JPS59187786A - 酵素法リン脂質二級アルコ−ル誘導体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、酵素法によるリン脂質二級アルコール誘導体
の製法に関し、従来酵素法によって製造できないとされ
ていたリン脂質二級アルコール誘導体を包含して広い救
囲のリン脂質二級アルコール誘導体の製造ケ可能とした
ｒイカ法リン脂質二級アルコールど導体の製法に関する
。更に詳しくは、従来酵素法で使用されたキャベツ由来
のホスオり・９−ゼＤ（至適温度４０℃す、下、至適ｐ
　Ｈ５，４〜５６）とは昇なって、至適温度６０〜７０
℃、至適７）　Ｈ７付近のホスホリパーゼＤＭの存在下
ｆ、リン脂質と二級アルコールとを反応させるリン脂質
二級アルコール誘導体の製法に関する。 面、本発明に於て、リン脂質二級アルコール誘導体とは
、出発物質であるリン脂質のリン酸構造部分とアルコー
ル構造部分とのエステル結合を、ホスホリパーゼＪ）Ｈ
の作用で加水分解すると同時に、」二記反応に用いる二
級アルコールへ転移させて誘導した、出発物質とは異な
る新しいリン脂質を意味する。 特に、本発明は、下鍔己式（＋） １（ Ａ　−０−Ｐ　−０−Ｅ　　　　　　　　・・・・・・
（１）■ Ｒ 但し式中、Ａは下記（１）又は（１１）を示し、ここで
、Ｒ５及びＲ２け共に一〇−ＣＯＲ１＋であるか、もし
くけ共に一０４□であるか、もしくは式（１）において
Ｒ１とＲ２は−１１−１９の数を示す〕を表わし、上記
に於て、Ｒ１１及びＲ□は同一でも異っていてもよく、
夫々、Ｃ２〜Ｃ２１の飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化
水素基を示し、 Ｂ　ｉｊ、　−（ＣＨｔ）ｙ＃　（ＣＨｓｒｓ、−（Ｃ
Ｈｚ　）　ｔ　”２、−ＣＭ、ＣＨ（ＮＨ，）ＣＯＯＨ
，−ＣＨ，ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ，）、−ＣＨ，ＣＨ，Ｎ　
（ＣＨ，）、、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２０Ｈもしくは−
（Ｃｕｔ　）ｒｒＬＨ（ここで、ｍは１〜５の数金示す
〕を示す、 　５− で表わされるリン脂質と、 ハロケ゛ン、アミノ、アセチノペ水酸基、Ｃ３１、ミ下
のモノ−もしくはジ−アルキルアミノ及びフェニルより
成る群からえらばれた置換基で置換されていてもよいＣ
３〜Ｃ７゜の直弾もしくけ分岐アルキル基又は−ヒ制面
換基で置換されていてもよいＣ４〜Ｃ６の脂環式炭化水
素基Ｒを有する二級アルコール とを、ホスホリ・ぐ−ゼｌ）Ｈの存在下に反応させるこ
とを特徴とする下記式（１） ％式％（） 但し式中、Ａ及びＲは一ヒ記したと同義である、で表わ
されるリン脂質二級アルコール討導体の製法に関する。 従来、ホスホリパーゼＤが、リン脂質たとえば　６− ホスファチジルコリンのコリン塩基−リンやエステルを
加水分解し、遊離塩基とホスファチジン酸を生ずる反応
を触媒することが知られているＣ　Ｍ。 Ｋａｔｅｓ　Ｃａｕ　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｐｈｙｓ
ｉｏｌ　３２．５７１（１９５４）’ｌ］。 更に、リン脂質たとえばレシチンとエチルアルコールと
をホスホリパーゼＤの存在下に反応させると、リン脂質
のリン酸構造部分と該リン脂質のＹＡ基もしくはアルコ
ール構造部分とのエステル結合が加水分解されると同時
にホスファチジル基転移作用により、ホスファチジルエ
タノールを生成することが報告されているＣ　Ｄａｕｓ
ｓｏｎ；Ｂｉｏｃｈｅｍ。 Ｔ、、１０２．２０５　　（１９６５）　　〕：　〔Ｙ
ａｎａ：、！、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ’ｈｅｔｎ、、　、　
２４２．４７７（１９６７））。 上述のようなホスホリンぐ一ゼＤのホスファチジル基転
移作用が知られて以来、この分野における研究が進めら
れ、英国特許ＡＩ、５８１，８１０　　（対応西ドイツ
国公開Ａ　２７１７５４．７　＞の提案が知られている
。 この提案によれＬ７ｆ’　、との提亡の−＃穴で示され
たリン脂質と、水酸基、へロケ゛ン、アミノその他の置
Ｊｑ＋基で置換゛きれていてもよいＣ６までの直鎖もし
く＋ｄ分枝のアルギル基を有する一級アルコールとの前
記キャベツ由来のホスホリパゼーゼＤの酵素作用を第１
１用した一級アルコール転移反応について開示されてい
る。そして、該反応は、５を超える要素原子を貧有（７
ない一級アルコールでのみ起り、若し、５を超える炭素
原子を含廟する該アルコールの場合には、反応の王生成
セ’ＩＩけ対応するホスファチジン酸であると記載され
ている。更に、該提案にはアルコール成分の選択は、上
記の要求を満した一級アルコールである限りとくべつな
制約のないことも１１載されている。 更に、Ｒ，Ｍ、　Ｄａｗｓｏｎは、リン月）−脂質とし
てレシチンを用い、二級アルコールとして２−プロパツ
ールを用い、キャベツ由来の公知ホスホリン（−ゼＤに
よる実験の結果、レシチン基質のホスファチジル基の二
級アルコールへの転移は起らなかったことを報告してい
る［　ＥｉｏＣｈｅｍ、、　Ｊ、、　ｖｏｌ、１０２．
２０５　　（１９６７））。 上述のように、従来ホスホリパーゼＤによるリン脂質と
アルコールとの間の転移反応には一級アルコールとくに
炭素原子数の比較的小さな一級アルコールの場合にしか
生起せず、二級アルコールとの間には生じ々いというの
が技術常識であった。 本発明者外は、従来公知のホスホリ・クーゼＤとは、そ
の至適湿度、至適ｐＨ等で異方るホスホリパーゼＤ生産
能を有する微生物の存在を発見して、既に、特願昭５６
−１６１０７６号、特願昭５６−１６３４７５号に提案
した。 更に研究を進めた結果、該ホスホリパーゼ生産　９− 性徴生物の生産する酵素は、従来、リン脂質二級アルコ
ール誘導体は形成でき々いとなされていたにも拘わらず
、広い鞘囲のリン脂質と二級アルコール間の転移反応を
可能とする酵素的触媒作用を示すという篤くべき事実を
発見した。 不発明者等の研究によれば、リン脂質とたとえばＣ４二
級アルコール２−ブタノールとの間におけるリン脂質二
級アルコール誘導体の形成を触媒する本発明に於て新た
にホスホリパーゼＤＭと呼称する酵素が右任し、このホ
スホリパーゼＤＭの存在下に、前記式（１）で表わされ
るリン脂質と前記の二級アルコールとを反応させること
により、従来製造できないと云われていたリン脂質二級
アルコール成分体を包含して新しい誘導体が製造できる
ことが発見された。 斯くて、畑雑且つ不利益な化学的合成手段を葵。 することなしに、温和且つ各易な条件及び手段で、−１
０− 副反応を伴うおそれもなしに、酵素法によって新しいリ
ン脂質二級アルコール誘導体を好収率で製造できること
がわかった。 従って、本発明の目的は新しい酵素法リン脂質二級アル
コール誘導体の製法を提供するにある。 本発明の上記目的及び更に多くのそ（１の目的々らびに
利点は、以下の紀載から一層明らかとなるであろう。 本発明ワラ法でオＩ］用する原料リン脂質は下記式（１
）％式％ （１） 但し式中、Ａは下記（＋）又は（１１）Ｃ’Ｅ、　−Ｃ
Ｈ，−Ｒ。 を示し、ここで、Ｒ１及びＲｔは共に一〇−ＣＯ，Ｒ，
，であるか、もしくは共に一〇−Ｒ，２であるか、もし
くけ式（１）においてＲＩ　とＲ３は−１１−１９の数
を示す〕を表わし、」二記に於て、Ｒ７１及びＲ８２は
同一でも異っていてもよく、夫々、６７〜Ｃ２１の飽和
もしくは不飽和の脂肪族炭化水素基を示し、 十 Ｂは−（ＣＨ２）、Ｎ　（ＣＤ、）、、−（ＣＤ、）、
ＮＥ、、−ＣＤ２ＣＨ（ＮＥ２）ＣＯＯＨ，−ＣＤ、Ｃ
Ｂ２ＮＨ（ＣＥ、）、−ＣＥ２０Ｈ２Ｎ　（Ｃ’Ｈ３）
、、−ＣＨ２ＣＢＯＨＣＨ，、ＯＨもしくは−（ＣＨ２
）Ｈ〔ここで、兜は１〜５の数１１′Ｌ を示す〕を示す。 上記式（１）原料リン脂質は公知化合物であって、市場
でも入手可能であり、そｔ］自体公知の方法によって天
然物より抽出採取又は合成することができる。例えば、
動植物組織から公知の手段で抽出して得られるレシチン
、ケファリン、ホスファツルセリン、ホスファチジル−
Ｎ−メチルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロ
ール、ホスファチジル−Ｎ、Ｎ−ジメチルエタノールア
ミン、ホスファチシン酸アルキルエステル等の単独或い
