JPS5948488A

JPS5948488A - 固定化補酵素及びその製造方法

Info

Publication number: JPS5948488A
Application number: JP15776082A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Kihara; 木原　康夫; Yutaka Moroishi; 裕諸石; Takeshi Hibino; 健日比野; Takashi Kawasaki; 隆志川崎
Original assignee: Nitto Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1982-09-10
Filing date: 1982-09-10
Publication date: 1984-03-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は固定化補酵素及びその製造方法にかんする。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に熔解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方ｌ去によれば反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。このような問題
を解決するために、既に水不溶性の担体に酵素を固定化
し、この固定化酵素に基質を反応させることが提案され
ている。

一方、酵素によっては、その触媒作用を発現するために
補酵素を必要とする場合がある。このような場合には、
固定化酵素にどのようにして必要とする？ｉｔｉ酵素を
結合させるかが極めて重要な問題である。よく知られて
いるように、補酵素はアポ酵素と結合し、ホロ酵素とな
って酵素反応を行なうが、酵素と補酵素間の結合は一般
に可逆的であり、且つ、比較的弱いため、補酵素が容易
にアポ酵素から分離１−るからである。酵素についてと
同様に、補酵素を水不溶性の担体に固定化して用いるこ
とも既に知られているが、従来、酵素及び補酵素の固定
化に用いられている担体は、通常、セルロース、デキス
トラン、アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリル
アミドゲル、多孔性ガラス等の径１龍乃至敷部の粒子で
あり、担体に一定長さの鎮状構造、所謂スペーサ基を介
して酵素や補酵素を結合させ、その自由度を高めても、
固定化酵素や固定化？１ｉ酵素自体がいずれも反応系内
で固定されておれば、それぞれの自由運動範囲は極めて
限られているので、酵素と補酵素とが接触する機会は非
常に少なく、目的とする酵素反応は行なわれ難い。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の補酵素と同様に自由に移
動でき、また、反応系からの分離回収が容易であり、更
に、遊離の酵素や従来の形態の固定化酵素と組合せて用
いるのに適する固定化補酵素及びその製造方法を提供す
ることを特徴とする特に、本発明は、官能基を高密度に
有する水分散性高分子重合体粒子に？ｉｌｉ酵素を高負
荷量で固定化すると共に、補酵素活性が長期にわたって
高く保持される固定化補酵素、及びその製造方法を提供
することを目的とする。

本発明による固定化補酵素は、第１のエチレン性単量体
組成物の重合体からなる５０〜９８重量％の重合体芯部
と、官能基を有するエチレン性単量体を含む第２の単量
体組成物の重合体からなる２〜５０重票％の重合体殻部
とより構成される水分散性高分子重合体粒子に、上記官
能基を介して補酵素が共有結合にて固定化されているこ
とを特徴とし、かかる固定化酵素は、本発明に従って、
第１のエチレン性単量体絹成物を水媒体中で乳化共重合
させて水分散性高分子重合体粒子からなる重合体芯部を
形成した後、水媒体中でこの重合体芯部の存在下に官能
基を有するエチレン性単量体を含む第２のｔＲ量体組成
物を乳化共重合させて、上記重合体芯部の上に重合体殻
部を有する水分散性高分子重合体粒子を形成させ、次い
で、この重合体粒子に上記官能基を介して補酵素を共有
結合にて固定化することにより製造される。

本発明においては、先ず、第１の単量体組成物を水媒体
中で乳化共重合させて水分散性高分子重合体粒子からな
る重合体芯部を形成する。ここに得られる重合体芯部は
、本発明による固定化補酵素の存在下に酵素反応が行な
われる温度、一般的には５〜９０℃の温度で溶融軟化し
ないことを要し、従って、得られる重合体粒子のガラス
転移温度が少なくとも０°Ｃであるようにｍ量体組成が
選ばれ、好ましくは５℃以上であるように選ばれる。

従って、本発明においては、第１の単量体組成として、
スチレン、メチルスチレン、ビニルトルエン、塩化ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリ／Ｌ’Ｓ　Ｘ　７１
．チル、特に炭素数１〜イのアルキルエステル、アクリ
［１ニトリル、メタクリロニトリル、酢酸ビニル、プロ
ピオン酸ビニル、ブタジェン、イソプレン、アクリルア
ミド、メタクリルアミ）；等の１種又は２種以上が用い
られる。

