JPS5934893A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−フェニルアラニン（Ｉｕ下単
にフェニル７ラニ／という。）の製造法に関する。

従来、発酵法によるフェニルアラニンの製造法としては
、ブレビバクテリウム属又はミクロコツカス属細菌のＬ
−チルシン要求菌を使用する方法（特公昭３７−６３４
５）、生育にＬ−チロジノば要求しかつ５−メチルトリ
プトファンに耐性な有する変異株を使用する方法（特公
昭５１−２１０７９　）、フェニルアラニンアナログに
耐性を有する変異株を１吏用する方法（特開昭５０−１
２３８７８、特開昭５１−２８７１２　）、更にはデフ
イニン感受性株を使用する方法（特公昭５６−６４７９
３　）等が知られている。

本発明者等は更にフェニルアラニン生産性の高いフェニ
ルアラニン生産菌を育種することを目的として鋭意研究
を重ねた結果、チロシル−グルタミン酸の存在下でフェ
ニルアラニンアナログに耐性を有する菌株の中にフェニ
ルアラニン生産性の著しく高い菌株が多数存在すること
を発見した。

本発明はこの発見に基いて完成されたものである。

即ち、本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバクテ
リウム属に属し、Ｌ−チロシフ要求性す有し、チロンル
ーグルタミン酸の存在下でフェニルアナログ又はチロシ
ンアナログに耐性を有し、かつフェニルアラニン生産能
を有する微生物を培養して培養液中にフェニルアラニン
な生成、蓄積せしめ、該フェニルアラニンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるフェニルアラニンの製造法
ｅこ係るものである。本発明で用いられる微生物はブレ
ビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属しＬ−
チロシン要求性な有し、チロンルーグルタミン酸の存在
下でフェニルアラニンアナログ又はチロシンアナログ、
特Ｖこ２０００’μ２／罰以上のフェニルアラニンアナ
ログに耐性を有しかつフェニルアラニン生産能を有する
変異株であり、具体的には次の変異株が代表例として挙
げられる。

ブレビバクテリウム　　ＡＪ　　／／９り１！　　ＦＥ
ＲＭ−Ｐ　ｇ６？Ｌラクトフェルメンタム　（Ｔｙｒ’
　　、ＰＦＰｒ　）コリネバク−ｒｖウム　　　ＡＪ　
　１ｔｔｒｔ　ＦＥＲＭ−Ｐ　ｔｔｙｔ−アセトアシド
フイラム　　（Ｔｙｒ　−、ＰＦＰｒ）注）Ｔｙｒ−：
　　Ｌ−チロジノ要求性ＰＦＰｒ　　：　　Ｐ−フルオ
ロフェニルアラニ／耐性５−ＭＴｒ：５−メチルトリプ
トファン耐性これら本発明の変異株は、ブレビバクテリ
ウム属又はコリネバクテリウム属のフェニルアラニ／生
産菌を親株として、これに通常の変異誘導操作、例えば
紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−−ニトロ
ーＮ−ニトロソグアニジ／（ＮＧと略す）亜硝酸等の薬
剤処理を施し、変異処理した菌体をチロシル−グルタミ
ノ酸及び親株が生育できない量のフェニルアラニンアナ
ログ又はチロシンアナログを含有する寒天平板培地で培
養し、該平板培地に生育するコロニーを分離することに
よって得られる。

上記ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属の
フェニルアラニ／生産菌は公知のものを使用すれば良い
が、具体例としては次のような変異株が使用される。

親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又はコリネ
バクテリウム属の微生物特にグルタミノ酸生産性細菌と
して知られている微生物を使用することができる。この
場合會こは、グルタミノ酸生産性細菌にＬ−チロシフ要
求性及びフェニルアラ−／生産性な付与した後、チロシ
ル−グルタミノ酸及びフェニルアラニンアナログを含有
する培地で生育する変異株を誘導すれば良い。このよう
な親株の例としては、ブレビバクテリウム・デバリカタ
ムＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９，ブレビバクテリウム
・ロゼラムＡＴＣＣＩ　４０６６、フリネバクテリウム
φアセトアシドフイラムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバ
クテリウム・アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６、
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
等が１吏用される。

上記チロシル−グルタミン酸はＬ−チロシンと異りフェ
ニルアラニンアナログ又はチロシンアナログと稍丸しな
いので、これらアナログの存在下であってもＬ−チーシ
ン要求性のフェニルアラニノ生産菌の菌体に良好に取り
込まれ、該フェニルアラニノ生産菌のし一チロンン要求
性な満足せしめることができる。このよりなＬ−チロシ
ン源となるものはチロシル−グルタミノ酸の他にチロシ
ル−７ラニン、−Ｊ−ａ：ンル−グリシン、チロシル−
ロイシン、チロシル−グリシル−グリシノ、チロシル−
チロシル−チロシフ　等Ｌ−チロシンのオリゴペプチド
が有り、チロシル−グルタミン酸の代りにこれらのチロ
シンのオリゴペプチドを用いることもできる。

本発明でいうフェニルアラニンアナログとはブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属の微生物の生育を
阻害するが、この生育阻害がフエニルアラニア（又はＬ
−チロシン）の存在ニよって部分的又は完全に解除され
るような化合物ないい、例としては、例えば、ｏ−ｌｍ
−又はｐ−フルオロフェニルアラニ’、０−１ｍ　−１
又ハｐ−アミノフエニルアラニン、β−フェニルセリ／
、／りｐヘキシルアラニン、α−アミノ−β−フェニル
エタノスルフオフ＃　ｏ　−、ｍ　−、又ハｐ　−プロ
モフェニルアラニノ、β−２又はβ−３−チェニルアラ
ニア、β−２−ヒロールアラニ７．１−シクロペンテ７
−１−アラニア、１−ンクロヘキセ７−１−アラニア、
２−アミノ−４−メチル−へキセノ酸、ｓ−、（１，２
−ジクロルビニル）−システィン、β−４−ピリジルア
ラニア、β−２−ピリジルアラニ／、β−４−ビラゾー
ルアラニ／、ｐ−ニトロフェニルアラニア等が挙げらｈ
る。チロン／アナログは上記フェニルアラニ／アナログ
と明確に区別されず、例えば、ｐ−フルオロフェニルア
ラニンはチロシン、フェニルアラニンの何れのアナログ
として作用する。その他チロ’／　７７　す＋：＋　ク
トしては３−７ミノチロシン、３−フルオロチロジノ、
３−ハイドロキンチロン／、３−ニトロチロシフ等が挙
げられる。

次に本発明で開用する変異株の変異誘導法及び薬剤に対
する耐性度を以下の実験例にて示す。

実施例 プレビバクテリウムーラクトフェルメノタムＡＴＣＣＩ
　３８６９より誘導したＬ−チロジノ要求性のフェニル
アラニ／生産菌ＡＪ３４３５ＦＥＲＭ−Ｐｌ　９１２を
イースとブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した菌体
を集めて１１５゜Ｍす／酸緩衝液（ｐＨ７，０）Ｉｃ懸
濁した（ｔｏ’〜１０９個／ｍ７！の個体ｍ７！）。こ
の懸濁液にＮＧを加え（濃度は２００７１　ｔ　／　ｍ
７り、室温ｔ、ｎ４０分間保持した。このようにしてＮ
Ｏ変異処理した菌体な同リン酸緩衝液で充分洗浄した後
、ｐ−フルオロフェニルアラニンを２ｏｏｏμｆ／ｒｎ
ｌ含ｔｒ最小寒天平板培地（第１表）に塗布し、３１，
５℃で３〜７日間培養した。

第１表　最小培地の組成（ｐＨ７，０）成　　　　分　
　　　　　　　　　　　含　　　量グルコース　　　　
　　　　　　　２０９／を硫酸アンモニウム　　　　　
　　　　５　〃尿　　　　素　　　　　　　　　　　　
　　　　２　　〃ＫＨ，ＰＯ４１＃ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０１＃ Ｆｅ、Ｍ乳　イオノ　　　　　　　　各ｐｐｍビオチア
　　　　　　　　　　　　５０μｆ／／。

サイアミ／塩酸塩　　　　　　　２００　　＃ＤＬ−メ
チオニ７　　　　　　　２ｏｏｔｎｇ／ｌチロンルーグ
ルタミ／酸　　　　　　２００　　〃平板」二に生育し
たコロニーのうち大きなものなｐ−フルオロフェニルア
ラニン耐性株として採取した。このようにして得られた
耐性株の内には親株よりフェニルアラニノ生産能の著し
く優れたものが多く見い出された。この内生産能の最も
高い菌株ＡＪ　　ｌ／９ｔ６ｆ１選んだ。同様の変異誘
導操作により、ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性株テ
あるブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ３
４３７を親株とし更にフェニル７ラニノ生産能の高いＡ
Ｊ　　／／９ｔ７　　を得た。一方、コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフイラムＡＪ３２４４を親株とし、こ
れにＬ−チロシン要求性を付与した後、同様の方法でｐ
−フルオロフェニルアラニ／耐性株を誘導し、その内か
らＡＪ　　／／９ｒｆｒ　　を得た。

実施例 第２表に示ス濃度のｐ−フルオロフェニルアラニアを含
む第１表の液体培地な試験管に４．０ｍ７！宛分注し加
熱殺菌した。これに上記異変株な１白金耳完接種し３１
．５℃にて２４時間振盪培養した。

この培養液を水で２６倍に希釈し、その５６２　ｎｍに
於ける吸光度を測定して生育度を求めた。その結果を第
２表に示す。尚、第２表には薬剤無添加時の生育度を１
００とする相対生育値を示した。