は混合物をそのまま若しくは精製して用いることができ
るし、β型リン脂質やアルキルエーテル型リン脂質につ
いても、それ自体公知の方法によってその構造の一部も
しくは全部を化学合成して利用することができる。 本発明方法に於て、上記式（Ｉ）原料リン脂質とホスホ
ＩＪ　ｚＲ−ゼＤＭの存在下に反応せしめる二級アルコ
ールは、０３〜Ｃ１ｏの直鎖もしくは分岐アルキル基Ｒ
又は０４〜Ｃ８の脂環式炭化水素基Ｒを有する二級アル
コールであって、これらは更に、八日ｒン、アミン、ア
セチル、水酸基、Ｃｓ以下のモノ−もしくはジ−アルキ
ルアミノ及びフェニルより一　１３　− 成る群からえらばれた置換基−ｒ−Ｐ換されていてもよ
い。 このよう々二級アルコールの具体例としては、下肥のよ
うに二級アルコールλ・例示することができる。 すなわち、脂肪族アルコールとしては、２−プロパツー
ル、２−ブタノール、２−ペンタ／　−／１＝３−ペン
タノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−へギザ
ノール、３−ヘキサノール、ｌ−ヘキセン−３−オール
、２−ヘプタツール、３−ヘプタツール、２−オクタツ
ール、２−ノナノール、３−ノナノール、２−デカノー
ル、３−デカノール、２．３−ブタンジオール、２−メ
チル−２，４−ベンタンジオール、■−クロロー２−プ
ロノぐノーノへ　１−プロモー２−ブタノール、■−７
ミ／−２−プロノぐノール、ジインプロノやノールアミ
ン、１−アミノ−２−ブタノール、３−ヒト−１４− ロギシー２−ブタノン、族ヤニチル、β−ヒドロキシ酪
鵜シ、ジプロピレンダリコールなど、が例示でき、又、
芳香族アルコールとしてはｌ−フェニルエタノール、１
−フェニル−２−７’ロノぐノール、ｐ−クロロフェニ
ルメチルカルビノール　α−（１−アミノエチル）−ｐ
−ヒドロキシベンツルアルコール、ジフェニルメタノー
ル等が例示でき、更に、脂環式アルコールとしてはシク
ロブタノ−／Ｌ＝、　シクロオクタツールへ　シクロヘ
キサノール、シクロオクタツール、２−クロロシクロヘ
キサノール、１．４−ジヒドロキシシクロヘキサンナト
が例示できる。 上記例示の如き二級アルコールは、天然物、合成品のい
ずれでも利用できるが、目的とする二級アルコール以外
のアルコールを含″！、ないように予め適当な公知手段
を利用して精製して利用するのが好ましい。このような
精製手段の例としては、たとえＩ’：ｊ、：　、Ａ　Ｗ
＋　、？）結晶、アルミナ、シリカグル、活性炭などに
よるカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー及Ｑ・こわ２らの適当な組み合わせ布製手段を例示で
きる。 本発明方法によれば、前記例示の如き式（１）！Ｊン脂
質と上記例示の如き二級アルコールとをホスホリパーゼ
ｌ）Ｊυの存在下にｊ又け７、させる。 この際利用するホスホリパーゼＩ）Ｍとしては、従来公
知のキャベツから抽出さｔたホスホリパーゼＤの至適温
度４０℃以下、至適ｐＨ５，４〜５．６に対しで、至適
温度６０〜７０℃、至適ｐＨ７付近である点で公知ホス
ホリパーゼＤと区別できるホスホｌ）　ｙＲ−ゼＤＡｆ
生江菌の生産するホスホリ・ぐ−ゼＩＢＭが例示できる
。該ホスホリパーゼＤＭは、Ｃ′４二級アルコール２−
エタノールと式（１）リン脂質例えばレシチンとの間に
おけるリン脂質二級アルコールＷ’！；３１体の形成金
触媒する点でも公知ホスホリパーゼＤと区別できる。 このようがホスホリンぐ−ゼＤＡｆ牛産菌の例どしては
、同一出願人の出願に係わる特願昭５６−１６１０７６
号に開示されたノカルディオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏ
ｐｓｉｓ　）属に属するホスホリパーゼ９Ｍ生産菌たと
えばノルカデイオプシス属ＮＯ７’１９株〔１＃ＲＭ−
Ｐ扁６’ｌ　３３　）、同一出願人の出願に係わるｆｉ
−願昭５６−１６３４７５号に開示されたアクチノマデ
ューラ　（ｙｌＣｔ　１ｎｏｒｎ、ａｄｕｒａ　Ｊ属に
属するホスホリパーゼ９Ｍ生産菌たとえばアクチノマデ
ューラ属ＮＯ３６２株〔ＦＥＲＭ−ＰＡ　６１３２　］
等を挙げることができる。至適温度及び至適ｐＨの相違
と共に他のいくつかの相違点と共に、下掲第１表に、本
発明方法で利用するホスホリパーゼＤＭと公知ホスホリ
パーゼＤとの酵素学的性質の差異を示した。 −１７− 公知ホスホリパーゼＤを用いては得られなかったリン脂
質二級アルコール誘導体が、本発明方法で形成できる押
出Ｋ　ｆ＋、ｌ：、この形雰的８１！媒反応に関与する
公知オスホリパーゼＤと本）誘明方法で用いるホスホリ
パ−ゼＪ）Ｍとの上記の如き酵素学的性質の差昇が閏刀
しているものと推測される。勿論、本発明方法は、この
ような作用の推測によって何等の制約もうけるものでは
ない。 −１９一 本発明方法で利用できるホスホリパーゼＤＭを生産する
前記ホスホリパーゼＤＭ生産菌ノカルディオプシス属Ｎ
０７７９株ＩＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、６１３３］及びアク
チ７マデューラ属ＮＯ３６２株［ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、
６１３２１の菌学的性状及びそれらがｌｊ＝産するホス
ホリパーゼＤＭの力価測定法、理化学的性質について以
下に述べる。 ／カルデイオプシス属Ｎ０７７９株［ＦＥＲＭ−ＰＮｏ
、６１３３］の菌学的性状ニー （ａ）形態 グルコースアスパラギン寒天、グリセリンアスパラギン
寒天、酵母麦芽寒天培地等では良好に、また澱粉無機塩
培地では中程度に生育して気菌糸の集落を着生する。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察時期により
若干変化するが、おおむね白色ないし灰白色から明るい
灰色を呈する。 シュークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、オートミール寒
天培地では気菌糸を着生しないか、貧弱−２０＝ にしか着生しない。 寒天培地上に生前させた本菌株を顕＠鏡で観察すると、
気菌糸は０．５〜（１，８μで直線状でゆるく波形又は
屈曲を混じえながら分校をもって長く伸び、気菌糸全体
は数１（）からｌ　Ｏｆ’ｌケ以−１−のすべで胞子か
らなる連鎖によって形成されている。 胞子の大きさは（）、５〜０，８Ｘ０．７Ｘ］、０μで
、はぼ短円筒形で大きさはやや不規則である。 基土菌糸は中０．５〜０　、　ｓ　ａで分枝をもって伸
長し、寒天培地上ではかならずしも分断しないが、液体
培養することによりほとんどの場合細かく分断する。 しかし遊走胞子、胞子のう、菌核等は形成されない。 （１））各種培地上での性状 以下に記載する実験方法は主としてイー・ビー・シャー
リング（Ｔ　ｎｌ、、　、Ｊ　、　Ｓ　ｙｓＬ、　Ｂａ
ｃｌｅｒｉｏｌ、　１６巻、３１３〜３４０．１９６６
年）の方法にしたがって行った。 ２１− 色調は［色の標準−Ｉ（財団法人日本色彩研究所、１９
６４年）を用いて決定し、色相名とともに括弧内に色相
名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を記入した。 培養は２５℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３週間目の
各培地上における観察結果を第２表に示した。但し第２
表中、生育項目に記載した基土菌糸表面の色は胞子着生
前の培養−週間目における観察結果を示しており、胞子
着生力暉く基土菌糸表面の色の？ｌＩｌ固定な培地につ
いては、記載していない。 ２２− （ｃ）生理的性質 １　生Ｗ？ｇ度二５°Ｃ〜３　（１’Ｃ附近で生育腰２
０〜３０″Ｃで最もよく生育する。 ２ゼラチンの液化：液化しない（グルコース・ペプトン
・ゼラチン培地−１−１２５°Ｃ１３週間培養）。 ３　スターチの加水分解二分解する（又ターチ寒天培地
１−１２５°Ｃ１３週間培養）。 ・１　脱脂牛７Ｌの凝固、ペプトン化：凝固、ペプトン
化共にせず（３ｏ’ｃ、：（〜４週間培養）。 ５　メラニン様色素の生Ｉ＃、：ペプトンイースＨＸ寒
天、チロシン寒天で生成する（２５°Ｃ１２へ４０間）
。 （ｄ）炭素ｉｎノ同化性（：４０’Ｃ１Ｈ’ｌ−１６Ｆ
ｌｔＲ養）Ｌ−アラピアース　−　シュークロース　−
