JPS5832960B2 - ホスホジエステラ−ゼオソガイスル シンキカゴウブツノビセイブツニヨルセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規生理活性物質の製造法に関するものであり
、動物体内に存在するアデノシン３′、５７コ シン３’ｓ ５’−環状リン酸の分解を阻害する新規化
合物であるホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−Ｉｔ
たはＰＤＥ −ＩＩの製造法に関するものである。

アデノシン３’，５／−環状リン酸は、現在ステロイド
ホルモンを除く他のほとんどのホルモンの第２の伝達物
質であることが明らかにされてきている。

したがってこのアデノシン３．’ｔ ５’−１ｌｌン酸
を分解する酵素であるアデノシン３，／， ５／ ｉ
状リン酸ホスホジェステラーゼを阻害することは、細胞
内のアデノシン３′，５′−環状リン酸のレベルを制御
することとなり、その阻害剤は各種の生理的効果が期待
される。

たとえば肝臓における糖代謝の改善、強心作用、平滑筋
弛緩作用、気管支拡張作用、冠状動脈拡張作用、脂質代
謝の改善、精神安定作用、体液分泌促進作用、ホルモン
分泌促進作用等を有する可能性を有する。

捷た、アデノシン３／，５／ｉ状リン酸の誘導体である
ジブチリルアデノシン３／，５／ｉ状リン酸は、培養動
物細胞において、ガン細胞の増殖とガン化を抑制するこ
とが知られている，（「蛋白質・核酸・酵素」１８巻厘
１３ １１９５頁、１９７咋）。

このことはアデノシン３／，Ｓ／−環状リン酸ホスホジ
エステラーゼの阻害剤は抗ガン作用を有する可能性が考
えられる。

更に、最近高血圧ラットの血管中にはアデノシン３％５
／ ３Ｊｊ状リン酸含量が低いことが明らかにされ（
「サイエンス」、１７９巻８０７頁１９７３年）、抗高
血圧作用や抗動脈硬化作用をアデノシン３／， ５ ／
−環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害剤が持つこ
とが期待される。

またアレルギーの発現にもアデノシン３／， ５／
ｉ状リン酸が関与していることが発見され（「バイオチ
ク」３巻厘１２、９６２頁１９７２年）、アデノシン３
７， ５／−環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害剤
が抗アレルギー、喘息防止作用等の効果を示すと思われ
る。

具体的にはすでにアデノシン３′，５′−環状リン酸ホ
スホジエステラーゼの阻害作用と精神薬との密接な関係
が明らかにされている（ 「サイエンス」１７６巻４２
８頁１９７２年）。

以上の如く本発明のアテノシン３’、 ５’−ｉ状リン
酸ホスホジェステラーゼの阻害剤は医薬として広範な領
域での利用が充分期待上れる。

また本発明の方法で製造されるホスホジェステラーゼ阻
害物質ＰＤＥ −ＩｔたはＰＤＥ−ｎは、天然から発見
された新規骨格を持つ化合物であり、化学的な興味と共
に生理活性物質の新規な母核を与えるという意味は大き
いと思われる。

本発明の方法で製造される前記の物質ＰＤＥ−■または
物質ＰＤＥ−ｎは次の一般式 〔式中、Ｒは物質ＰＤＥ−Ｉではア□）基（−ＮＨ３）
を表わし、物質ＰＤＥ−Ｉ［ではメチル基（−ＣＨ３）
を表わす〕で示される化合物である。

本発明によると、ストレプト□セス属に属するホスホジ
ェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−ｍ生産菌又はホスホジェ
ステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−ｍ生産菌を好気的に培養し
、その培養物より物質ＰＤＥ−■又は物質ＰＤＥ −Ｉ
Ｉを採取することを特徴トスる、ホスホジェステラーゼ
阻害物質ＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ−Ｉ［の製造方法が提供
される。