尚、よく知られているように、ガラス転移点が０℃以下
の単独重合体を形成する中量体でも、他の単量体と共に
共重合させることにより、ｉｑうれる共重合体のガラス
転移点をＯ”ｃ以上とすることができ、従って、ガラス
転移点が０°（：以下のｆＢ独重重合体与えるアクリル
酸エチルやアクリル酸ブチル等を単量体成分として用い
ろことは何ら差支えない。例えば、アクリル酸エチルの
単独重合体のガラス転移点は一２２℃であるが、単独重
合体のガラス転移点が１０５℃であるメタクリル酸メチ
ルとアクリル酸エチルを共重合することによって、ｆＩ
當、ガラス転移点が約３０°Ｃである共重合体を得るこ
とができる。

本発明においては、第１の単量体組成が１〜８０重量％
のアクリロニトリル及び／又はメタクリロニトリルを含
有するのが好ましい。この単量体を存在させることによ
り、乳化剤を用いなくとも、重合の安定性が確保される
と共に、得られる水分散性高分子重合体粒子の分散性も
また、良好となるからである。

特に、本発明において好ましい第１の単量体組成物は、
ｆａｔアクリロニトリル及び／又はメタクリコニ１−リ
ル１〜８０重量％、好ましくは５〜７５重景％、特に好
ましくは１０〜６０重量％、（ｂｌ多官能性内部架橋用
単量体Ｏ〜２０重量％、好ましくは０．１〜１５重量％
、特に好ましくは０．５〜１０重量％、及び（ｃｌアク
リル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエステ
ル及びスチレンから選ばれる少なくとも１種のＣＩ’ｉ
里体２０〜９９重Ｍ％、好ましくは２５〜９５重里％、
特に好ましくは４０〜９０重量％とからなる。かかる小
量体組成物を用いることにより、乳化剤の不存在下にも
重合は非密に安定に行なわれ、望ましくない水溶性重合
体等の副生を抑えることができるからである。尚、多官
能性内部架橋用単量体は後述するように、重合の安定性
を高めるのに役立ら１、その具体例については、後述す
る。

上記の第１の単量体組成物の乳化共重合ば水媒体中で行
なわれ、重合開始剤としては、例えば、２．２′−アゾ
ビスイソブチルアミジウム塩酸塩、２゜２゛−アゾビス
シアノバレリアン酸、過硫酸塩等が用いられる。こめよ
うにして得られる水分散性ｉｎｉ分子重合体粒子は、本
発明において担体として用いる水分散性高分子重合体粒
子の芯部を構成し、通常、平均粒径が０．０３〜１．５
μの範囲である。

本発明においては、乳化剤を用いないで乳化共重合体さ
せるのが好ましく、また、上記したようＧ、二乳化剤な
しで共重合させることができる。得られる水分散性高分
子重合体粒子に乳化剤が混入していると、補酵素の固定
化の際に？ｉｌｉ酵素が失活することがあり、また、固
定化された補酵素が脱離しやすい等の有害な影響を及ぼ
す傾向があるからである。しかし、乳化剤がかかる有害
な影響を与えないときは、乳化剤の存在下に乳化共重合
を行なってもよいのは勿論である。

次に、本発明においては、水媒体中で上でｆｌた重合体
芯部をなす重合体粒子の存在下に、官能基を有する単量
体を含む第２の単量体組成を乳化共重合させ、上記第１
の単量体組成物からなる重合体芯部の上に重合体殻部を
形成させる。ここに、官能基とは、これを介して補酵素
を共有結合にて固定化し得る有機基を意味する。

この第２段の乳化共重合においても、乳化剤を用いない
のが好ましいのは前記と同じである。尚、本発明におい
ては、共重合した後、化学反応によ？て」二記官能基に
変換し得る側鎖を有する単量体を単量体組成物の成分と
して用いる場合も、官能基を有する単量体を共重合させ
る場合に含めることとする。

上記官能基としては、カルボキシル基、第１級アミン基
、ヒドラジド基、グリシジル基等を挙りることができる
。かかる官能基を有する単量体の具体例として、例えば
、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸のようなカル
ボキシル基を有する０１螢体、ヒトし】キシエチルアク
リレ−１、ヒＩシ１キシエチルメタクリレ−１〜のよう
な水酸基を右する単量体、グリシジルメタクリレ−Ｉ・
のようなグリシジル基を有するｔｐ、Ｍ体を挙げること
ができる。

