JPS59146596A - Ｓ−アデノシル−ｌ−ホモシステインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は物足微生物の菌体全酵素源として用いるアデノ
シンとホモシスティンからＳ−アデノシルート−ホ石ン
ステインを効率良く酵素合成して採取する方法に関する
。

Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシスティン（以下、ＳＡＷと
略称する）は、生体内においで５３−アデノシルメチオ
ニン（以下、ＳＡＭと略称する）が関与するメチル基供
与反応で生じる重要な生理活性物質である。而して、近
時かかるＳＡＤに鎮静剤、睡眠誘発剤などとしての効果
が見い出されておシ、その大量生産が期待されている６
゜従来、ＳＡＭの製造方法としではツ”ツカロマイセス
属またはキャンデイダ桃の酵母から抽出する方法〔例え
はアーカイブズ・オブ・パイ調グミストリー・アンド・
パイオンイジツクス（ｌｙｒｃｂ、。

Ｅｉｏｃｈｅｍ、ＢｉｏｐｈｙＢ）６９．５７５（１９
６２）］、Ｓムｂ１からの酵素的脱メチル法〔例えばジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・クミストリ−（Ｊ。

１３１ｏ１ｊ；ｈｅｍ）２４０．２５１２（１９６５）
）、ＳＡ、Ｍからの化学的脱メチル法（例えば持分ｌ１
８４５−３７５５６号）などが知られている。しかしな
がら、これらの方法はいずれも非常に経費がかかり、工
業的製造法とは言い難い。

一方、アデノシンとホモシスティン會サツカロマイセス
属またはキャンデイダ属酵母の菌体抽出物の存在下に酵
素合成する方法し例えばアーカイブズ・オプ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ−
Ｂｉｏｃｈｅｍ・Ｂｉｏｐｈｙｏ）６９．５７５（１９
６２）’］も知られている。しかし、この方法は菌体か
らの抽出物を用いる点で操作性に難があり、必ずしも実
用的とは召い難い。

本発明者らは以上のように実状に鑑み、ＳＡ、Ｈの酵素
的合成法に関して釉々検討金加えた結果、サツカロマイ
セス属またはキャンデイダ属に属する菌体を酵素源とし
て用いた時に、アゾンシンとホモシスティンから簡単に
、しかも効率良＜ＳＡＩ王が合成できることを見い出し
本発明全完成した。

かくして本発明によれば、ザツカ（Ｕマイセス属または
キャンデイダ属に属しアゾンシンとホモシスティンよＪ
ｓＡＨを合成する能力を有する微生物の菌体の存在下に
アゾンシンとホモシスティン奢水性媒体中で接触させて
反応せしめ、Ｓ、ＡＨ’ｉ合成して採取することを特徴
とするＳＡＨの製造法が提供ちれる３゜ 本発明において酵素源として用いられる微生物は上記の
属に属し、生菌体または乾燥函体の形態でアデノシンと
ホモシスティンからＳＡＨを合成できる能力を有するも
のであ扛はいずれでも良く、その具体例としてはサツカ
ロマイセス・セレビシェ（Ｐμｈト５ｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉ５−嶋ｅ）ＩＦＯ１８０５゜サツカロマイセス
・セ１／ビジエＩＡＭ４１７５、丈ツカ０１イセス、シ
ｘ′＜＋）エリ（杏乏五９カー門び巴り分２皐ｊ加Ｗ悼
去ヅリエＦＯ１７２７，９ツカロマイセス・エキシブー
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ２．ｅ、ｘｉＢｕｕ、ｓ
、）ＩＦＯ０２１５、ツ゛ツカ１フイゞ８゛つ′９ルア
ゝ（一旦止！２−彬慧夕−ぞ戸−！−グーどμ千−１゛
Ｗ男）１１＋００５６５．サツカロマイセス・ファーメ
ンタテ（−３ａ、：ｃｈａ−リ三Ｌ５ｃｏｓｆｅｒｍ−
？ｎＱリ−）王ＦＯ０４２２、サツカロマイセス・五コ
ウィシー（３ａ、ｃ−リＹ五Ｐ巴−ηシー９−−Ｌ？憑
侵ＪＩＦＯ０４８７、サツカロマイセス・ハヤスス（旦
す況バー仝−Ｚ’Ｏ巳とシソしシー茫Ｌリ−ピ一つ工Ｆ
Ｏ０２０６、サツカロマイセス・ロゼイ（−ｕｙ分−Ｌ
？−ツ９？−９ｒｏｓｅ土）丁ＦＯ１１７２、ツ゛ツカ
ロマイセス・デルプリュツキー（１９ａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃＱｆｉｌｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）工ＦＯ０９５５
、キャンプイタ・ウチリス（＜２．５ｎ共６ａ−４彷−
λ１ｓ−）工Ｆ’００３’９６、キャンプイタ・ギリェ
ルモンディー（−９−正ｕ史−９只−リ１す裂す４±）
ＩＢ’Ｏｔ３５６６、キャンプイタ゛・サケ（９−料土
蛙ｅ＋ａｋｅ）ＩＦＯ１６３”ｙ、キャンプイタ・トロ
ビ■Ｂ’ｏｏ口１６、キャンプイタ・マセドニエンシス
（Ｃａｎａｉｄａｍａｃｏｄｏｎｉｅｎａｊ、ｓ）工Ｆ
ＯＯ７０６、ギー・ンデイダ・ンユードトロビカリス（
−ε鼎、ｄ、ｉｄ−ａ−５８Ｏ４２、キャンプイタ・イ
ンターメディア（Ｃａｎ１．ｉｉｄａｉ１１ｔｅｒＩｌ
ｌｅａｊ、ａ）工ＦＯ０７６１、キャンプイタ・アルビ
カンス（−Ｓ、ａ、Ｗ９１−一一−−リーゴ＾ザー）■
ア゛０１５９４などが挙げられる。また市販ノくン１７
母、？＃ｒ／Ｊ酵母なども前記の属に属するかぎり便用
することができる。さらにこれらの菌の天然及び人工変
異菌であっても＋９ＡＨ合成能を有するかき゛り同様Ｖ
こ使用することができるＯ本発明におけるＳＡＨの合成
方法は微生物の生菌体又は乾燥菌体の形態で菌体円酵素
の作用金利用するものであるが、この酵素は微生物を通
常の方法で培養する事により調整する事ができる。