本発明の方法で使用されるホスホジェステラーゼ阻害物
質ＰＤＥ−ｍ生産菌又はホスホジェステラーゼ阻害物質
ＰＤＥ−ｍ生産菌の一例としては、本発明者らによって
初めて昭和４８年２月微生物化学研究所の構内の土壌よ
り分離された放線菌でＭＤ７６９−Ｃ６の番号が付され
た菌株がある。

このＭＤ７６９−Ｃ６株は下記のような性状を有する。

１形態 ＭＤ７６９−Ｃ６株は顕微鏡下で分枝した基中菌糸より
気菌糸を伸長し、その先端はループ状、かぎ状、螺旋状
である。

輪生分枝を示さず、菌核等の特殊器官を形成しない。

気菌糸の先端に形成される成熟した胞子鎖は１０個以上
の胞子の連鎖をみとめ、胞子の形は惰円形で、大きさは
０．８〜１．２ミクロン位、胞子の表面はとげ状である
。

２ 各種培地における生育状態 色の記載について０内に示す標準はコンティナコーポレ
ーション・オブ・アメリカのカラー〇／）−モニー０マ
ニュアル（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ Ｃａｒｐ −ｏｒａｔ
ｉｎｎ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａのＣｏ１ｏｒ ｈａｒｍ
ｏｎｙ ｍａｎｕａｌ）によるものである。

（１）シュークローズ・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 黄味灰色（Ｉ Ｖ２ ｄｐ ＃ Ｐａｒｃｈｍｅｎｔ
）の発育上で気菌糸はほとんど着生せず々わずかに白い
気菌糸をつけ、溶解性色素は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
） 黄味灰色ＣＩ Ｖ２ ｄｐｔ Ｐａｒｃｈｍｅｎｔ 〜
ｌｉｄ １ｃｙＬ Ｌ Ａｎｔｉｑｕｓ Ｇｏｌｄ 、
ｌの発育上に白色（３ｂａＰｅａｒｌ ５ｈｅｌｌ Ｔ
ｉｎｔ 、ｌ〜明るい灰色〔５ｄ ｃ ｔＰｕｓｓｙ
ｗｉｌｌｏｗ Ｇｒａｙｌの気菌糸をわずかに着生し、
溶解性色素は認められない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地
−５，２７℃培地） うす黄茶色（３１ｅｔ Ｃａｍｅｌ Ｍａｐｌｅ Ｓｕ
ｇａｒＴａｎ〕〜明るい茶灰色（３ｇ（＋ Ｂａｍｂｏ
ｏ Ｃｈａ −ｍｏｉｓ）の発育上に白〜明るい灰色（
１０ｆｅ。

Ｄｕｓｋ、ｌの気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに
黄茶色を呈する。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＰＳ培地−４，２
７℃培養） 明るいオリーブ色（２１ｅｙ Ｍｕｓｔａｒｄ ０１ｄ
Ｇｏｌｄ）の発育上に白色（３ｂａｔ Ｐａａｒｌ ５
ｈｅｌｌＴｉｎｔ〕〜明るい灰色（１３ｆｅｙ Ｄｕｓ
ｋ Ｐｅｗｔｅｒ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は認
められない。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地７．２７℃培養）
にぶ黄色（２ｇｅｔ Ｂａｍｂｏｏ Ｃｈａｍｏｉｓ
〜２ｐｇｙＭｕｓｔａｒｄ Ｇｏｌｄ）の発育上に白〜
明るい灰色〔１３ｄｅ ｙ Ｐｓａｒｌ Ｇｒａｙ Ｓ
ｍｏｋｅ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は、わずかに
うす黄茶色を呈する。

（６）栄養寒天培地（２７℃培養） 発育は黄味灰色Ｃ１ｙ２ｄ ｂ ＋ Ｐ ａｒｃｈｍｅ
ｎｔ 、］を呈し、気菌糸は着生しない。

溶解性色素はみとめられない。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２，２７
℃培養） うす黄茶色（３ｎｇ＊ Ｙｅｌｌｏｗ Ｍａｐｌｃ）の
発育上に白色（１５ｂａ＊ Ｂｌｕｅ Ｔｉｎｔ）〜明
るい灰色（５ｆ ｅ、 Ａｓｈｅｅ 、ｌの気菌糸を着
生し、溶解性色素はみとめられない。