また、重合体芯部をなす重合体粒子の存在下に水媒体中
で、アクリルアミドのようなアミド基を有する単量体、
及びアクリル酸メチル、メタクリル酸メチルのようなメ
チルエステル基を有する単量体をそれぞれ含有する第２
の単量体組成物をＩＬ化共重合し、上記重合体芯部の上
にこれらを単量体組成として有する共重合体を重合体殻
部として生成させ、次いで、こΦ共重合体中の上記アミ
１−基ヲボフマン分解し、また、メチルエステル基にヒ
ドラジンを作用させることによって、官能基としてアミ
ド基やヒドラジド基を有する共重合体からなる重合体殻
部を形成させることができる。また、第２の単量体組成
物にアクリル酸エステルのようなエステル基を有する単
量体を含有させ、これを重合体芯部の存在下に共重合さ
せ、次いで、このエステル基を加水分解することにより
、官能基としてカルボキシル基を有する共重合体からな
る重合体殻部を形成させることもできる。

第２の単量体組成において、官能基を有する単量体は水
溶性であることが多く、従って、これを中型で乳化重合
させると、望ましくない水溶性重合体が生しることがあ
る。従って、本発明においては、第２の単量体組成物と
して、上記官能基を有するｆ単量体１〜７０重量％と共
に、アクリロニトリル及び／又はメタクリル酸Ｉ・ジル
１〜８０重景％と、多官能性内部架橋用単量体０〜２廿
市量％と、これらと共重合性を有する中量体２０〜９８
重量％を含有する単量体組成物を乳化共重合さセるのが
よい。また、ここにおいても、形成される重合体殻部が
酵素反応の行なわれる温度で溶面ｉしないことを要し、
従って、形成されろ重合体殻部のガラス転移温度が少な
くともＯ′Ｃ８好ましくは５°Ｃ以上であるように、単
量体組成物チ従って、上記共重合性単重体としては、前
記したスチレン、メチルスチレン、ビニル１ルエン、塩
化ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル
、特に炭素数１〜４のアルキルエステル、アクリロニト
リル、メタクリｔＪユ１−リル、酉酸ヒニル、プロピオ
ン酸ビニル、ブタジェン、イソプレン、アクリルアミ１
゛、メタクリルアミｌ−等の１種又は２種以上が好まし
く用いられろか、ｑ４１に、アクリル酸及びメタクリル
酸の炭素数１〜４のアルキルエステル及びスチレンが好
ましく用いられる。

従って、特に本発明において好ましい第２の単量体組成
物は、（ａ）官能基を自するＩｌ′１．量体１〜７０重
里％、好ましくは５〜６５重里％、牛冒こ（！７ましく
は１０〜６０重晴％、（ｔ＋）アクリ１−にトリル／又
はメタクリコニトリル１〜８０重量％、好ましくは５〜
７５重量％、特に好ましくは１０〜６０重景％、ｆｃｌ
多官能性内部架橋用単量体Ｏ〜２０市里％、好ましくは
０．１〜１５重舟％、特に好まＬ　＜　６；１：　ｏ、
　５〜１０７ｍ景％、及び（ｄ＋アクリル酸エステル、
メタクリル酸エステル及びスチレンから選ばれる少なく
とも１種の単量体２０〜９８重景％、好ましくは２５〜
９５重景％、特に好ましくは４０〜８０重量％とからな
る。

このような単量体組成物を乳化共重合させることにより
、官能基を有する単量体からなる単独重合体の生成が抑
制されて、特に重合が安定に行なわれると共に、得られ
る水分散性高分子重合体粒子もまた、分ｔｉｋ安定性に
すぐれ、更に、これに酵素を固定化したとき、酵素のｍ
離も抑えられるからである。

上記の内部架橋用多官能性単量体としては、多価アルコ
ールのポリ　（メタ）アクリレートが好ましく、具体的
には、エチレングリコールジメタクリレ−１・、ジエヂ
レングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコ
ールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタ
クリレ−１−１１，３−ブチレングリコールジメタクリ
レ−１−１１−リエチレングリコールジアクリレ−１、
トリメチロールプロパントリメタクリレ− パントリアクリレートンテトラアクリレ−１−等が用いられる。シヒニルベン
ゼンもに丁ましく用いられる。

一般に、官能基を有する単量体は親水性であるため、こ
れを単独で乳化重合すると、重合が不安定になると共に
、望ましくない水溶性重合体等の副生が多く、分散性の
良好な重合体粒子を借ることが困ゲＷである。