微生物を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩、有
機微量栄養源を含有する通常の培地でよく、微生物の種
類に応じて適宜選択して使用すればよい。また培養方法
は通常液体培地で行なわれるが、固体表面培養によって
も行うことができる。

培養条件は微生物の種類に応じて適宜選択すれば良く、
温度１０〜６０ｐ、ＰＨ３〜１０の範囲が用いられるが
、一般的には温度２０〜４０Ｃ，ＰＨ４〜９の範囲で１
０〜１２０時間培養すれば良い３、培養中には通気・攪
拌を行って微生物の生′＃を促進させることもできる。

本発明におけるＳＡＨの合成反工６には、前記のように
して培養した微生物が生菌体または乾燥国体の形態で使
用される。例えば、微生物の４養液中の菌体をそのまま
使用してもＳＡＨの合成反応は進行するが、培養液中の
成分が障否になる場合や菌体量を多く便用したい場合に
は培養液から分離した菌体全用いることが好ましい。１
々体は生菌体の１１で充分に使用目的を達するが、貯蔵
□あるいは□取扱い°の便宜から風□乾菌体、凍・結乾
燥１菌□体、アセトン歯体などのような乾燥菌体とｔて
用６ることもできる。また菌体を□常法に従って固□定
化して使用することもできる。′：□″ 本発明におけるＳＡＨ合成反応は酵素反応基質であるア
デノ７ンとホモシスティンとを微生物菌体の存在下に水
性媒体中で接触させることによって行なわれる。反応に
供されるホモシスティンは□Ｌ体、ＤＬ体のいずれ＋あ
っても使用する・ことができる。また反応の条件は適宜
癲択す五ば□よく、基質濃度としてアデノジシを１’ｒ
ｎＭ以上、□好ましくは２〜２００”ｍＭ、ホ″％シス
ティン濃度雀□１＋ｍＭ以上、好ましくば２−２’１１
’Ｏ’ｌＩＩＭ’と□すればよい。

な□お、本発明におけ□る系モジスティンなる用語は反
応系内におＧてホモシスティンを□供給する物置（例え
ばホモシスチシ、ホモシ艮テイツチオラクトンなど）を
も含むものとして理解されるべきである。□、・ 反応における系のＰＨは４−１２、好ましくは６〜１０
に保てばよぐ、ｐＨの調整は通常の方法、たと、えば、
リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファ
ー、トリスバツンアー、塩化アンモニウムバッファー、
グリシンバッファーナトによって調整すればよい。

反応温度は、反応がよく進行し＃累活性、基質および生
成物に影響のない温度でおればよく、通常は１５〜６ｏ
’ｔＳ、爵ましくは２０〜色ＤＣである。反応時間は基
質のゐＡＨへの転化率が増大するように設定すればよく
、バッチ式の場合、通常０．１〜４８時間好ましくは０
５〜６６時間である。