（８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ培地−３，２７℃
培養） にぶ黄たいたい色〔ＩＶ２ｎｃ、Ｇのｌｄ〕の発育上に
灰白色Ｃ２ｄｃｐ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｔｒｉｎｇ）
〜明るい灰色（５ｆ ｅ ＋ Ａｓｈｅｓ 〕の気菌糸
をわずかに着生し、溶解性色素はみとめられない。

（９）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）発育は灰白
色（２ｄａｙ Ｐｅａｒｌ ５ｈｅｌｌ Ｔｉｎｔ）気
菌糸は矯生じない。

溶解性色素はみとめられない。

（１０）ペプトン・イースト鉄寒天培地（ＩＰＳ培地−
６，２７℃培養） 発育はうす黄たいたい色（２ｄｂｙ Ｉｖｏｒｙ）、気
菌糸は着生せず、溶解性色素はみとめられない。

３ 生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・麦芽寒天を用いて、４°Ｃ，８°Ｃ２１５°
Ｃ９２２°Ｃ９２７°Ｃ２３７°Ｃ９４５°Ｃの各温度
で試験の結果、４℃、８℃を除いてそのいずれの温度で
も生育したが、最適生育温度は２２℃〜２７℃でのった
。

（２） ゼラチンの液化（グルコース−ペプトン−ゼ
ラチン、２２°Ｃ９２７℃培養） ２２℃では１１５程度、層状の液化がみられ、２７℃で
はほとんど液化した。

（３）スターチの加水分解（スターチ−無機塩寒天、２
７℃培養） スターチの氷解性がみられ、その作用は中等度である。

（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養後１４日日日で凝固、ペプトン化はみとめられない
。

（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イーストプ
ロス、■ＰＳ培地−１；ペプトン・イースト・鉄寒天、
■ＰＳ培地−６；チロシン寒天、ＩＰＳ培地−７、いず
れも２７℃培養） トリフトン−イーストグロス、ペプトン−イースト−鉄
寒天及びチロシン寒天ともメラニン様色素の生成はみと
められない。

（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴＩＩ−グ寒天、
２７℃培養） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトース、シュークロース、イノシトール、Ｌ
ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトールを利用し
てよく発育し、セルロースは利用しない。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天、２７℃
培養） リンゴ酸石灰の溶解が、みとめられ、その作用は中等度
である。

以上の性状を要約すると、ＭＤ７６９−Ｃ６株はストレ
プトミセス属に属し、気菌糸の先端はループ状、かぎ状
、螺旋状で胞子の表面はとげ状である。

種々の培地で黄味灰〜黄茶〜にぶ黄色の発育上に白〜灰
色の気菌糸を着生し、溶解性色素は無色〜うす黄茶色を
わずかにおびる。

メラニン様色素はトリプトン・イーストプロス、ペプト
ン・イースト・鉄寒天培地、チロシン寒天培地とも陰性
である。

蛋白分解力、スタンチの氷解性はともに中等度である。

これらの性状より既知菌種を検索すると、ＭＤ７６９−
Ｃ６株に最も近縁の種としてストレプトミセス・グリゼ
オフラヴスＳ ｔｒｅｐ ｔｏｍｙ ｓｅｓ ｇ ｒ−
ｉ ５ｅｏｆ １ａｖｕｓ （Ｋｒａｉｎｓｋｙ ）
Ｗａｋｓｍａｎ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉ ｃｉがあげられ
る。

次にストレプトミセス・グリゼオフラヴスの原記載（Ｂ
ｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅＢａｃｔｅｖｉｏｌｏｇｙ ｐ ６ ｔｈｅ
ｄｉｔｉｏｎ、 Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍａａｎｄ Ｗ
ｉｌｋｉｎｓ Ｃｏｔ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ）および
ＩＰＳ菌株５４５６ （Ｓ −ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕ
ｓ ）の同時培養とＭＤ７６９−Ｃ６株を比較すると、
下記の表に示す如くである。