特に、水溶性重合体が生成すると、その一部は水不溶性
高分子重合体粒子上に吸着されて残り、これを担体とし
て酵素を固ま化すると、この水溶性重合体にも酵素が固
定化される。このような水溶性重合体を含む担体に酵素
が固定化された固定化酵素によれば、酵素反応の際に酵
素が水溶性重合体と共に基質溶液中に溶出して、酵素活
性の経時低下が著しいうえに、溶出した酵素が基質や反
応生成物と混在することとなるので、反応後にその分離
を要する等の種々の不都合を生じる。

しかしながら、本発明に従って、予め調製された重合体
芯部の存在下に、官能基を有する単量体と、アクリロニ
トリル及び／又はメタクリロニトリルと、好ましくは多
官能性内部架橋用単量体とを乳化共重合させることによ
り、乳化剤の不存在下においても、重合の安定性が確保
されると共に、望ましくない水溶性重合体の生成が抑え
られて、これらの単量体組成物を重合体芯部の上に安定
に共重合させることができ、かくして、表面に官能基を
高密度に有する水分散性高分子重合体粒子を得ることが
できるのである。

このような結果が得られる理由は必ずしも明らかでばな
いが、第２の単量体組成物の乳化共重合に際しては、既
に重合の場として第１の単量体組成物からなる重合体芯
部が与えられており、且つ、重合初期に生じる官−能基
を有する単量体を主成分とする水溶性の低分子量の重合
体にアクリロニトリル及び／又はメタクリロニトリルと
多官能性内部架橋用単量体とが有効に共重合して水不溶
化すると共に、芯部重合体粒子との親和性がよくなって
、その表面に円滑にグラフ１〜化され、かくして、重合
が安定化するのであろう。従って、本発明においては、
第２の単量体組成物は、前記したように、アクリレート
リル及び／又はメタクリロニトリル、及び多官能性内部
架橋用単量体を含有するのが望ましいのである。

また、重合体芯部の上に」二記のような第２の単量体組
成物を乳化共重合させて、重合体殻部を形成することに
より、補酵素の固定化に没立つ官能基を′水分散性高分
子重合体粒子の表面に高密度で形成させることができ、
かくして、本発明によれば、補酵素を高負荷量で固定化
することができるのである。

更に、本発明においては、以上のようにして得られる水
分散性高分子重合体粒子において、重合体芯部が５０〜
９８重量％であり、重合体殻部が２〜５０重量％となる
ように第１及び第２の単量体組成物を逐次的に乳化共重
合させる必要がある。

酸部が重合体粒子において２重量％よりも少ないときは
、重合体殻部として重合体粒子がその表面に有する共重
合体の官能基の量が少なくなり、固定化し得る酵素の量
が限られることとなって、高い補酵素活性を有する固定
化補酵素を得Ｉｆｆくなるからである。一方、５０重量
％を越えるときは、官能基が親水性であるために、重合
体芯部をなす水分散性高分子重合体粒子の存在下に第２
の単量体組成物を共重合を行なっても、酸部を形成する
以外に、第２の単量体組成物のめによる水溶性重合体を
生成し、前記したような不都合を生じ、更に、重合の安
定性や重合体粒子の分散性も損なわれることが゛あるか
らである。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０５μ〜２μ、好ましくは０．１μ〜
１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とする固
定化補酵素を水中に分散させて酵素と共に酵素反応を行
なわせた後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎ
ると、単位体積当りの粒子表面積が小さくなり、補酵素
の固定化量が少なくなると共に、水中に分散させるのが
困ゲ１ｔとなるので好ましくない。

上記のような水分散性高分子重合体粒子の有する官能基
にこれを介して補酵素を共有結合にて固定化する方法は
特に制限されず、従来より知られている方法が適宜に採
用される。かかる方法として、官能基の種類に応じて、
例えば、ジアゾ法、カルボジイミド法、臭化シアン法、
アジド法等が挙げられるが、これらに限定されるもので
はない例えば、一つの方法として、例えば、ニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチド（Ｎ／ＶＤ）を固定化す
る場合、■−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩や１−シクロへキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミＦ−メト−ｐ−
１−ルエンスルボネート等の水溶性カルボジイミドを用
い、通常の条件下で補酵素と反応させればよい。例えば
、カルボキシル基の５〜５０倍当景のカルボジイミドの
水溶液にＮＡＤ熔液を加え、温度５°Ｃ程度、ｐＨ４，
５〜６．０に保持して、重合体粒子とＮＡＤとを一夜反
応させればよい。

