JPS58890A - ウロキナ−ゼの回収法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウロキナーゼの回収方法に関するもので、人尿
あるいはウロキナーゼ含有液より、高収率でかつ高純度
のウロキナーゼを、工業的に有利に回収する方法を提供
しようとするものである。

ヒト尿中にはフィブリンを分解する物質が存在し、Ｗｉ
ｌｌｉａｍｓ　（１９５１）　５ｏｂｅｌ　（１９５２
）らはこの物質はプラスミノーゲンをプラスミンに活性
化する酵素であるとして、これを「ウロキナーゼＪと命
名した。それ以来ウロキナーゼは末梢動静脈血栓症、脳
血管閉鎖症や、心筋梗塞症などの血液循環系における血
栓症、塞栓症の溶解治療剤として用いられてきた。また
最近においては制癌剤との併用の有用性がみとめられ、
ウロキナーゼの重要性はさらに増してきている。

人尿から単離されたウロキナーゼは、抗原抗体反応など
の副作用がなく、現在広く用いられている。従来、人尿
からウロキナーゼを取得するため、硫酸バリウム、シリ
カゲル、ハイフロス−バーセル、ベントナイト、ハイト
ロキシルアパタイト、ゼオライト、リン酸セルロース、
ボンネル、その他のイオン交換体を吸漬剤として使用す
る方法が知られている。本発明者らは、これらの公知の
取得方法に比べてさらに優れた方法を開発すべく研究の
結果、ウロキナーゼの吸着剤として使用されたことのな
いパーライトが効果的であり、高収率で比活性の高いウ
ロキナーゼの回収方法として、工業的規模においても経
済性の高いことを見出し本発明を完成した。本発明で使
用するパーライトはガラス質火山岩の粉末を１０００°
Ｃ前後の温度で急熱して膨張させ、細かい気泡状細胞構
造となし、これを粉砕分級したもので、数％乃至それ以
下の結合水分を有するケイ酸塩を主成分とする鉱物質で
ある。

本発明の概要は、人尿またはウロキナーゼ含有液、例え
ば泡立て法などにより濃縮した尿を、ＰＨａ５〜９．５
に調整し、生ずる沈澱物を除去後ＰＨを再度調整して６
０〜７．０とする。さらに水を加えて電導度（以下ＥＣ
と略す）を１０〜２０ミリモー／　ｃｍとする。これを
あらかじめ工Ｎ−塩酸で処理しておいたパーライトと接
触させ、ウロキナーゼを吸着させる。凍原１１当り通常
４００〜Ｌ６００Ｗ９程度のパーライトが適当である。

吸着操作はカラム法によっても、あるいはパッチ法によ
っても可能である。ウロキナーゼを吸着したパーライト
を吸着剤の５倍容の水で洗浄し、ついで、０．１〜０．
５　Ｍの塩類水溶液で洗浄し、不純物を除去する。塩類
溶液による洗浄液量は、吸着剤容積の２０倍量が適当で
ある。この洗浄によりウロキナーゼ以外の大部分の蛋白
質が溶出除去される。次にα１〜α５Ｍの塩類を添加し
たＰ　Ｈ９，５〜１２−０のアルカリ水溶液または４％
アンモニア水溶液で吸着剤を溶出処理することにより、
５．０００〜ｌ　Ｏ，ＯＯＯ単位／ツ蛋白質の高純度の
ウロキナーゼ溶出液を取得することができる。

に 人尿（原振）あるいは泡立て法など希より濃縮した尿を
使用した場合のＫＯとパーライトに対するウロキナーゼ
の吸着率の関係は以下のとおりである。第１表は人尿を
泡立て法により約１・３倍に濃縮した液に、水または食
塩１を加えてＫＯを１０〜ｔ５ミリモー／　Ｃｍとした
時のパーライトに対するウロキナーゼの吸着率を示した
ものである。パーライト量は濃縮した尿に対して２　／
ｖ％使用した。

第　　１　　表 この結果は、ウロキナーゼ含有液のＢＯｔ−２０ミリモ
ー／　ｃｍ以下で吸着すれば、９０％以上の吸着が可能
なことを示している。

第２表はウロキナーゼ含有液をＥＯ＝１３ミリモー／　
ｃｍ、　Ｐ　Ｈ６，５とした時のパーライト量とウロキ
ナーゼ吸着率の関係を示したものである。

この結果、尿１ノに対しバーライ）　４００ｔｎｙ程度
の使用で吸着率９０°％以上が確保できることを示して
いる。また泡立て法により１３倍程度に濃縮した尿に対
して０．５　／ｖ％の使用量で、吸着率は９０％以上で
あった。

次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。なお
、ウロキナーゼ活性の測定はプルラフらのフィブリン平
板法（Ｊ、　Ｐｌｏｕｇ：Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。