Ｄ−キシロース　　−　イ７シト−ル　　−Ｄ−グルコ
ース　　＋　１、−ラムノース　−Ｄ−７ラクトース　
−　　ラフイ７−ス　　−（ｅ）細胞の化学分析 本菌株のディアミノピメリン酸はメソ型であり、２４− ヒＹロキシディアミノピメリン酸を含まない。細胞壁の
糖組成は、アラピアース、キシロース、マデュロース、
ラムノース等を有せず、ガラクｈ−ス、マンノース等を
有する。又本菌株はノカルＶミフール酸を有しない。 以」二の分析結果にツいてＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ｏｆ口］ｅ　　Ｄｐｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂ
ｅｃＬｅｒｉｏｌｏｇｙ　　第８版、　６５７頁〜６５
８頁（１９７４年）や、レシェバリエ（Ｔ　ｎｔｅｒ、
　Ｊ　、　Ｓ　ｙｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
２０巻、４３５頁〜４４３頁、１９７０年）、メイヤー
（Ｉ　ｎｌ：、　、Ｊ　。 Ｓ　ｙｓＬ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２６巻、４８７
百〜４９３頁コ９７６年）らの分類法にしたがって判定
すると、本菌は細胞壁類型（ｃｅｌｌ　ｕ＋ａｌｌ　ｔ
ｙｐｅ）ＩＩＩ型、糖組成類型（ｃｅｌｌ　ｕ＋ａｌｌ
　ｓｕｇａｒ　ｐａｔ、ｔｅｒｎ）Ｃ型となる。 以−Ｌ本菌は、細胞壁類型がＩＩＩ、糖紹Ｉ＃、類型が
Ｃであることか呟しシェバリエの分類法によればグソン
ビレイタイプのアクチ７マデューラ属、サーモアクチア
ミセス属、アクチノビイフイグス属、ゲオダーマトフイ
ラス属のいづれかに属する。 〜２５− しかし本菌は、その形態において気菌糸のすべてか胞子
の長い運針（から戊り、塾生菌糸を細かく分断するか、
内生胞子、遊走胞子、胞子のうか“見い出されない５二
とより、ダソンビレイクイプの７クチ７マデユーラ属（
Ｇｅｎｕｓ　Ａｃ１．ｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｄａｓｓ−
ｏｎｖｉｌｌｅｉ　１．ｙｐｅ）に同定するのが分類上
妥当である。 なお、近年ダソンビレイクイプの７クチ／マデユーラ属
はメイヤーの提起した新属ノカルディオプシス属に統合
され、ノカルディオプシス属の名称で取り扱われること
か一般的である。 そこで本菌は、ノカルディオプシス属ＮＯ？７９　（Ｇ
ｅｎｕｓ　Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ　ｓｐ　Ｎ　０７
７９　）と称することにした。そして本菌は工業技術院
微生物−に業技術研究所に寄託されており、その受託番
号は［−微工研菌寄第６１３３号」である。 本発明で用いるホスホリパーゼＤＭを生産するのに用い
る使用菌としては、ノカルディオプシス属Ｎ０Ｖ７９お
よび本菌株を変異処理した変異株だけでなく、ノカルデ
ィオプシス属（１日属名アク２６− チ７マデユーラ　グソンビレイタイプ属）に属しホスホ
リパーゼＤＭを生産する菌であれば全て利できる。 アクチノマデューラ属ＮＯ３６２株［ＦＥＲＭ−ＰＮｏ
、６１３２］の菌学的性状ニー （ａ）形態 澱粉無機塩寒天、チロシン寒天、酵母・麦芽寒天、オー
トミール寒天培地等では良好に、またグリセリンアスパ
ラギン寒天では中程度に生育して気菌糸の集落を着生す
る。 胞子を着生した菌叢の色は培地の種類、観察時期により
若干変化するが、おおむねやや紫昧を持った灰白色から
灰色を摺する。 シュークロース硝酸塩寒天、栄養寒天、グルコースアス
パラギン寒天では気菌糸を着生しないか、貧弱にしか着
生しない。 寒天培地−１−に生育させた本菌株を顕微鏡で観察する
と、気菌糸は中０．８〜１．２μで分枝し、一部ループ
状又は螺線状をなし、屈曲を混じえなが２７− ら主として直線状を二長く伸び、先端はループ状にゆる
く巻いている場合が多い。 胞子は数１０から１　＋−，＋　ｔ−、）　Ｋ月−の連
鎖状をなして着生し、はぼ気菌糸全体を形成する。 胞子の大きさは（’１．８〜ｉ、２×１．２〜１．７μ
で゛、短円筒又は卵形で、大きさ形ともやや不規則であ
る。 塾生菌糸は巾（）、６〜１．０μで、不規則な分枝なも
って屈曲しなか゛ら伸艮腰遊走胞子、胞子−の！）、菌
核等は形成されない。 また通常、隔壁、菌糸の分断は見られないが、液体培養
により菌糸の分断が見られることもある。 （１））各種培地にでの性状 以下に記載する実験方法は、主としてイー・ビー、シャ
ーリング（１ｎｔ、、　、Ｊ　、　Ｓｙｓ↑、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ。 １６巻、３１３〜３４０．１９６６年）の方法にしたが
って行った。 色調は、Ｆ色の標準−１（財団法へ日本色彩研究所、１
９６４年）を用いて決定し、色相名とともに括弧内に色
相名、彩度番号、明度番号の順に色相記号を記入した。 培養は２５℃で行い、最も生育の旺盛な２〜３週間週間
釜培地上における観察結果を第３表に示した。但し第３
表中、生育項目に記載した塾生菌糸表面の色は胞子着生
前の培養−週間口における観察結果を示しており、胞子
着生が早く塾生菌糸表面の色の判定困難な培地について
は記載していない。 ハ　　８　　　　　　　　　　ぺ　　１ヘ　　　　　　
　　　　ベ　　；へ　　　　　　　　　　１ト　　資１
１−　　　　　　　　　　櫃　　　　　　　　　　宕　
　　　　　　　　　←（ｃ）生理的性質 １　生を温度：１０℃〜３７℃附近で生育し、２０〜３
０°Ｃで最もよく生育する。 ２ゼラチンの液化：液化しない（グルコース・ペプトン
・ゼラチン培地上、２５°Ｃ１３週間培養）。 ３　スターチの加水分解二分解する（スターチ寒天培地
上、２５℃、３週間培養）。 ４脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：凝固せず、ペプ）＞化
する。（３０°Ｃ１３〜４週間培養）。 ５　メラニン様色素の生成：ペプトンイースト鉄寒天、
チロシン寒入で生成する（２５°Ｃ１２〜４日）。 （ｄ）炭素源の同化性（３０°Ｃ１１Ｏ−１６日ｉ養＞
Ｌ−アラピアース　＋　　シュークロース　−Ｄ−キシ
ロース　　＋　イ７シトール　　±Ｄ−グルフース　　
＋　Ｌ−ラム７−ス　−Ｄ−７ラクトース　−　ラフイ
７−ス　　−（ｅ）細胞の化学分析 本菌株のディアミノピメリン酸はメン型であ１）、３１
− 細胞壁の糖組成は、アラビノース、キシロース、ラムノ
ース等を有せず、マデュロース、〃ラクトース、マンメ
ース笠を有する。 以上の分析結果にライてＢｅｒ）７ｅｙ’ｓＭａｎｕａ
ｌ　ｏｆＬｌ＋ｅ　Ｄｅｔｅｒ＋ｏｉｎａｊｉｖｅ　Ｂ
ｅｃｌ、ｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｆｌ’ｓＢ版、６５７頁〜
６５８頁（１９７／１年）や、レジエバ′り工（Ｔ　ｎ
ｔｅｒ、Ｊ　、　Ｓ　ｙ≦甫〕ｍ、　Ｂａｃｌｅｒｉｏ
ｌ、　２０巻、・１３５頁〜／Ｉ４３頁、１９７　（１
年）等の分類法にしたがって判定すると、本菌は細胞壁
類型（ｃｅｌｌ　ｕ＋ａｌ１１、ｙｐｅ）ｌｌｌ型、糖
組成類型（ｃｅｌｌ　ｕ＋ａｌｌ　ｓｕｇａｒ　ｐａｔ
ｌｅ−ｒｎ）［３型となる。 １？大上本菌は、細胞壁類型がｌｌｌ、糖組成類型が１
３であることから、ミクロビスポラ属、ストレプトスボ
ランギウム属、スピリロスボラ属、プラノモノスポラ属
、デルマドフィラス属、アクチノマデューラ属のいづれ
かに属する。しがし本菌はその形態において多数の胞子
〜から成る胞子連鎖を着生し、菌核、胞子嚢、遊走胞子
が見い出されないことより、アクチ７マデューラ属（Ｇ
ｅ肌ＩＳ　Ａｃｔｉ＋ド３２− ｏｍａｄｕｒａ）に同定するのが分類学上、最も妥当で
ある。 そこで本菌は、アクチノマデラーラ属ＮＯ３６２（Ａｃ
ｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｓｐ　Ｎ　Ｏ３６２）と称する
ことにした。そして本菌は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されており、その受託番号は「微工研菌寄第
６１３２号（ＦＥＲＭ　Ｐ−６１３２）Ｊである。 本発明で用いるホスホリパーゼＤＭを生産するのに利用
する使用菌としては、」−記したアクチ７マデューラ属
ＮＯ３６２、及び本菌株を変異処理した変異株だけでな