別の方法として、重合体粒子の表面のカルボキシル基に
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカルボジイミドの存在
下に反応させた後、ＮＡＤのアミノ基を反応させること
もできる。

更に別の方法として、重合体粒子のカルボキシル基にカ
ルボジイミドとジアミンとを反応させて、重合体粒子に
アミノ基を導入し、このアミノ基に従来より知られてい
る種々の方法にてＮＡＤを反応させるのである。例えば
、グルタルアルデヒドのような架橋試薬を用いて、補酵
素のアミノ基を重合体粒子に結合させることができる。

即ち、重合体粒子の有するアミノ基に対して過剰にジア
ルデヒドを反応させ、重合体粒子に一方のアルデヒド基
により結合したジアルデヒドの他方のＭｌｉｉｔアルデ
ヒド基に補酵素の７ミノ基を反応させるのである。また
１、他の方法として、ジアゾカップリング赳によること
もできる。例えば、アミン基を導入した重合体粒子にｐ
−ニトロベンズアルデヒドを反応、結合させ、次にニト
ロ基を通常の方法、例えば、水素化ホウ素ナトリウムと
亜二ヂオン酸ナトリウムによってアミノ基に還元し、こ
のアミン基を亜硝酸ナトリウムによってジアゾニウム基
とし、これを？ｉ　酵素のアミノ基とジアゾカップリン
グさせるのである。

以上のようにして、補酵素を重合体粒子に共有結合させ
た後、用いた反応試薬や固定化されていない６ゲ素を遠
心分離、膜分Ａ１１等の適宜の手段によって除去すれば
、本発明の固定化補酵素を得る。

本発明による固定化補酵素は水分散１１にとして用いら
れ、アポ酵素及び基質と接触される。アポ酵素はＭ離で
も、固定化酵素でもよい。例えば、７ボ酵素がセルロー
ス誘導体やポリアクリルアミドゲル粒子に固定化されて
いる従来の固定化酵素を用いる場合、固定化酵素をカラ
ムに充填し、このカラムに基質を含む本発明の固定化補
酵素を通過させる。反応終了後、固定化補酵素は膜分離
その他適宜手段により分離される。

本発明において固定化される？ｉｔｉ酵素は特に制限さ
れないが、具体例として、ニコチンアミトーアデニンジ
ヌクレオチｌ”　（ＮＡＤ）　、ニコチンアミド−アデ
ニンジヌクレオチドリン酸（ＮΔＤＰ）、フラビン−ア
デニンジヌクレオチド（ＦＡＩ））、ピリドキサルリン
酸、補酵素Ａ、補酵素Ｑ、ジアノコバラミン、ヒオチン
、アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）　、アデノシ
ンシボスフエート（ΔＤＰ）、アデノシンモノホスフェ
−１−’（ＡＭＰ）等を挙げることができる。

本発明においては、水分散性高分子重合体粒子に補酵素
を結合するに当って、その自由度を高めるためにスペー
サ基を介在させるのが有利である。

スペーサ基は予め重合体粒子に結合させ、この後に補酵
素と結合させてもよく、或いはスペーサ基を予め補酵素
に結合させ、この後に重合体粒子と結合させ−どもよい
。また、補酵素と重合体粒子にそれぞれ予めスペーサ基
を結合さゼ、これらスペーサ基にて相互に結合してもよ
い。

スペーサ・基としては、ヘキザメチレンジアミン、Ｆデ
カメチレンジアミン、キシリレンジアミン等のジアミン
、６−アミノカプロン酸等のアミノアルキルカルボン酸
等が好ましく用いられるか、また、グリシルグリシルグ
リシン等のようなものも好ましく用いられる。但し、こ
れら例示したものに限定されるものではない。