上記のようにＭＤ７６９−Ｃ６株とストレプトミセス・
グリゼオフラヴスとは生理的性質（シュークロース、ラ
フィノースの利用性および□ルクのペプトン化）におい
て若干の差異がみとめられる。

しかしながら両画は形態的諸性状、各種培地上の諸性状
および上記以外の生理的性質において極めて良く類似し
ている。

したがってＭＤ７６９−Ｃ６株をストレプトミセス・グ
リゼオフラヴスＭＤ ７６９−Ｃ６株と同定した。

なお、ＭＤ７６９−Ｃ６株を工業技術院微生物工業技術
研究所に昭和５０年７月１９日保管委託申請し、微工研
菌寄第３１７８号として寄託しである。

ｍ菌は人工的に、また自然界で変異を起こしやすいが、
本発明にいうストレプトミセス・グリゼオフラヴスＭＤ
７６９−Ｃ６はそれらの変異菌のすべてを包括する。

本発明にいうこれらの菌種は物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤ
Ｅ−Ｉ［を生産し、本菌種およびその変異菌と明確に区
別されないストレプトミセス属の菌はすべてこれを包含
する。

本発明の目的物質ＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ −Ｉ［をその
培養液中に生産せしめる方法は通常の微生物の培養法と
して公知の培養法に準じて行うことができる。

栄養源としては放線菌の栄養源として公知のものを使用
できる。

たとえば市販されているグリセリン、グリコース、ラク
トース、シュークロース、でんぷん、マルトース、糖蜜
などの炭水化物あるいは脂肪（動物脂肪、大豆油、綿実
油などの純植物油）などの炭素源および市販されている
ペプトン、肉エキス、コーンスチ−７”！Ｊ−カー、綿
実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺアミン、カ
ゼイン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウムなどの窒素源と、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム
、硫酸アグイ・シウムなどの無機塩を使用できる。

その他必要に応じて微量の金属塩を添加する。

これらのものはホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ−
ＩおよびＰＤＥ−ＩＩ生産菌が利用し、また物質ＰＤＥ
−ＩおよびＰＤＥ−■の生産に役立つものであればよい
。

公知の放線菌の培養材料はすべて利用できる。

大量生産には、液体培養が好ましい。

培養温度はＰＤＥ−Ｉ又はＰＤＥ −ＩＩ若しくはこれ
らの両物質を生産する微生物が発育し、ＰＤＥ−Ｉ又は
ＰＤＥ −Ｉ［若しくはこれらの両物質を生産する微生
物が発育し、ＰＤＥ−Ｔ又はＰＤＥ−１［若しくはと沌
の両物質を生産する範囲で（２０〜３５℃）適用し得る
が、殊に好ましいのは２５〜３０℃である。

培養は普通ＰＤＥ−丁又はＰＤＥ−１［若しくはこれら
の両物質が充分・に蓄積する昔で継続される。

たとえばグルコース２優、でんぷん２％、大豆粉２％、
酵母エキス０．５％、食塩０．２５％ＣａＣＯ３０，３
２％、Ｃ１１ＳＯ４・５Ｈ２０，０，０００５％、Ｍｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２００，０ＯＯ５％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２
００，０００５％の培地をｐ Ｈ７，４に調整し、滅菌
後ＭＤ７６９−Ｃ６株を斜面培養したものから胞子およ
び菌糸を接種し、２７℃にて好気的に振と５培養を行う
と、培養４〜１０日目に日日中にＰＤＥ−ＩおよびＰＤ
Ｅ−ｎの蓄積がみとめられた。

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩはアテノシン３′。

サー環状リン酸ホスホジェステラーゼの阻害活性の測定
で定量される。

すなわち市販の放射性ラベル化合物アテノシン３／、５
／−環状リン酸−８１４０アンモニウム塩がこの酵素に
より、加水分解され生成するブテノシン５′−リン酸を
、アルミナカラムにて基質ブテノシン３／、５／１３状
リン酸と分離し、未反応のブテノシン３：’、５’−項
状リン酸の放射活性を液体シンチレーションカウンター
にて測定し、阻害活性を知る。