く、アクチノマデューラ属に属しホスホリパーゼＤを生
産する菌であれば全て用いる事かで外る。 本発明方法で利用するホスホリパーゼＤＭを、」−記例
示の如きホスホリパーゼＤＭ生産菌を用いて製造するに
は、」−記例示の如きホスホリパーゼＤＭ生産菌を培地
に培養し、培養物よりホスホリパーゼＤＭを採取すれば
よい。その培養形態とし＝３３− ては、液体培養、固体培養いづれも用いることが出来る
が、工業的には深部通気攪拌培養を行うのが有利である
。 また使用する培養源としては、−・殻に微生物培養に用
いられる炭素源、窒素源、無機塩、及びその他の＠量栄
養素の他、／カルデイオプシス属やアクチ７マデューラ
属に属するホスホリパーゼ１）Ｍ生産微生物の利用する
ことの出来る栄養源であれば、すべて使用することか出
来る。 培地の炭素源としては、例えばブＶつ糖、果糖、ショ糖
、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、糖蜜、ソル
ビトール等の他、脂肪酸、油脂、粗レシチン、アルコー
ル、有機酸などを例示でき、これらは単独でまたは組合
せて用いることができる。 窒素源としては、無機窒素源、有機窒素源いづれでも利
用可能であり、無機窒素源としては、例えば硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、燐酸１
アンモニウム、燐酸２アンモニウム、塩化アンモニウム
等が挙げられ、また有３４− 機窒素源としては、大豆、米、とうもろこし、綿実、菜
種、小麦などの粉、糠、脱脂粕をはしめ、コーンスチー
プリカー、ペア’）ン、酵母エキス、肉エキス、カゼイ
ン、アミノ酸等が例示でトる。 無機塩及び＠量栄養素としては、例えばリン酸、マグネ
シウム、カリウム、鉄、アルミニウム、カルシウム、マ
ンガン、亜鉛等の塩類の他、ビタミン、非イオン界面活
性剤、消泡剤静菌の生育やホスホリパーゼＤＭの生産を
促進する適当な物質を例示で外、必要に応して使用出来
る。 培養は好気的条件で行なわれる。培養温度は菌が発育し
、ホスホリパーゼＤＭを生産する温度範囲で適宜変更選
択でとるが、特に好ましいのは約２０〜約３５°Ｃであ
る。 培養時間は条件により異なるが、ホスホリパーゼＤＭが
最高生成量に達するまで培養すればよい。 液体培養の場合は例えば１〜３日程度である。 培養物中に生成したホスホリパーゼＤは、液内培養では
主として培養液中に溶けているので、培養終了液より固
形物を炉別して得られる培養が液よＩ）ホスホリパーゼ
ＤＭを採取できる。 培養が液中よＩ）ホスホリパーゼＩ）　Ｍを採取するに
当っては、通常酵素精製に用いられるあらゆる方法か利
用出来る。例えば硫安、食塩等にょる塩析、アセトン、
エタノール、メタ７−ル等の有機溶剤による沈澱、透析
、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフ
ィー、デル濾過、吸着剤、等電点沈澱等の方法が使用出
来る。さら（ここれ等の方法を適当に組み合せることに
よって、ホスホリパーゼＤＭの精製効果が−にる場合に
は、組合せて行うことが出来る。 ト述のようにして相ることのできる本発明）ｊ法で利用
できるホスホリパーゼＤＭは、たとえば安定化削として
各種塩類、糖質、蛋白質、脂質、界面活性剤等を加える
が、もしくは加えることなく、減圧濃縮、ｊ成圧乾燥、
凍結乾燥等の方法により液状又は固形のホスホリパーゼ
ＤＭの形態にすることが出来る。本発明方法で利用する
ホスホリパーゼＩ）Ｍの酵素活性測定法は、基質グリセ
ロ燐脂質に作用してリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解して生ずる塩基の量を測定して求める。ホスホ
リパーゼＤＭの活性は、特に記載しないかぎ１）、以下
に記載するコリンオキシダーゼ法により測定した。 力価測定法： １％卵Ｔｌｊ　Ｉｉ　製レシチンエマルジョン（０，１
ｇレシチン、１＋ｎｌエチルエーテル、１０ｍ１蒸留水
の超音波乳化液）０，１ｍｌに、０．２ＭｐＨ７，２）
リス−塩酸緩衝液（’）、１ｍｌ、Ｉ）、　Ｉ　Ｍ　Ｃ
ａＣｌ、水溶液０゜（１５ｍｌ、蒸留水０．１５ｍ１を
混合し、これに酵素液０，１ｍｌを加え、３７°Ｃで２
０分反応後、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａを含む１Ｍ）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．２ｍｌを加え、直
ちに５分間煮沸して反応を完全に停止する。次にコリン
エステラーゼ測定用試薬〔日本商事（株）製造〕のキッ
トに含まれるコリン呈色剤を呈色溶解液に溶解した溶液
４ｍｌ加え、３７℃で２０分間反応させた後、３３７ 一５ＯＯｎの吸光度を測定する。 月！１１ｔとしては、あらかしめ熱失活した酵素液を用
いて同様に反応させたものの吸光度を測定する。 そして１分間に１μモルのコリンを遊離する酵素活性を
１単位とする。 前述した７カルデイオプシ又属Ｎ（’１７７９株及びア
クチ７マデューラ属Ｎ（−）３６２株の夫々を用い、後
記９精製方法に記載した方法により精製した酵素標品を
用いた本発明方法で利用できるホスホリパーゼＤＭの理
化学的性質についで以下にのべる。 １作用 グリセロリン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結
合を分解してホス７アチノン酸と塩基を遊離する。 ＣＨ，０ＣＯＲＣＨ２０ＣＯＲ １ ３８− ２　基質特異性 基質としてレシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリ
ンのいづれか１つを０．５μモル含むエマルソヨン０，
１ｍｌを用い、蒸留水の代りに１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１０（、）を含む水溶液を用いる以外は、」二記力価測
定法と同様にして反応させ遊離したコリン量を測定し、
各基質に対するホスホリパーゼＤＭ活性を測定した。そ
の結果、レシチンに対する活性を１００とした時の相対
活性は、メカルデイオプシス属ホスホリパーゼＤＭニー
リゾレシチン４．９；スフィンゴミエリン０．３、アク
チノマデューラ属ホスホリパーゼＤＭニーリゾレシチン
３．６：スフインゴミエリン０，３、であった。 ３　至適ＤＨ 力価測定法において用いる緩衝液の代りにｐＨ３，０〜
４．０では蟻酸・蟻酸ソーダ緩衝液、ｐ　Ｈ４，０〜５
．５では酢酸・酢酸ソーダ緩衝液、ｐＨ５，５〜８．５
ではトリス・マレイン酸・苛性ソーブ緩衝液、＋１　ｔ
Ｉ７　、ｆ’、１〜９．０ではトリス・塩酸緩衝液、ｌ
］　）ｌ　９　、　ｆ’、）〜Ｎ１ｊ）ではグリシン・
苛性ソーダ緩衝液を用いてホスホリパーゼＤＭの活性を
測定し、至適１］Ｉ］を求めた、１また同測定法で用い
る蒸溜水（１，１５＋ｎｌの代りに１％Ｔｒｉ１．ｏｎ
　Ｘ−１００（和光純薬）水溶液０，１．５ｍｌを用い
た時の至適、　Ｉ−（についても求めた。 その結果、蒸留水を用いた場合、 メカルデイオプシス属ホスホリパーゼＤＭニー至適１ｄ
（７付近（６，５〜７　、　（１）、アクチノマデュー
ラ属ホスホリパーゼＩ’）Ｍニー至適１）ｌ−１７付近
、 であり、１％Ｔｒｉ１．ｏｎ　Ｘ　−１０（ｉ水溶液を
用いた場合、 メカルデイオプシス属ホスホリパーゼＤＭニー至適ｐｌ
（５付近、 マクチ７マデューラ属ホスホラパーゼｒ）Ｍニー至適１
）Ｉ−１５、５イ」近、 であった。 ４　至適温度 力価測定法において、反応温度条件を１０．２０．２５
．３７．４０，５０．５５．６０．７０．８０および９
０℃で酵素活性を測定した。その結果、 ノカルディオプシス属ホスホリパーゼＩ”）Ｍニー至適
温度６０℃〜８０℃、とくには６０°Ｃ〜７（’）’Ｃ
。 アクチノ→デューラ属ホスホリパーゼＤＭニー至適温度
５５℃〜８０℃、とくには６０°Ｃ〜７０℃、 と認められた。 ５　　ｐＨ安定性 酵素溶液０．１ｍｌに、ノカルディオプシス属ホスホリ
パーゼＤＭの場合は０．２ｍｌのアクチ７マデューラ属
ホスホリパーゼＤＭの場合には０．９ｍ１の０１１Ｍの
各種緩衝液、すなわちｐＨ３，０〜３゜５ではグリシン
・塩酸緩衝液、ｐＨ３，５〜７．０では酢酸・酢酸ソー
ダ緩衝液、ｐＨ５，０〜８．０４１− ではトリス・マレイン酸・苛性ソーダ緩衝液、ｐ　Ｈ７
、（ｌへ９　、ｆ’）ではトリス・塩酸緩衝液、ｌ）　