より具体的には、本発明においては、補酵素に予めスペ
ーサ基を結合させ、これを重合体粒子に結合させるのが
よい。このように予めスペーサ基を結合させた補酵素の
具体例として、例えば、Ｎ６−〔（６−アミノへキシル
）カルバモイルメチル〕−Ｎ　Ａ　ｌ）、Ｎ６−スフシ
ール−ＮΔ　−Ｎ６、−（４−（３−ヒドロキンブチル
）〕−ＮΔＤ、Ｎ６−〔（６−アミノへキシル）カルバ
、せイルメチル〕−Ｎ　Ａ　Ｉ）　Ｐ等を挙げることが
できる。１特に、本発明においては、重合体粒子として
カルボキシル基を有するものを用い、これに前記したよ
うなジアミン型スペーサ基を結合し、更に、これに脂肪
族のカルボン酸残基の炭素数が２〜１１の直鎖アミノア
ルキルカルホン酸を水溶性カルボジイミドにより反応さ
せて、かくし７て、末ｉ′ｌ１ｉｌにカルボキシル基を
もつ重合体粒子をｉ（Ｉ、一方において、？ｉＩｉ酵素
には予め遊離のアミノ基を有するようにスページ′基を
結合せしめ、例えば、このようにして得られたΔ”Ｔ”
Ｐ、ＮＡＤ、ＮΔＤＰ等を前記重合体粒子に水溶性カル
ボジイミドにより結合固定化するのが望ましい。

本発明による固定化補酵素は、以上のように、水不溶性
の担体としての水分散性高分子重合体粒子が、重合体芯
部の上に高密度に官能基を有する重合体殻部が形成され
ている。従って、従来のセルロース誘導体粒子等を担体
とする場合と異なり、補酵素が高質＠量にて固定化され
ると共に、固定化補酵素自体が遊離の補酵素と同様に反
応系内を自由に移動できるため、酵素との接触機会が非
常に高く、円滑な酵素反応を確保することができる。

しかも、本発明に゛よる固定化補酵素は水不溶性の重合
体粒子に共有結合にて固定化されているために、担体か
ら容易には脱離せず、更に、酵素反応後には遠心分離、
塩析、凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による成分！
１Ｓ１１等によって容易に回収でき、かくして、し期間
にわたって高い？ｉｌｉ酵素活性を保持させつつ、繰返
して使用することができる。

また、本発明の固定化袖ｆｉ？素をその製造面からみれ
ば、一般に官能基を有する単量体を含む単量体組成物を
乳化共重合させて、表面に高密度にこの官能基を有する
水分散性高分子重合体粒子を住成させることは困難であ
るが、本発明によれば、予め重合体芯部を形成しておき
、この上に官能基を有する１１！量体を含む単量体組成
物を乳化共重合させるので、安定な共重合によって重合
体粒子を得ることができ、且つ、得られる水分子ｌＪ＜
性高分子重合体粒子は第２の単量体組成物のめを乳化共
重合させる場合と異なって、表面に訓密度で官能基を有
することとなり、この結果、本発明の方法により得られ
る水分散性高分子重合体粒子には高負荷量にて補酵素を
固定化することかできるのである。

特に、本発明によれば、前記単量体組成により、乳化剤
を特に用いることなく、望ましくない水溶性重合体の生
成を抑えて、安定に水分ｌｆ＆性ｉ！’１１３３子重合
体粒子を得ることができ、更に、第２の中量体組成物に
おいて、（メタ）アクリロム１−リルと内部架橋用単量
体を併用する好ましい単量体組成によれば、得られる水
分散性高分子重合体粒子は強度が大きいと共に、粒子相
互の粘着も起こらない。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれら実施
例により限定されるものではない。

実施例１メタクリル酸メチル８０ｇ及びアクリロニトリル１５ｇ
を蒸留水４２１ｇに加え、２，２゛−アゾビス−２−ア
ミジノプロパンニ塩酸塩０．３　ｇ　ヲ水１０ｇにｌ８
解した重合開始剤水溶液を６０°Ｃの温度で窒素気流下
に加え、１．２０　ｒｐｍで攪拌しつつ４時間重合させ
て、重合体芯部としての水分散性高分子重合体粒子を得
た。次いで、これに上記と同し重合開始剤０．０３　ｇ
を水１０ｍ１に熔解した重合開始剤水溶液を加え、更に
、メタクリル酸メチル５．５ｇ、アクリロニトリル５ｇ
、メタクリル酸３ｇ及びＩ−リエチレングリコールジメ
タクリレー１０．５ｇの混合物を１時間要して添加し、
３時間反応させて、上記芯部の上に官能基としてカルボ
キシル基を有する重合体殻部を形成さセた。このように
して得た重合体粒子の水分ａ液は、固形分２０％、重合
体粒子の平均粒径は０．４５μであった。