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎは生産菌ＭＤ ７６９−Ｃ
６株を液体培養した時、液体部分と菌体を含む固形部分
に存在する。

液体部分のＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ −ＩＩは水と混和
しない適当な溶媒たとえばｎ−ブタノールや酢酸ブチル
にて酸性側にて振とう抽出できる。

また活性炭などの吸矯斉１］にて液体部分よりＰＤＥ−
ＩおよびＰＤＥ−Ｉ［を吸着せしめ、メタノールや含水
アセトン（ｐＨ８）の如き適当な溶剤にて溶出できる。

また菌体固形部分中のＰＤＩＩ、−ＩおよびＰＤＥ−Ｉ
Ｉは水と混和する。

例えばメタノール、アセトン等にて抽出できる。

そしてこの抽出液を減圧下濃縮し、水溶液とし、水と混
和しない溶媒たとえば酢酸エチルや酢酸ブチルにて、酸
性側にて抽出することにより、精製できる。

これらの液体部分と菌体固形部分の抽出液は、減圧下濃
縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製で
きる。

展開溶媒としてクロロホルム−メタノール系をもちいれ
ば、（９５：５）にてＰＤＥ−ｍは溶出され、結晶状に
得られる。

一方ＰＤＥ−Ｉはクロロホルム−メタノール（９：１）
にて溶出され、その活性部を減圧下濃縮し、メタ／−ル
にてセファデックスＬＨ−２０のクロマトグラフィーを
行うことにより粗結晶が得られる。

これをメタノール等の適当な溶媒にて再結すると、純粋
な結晶が得られる。

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎはその精製法においてその
化学的性質が利用されているように、酸性物質であり、
アルカリにはよく溶けるが各種溶剤に対する溶解性は低
い。

そして物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ｎはよく似ている
が、若干ＰＤＥ−■の方が、溶剤に溶解しやすい。

すなわち、ジメチルスルホキサイド、ピリジンに溶け、
メタノールには難溶であり、エタノール、アセトン、酢
酸エチル、酢酸フチル、クロロホルム、ベンゼン等には
極めて溶けにくいか不溶である。

定性反応はニンヒドリン、エーリツヒ、塩化第二鉄、ザ
ルコツスキー、ファンウルク反応等には陰性でリンモリ
ブデン酸アンモニウム反応にはいずれも陽性であった。

捷たライドン、ス□ス反応に対してはＰＤＥ−Ｉは陽性
で、ＰＤＥ−ＩＩは陰性であった。

本発明にて得られた目的物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−
ＩＩの結晶は、それぞれ２３５℃、２５０’Ｃにて分解
点を与え、元素分析の結果の一例をあげるとＰＤＥ−Ｉ
はＣ：５２．５７％、Ｈ：４．８４％、Ｎ：１４．１３
優、０：２８．４０係を示し、ＰＤＥ−■はＣ：５５．
８１饅、Ｈ：４．７３咎、Ｎ：９．３５φ、０：２７．
８９％を示した。

マスヌベクトルより、ＰＤＥ−Ｉはｍ／’ｅ２９１に、
ＰＤＥ−ＩＩはｍ／ｅ ２９０にそれぞれ分子イオンを
与え、高分解能マススペクトルからＰＤＥ−ＩはＣ１３
Ｂ１３Ｎ３０゜（実測値：２９１．０８５３、理論値：
２９１．０８５３）、ＰＤＥ−Ｉ［はＣ１４Ｈ１４Ｎ２
０５（実測値：２９０．０９１１、理論値：２９０．０
９０２）なる組成を有する。

なお、分子式Ｃ１３Ｈ１３Ｎ３０５の理論値はＣ：５３
．６１％、Ｈ：４．５０優、Ｎ：１４．４３咎、０：２
７．４７％であり、Ｃ１４Ｈ１４Ｎ２０．の理論値はＣ
：５７．９３％％Ｈ： ４．８６％、Ｎ：９．６５俤、
０：２７．５６係である。