Ｉ−１９。 ０〜！Ｊ、５ではグリシン・７Ｍ性ソーダ緩衝液を夫々
加え、２５℃で２時間保った。その後、これら酵素緩衝
溶液に＋１．５　Ｍ　）　’）ス・塩酸緩衝液（＋）　
１−１７．２）を、Ｚカルデイオプシス属ホスホリパー
ゼＤＭの場合には１．２ｍｌ、マクチ７マデューラ属ホ
スホリパーゼＤＭの場合には９．０ｍｌ加え、ｐＨを７
．０〜７．３とした。この溶液０．１ｍｌを用い、力価
測定法に従って力価を測定し、安定、　Ｉ−１範囲を調
べた結果、 ノカルディオプシス属ホスホリパーゼｒ’）Ｍニー特に
安定なｐ　Ｉ（４，、（１〜７．０、アクチノマテ゛ユ
ーラ属ホ又ホリパーゼＤＭニー特に安定なｐＨ４，、（
１〜８．０、 と認められた。 また、力価測定法で用いる蒸溜水０．１５ｍ１の代りに
１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ｆ’）　ｆ）水溶液０．］Ｓ
ｍｌを用いる他は、」二記と同様に操作して、　＋（安
定範囲一４２＝ を調べたが、結果は」１記したところと殆んど変らなか
った。 Ｇ　熱安定性 酸素溶液０．１ｍｌに０．ＩＭ）ＩＪスス−酸緩衝液（
＋１１１７　、２　）を、ノカルディオプシス属ホスホ
リパーゼＤＭの場合には４ｍｌ、アクチノマデューラ属
ホスホリパーゼＩ）Ｍの場合には９．９ｍｌ加え、２０
．３０．３７．４０．５０．６０および６５°Ｃに３０
分間放置した後、残存する酵素活性を測定した。 その結果、 ノカルディオプシス属ホスホリパーゼＤＭＳ−３０°Ｃ
で３０分の熱処理では殆んど失活せず、５０’Ｃで３０
分の熱処理で８０％の活性が残存、アクチノマデューラ
属ホスホリパーゼＤＭニー３＋１’Ｃで３０分の熱処理
では殆んど失活せず、５０°Ｃで３０分の熱処理で６０
％の活性が残存、という結果であった。 ７　各種物質による影響 力価測定法においてＣａＣｌ２水溶液の代り

【こ各種物
質の水溶液をｆ’）　、　０５　＋ｎｌ加え、酵素反応
系中でｉ＋ｎＭ濃度に成るようにして活性を測定した。 その結果は水添加の時の活性を１００とし、相月活＋１
として賦活作用のあったものは、ノカルディオプシス属
ホスホリパーゼＩ）Ｍ　ニー例えば、Ａ　Ｉ　Ｃ，＋　
３、ＣｕＳＯ４，７，ｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＣａＣ１
７、ＦｅＣｌ７、ｌ；’　ｅ　Ｓ飢、ＭｇＣ１７，５ｎ
Ｃ１３、デオキシコール酸ソーダ、エタノール、イソプ
ロパ７−ル、１−ブタ７−ル、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
０゜アクチ７マデューラ属ホスホリパーゼＤＭニー例え
ば、Ａ、ｌＣ１：１．ＣａＣｌ３、ＦｅＣｌ２、ＦｅＣ
１，、Ｍ　ｇ　Ｃ＋　２．５ｎＣ１７、デオキシコール
酸ソーダ、エタ／−ル、インプロパ７−ル、ドブタ／−
ル、で、一方、閉害作用のあったものは、 ノカルディオプシス属ホスホリパーゼＴ’）Ｍニー例え
ば、ド゛デシル硫酸ソーダ、セチルピリジニウムクロラ
イド、 アクチ７マデューラホスホリパーゼＤＭニー例えば、セ
チルピリジニウムクロライド、であった。 ８　力価の測定法 前述したとおりである。 ９　精製方法 きな粉３．０ｇ、コーンスターチ−プリカー１゜０％、
ペプトン０．５ｇ、粉末酵母エキス（）、１％、グルツ
ース１．０　ｇ　−Ｎ　）（４Ｎ　Ｏ３０、２５％、Ｋ
　２　ＨＰＯ４０，４％、ＭｇＳＯ４・７１４２００．
０１％、ツウイン（Ｔｕ＋ｅｅｎ）−８５０、１％から
成る培地（，１４６，０）約１５１を３０１ジャーファ
ーメンタ−に入れ、１２０°Ｃで１５分間滅菌後、シー
ド培養液１゜５１を植菌し、２７°Ｃで４０時間培養を
行った。 尚、上記シー［゛培養液は、澱粉１％、（ＮＩ（、）Ｈ
２ＰＯ，０，２５％、ペプトン０．２５％、Ｋ　２ＨＰ
○３０．２％、ＭｇＳＯ４０，０１％を含む水溶液培地
（ｐｌ−（６，８）１００ｍｌを５００ｍ１坂ロフラス
コに入れ、蒸気殺菌後、メカルデイオプシス属Ｎ０７７
９株ｒＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、６１３３１又はアクチノマ
デューラ属Ｎｏ３６２株［ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、６１３
４５− ２１の胞子を一白金耳接種し、培養温度３０°Ｃ１１２
０回転／分の条件で２日間振盪培養して調製した。 培養後、菌体固形物を遠心分離によ１）除去腰遠心）１
清１３１（／カルデイオプシス属ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、
６１　、’４３株を用い？、ｚ場介は（１，５４，ｕ／
ｍｌ；アクチ７マデューラ属Ｆ　ＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、６
１３１株を用いた場合は１．７ｕ／ｍｌであった。）を
得た。この遠心−１−清を５°Ｃに冷却した後、−２０
°Ｃのアセトンを加えてアセトン濃度３０〜７０％画分
に相当するホスホリパーゼＩ）　Ｍを含む沈澱物を遠心
分離により婁めた。この沈澱物を、メカルデイオプシス
属ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｎｏ、６　］　３３株を用いた場合に
はｐｉ（６，（’ｌ、アクチ／マデューラ属Ｙ７ＥＲＭ
−Ｐ　Ｎｏ、６　］　３　］株を用いた場合は（往１６
゜５のトリス−マレイン酸に溶解し、０．０２Ｍの同緩
衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースに通塔し、通過区分を集めた。次に川内
等の方法ＣＪ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、−８１−２１４
６− ６３９（１，９７７）：］で調整したバルミトイルガー
ゼをカラムに充填し充分に水洗してから一１二記ＤＥ　
Ａ　Ｅ−セルロース通過液を注入し、活性を吸着した。 これを０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＪ−１７゜２
）で洗浄後、（１，２％Ｔｒｉｔ：ｏｎ　Ｘ−１００を
含む同緩衝液を加え活性を溶出した。活性区分を集めて
バイオエンジニアリング＋１製の限外濾過膜（Ｔｙ−ｐ
ｅＧ−］、ＯＴ）を用いて濃縮した後、ゲル濾過相体と
してトヨパールト（Ｗ〜５５Ｆ〔東洋曹達（株）製〕充
填カラノ、に注大腰蒸留水を用いて通塔し、活性区分を
集めて凍結乾燥を行った。 この乾燥粉末を、ノカルディオプシス属ホスホリパーゼ
ＤＭの場合にはＱ、０２５Ｍイミダゾール−塩酸（ｐＨ
７，４）に溶解後、アクチノマデューラ属ホスホリパー
ゼＤＭの場合には（’１，０２５Ｍトリスー酢酸（ｐＨ
８，３）に溶解後、ファルマシア・ファインケミカルス
社製のポリバッファ交換体ＰＲＥ　　９４（２０ｍ１）
充填カラムに通塔して活性を吸着後、同ネ１製の溶出用
ポリバッファ（ｐＨ５゜（））を用いてｐ！−１勾配に
より溶出した。溶出したホスホリパーゼｌ）Ｍの活性区
分を集めて限外濾過膜にて濃縮し、セファデックスＧ−
７５充填カラムに通塔し、ホスホリパーゼ１−）Ｍ活性
区分を婁めて凍結乾燥した。 斯くて、ノカルディオプシス属ホスホリパーゼ「）Ｍの
場合には、約・１０％の活性回収率で、比活性１７８６
．’ｌ　ｕ／＋ｎシ（蛋白質として、アクチ／デ゛ユー
ラ属ホスホリパーゼｌ）　Ｍの場合には約４；（％の活
性回収率で、比活性２１８，３ｕ／１ｎｇ蛋白質として
、ホスホリパーゼＩ）λ４か回収された。 ＼ Ｏ等電点 ノカルディオプシス属ホスホリノぐ一ゼＤＭニー４．８
５±０．１（アンホライン電気泳動法により測定） アクチノマデューラ属ホスホリノぐ−ゼＤＭニー６．４
±０１　（アンホライン電気泳動法により測定） Ｏ転移作用 従来公知のホスホリパーゼＤは、Ｒ述のように、レシチ
ンからホスファチジン酸を生成し、これをル、゛素数１
から５寸での伯仲の１級アルコールに転移してエステル
を形成するが、２級アルコールとの間には形成しないこ
とが知られている。ホスホリパーゼＤＭについても同様
に転移作用を調べた結栄、本酵素では、公知ホスホリパ
ーゼＤでは転移を生じないことの記載された１級アルコ
ールを包含して、良に広範、囲のアルコールに転移が起
シー　４９− エステルが形成するほかに、前記２級アルコールに転移