Ａｃｔａ　ｌ　２７Ｂ　（１９５７））によって行い、
活性表示はジョンソンらにより定められた国際単位（工
Ｕ）（Ａ。

Ｊｏｈｎｓｏｎ：Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｄｉａｔｈｅｓ
　ｈａｅｍｏｒｒｈ　（Ｓｔｕｔｔｇ）２１、２５９．
　（１９６９））によった。また蛋白質の定量は、Ｆｏ
ｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法で行った〇 実施例り 人尿２５／を泡立て法により濃縮した液ｚｏｔをｐＨａ
５にして、生ずる沈澱物を遠心分離して除去した後Ｐ　
Ｈ６，５に調整する。水を加えて、ＥＣ−１２〜１３ミ
リモ一／Ｃｍとなし、あらかじめ１Ｎ塩酸処理後水洗し
たバーライ）４０ｇを加え、１時間攪拌しウロキナーゼ
を吸着させた。ウロキナーゼを吸着したパーライトは戸
別し、２００ｙＪの蒸留水で洗浄した後、３００ｆｒＬ
ｌの水に分散させカラム（径９Ｘ３ｃｍ）に注加した。

水が流下した後゛さらに５００−の蒸留水で洗い、次い
で０．５Ｍ夾 −Ｎａｃｌ水溶液８００−でｉ推量白質を流出除去した
。最後にＱ　５　Ｍ　Ｎａｃｌ　　を含む０．２％アン
モニア水溶液でカラムを溶出し、無色透明のウロキナー
ゼ溶出液を得た。吸着率９５％、溶出率９８％、比活性
は９５０５工Ｕ／Ｗ蛋白質であった。

実施例２ 人尿２．６００１を実施例りと同様に処理して濃縮法１
６０１を得た。この濃縮液を調整してＩｃｅ−１４５ミ
リモ一／Ｃ７＋Ｉ％　Ｐ　Ｈ６，５とした液３２０１に
、ＩＮ−ＨＱＩであらかじめ処理し水洗したパーライト
３．５　ｋｇを添加し１時間攪拌しウロキナーゼを吸着
させた。このパーライトをカラムに注加しく径４０Ｘ１
６ｃｍ）、まず蒸留水１００！で、次いで０．５　Ｍ　
−Ｎａｃｌ水溶液６５１で洗浄後、０５Ｍ　−Ｎａｃｌ
を含む０２％アンモニア水溶液で溶出して、無色透明の
ウロキナーゼ溶出液を得た。吸着率９０％、溶出率８３
％、比活性６５８０工Ｕ／ｆＩ９蛋白質、人尿の１を当
りウロキナーゼ収量は５０６万ＩＵ／Ｔであった。

実施例３゜ 直径９　Ｃｍのカラムに、あらかじめＩＮ−Ｈｃｌ処理
し水洗したバーライ）４０ｇを充填した（径９×３ｃｍ
）。人尿２５．　ＯｌをＰＨａ５として生ずる沈澱物を
除去後、ＰＨを６．５に調整する。この液７に水を加え
てＥＣ−１２〜１３ミリモー／　ｃｒｎに調整した後、
前記カラムに通した。全量がカラムを通過した後、蒸留
水１１でカラムを洗い非吸着物質を除去した。さらに０
．５　Ｍ　−Ｎａａｌ水溶液８００−をカラムにかけて
洗浄し、ム雑蛋白質を溶出させた。

最後に０５　Ｍ　−ＮａｃＩを含む０．２％アンモニア
水溶液で溶出し、無色透明のウロキナーゼ溶出液を得た
。吸着率９１．５％、溶出率９５％、比活性は、１０１
５８工Ｕ／う蛋白質であった。

実施何本 直径１５１Ｊ＋のカラムに、あらかじめＩＮ　−ＨＱＩ
処理し水洗したバーライ）４０ｇを充填した。

粗ウロキナーゼ（２４０工ｔｒ　／　ｍｙ　％比活性５
４２工Ｕ／う蛋白質）３００万工Ｕを２０００工ｖ／ｄ
の水溶液とし、ＰＨ６，５に調整後Ｉｃｃ−ｚｏミリモ
ー／　ｃｍとした液を前記カラムに通した。全量がカラ
ムを通過した後、蒸留水８１でカラムを洗浄し非吸着物
を除去し、ついで０５　Ｍ−Ｎａｃｌ水溶液７ノで蟲雑
蛋白質を洗い流した。最後にαＩＭ−Ｎａｃｌを含む０
２％アンモニア水溶液でウロキナーゼを溶出させ回収し
た。吸着率９０％、溶出率９６％、比活性は８　’７６
１　Ｉ　Ｕ　／　ｔＩ９蛋白質であった。

特許出願人　合同酒精株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　人尿またはウロキナーゼ含有液をパーライト
   と接触させウロキナーゼを吸着せしめ、該パーライトよ
   りウロキナーゼを溶出することを特徴とするウロキナー
   ゼの取得法。
2. （２）　　パーライトの、使用量が、溶液を人尿に換算
   して１！当り４００ｉ以上１，６００１Ｆ９以下である
   特許請求の範囲（１）記載のウロキナーゼの取得法。
3. （３）　　パーライトよりウロキナーゼを溶出するに先
   立ち、０１〜０．５　Ｍの塩類溶液で洗浄する特許請求
   の範囲（１）記載のウロキナーゼの取得法。
4. （４）　　吸着に先立ち、人尿またはウロキナーゼ含有
   液の電導塵を、〕０〜２０ミリモー／　ｃｍに調整する
   特許請求の範囲（１）記載のウロキナーゼの取得法０