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩＩの赤外線吸収スペクト
ルはそれぞれ第１図および第２図に示す。

物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの紫外線吸収スペク
トルはよく似たパ汐−ンを示し、水溶液にてＰＤＥ−Ｉ
は２５３ｍμ（６４１，００００）と３１０ｍμ（６１
７，０００）に極大吸収を示し、Ｇ−６は２６３ｍμ（
ε３８．０００ ）と３１０ ｍｔｔ （ｅ １２．０
００）に極大吸収を示す。

また０、ＯＩＮ塩酸溶液ではＰＤＥ−Ｉは２３６ｍμ（
ε３９．０００ ）と３２０ｍμ（ε１９．０ＯＯ）に
、Ｇ−６は２６６ｍμ（ε３６．ｏｏｏ）と３２４ｍμ
（εｌ ５．０００ ）にそれぞれ極大吸収を示し、０
．０１Ｎ塩化ナトリウム溶液ではＰＤＥ−Ｉは２３４ｍ
μ（ε３３．０００ ）、２５３ｍμ（６３８，０００
）そして３３８ｍμ（５２２，０００）に、Ｇ−６は２
６６ｍμ（ε２６．ｏｏｏ）と３４４ｍμ（１８，００
０）にそれぞれ極大吸収を示す。

物質ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの化学構造は、その
モノメチル体を直接法にてＸ線回折を行い、次式に決定
された。

ＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩの生理学的性質はマウス
に対し、腹腔内投与を行うと、いずれも２５０ｍｇ／ｋ
ｇにて毒性を示さなかった。

ブテノシン３／、３−環状リン酸ホスホジェステラーゼ
に対する阻害活性は以下の方法にて測定し、ＰＤＥ−Ｉ
のＩＤ５ｏは０．６ μｇ／ｖｄｌ、 Ｐ Ｄ Ｅ−Ｉ
ＩのＩ Ｄ、ｏは３．０μｇ／ｍｌの結果を得た。

７テ／ シン３’、 ５’ −環状リン酸＝８−１４Ｃ
アンモニウム塩（２×１０伽）の１×−４モル、７ｘｌ
Ｏ”モルの硫酸マグネシウム、１×１０−３モルのブテ
ノシン５′−リン酸、８Ｘ１０−２モルのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）ホスホジェステラーゼ１０μｌ（蛋
白量は通常０．３１Ｔ１ｇ／７７１１）に、物質ＰＤＥ
−Ｉ又はＰＤＥ−ＩＩを２μｇ１１μＦ、 ０．５μ
ｆｌ、 ０．２５μ、＠、０．１２５μｇ１０μｇをそ
れぞれ合わせて蒸留水にて全容を０．１１１１１とし、
３７℃２０分間反応させた後、未反応のアデノシン３’
ｔ５’−ｉ状リン酸をアルミナにて吸着させ、１×１０
−２モルのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にて溶出し
、その放射活性を測定し、阻害活性を求めた。

以下本発明によるＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ−ＩＩ製造の
実施例を示すが、本発明によりＰＤＥ−ＩおよびＰＤＥ
−ＩＩの性状、生産方法、抽出精製法が明らかにされ
たので、この明細書に記された知見に基いて、本明細書
に記された方法を修飾した方法が容易に設定される。

本発明はそのすべての修飾法を包括し、実施例はその例
示で本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例 １ ブテノシン３’す５’−ｉ状リン酸ホスホジェステラー
ゼ阻害作用を有する物質を産生ずる放線菌ＭＤ７６９−
Ｃ６株（微工研菌寄第３１７８号）の斜面培養から一白
金耳量を、でんぷん２，０饅、グルコース２．０％、大
豆粉２．０％、酵母エキス０．５％、ＭａＣｌｏ、２５
％、ＣａＣＯ３０，３２％、Ｃ１１ＳＯ４，５Ｈ２Ｏ０
，０００５％、ＭｎＣｌ２４Ｈ２００，０００５％、ｚ
ｎＣ１２・７Ｈ２００，００５％を含む培地１１０ｍ１
づつを５００ｍ１容量の振とうフラスコ９０本に分注し
、１２０’Ｃ。