重合は非常に安定に行なわれて、凝集物は０．０８％で
あった。

この分散液を遠心分離し、」二澄中のカルボキシル基に
ついて定量したところ、仕込み量の０．９％のカルボキ
シル基しか定量されず、水溶性重合の生成は僅かであっ
た。

次に、上記重合体粒子を固形う）２０重Ｍ％になるよう
に蒸留水に分散させて’７′ｉ敗液５（１ｍｌを得、１
−シクロヘキシル−３−（２−モル七トリノエチル）カ
ルボジイミトーメ＋−−ｐ−＋−ルエンスルポ１ネート
２．５　ｇを水３０ｍ１に熔解した水溶液を上記分散液
に加え、■））１を塩酸で５．８に調整した。この後、
Ｎ−（（６−アミノへキシル）カルバモイルメチル補酵素水溶液を」二記分散液に加え、４°Ｃの温度で、
塩酸にてｐｌ＋を５．８に調整しつつ−　２４時間緩慢
６．ニ攪拌し、補酵素を共有結合にて重合体粒子に固定
化した。次いで、遠心分８１ｔシて上澄を捨て、沈降し
た重合体粒子を水洗して、本発明による固定化ＮＡＤ誘
導体を得た。上澄には２％の上記ＮＡＤ誘導体が残存し
ており、用いたＮへＮ）誘導体の９８％が固定化された
ことがｍｌ　ＦｕＮされた。

この固定化補酵素をグリセルアルデヒドボスフエートデ
ヒトロゲナーゼを用いて測定したところ、活性収率は遊
離のＮ−（（６−アミノへキシル）カルバモイルメチル
）−ＮＡＤ基準で６７％であった。

尚、活性収率とは、固定化された補酵素の活性の理＋％
Ｉ　Ｆｆｌに対する実際の活性の割合として定義される
。

参考例本参考例は、実施例１と同様にして単量体組成物を段階
的に共重合させた場合において、第１及び第２のｔ’ｔ
＞−ｍ体組成を種々に変化させて共重合したときの凝集
物及び重合後の分散液の上澄中のカルボキシル基量を示
す。結果を表に示す。

また、実験番号４の単量体組成を一括して共重合させた
とき、凝集物は７，３％、カルボキシル基量は６％であ
って、分散液中の重合体粒子はその１ｇ当りカルボキシ
ル基を０．０８　ミリモル有していた。しかし、段階的
に共重合した場合の重合体粒子は、その１ｇ当りカルボ
キシル基を０．３５ミリモル有していた。

実施例２実施例１で得たカルボキシル基を有する重合体粒子を蒸
留水５０ｍ１中に固形分２０重量％となるように分＋Ｉ
＆さ・１．次に、実施例■と同じ力ルボジイミＦ２．５
ｇを水３０ｍ１に溶解した水溶液′を加え、希塩酸でｐ
ｌ＋を５．８に調整した。更に、ｍ−キシリレンジアミ
ン１ｍｌを水１０ｍ１に溶解し、希塩酸にてｐ＋１を５
．８に調整した水溶液を加え、ｐｌ＋を５．８に保ちつ
つ、４°Ｃの温度で２４時間緩慢に攪拌した。

次に、遠心分離し、沈降した重合体粒子を蒸留水で繰返
し洗１作し、かくして、アミノ基を有する重合体粒子を
得た。

この重合体粒子を再び固形分２０％となるように蒸留水
に分散させ、Ｎ　−スクシニル−ＮＡＤｏ、２ｇを水１
０ｍ１に溶解した補酵翠水溶液を上記分散液に加え、希
塩酸でｐｌ＋を５．８になるように調整しながら、更に
１−シクロベニ１−シル−３−（２−モル承りノエチル
）カルボジイミ１−メト−ｐ−トルエンスルポ不−１−
２，５８を水３０ｍ１に熔解した水溶液を加え、ρ１１
５．８に調整しつつ、４°Ｃの温度で２４時間攪拌した
。

この後、分１１に液を遠心分離し、沈降した重合体粒子
を」二記と同様に繰返し洗Ｉ條し、本発明による固定化
ＮＡＤ誘導体を得た。用いたＮＡＤ誘導体の９２％が固
定化されたことが確認された。