第２表　　ＰＰＰに対する耐性度 ＰＦＰａ度　　　　　菌　　株（ＡＪ扁）（ｍ９／ｍｅ
）　　３４３５　　＋＋ｊｙ＆　３４３７　１１ｑ５７
３２４４　　１１ＭＷｔ０　　　１００　１００　１０
０　１００　１［１１００２０１００５０１００５２１
００ ４０１００４０１００３５１００ ６０９８０９８０９７ ８０９０（１９１０９１ １００８５０８７０８６ 尚、第１表に示すフェニルアラニア生産菌を、チロンル
ーグルタミ／酸の代りにＬ−チロシンを含む培地を用い
て同様の方法て培養した場合、ｐ−フルオロフェニルア
ラニノの濃度力２．０　ｍｇ／ｒｄ以−］−になるとい
ずれの菌株も生育しなかった。このことは、Ｌ−チロシ
フを用いる従来法では本発明の変異株を育種することが
できないことを意味するものである。本発明のアナログ
耐性株とは、」二記実験例２に示す方法に於て２．Ｏｍ
９／ｍ１．以上のアナログの存在下で良好に生育できる
変異株を意味する。

本発明で使用する培地は炭素源、無機塩類及びＬ−チロ
シフを含み、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使
用される。炭素源としては使用する変異株の利用可能な
ものであれば良く、例エバクルコース、フラクトース、
シュークロース、マルトース、澱粉分解物糖蜜等の糖類
が使用され、その他、エタノール、プロパツール等のア
ルコール類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株に
よってはツルマルバラフイア等も単独あるいは他の炭素
源と併用して使用される。

窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミ
７、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプト
ン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され
、生育にＬ−チロシン以外のアミノ酸等を要求する栄養
要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補
添することが必要である。無機塩類としてはＫＨ２ＰＯ
，、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＦｅＳＯ４等が適宜添加
される。

培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養期間中培
地のｐＨを５ないし９、温度を２０℃ないし４０℃に制
御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は通気攪拌培養す
ることによりフェニルアラニ／が著量培養液中に蓄積さ
れる。培養液からフェニルアラニ／を採取する方法は公
知の方法ｔこ従って行えばよく、培養液から菌体を分離
除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂
を用いる方法等により採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 下記第３表に示すフェニルアラニア生産用培地を調整し
、５００　ｍｌ！容振盪フラスコに２０　ｍｅ宛分注し
、１２０℃で１０分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末１．０７を補ネＬち。

第３表　フェニルアラニア生産用培地（ｐ　Ｈ７，０）
成　　分　　　濃　度　　　成　　分　　　　濃　度グ
ルコース１３．０Ｗ７ｄｌ　　■侶０４−４Ｈ２０１，
０ｍ９１ｄｌ硫酸アンモニウム　　　１．０　　〃　　
　Ｌ−チロシン　　４ｏ　　　〃ＫＨ２Ｐｏ４１．５　
　＃　　　ＤＬ−メチオニ７４０　　　〃Ｊ１４７ＳＯ
４・７Ｈ２００，０４’　　　　大豆蛋白分解液　　３
．　ＯｍＶｄｅビオチア　　　　　５．Ｏｐｔ／ｄ７！
　　フマール酸　　　　１．２１／ｄｌサイアミン塩酸
塩　２０　　　〃　　　酢　　　酸　　　　　ｏ、３〃
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０１，Ｏｍｆｊ／ｌｉｅこの培地に
第４表に示すフェニルアラニン生産菌を１白金耳液種し
、３０℃で７２時間振盪培養した。培養液中のフェニル
アラニノ生成量を測定し、その結果を第４表に示した。

第４表　　フェニルアラニンの蓄積童 画　　　株　　　　　　　　（２／　）ＡＪ　　　３４
３５　　　　　　　　　　０．４０ＡＪ　　１１９５６
　　　　　２・Ｏ ＡＪ　　　３４３７　　　　　　　　　　２．１ＡＪ　
　　１１９５７　　　　　　　’　　　２．６５ＡＪ　
　　３２４４　　　　　　　　　　０．１５ＡＪ　　　
１１９５８　　　　　　　　２．１特許出願人　　味の
素株式会社 ５１９−

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属し、Ｌ−チロシフ要求性を有し、チロシル−グ
   ルタミン酸の存在下でフェニルアラニンアナログ又はチ
   ロシンアナログに耐性ヲ有し、かつＬ−フェニルアラニ
   ア生産能を有する微生物を培地中で培養し培養液中にＬ
   −フェニルアラニアな生成、蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とする発酵法によるフェニルアラニアの製
   造法。
2. （２）Ｌ−フェニルアラニア生産能を有する微生物が、
   チロシル−グルタミン酸の存在下で２０００μ９７ｍＮ
   Ｊ、上のフェニルアラニンアナログに耐性を有する微生
   物である特許請求範囲第（１１項のＬ−フェニル７ラニ
   ／の製造法。