してエステルを形成することが判明した。 大賢明ｙ１？：’“Ｓで禾］片−中るボス月・す・ぐ−
ゼＤＭＩ、ｆ、後ρ転イへ作用の実Ｕカ法［７’　Ｉ、
Ｃによる転移生成物の生、幌消許り方法〕に従つ−Ｃ反
応を行って、Ｃ４二級アノ１コール２−ブタノールとリ
ン）！、ｉ？　質例ｔ　Ｉｄレシチンとの間におけるリ
ン月旨質二級アルコールド導体形成反応を触館して、該
リン脂質の該二級アルコール誘導体を形成する。公知ホ
スホリパーゼＤは、」１記１．導体を形成し５々い。 本、発明方法によれｌ：１’、前Ｈに例示の如き式（Ｔ
）　ＩＪン脂質とｍｓ記例示の如き二級アルコールとを
、上記に詳しく述べたホスホリパーゼ７）−Ｍの存在下
に反応させることにより、下翫式（Ｉ＋） Ｉ Ａ−０−ｐ−０−Ｒ（璽） Ｒ −５０− 伊し式中、Ａ及びＲは前言・−したと同義である、で表
わされるリン脂質二級アルコール誘導体を製造すること
ができる。この際、ホスホリパーゼＤＭは精製品として
使用する必要はなく粗製品であってもよい。更に、適当
な固定化相体たとえばポリプロピレン膜、セライト粒、
ガラスピーズなどの如き各種の重合体樹脂類や無機材料
の粒状物やフィルム状物に担持固定化して利用すること
もできる。 反応は、ホスホリパーゼＤＭの存在下で、好ましくは溶
媒の存在下に、式（１）　ＩＪン脂質と二級アルコール
と全接触せしめることにより行うことができる。利用す
る溶媒の例としては、水性溶媒及び水性溶媒と有機俗媒
との混合溶媒を例示することができる。二級アルコール
それ自体に溶媒の役目を兼ねさせることもできる。また
、ホスホリ・クーデＤＭの酵素学的触媒作用を阻害しな
い任意の他の添加剤を含む溶婢も第１」用でき、たとえ
ば該作用を促進したり、酵ネモの安定化に役立つ適当な
添加剤を含イゴした溶媒であることができる。例えば、
酢酸、クエン酸、リン酸などの緩衝剤を含有したり、塩
化カルシウムその他の中性塩を含有したり１−た水性溶
媒であることができる。史Ｖ（、有機溶媒の例としては
、前記二級アルコールそれ自体を包含して、例えば、ｎ
−へブタン、ｎ−ヘキサンなどの如き脂肪族炭化水素類
；シクロペンクン、シクロヘキサン、シクロブタンなと
の如き脂環族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレ
ンなどの如き芳香族炭化水素類；アセトン、メチルイソ
ゾロビルケトンなどの如きケトン類；ジメチルエーテル
、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの如
きエーテル類；酢酸メチル、酢酸エチルなどの如きエス
テル類；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレンなど
の如きハロダン化炭化水素類；ソメチルホルムアきドの
如きアミド浴媒類；ジメチルスルホキシドの如きスルホ
キシド溶媒類などを例示することができる。 水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒の形で利用する場合の
両者の混合比は適当に選択できるが、例えば水性溶媒：
有機溶薦：　ＣＶ／Ｖ比）の比で５０：１〜１：１０の
如キ混合比を例示することができる。 反７モル比、ホスホＩＪ　ノ？−ゼＤＭの使用ｉ、ｉ媒
の使用量などは、適宜にノ′ｌｐ折できるが、例えば、
式（１）リン脂質１モルに対して式（Ｉ＋）二級アルコ
ール約１：１０〜約１：１００モルの反応モル比を例示
することができる。また、ホスホリンぐ−ゼＤＭの使用
音としては、例えば、式（Ｔ）リン脂質１１当り約１０
０〜約１０００単位程度の使用量を例示することができ
る。さらに、溶媒の使用量としては、例えば、式（Ｉ）
ＩＪン脂質に対して約１０〜約５００谷−倍程度の使用
量を例示できる。 −５３− 反応は、室温で進行するので、とくに冷却或は加熱の必
要Ｉｒｊ、ないが、所望により適宜に冷却もしくは加渦
条件を採用することができる。例えば、約２０〜約６０
℃の如き反応温度を例示することができる。また反応時
間も適宜に選択できるが、例えば約１時間〜約２４時間
の如き反応時間な例示することができる。所望により、
たとえばＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）などの手法
を利用して反応経過を追跡し、所望の目的物の形成を確
認することにより反応時間を適宜に変更することができ
る。 ホスホリパーゼＤＭの存在下で式（Ｔ）　ＩＪン脂質と
前記二級アルコールとを接触せしめる態様は適宜゛に選
択できるが、攪拌もしくは振盪条件下で行うのが普通で
ある。又、前記のように適当な粒状物やフィルム状物担
体に担持固定化した同定化酵素の形でホスホリパーゼＤ
Ｍを利用する場合には、−５４− 例えば、固宇化酵素膜もしくは固定化酵素粒子層を介し
て反応組成液を循環ポンプを用いて通過させる態様で行
うことができる。 Ｊ二連のようにして反応を行った後、形成された式（Ｉ
［）リン脂負二級アルコール誘導体は、そのまま又は塩
の形で沈殿分離して利用することができる。 更に、ケイ酸カラムクロマト、アルミナカラムクロマト
、高速液体クロマト、向流分配、ｒル濾過、吸着クロマ
ト等の適当な公知の方法を利用して分離精製することが
できる。 本発明方法によれば、上述したようにして、式（１）リ
ン脂質と前記二級アルコールとを、ホスホリパーゼＤＭ
の存在下に反応させて式（１１）　１，１ン脂質二級ア
ルコール訪導体を製造することができる。 得られる式（ＩＩ）　ＩＪン脂質二級アルコール誘導体
は、すぐれた界面活性作用を有し細胞膜の透過性に大き
な影響を持つ。この意味から、該式（Ｉ［）誘導体はリ
ポソーム形成基材として、又、化粧品たとえばクリーム
、乳液に配合して皮膚生理に役立つ乳化剤として、更に
脂肪系薬剤の乳化剤、殺虫剤、除草剤など乳化Ａｌｌな
どの広い乳化剤用途に有用である。 更に、多くの場合、リン脂質はそれぞれ特異な生理活性
を有することが知られているが、本発明方法で得られる
式（１）３導体の多くは、その近似的構造を有するとこ
ろから、各種の生理活性が期待できる。父、二級アルコ
ール水酸基を有する或は二級アルコール水酸基全導入し
た薬理活性化合物を、リン脂質に転移させることによっ
て、該化合物の薬理的副作用會弱めたり或は条理効果を
高めてその投与量を低減させたシすることも期待できる
。さらに又、上記薬理活性化合物をリン脂質に転移させ
て、該化合物を患部に的確に集中させるための薬理活性
化合物のキャリヤーとして、さらには、薬理活性化合物
の保−基として有用な役割をはなすととも期待できる。 又更に、各種医薬品をはじめとする化学合成の中間体と
して有用であり、例えば、反応性の高いハロゲノやアミ
ン置換基を有するアルコールを転移させた誘導体を利用
出来る。更に又三重水紫やＩ４Ｃでラベルした二級アル
コールを転移することによってラベルされたリン脂質誘
導体が得られ、リン脂質の代謝経路の解明に利用する事
も出来る。 以下、実施例によシ本発明方法男施の敞態様について、
更に詳しく例示する。 参考例１　ホスホリノで一ゼＩ）Ｈの調製前記■精製方
法の項に従って、ノカルディオプシス属Ｎ０７７９株〔
ＦＥＲＭ−Ｐ況６１３３）及びアクチノマデューラ属ｆ
ｉ１０３６２株〔ＦＥＲＭ−Ｐムロｘａ２］の夫々を用
いて、該項に記載したとおシの活性回収率及び比活性で
ホスホリ／り一ゼＤＭを得た。 −５７− 宙施例１　　（Ｒｕｎ　Ａ　１〜Ａ　２１　）後掲第４
表に示した下記式（１）　ＩＪン脂質基質１：Ｌ−α−
レシチン、β、γ−ノミリストイル（シグマ社） （１，２−ジテトラデ力ノールーｓｎ−グリセロール−
３−ホスホリルコリン）基ｔ＠３：Ｌ−α−レシチン、
β、γ−ジヘキサデシル（カルビオケムーヘ−ＩＪ　７
　タ社）（１、２−ジヘキサデシルーｓｎ−グリ七〇　
−ルー　３−ホスホリルコリン）％質ｍ：Ｌ−α−レシ
チン、β、γ−ヘキサデシリジン（同上） （１、２−シクロヘキサデシリデンーＳｎ　−りＩＪ　
セロ−ルー３−ホスホリルコリン） 基質！１’：β−レシチン−α、γ−ジノｅルミトイル
（同上） −５８− （】、３−ジヘキサデカノイルーダリセロール−２−ホ
スホリルコリン） と、後掲第４表に示した多数種の二級アルコールとを、
後記ＴＬＣによる転移生成物（リン脂質二級アルコール
）の生成確認方法に従って、ホスホリパーゼＤＭの存在
下で反応させて、転移生成物の形成を確認した。そのＲ
