に
より生成したフラクトース量から測定したところ、２
７ ７． ８ Ｕ＼ｇ一担体であった。

但し、１分間に１μモルのフラクトースを生成する酵素
活性をＩＵとした。

実施例 ２ 実施例１と同様にして得られた嘆状担体４ｃｒｒＬ×４
ｃｆｒＬを水５０ｍｌと共に３００ｍｌ容量ビーカーに
入れ、次に１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩１００■とキシリレンジアミ
ン１％水溶液３．６ｍ／！を添加し、室淵で攪拌下に０
．ＩＮ塩酸又は０．ＩＮ水酸化ナｌ− ＩＪウム水溶液
を添加し、ｐＨを４．８〜５．５に調整した。

３５時間後、４℃に冷却し、一夜放置した。

この後、蒸留水で十与に洗浄して、キシリレンジアミン
をスペーサとする担体を得た。

カルボジイミドの存在下に上記担体にグリコースイソメ
ラーゼを実施例１と同様に反応させて固定化した。

この固定化酵素の活性は３０８．８Ｕ／ｙ一担体であっ
た。

実施例 ３ 極限粘度〔η〕が０．７３、イミド化率が９９％以上で
あり、前記一般式においてＲが 《巨刈ＣＨ２《巨ＸであるポリイミドのＮ −メチル−
２−ピロリドン溶液（固形分１８％、粘度５７ポイズ）
を調製した。

硝酸カリウムの１５重量％Ｎ−メチル−２−ピロリドン
溶液を硝酸カリウムがポリイミド１００部当り５部の割
合になるように上記ポリイミド溶液に加え、均一に混合
した。

この溶液をガラス板上に厚さ２５０μに塗布した後、直
ちに２５℃のｔ−ブチルアルコール中に投入、１０秒間
浸漬した後、２０秒後に１０゜Ｃの水中に投入、１２０
分間浸漬した。

得られた膜を実施例１と同様にして加水分解して担体と
し、実施例１と同様にしてグルコースイソメラーゼを固
定化した。

この固定化酵素の活性は２５６Ｕ／ｇ一担体であった。

実施例 ４ 実施例３で得たポリイミドのＮ−メチル−２−ピロリド
ン溶液をガラス板上に厚み１ｍｍに塗布し、１２０℃で
３０分間乾燥し、更に１６０°Ｃで１時間乾燥した。

冷却後、水中に一夜浸漬して非多孔性フイルムを得た。

このフイルムを実施例１と同様にしてｐＨ１１のＮａ
２ＨＰＯ４− Ｎ ａＯＨ緩衝液に浸漬し、４０゜Ｃで
４時間振とう、加水分解し、担体を得た。

この担体に１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ
エチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸
の存在下にジャック・ビーン由来のウレアーゼを固定化
し、本発明による固定化酵素を得た。

活性収率は６８係であった。実施例 ５ 実施例４で得たフイルム状担体に同様にしてバクテリア
由来のα−アミラーゼを固定化した。

活性収率は８２係であった。

実施例 ６ 実施例１で得た担体を室淵で０．ＩＮ塩酸中に３０分間
浸漬した後、蒸留水で十分に洗浄した。

５０ｍ９／ｒＩ′Ｌｌ濃度のα−アミラーゼ水溶液に上
記担体を接触させ、α−アミラーゼをイオン結合にて固
定化した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 主として一般式 で表わされる繰返し単位からなる水不溶性ポリイミド成
   形物が少なくともその表面においてイミド開環率が１０
   〜１００係に開環され、かくして形成されたカルボキシ
   ル基に酵素が固定化されていることを特徴とする固定化
   酵素。 ２ ポリイミド成形物の基体層のイミド開環率が０〜３
   ０係であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の固定化酵素。 ３ 一般式においてＲが であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の固定化酵素。