２０分間滅菌したものに接種し、２７℃で毎分１８０回
転の振とうで６日間培養した。

ｐＨは植菌前７．０．１目抜６．８．２目抜５．８．３
目抜６．６．４目抜６゜８．５目抜７．４．６目抜７．
６Ｓｆｉ。

この６日間培養液７．４１を得、υ埼塩酸にてｐＨ２，
０とし、等量のｎ−ブメノールで抽出した。

これを減圧下濃縮乾固し、水６００ｍ１を加え、アンモ
ニア水にてｐＨ８とし、不溶物を除く。

そしてこの可溶液を塩酸にてｐＨ２，０とし、６００Ｔ
Ｌｌの酢酸ブチルにて２回抽出した。

菌体固形部はメタノール２１にて２回攪拌抽出し、これ
を減圧下濃縮し、溶媒留去抜水にて約４００ｍ１とし、
ｎ−ヘキサンにて２回洗浄した。

次にこの水溶液を塩酸にてｐＨ２，０とし、酢酸ブチル
４００ｍ１にて２回抽出した。

これらの酢酸ブチル抽出液を合わせ、減圧下濃縮乾固し
、タール状物質２．２ｇを得た。

このものはアデノシン３／、 ５Ｖ 、３Ｊ状リン酸ホ
スホジエステラーゼ活性に対する５０％阻害率（ＩＤ５
ｏ）は１２．８μｇＡｌであった。

これをシリカゲル（マリンクロット社製シリシックアシ
ド１００メツシユ）２００ｇのカラムにてクロマトグラ
フィーを行い精製した。

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて溶出される
活性フラクションとクロロホルム−メタノール（１：１
）のトップに溶出される活性フラクションカ得られた。

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて溶出される
活性フラクショ７６５０ｒｌ１ｇは更にシリカゲル（マ
リンクロット社製シリシックアシドＣＣ−７スペシヤル
）３０．９にてカラムクロマトグラフィーを行い。

クロロホルム−メタノール（９５：５）にて展開すると
、その活性フラクションよりＰＤＥ−Ｈの純結晶１２０
ｍｇが得られた。

クロロホルム−メタノール（１：１）にて溶出される活
性フラクション３５０１１１ｇは、メタノールに溶解し
、不溶物を除去後、メタノールにて膨潤させたセファテ
ックスＬＨ−２０のカラム（径１．７ｘ５３ｃｒＩＬ）
にて精製を行った。

そしてその活性部を減圧下濃縮乾固し、メタノールにて
再結しＰＤＥ−Ｉの結晶１２．３ｍｇを得た。

実施例 ２ ジャーによる培養は、実施例１のフラスコ培養の場合と
同様な培地を調製し、放線菌ＭＤ７．６９ｊＣ６株（微
工研菌寄第３１７８号）の斜面培養から一白金耳量を接
種し、２日間培養したものを第１次種母とし、同一培養
条件にて種母を２％接種し、２日間培養したものを第２
次種母とした。

培地１５１を３０１容のジャーに仕込み、１２′０°Ｃ
３０分間滅菌し、これに先きの種母を５％植菌し。

温度２７°Ｃ１毎分２５０回転攪拌、通気量毎分１５１
で７日間培養した。

この培養液をバスケット型遠心機で１過し、６１の涙液
を得た、この涙液を６０ｇの活性炭にて処理し、活性成
分を吸着し、水洗後活性炭より５０％アセトン水（ｐＨ
８）１１にて２回溶出し′た。

この溶出液は減圧下溶媒留去し、塩酸にてｐＨ２とし酢
酸ブチル１１で２回抽出した。

菌体固形部はメタノール１１にて２回攪拌抽出後、メタ
ノールを減圧下留去し、水にて５００１ｎｌとし、塩酸
にてｐＨ２とし、酢酸ブチ／Ｌ＝５００ｍｌにて２回抽
出した。