その他目的に応じて本性媒体中にアセトン、エタノール
の如き有機溶媒や各種の界面活性剤を添加して反応を行
わせることもでき意。

かくしてＳＡＨを含有する反応液が得ら扛るが、該反応
液からＳＡＨを採取する方法は公知方法によればよい・
門の分竺棒としては、例えばＳＡＨ含有液を癲酸性カチ
オン交換樹脂に接触させてＳＡＨを吸着させた後、硫酸
で溶出させ、溶出液に□リンタングステン酸を加えてＳ
ＡＨを沈殿させる方法、ＳＡＨ含有液を活性炭に接触さ
せてＳＡＨを吸着させた後、エタノビル／永、／ｍアン
モニア呆”（５ｏ：５ｏ”：１’）で溶出させ、溶出液
を減圧上濃縮して譲縮物の・Ｈを酢酸手１７Ｉ／Ｃ調ｍ
した赫、ＳＡＷをＯＣで晶出させる方法雇哩が例票され
る。

以下に実施例を挙けて本発明を、さらに具体的に説明す
る。ただし本発明はこれらの例のみに限定されるもので
はない。□ なお、実施例における５Ａ）ｌの定量は次のようにして
行った。すなわち、反応終了後、反応液を直ちにθ〜５
Ｃに冷却し過塩素Ｅｉ添加して反応を停止した□次いで
遠心分離にて不溶物を除去したのち、得られた上置液に
リン酸カリウムバッファー（ｐ’Ｈ７，□０）を添加し
て、生成した過塩素酸カリウムを遠心分離によシ除去し
た。かくして得られた上澄液の所定蓋を採取して高速液
体クロマトクランイー（日立製作所製、６３′・８−３
０型、カラム：Ｏｏａｍｏｃｉｌ５ＣＩＢ、］）ａｔｅ
ｃｔｅｒ：ＵＶ２６０ｎｍ）を用いることによりＥＩＡ
Ｈの定量を実施したＯ 実施ｆＩｉ１ グルコース５ダンｄｚ’Ｑペプトンｏ、５９／ｃｌｚ。

酵母ｘキｙ、”０．１’ｆ’／ｄｌ、［１”２１？”０
４０．’２’ｌ／”ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４０。１ｇ／ｄｌ、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０。０２ｙ７ａＱ′、寒天２１１
７ｔｉｔからなる寒天斜面培地（ｐ”Ｈ４０）で２”８
’ｔ”、’４８時間培−した第１表□記載の菌棟１白金
耳′を、グルコース５ｊ／ｌｔ’ｔ、ヘフ’）’７ｏ：
５ａＡｉ’、ｇｐ母ｘ’＊ス’ｏ１ｆ７ｃｔｌ！、ＫＴ
１２ｐｏ４０．２ｉ７ｃｔｔ、Ｋ２ＨＰＯ４’ｏ１’ｙ
７ｃｔｔ’。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ’２０ｏ、ｏ２ｙ７ｃｔｔがらなりｐ
Ｈ６，５に調整、加熱滅菌した液体培地１［１ｍｌに植
□繭し、２””８””Ｃ’で４０時間振盪培養を行なっ
た。□遠心分離にて集函し、０．１Ｍリン曜ナナトリウ
ムバッファーｐａａ、５）で洗浄した後、ｔＭ菌体アデ
ノシン２ｍＭ、ＤＬホモシス ン酸ナトリ多ムバッファー（’ｐ’Ｈ８，！５）ｌＯ’
ＯｍＭからなる基質溶液１ゴに懸濁し、３ｏｃで４時間
振盪して反応させた。ｓＡＨの収量を測定し、その結果
を第１表に示した◎： 第１表 実施例２ 液体培地量が５ｍｌであること以外は実施例１と同様に
培養したキャンデイダ・ウチリスＩＦ″００３９乙の培
養液５ｍ１ｉ工ＮＮａＯＲでｐＨ８，５に調整した後、
アデノンン５μｍｏｌ、ＤＬ−ホモシスティン５μｍｏ
ｌ！ｆ添加し、６０Ｃで４時間振盪して反応させた。Ｓ
ＡＨの収量は０，２４μＴＩＩｏｌ／ｍ！であった。

実施例５ 液体培地量が５００ｍであること以外は実施例１と同様
に培養したサツカロマイセス・セレビジエエＦＯ１８０
５の培養液よｌ）ｍ体を遠心分離にて集菌（〜、生理食
塩水で一回洗浄した後、再び遠心分離にて集菌した。次
にこの洗浄菌体を用いて下記の手順に従い風乾菌体、凍
結乾燥菌体及びアセトン乾燥菌体をそれぞれ調整した。