ｔ値を後掲第４表に示した。 ＴＬＣによる転移生成物の生成確認方法ニー下記組成 １％リン脂質乳化液　　　　　　　０．１ｍ１０、４　
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，７）　　　　０．１　ｍｍ１０
８Ｉ塩化カルシウム水溶液　　　０．０５　ｍ６蒸留水
　　　　　　　　　　　　　０．１づ１０係二級アルコ
ール溶液　　　　０．１−の反応液に、ホスホリ／ｅ−
ゼＤＭ水溶液０．１　ｍ（０，２〜１．２μ／　０．１
　ｄ）を加え、３７°Ｃで１〜５胱間静置した。 面、上配置係リン脂質乳化液は、リン脂質ｌＯＱ　Ｍ９
にジエチルエーテル１　ｍｅ及び奏留水１０ｆｎ／を加
え、氷冷条件下に、６００Ｗ、２ｏ、ＫＨｚの条件で５
分間超音波処理して形成する。この際、上記反応液の形
成に、必要か場合には、水又はジエチルエーテル、アセ
トン等の有機溶媒を加えて上記ｌＯチ二級アルコール溶
液をＦｆＱ　＞Ｊした。 上記静置後、５ｏ　ｍＭｔ７）Ｅ　ＤＴ　Ａ　（ｘｆｖ
ンシアミン四酢酸）水溶液０．２　ｍＡ　ｆ加え、災に
クロロホルム−メタノール混液（２：　ＩＶ／Ｖ）５−
を加えて激しく攪拌し、脂質（生成物）を抽出した。 この懸濁液１２０００Ｘｓ’の条件で１０分間遠心処理
し、下層のクロロホルム層を分取し、クロロホルム−メ
タノール混液（ｌ：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）　　？　ｓμｔに溶
解してＴＬＣの試料とした。このうちｉｏμｔをシリカ
ダル薄層（フナグル６ｏＡ、２０Ｘ２０α、フナコシ薬
品）にスポットし、ジインブチルケトン−酢酸−水（４
０：２５：５）を展開溶媒として展開した。スポットの
検出には下記の試薬を用いた。検出されたスポットで未
分解の基質、及びその加水分解物（ホスファチジン酸及
びその類縁体）以外のリン脂質のスポットが検出された
場合、これを転移生成物と認めた。 検出試薬 リン酸の呈色：　Ｚｉｎｚａｄｅ　（７）試薬（Ｂｅｉ
ｓｓ、　Ｕ、　Ｊ。 ｃｈ、τ０ｆｎ（ＬｔＯ（１，１３１０４，１９６４） 一級アミンの呈色：ニンヒドリン試薬にンヒドリンの０
．２５チアセトン溶液） 二級アミンの呈色二次亜塩素酸−ベンジジン試薬（Ｂｉ
ｓａｈｅｌ　）ｉｆ、　Ｃ，らＢｉｏｃｈｉｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　　７　０　　５　９　８１
．９６３） −６１− 比較例１ 実施例１に於て、ホスホリパーゼＤＭの代りに、キャベ
ツ由来の公知ホスホリパーゼＤ（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈ、ｅ
ｍｉ−ｃａｒｓ　Ｉｎｃ、　）を用いるほかは、実施例
１と同様に行った。その結果、後掲第４表に示したすべ
ての二級アルコールについて転移生成物の生成は認めら
れなかった。 −６２− 実施例２　（７？ｕ外墓１ＮＪＩ６７）Ｌ−α−レシチ
ン、β、γ−シミリストイ・ル（シグマケミカルカンノ
ぐニー製、純度９８チ）４００■ジ工チルエーテル１ｍ
Ｊ、蒸留水１０　Ｆ、／！を超音波用セルに入れ、氷冷
しながら６００Ｆ、２ｏＫＨｚで５分間超音波処理をし
、乳白色の乳化液を得た。 このレシチン乳化液２ｆｎｌ（レシチン８０〜）、０、
４　Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ５，７）　　２　Ｍ！、、０
．１Ｍ塩化カルシウム水溶液１−及び１０％ｌ−アミノ
−２−プロパツール塩酸塩水溶液２ゴを共栓付試験管中
に入れ、ホスホリ・ぐ−ゼＤＭ水溶液（５ｚ／ゴ）２−
を加えてよく混合した後、３７℃で４時間静置した。反
応液に０．５Ｎ塩酸を０．５１Ｎ！、加えて、反応を停
止した後クロロホルム−メタノール（２：１）混液１５
ｆｎｔを加えて激しく混和し、リン脂質を抽出した。こ
の混合液を２０００ＸｆｌＯ分間−６４− 一　６３− 遠心１７、下層のクロロホルム層を分取した。上層の水
には更にクロロホルム１０ゴを加えて、同様の抽出操作
を行ない、クロロホルム層を合わせ、次いで、とれに１
０１ｎｌの００２Ｎ壌酸を加えて洗浄した。この混合液
から遠心によって再びクロロホルム層を分取し、減圧乾
固した後、ｌ−のｎ−ヘキサン−２−プロパノ−ルー水
（６０：８０ニア）混液に溶解した。 この試料２０μｔをシリカゲル薄層（フナグル、フナコ
シ薬品）にスポットし、ジイングチルケトン−酢酸−水
（４０：２５：５）の浴媒系で展開したところ、３梗類
のリン脂質が検出された。そのうち最もＲｆ値の大きな
スポットは、ホスファチジン酸とＲｆ値が一致し、一方
、最もＲｆ値の小さなスポットはレシチンと、Ｒｆ値が
一致した。 また、真中のスポットのみがニンヒドリン試薬で発色し
た。 −６５− この試料を高速液体クロマトグラフィーによって精製し
た。カラムはラジアルパックカートリッジシリカ８ＩＩ
１ｍＸ１０ｏｙ＋（ウォーターズ社製）、溶離液（ｆよ
上述したｎ−ヘキサン−２−プロノやノール−水（６０
：８０ニア１、流速は２ｍＡ１分であって、ピークの検
出には、４４１型紫外紳検出器（ウォーターズ社）によ
る’ｌ　４　ｗｍの吸収、及びＲ４０１型示差屈折計（
同）を用バブζ。試料は４回に分け、０．２５ｄずつ注
入した。 この操作によってホスファチジンＣ１１砂と、ホスファ
チジン酸の１−アミノ−２−プロノぐノールエステルの
２種類のリン脂質を分画することができた。 次いで溶仮液をη７−ヘキサンー２−プロパノールー水
（６０：８０：１４）ンこ変えて、カラムに吸着（２て
いる未分解のレシチンを浴出した♂停られた３　１ｉｊ
１類のリン片τ質は、ＴＬＣ及び高速液体クロマトグラ
フィーによっていずれも単一であることが確認された。 ３稠ぢ′！百のリン脂質（はホスファチジン酸約３０係
転移生成物約３０係、レシチン約４０チ（モル比）であ
って、約２０■のホスファチジン酸の１−アミノ−２−
プロノぐノールエステルが得られた。この化合物のＪＲ
スペクトルは、日本分光Ａ２０２型赤外分光光度計舎用
い、薄膜法で測定しまた。その結果を第５［浸に示した
（　Ｒｔｂｎ扁４）。 ｇｐ、−５表に妖したイｍのニイ汲アルコールを用いて
、上ｉピと同様に行った。その結、！、１！を第５表に
示した（　Ｒｑｂ　ｎ屋１〜３カ′ｔび５〜７）。／ζ
だし、反応液に該二級アルコールを加える際、そのアル
コールの溶解性に応じて、適宜、水又はジエチルエーテ
ルあるいけアセトン溶液として加えた。 実施例３　　（Ｒｕｎ遥ｌ−屋７） Ｌ−α−レシチン、β、γ−ノへキサデシル（カルピオ
ケムーベーリング社製）　　４００〜、ジエチルエーテ
ル１ｍ７！及び蒸留水１０ｍ１．の混合物を実施例２と
同様の方法で乳化させ、この乳化液２ｍｌを用いて、以
下、実施例２と同様の方法で反応を行なった。ただし、
二級アルコールとして、シクロヘキサノールの１０％ジ
エチルエーテル溶液を用いた。この反応液を実施例２と
同様に処理して、転移生成物１８〜を得た。この化合物
のＪＲスペクトルを第６衣に示した（　Ｒｕ　ｎ＆　７
　）。第６表に示した他の二級アルコールを用いて、上
記と同様に行った。その結果を第６表に示した（Ｒｕｎ
Ａｌ〜６）。 実施例４　　（Ｒｕ’ｎ、　ＩＦｈ　１〜＆　７　）Ｌ
−α−レシチン、β、γ−ヘキサデシリジン（カルビオ
ケムーベーリング社製）４０（１，？’（（実施例２と
同様の方法で乳化し、８ｏｍ！７相当の乳化液を用い、
転移反応の受容体として１−フェニル−２−ブロックノ
ールを加え、以下実施例２と同様の方Ｙ２．：で、反し
、抽出、精製を行なった。その結果転移生成物２２■に
荀だ。この化合物のＩ　Ｒスペクトルを第７表に示した
（ＲｕｎＡ６）。 第７表に示した他の二級アルコールを用いて、上記と同
怖に行った。その結果を第７表に示した（ＲｗｎＡ１〜
５及び７）。 実施例５　　（ＲｓＭ、　Ａ　１〜Ａ　７　）β−レシ
チン、α、γ−ジヘキサデカノイル（カルビオケムーベ
ーリング社製）４０（ｌｙを実施例２と同様に乳化し、
８０■相当の乳化液を用い、転移反応の受容体として１
−アミノ−２−プロパツールを加えて、以下実施例２と
同様の方法で、反応、抽出、精製を行方った。その結果
、転移生成物１０■を得た。この化合物のＪＲスペクト
ルを第８表に示した（Ｒｒｂｎ篇４）。 第８表に示した他の二級アルコールを用いて、上記と同
様に行った。その結果を第８表に示した（　Ｒｓ　ｎ　