これらの酢酸ブチル抽出液を合わせ、減圧下濃縮乾固し
て、メール状物質７．０．９を得た。

このもののアテノシン３′。５′−環状リン酸ホスホジ
ェステラーゼに対する阻害活性（ＩＤ５ｏ）は１９ μ
ｇ／ｍｌであった。

これをシリカゲル（マリンクロット社製シリシックアシ
ド１００メツシユ）５０ｇのカラムにてクロマトグラフ
ィーを行い、クロロホルム、クロロホルム−メタノール
（９９：１）にて展開後、クロロホルム・メタノール（
９５：５）ＩＣで溶出される活性フラクションより、Ｐ
ＤＥ−ＩＩを結晶状に５９．５ ｍｇｑ４た。

更にクロロホルム・メタノール（９：１）にて展開し、
ＰＤＥ−Ｉを含む活性フラクション８２３ｒｒＪｇを得
、これをセファテックスＬＨ−２０のカラムクロマトグ
ラフィーにて精製し、ＰＤＥ−Ｉの結晶５９．１ｍｇを
得た。

実施例 ３ タンクによる培養はＭＤ７６９−Ｃ６株を実施例１と同
様にして３日間培養した種母を第１次種母とし、同一培
養条件にて第１次種母を１．２５％植菌し、２４時間培
養したものを第２次種母とし、更に１３０１容汐ンクに
培地５（［を仕込み、１２００Ｃ３０分間滅菌し、第２
次種母を０．４８％植菌し、毎分２００回転、通気量１
００％、２７°Ｃ２４時間培養したものを第３次種母と
した。

実施例１と同様な培地を５７ｏｌ容メンクに３００１仕
込み、消泡剤として、アテ力メール０．００５多添加し
、１２０℃３０分間滅菌し、これに第３次種母を２優植
菌し毎分２５０回転で攪拌し、２７°Ｃで１１６時間培
養した。

この培養液をフィル汐−プレスで１過し、１３ｏｌの培
養ｒ液と４５．０ｋｇの菌体固形部を得た。

培養１液は塩酸にてｐＨ２としｎ−メタノール９０１に
て抽出し、これをアンモニア水にてｐＨ７とし減圧下濃
縮乾固し、水９１に溶解し、再び塩酸にてｐＨ２とし酢
酸ブチル９１で２回抽出し、減圧下濃縮乾固し、メール
状物質４４．７９を得た。

このもののアテノシン３’、 ５’−Ｅｉｊ状リン酸ホ
スホジェステラーゼ活性に対するＩＤ５ｏは７．２μｇ
／ｒｎｌであった。

菌体固形部は６０７のメタノールにて２回攪拌抽出を行
い、これを減圧下濃縮（ｓｇ）ｔ、、ｎ−ヘキサン２１
にて洗浄後、塩酸にてｐＨ２とし、酢酸ブチル８１にて
２回抽出し、この抽出液を減圧下濃縮乾固し、汐−ル状
物質５２．１ｇを得た。

このもののアテノシン３’＊ ５’−ＪＪ状リン酸ホス
ホジェステラーゼに対するＩＤ５ｏは３．８μｇ／ｒＩ
ｌｌであった。

これらのメール状物質をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにて精製することにより、ＰＤＥ■の結晶３４１
．４ｍｇを得た。

またＰＤＥ−Ｉはシリカゲルカラムクロマトグラフィー
にて精製した後セファテックスＬＨ−２０にて精製し、
ＰＤＥ−■を結晶状に２３９．６ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

参１図はＰＤＥ−Ｉの、第２図はＰＤＥ−ＩＩの臭化カ
リウム銑中で測定した赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属するホスホジェステラーゼ
   阻害物質ＰＤＥ−ｎ生産菌又はホスホジェステラーゼ阻
   害物質ＰＤＥ−ｎ生産菌を好気的に培養し、その培養物
   より物質ＰＤＥ−Ｉ又は物質ＰＤＥ−ＩＩを採取するこ
   とを特徴とする、ホスホジェステラーゼ阻害物質ＰＤＥ
   −Ｉ又はＰＤＥ−ＩＩの製造方法。