すなわち洗浄歯体を通風下に約１５時間室温にて乾燥し
た後、更に五酸化リンを入れた減圧デシケータ−中５Ｃ
で１日乾燥した。次にこの乾燥菌体を乳鉢で粉末状にす
りつぶし、町び減圧デシケ実施例５ 実施例６と同じ培養方法及び乾燥方法で調整したサツカ
ロマイセス・セレビシェＩＰ０１８０５の風乾菌体５０
ｒｖをアデノシン１０ｍＭ５Ｌ−ホモシスチン１０ｍＭ
、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８，ｏ’）１ｏＯｍ
Ｍからなる基質溶液１ａに懸濁し、５７Ｃで４時間反応
させた。ＳＡＨの収量は３９６μｍＯ／尼であった。

実施１づンリ６ 実施例６と同じ方法で調整したサツカロマイセス・セレ
ビシェＩＦ０１８０５の風乾菌体２００ｍノを１０ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，０）２ｒｔｔｌに
加えて懸濁し、氷冷したのちアクリルアミド３７５ｊｌ
ｌｐ、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド２０ノダ
、５％のＮ、Ｎ、Ｎ、′Ｎ’Ｎチーラメチレンジアミン
水溶液０．２５ｄを加えて溶解させ、減圧にして脱気し
た後、２．５％の過硫酸アンモニウム水溶液０．’２５
ｙｎｌを加えて水冷下に静置した。１時間後生成した菌
体含有ゲルを細かく粉砕し、１０ｍＭリン酸カリウムバ
ッファー（ｐＨ７，０）で洗浄・し菌体固定化物を調整
した。この固定化物１．９７をアデノシン１０ｍＭ、Ｄ
Ｌ−ホモシスティン１０ｍＭ。

リン酸ナトリウムバッファー（ＰＨ９，０）１００ｍＭ
からなる基質溶液２ｍｌに加え、３０Ｃで８時間反応さ
せた。ＳＡＤの収量は１１０μｎｏ！！〜であった０ 実施例７ 実施例３と同じ方法で調整したサツカロマイセス、セレ
ビシェエＦ○１８ｏ５の風乾菌体２．ｓ２をアデノシン
１０ｍＭ１ＤＬ−ホモシスティン１０ｍＭ、リン酸ナト
リウムバッファー（ｐＨ９，５）１００ｍＭからなる基
質溶液５０ゴに懸濁し、６７Ｃで６時間反応させたとこ
ろ、反応液中に２３８μｍｏｌ（９１ｍ９）のＳＡＨが
合成された。その後、水冷下５０予過塩素酸水溶液５１
ａを添加して反応を停止した後、遠心分離によシ菌体残
清などの不溶物を除去した。次いで得られた上清液に工
ＭＫＨＯｏ、水溶液を添加しｐＨ６，０に調整し、生成
した過塩素酸カリウムの沈殿を遠心分離にて除去した。

かくして得られた土７胃液を強酸性陽イオン交換樹脂ダ
ウエックス５０Ｘ８（Ｈ型）カラムに通液したのちカラ
ムを０．０２５％チオジグリコール水溶液および０．０
２５％チオジグリコール含有２ＮＷｔＷで洗浄したのち
、０．０２５％チオジグリコール含有６Ｎ硫酸で溶出さ
れる部分を集めて、こｆＬに２０％リンタングステン酸
水溶液を添加し、生成した沈殿物を遠心分離にて集めて
冷水で洗浄したのち、５倍容量のアセトン／水（５０１
５０・ｖ７ｖ）に溶解し、インアミルアルコール／エー
テル（１／１・Ｖ／Ｖ）で抽出した後、得られた水層に
ＢａＯＯ５を加えてｐＨを３．９に調整し、生成したＪ
３ａＳＯ４をロカにて除去した上清液を凍結乾燥したと
ころ、白色固体物が５６ｍノ得られた。シリカゲル薄層
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ペ
ーパークロマトグラフィー、赤外吸収スペクトル、比旋
光度を測定したところ、この白色固体物はＳＡＨ″″Ｃ
あることが確認された。

特許出願人日本ゼオン株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ダ゛ツカロマイセス属またはキーヤンデイダ属に属し
   アデノシンとホモ／スティンよりＳ−アデノシル−■、
   −ホモシスディンを合成する能力を有する微生物の菌体
   の存在下にアデノシンとホモシスディンを水性媒体中で
   接触させて反応せしめ、Ｓ−アテノシルーＬ−ホモシス
   ティンを合成１〜で採取することを特徴とするＳ−アテ
   ノシルーＬ−ホモシスティンの製造法。 ２微生物の菌体が生菌体または乾燥菌体である特許請求
   の範囲第１項記載の製造法。