Ａ　１〜３及び５〜７）。 実施例６（７？ｕ？７Ａ１〜＆５） Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン、β。 ｒ−ノミリストイル（り、Ｌ−α−ホスファチジルＮ−
メチルエタノールアミン、β、γ−シミリストイル（＋
１）、Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール、
β、γ−ノミリストイル（Ｉ［ｌ）　（以、Ｊ二、いず
れもカルビオケムーベーリング社）、Ｌ−α−ホスファ
チジルセリン（■）　（シグマ社）、及びＳ。 Ｆ、　Ｙａｎｇら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｔｔｍ、　
　２４２．４７７．１９６７）の方法で調整したＬ−α
−ホスファチツルエタノール、β、γ−シミリストイル
（Ｖ）を、実施例２と同様の方法で乳化した。各リン脂
質５０〜を含む乳化液１．５　ｍｌを、それぞれ別の共
栓付試験管に入れ、アルコールとしてｌ−フェニル−２
−プロ／ｅノールの１０％ジエチルエーテル溶液１＋＋
＋Ａ、０．４Ｍ酢酸緩衝液１ｍｌ、蒸留水１ｆｎｌ、０
．Ｏ１ｍ塩化カルシウム水溶液０．５−を加えて、更に
、この反応液を６００Ｆ、　２０ＫＨ２，１分間超音波
処理した。次いで各反応液にホスホリパーゼ０Ｍ水溶液
（８ｕ／ｍｌ’）　　１　ｍＡずつ加え、３７℃で６時
間静置した。以下、リン脂質の抽出及び精製は実施例２
と同様に処理し、共通の転移生成物であるホスファチジ
ン酸−１−フェニル−２−プロノぐノールエステルを得
た。収量はｌに対して６■、■に対して８■、ｍに対し
て７■、■に対して８〜、Ｖに対してｌ０ＩＱでめった
。そのＪＲスペクトルを第９表に示した。 第９表 特許出願人　名糖産業株式会社 −７７− 手続補正書 昭和５９年　７月１１日 特許片長ｉ　　　志　實　　学　　殿 １、事件の表示 幣涼ｌ隋５８−６　＋’ｌ　３０５考 ２、発明の名称 （キ率醜すンＩｌｉ′ｉ餉二糎アルコール防御捧の表紙
３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　　衾゛ｊ：０．賄名Ｖ件賀市１）用乙笹ノ家
町２−４１４、代　理　人〒１０７ （（−びか１名） （別紙） （Ｉｆ　　明細書第６頁６行に、［分岐アルキル基ｊと
ある後に、 「Ｒｊ と加入する。 （２）明細書第７頁４行に、［Ｋａｔｅｓ　ＣａｗＪと
あるを、 Ｆ　　Ｋａ、ｔｅｓ　Ｃａｎ　　」 と訂正する。 （３）明細書第７頁下から６〜５行に、［Ｄａ１Ｌｓｓ
ｏ″ＩＬ；Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｔ、、　Ｊとあるを、Ｆ
　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　；　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｊｒ、、　ｊと訂正する。 （４）　　明細書第２５頁７行に、゛「Ｂｅｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　Ｊとあるを、 ｊ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　」と訂正する。 （５）明糾引第２７頁２〜３行に、「全て利できる。」
とあるを、 「　全て利用できる。　　」 と訂正する。 （６）　　明ん１１？第２７頁末行に、「螺線状」とを
）るを、「　桿旋状　ｊ と訂正する。 （７）明細岩−第２８頁９〜１０行に、「胞子のり」と
あるを ＩＩ’　　胞子のう　」 ど訂正する。 （８）　　明１男第３０頁の表中、下から４行に、［Ｙ
−１−１９４とあるを、 ［ｉ’　　ｒ）’−１−１９　　ｊ と訂正する。 （９）明細書第３２頁５行に、［Ｂｅｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ　Ｊとあるを、 「Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　Ｊｌ と訂正する。 （１０）明旭書第３５頁下から２朽に、「ホスホ１）・
り−ゼＤ」とあるを、 「　ホスホリパーゼＤＭ　　ｊ と訂正する。 （１１）明細書箱３８頁末行の式を、以下のとおり訂正
する。 １７　　　ＣＨ２ＱＣ（Ｊ）Ｒ ＣＭ、０ＣＯＲ ０、−ｊ 　３− （１２）明細書第４３頁４行に、「酸素酒液」とあるを
、 「　酵素浴液　」 と訂正する。 （１３）明細書第４４頁７行に、「Ｐ’ｅＣ１，Ｊとあ
るを、「　ＦｅＣ１，ｊ と訂正する。 （１４）明細’ｉ第４４頁１１行に、「Ｆｅｃ１２、Ｆ
ｅＣ１，、」とあるを、 ’Ｉ　　Ｆｅ５Ｏ４ＸＦｅＣ１，、」 と言」正する。 （１５）明細書第４５頁下から５行に、「ＭｇＳＯ４」
とあるを、 「ＭＱ、ＳＯ４・７Ｈ２０ｊ と訂正する。 （１６）明！ｍＡ１ｖＷ　４７頁下から２行に、「ｐＢ
Ｅ９４Ｊとあるを、 　４− ＴＮ 「　　ＰＢＥ　　　　９４　　　」 と訂正する。 （１７）明１１１ｔＩ畳第５３頁１０行Ｋ「二斂アルコ
ール」とある侯ＶＣ１ １′約１＝１〜約１　：　１０００、好ましくは」と刀
口人する。 （１８）明細簀第５３頁下から５〜４行に、「脂質ＩＶ
当り」とめる俊に、 扛″約１０〜約１００，０００．好１しくは」と加入す
る。 （１９）明細豊第５４貞４行に、［ｆ］２０”ＣＪとあ
る前に、 「　約Ｏ″Ｃ〜約９０’Ｃ，好壕しくけ　」と加入する
。 （２０）明州＋Ｖ第５４頁６何に、「約１時間」とある
前に、 「約１分〜約１０日、好ましくは約０１時間〜約７２時
間、更に好ましくは約１時間〜約７２時間、とくに好捷
しく１」 と加入する。 （２１）明細書が５５６頁３〜４行に、「除草剤など乳
什剤など」とあるを、 Ｉｆ’　　除草剤などの如き農楽の乳化剤力ど　ｊと訂
正する。 （２２）明線１１第５８頁５行に、「１，２−ジテトラ
デ力ノールー」とあるを、 「　１，２−ソテトラデカノイルー　」と訂正する。。 （２３）明細搭第６０頁５〜６行に、［この際、・・・
・・・形成に、」とあるを、 「　上記反応液の形成に際して、　　」と訂正する。 （２４）明細書第６０頁下から４行に、「分取し、」と
ある後に、 「　３０℃で減圧乾固した後、　　」 と加入する。 （２５）明細書箱６０頁末行〜第６１頁１行に「６０．
４，２０Ｘ２０ｃＷＬＪとあるを、 「　６０／７．２０ｃｍＸ２０ｃｍ　Ｊｌと訂正する。 （２６）明細書第６６頁７行に、１２．４闘」とあるを
、Ｔ　　２１４鰭　」 と訂正する。 （２７）明細書第６７頁６行に、「薄膜法」とあるを、
「　液膜法　」 と訂正する。 　７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記式（Ｉ）０ １ Ａ　−０−Ｐ　−０−Ｂ　　・・・・・・（１）ＣＨ 但し式中、Ａは下記（１）又は（１１）Ｃ１ｉ２．−　
   　　　　　　　　ＣＨ２−Ｒ２を示し、ここで、Ｒ１及
   びＲ２は共に一〇−ＣＵＲ，，であるか、もしくは共に
   一〇−Ｒ１，であるか、もしくは式（ｉ）においてＲ１
   とＲ３は−１１−１９０オシを示す〕を表わし、上記に
   於て、Ｒ１，及びＲ１２は同一でも異っていてもよく、
   夫々、Ｃ，〜Ｃ２，の飽和もしくは不飽和の脂肪族炭化
   水素基を示し、 Ｂは−（ＣＨ２）２ＮＣＣＩｆｓ）ｓ、−（ＣＨ３）、
   ＮＦＩ、、−Ｃｈｉ、ＣＨ（ＩＶＨ，）ＣＯＯｆｌ、　
   　−ＣＨ，Ｃ，Ｈ，ＮＨ（Ｃ１ｌ、）、−ｃｉノ、ｃＨ
   ，ＩＶ　　（Ｃ１ｆ３）、、　　−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＩ
   Ｉ２０１１　　　もＬ　＜　Ｕ　−（（１？／１２）　
   ＩＩ　にこで、ｍは１〜５の数７７１゜ を示す〕を示す、 で表わされるリン脂質と、 ハロゲン、アミン、アセチル、水酸基、Ｃｓす、下のモ
   ノ−もしくはジ−アルキルアミノ及びフェニルより成る
   群からえらばれた置換基で置換されていてもよいＣ３〜
   ＣＩＯの直鎖もしくは分岐アルキル基Ｒ又は上記置換基
   で置換されていてもよいＣ°４〜Ｃ６の脂環式炭化水素
   基Ｒを有する二級アルコール と金、ホスホリパーゼＤ　ｉＷの存在下に反応させるこ
   とを特徴とする下記式（Ｉ＋） ０ （Ｉ Ａ　−０−Ｐ　−０−Ｒ−・−・−・（＋ｒ）ＣＨ 但し式中、Ａ及びＲは上記したと同義である、で表わさ
   れるリン脂質二級アルコール誘導体の製法。