この固定化補酵素を用いて実施例１と同じ反応を行なっ
たところ、活性収率ばＮ６−スクジニルーＮＡＤ基準で
８８％であった。

実施例３実施例２において得たアミン基を有する重合体粒子に、
同様にして６−アミツヘキクン酸を反応させ、スペーサ
基の炭素数を大きくした。この重合体粒子に実施例１と
同様にして、Ｎ　　〜（２−アミノエチル）−Ｎ八りを
結合させて、本発明による固定化補酵素を得た。これの
活性収率は、Ｎ６−（２−アミノエチル）−ＮＡＤ基！
１へて８１％であった。

また、次の連続反応によって、補酵素活性が長期にわた
って維持されることが確認された。

分画分子量１ｏｏｏｏのポリアミド中空繊維膜（日東電
気工業＠製ＮＴＵ−８０１０）を備えた膜モジュールを
用い、膜内に」二で得た固定化ＮＡＤ分散液、２５ｍ１
と、アルコールデヒドロゲナーゼ及びラフチー１−デヒ
ドロゲナーゼそれぞれ１キロ単位を含有するリン酸塩緩
衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ７，（１）を循環して流通し、
一方、膜外の空間には、０．５Ｍエタノール、０．０５
Ｍピルヒン酸及び１　ｍ　Ｍ　Ｊ元型ゲルタデオンを含
有するリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７，０）を基質
／８液として通過させ、２５°Ｃの温度で連続して反応
させた。得られた反応液を１００°Ｃで１０分間加熱し
て未反応ピルビン酸を分解させると共に、酵素及び補酵
素を失活させた後、乳酸の生成量をラクテートデヒトロ
ゲナーセにより求めることにより、固定化ＮＡＤ誘導体
の相対活性を経時的にしらべたところ、２週間経過後も
９２％を保持していた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１のエチレン性単量体組成物の重合体からなる
５０〜９８Ｍ量％の重合体芯部と、官能基を有するエチ
レン性単量体を含む第２の単量体組成物の重合体からな
る２〜５０重量％の重合体殻部とより構成されろ水分散
性高分子重合体粒子に、上記官能基を介して補酵素が共
有結合にて固定化されていることを特徴とする固定化補
酵素。
（２）第１の単量体組成物が（ａｌアクリロニトリル及
び／又はメタクリロニトリル１〜８０重量％、（ｂ）多
官能性内部架橋用単量体０〜２０重量％、及び（Ｃｌア
クリル酸９アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエ
ステル及びスチレンから選ばれる少なくとも１種の単量
体２０〜９９重量％とからなることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の固定化補酵素。
（３）第２の単量体組成物が（ａｌ官能基を有する単量
体１〜７０市量％、（ｂｌアクリロニ１リル及び／又は
メタクリロニトリル１〜８０市量％、（ｃ）多官能性内
部架橋用単量体０〜２０市量％、及び（ｄｌアクリル酸
アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエステル及び
スチレンから選ばれる少なくとも１種の小量体２０〜９
８重量％とからなることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の固定化補酵素。
（４）第２のエチレン性単量体組成物におりる官能基が
第１級アミノ基、水酸基、グリシジル基及びカルボキシ
ル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の固定化補酵素。
（５）水分散性高分子重合体粒子が０．０５〜２μの平
均粒径を有するｔとを特徴とずδＪ１＋ｒ許請求の範囲
第１項記載の固定化酵素。
（６）第１のエチレン性単量体組成物を水媒体中で乳化
共重合させて水分散性高分子重合体粒子からなる重合体
芯部を形成した後、水媒体中でこの重合体芯部の存在下
に官能基を有するエチレン性単量体を含む第２の単量体
組成物を乳化共重合させて、上記重合体芯部の上に重合
体殻部を有する水分散性高分子重合体粒子を形成させ、
次いで、この重合体粒子に上記官能基を介して補酵素を
共有結合にて固定化することを特徴とする固定化補酵素
の製造方法。
（７）第１の単量体組成物が（ａｌアクリロニトリル及
び／又はメタクリコニトリル１〜８０重量％、（ｂ）多
官能性内部架橋用単量体０〜２０重里％、及び（Ｃｌア
クリル酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエス
テル及びスチレンから選ばれる少な（とも１種の単量体
２０〜９９重量％とからなることを特徴とする特許請求
の範囲第６項記載の固定化補酵素の製造方法。
（８）第２の単量体組成物が（ａｌ官能基を有する単量
体１〜７０重量％、（ｂ）アクリロニトリル及び／又は
メタクリロニ］−リル１〜８０重量％、（ｃ＋多官能性
内部架橋用単量体０〜２０重量％、及び（ｄ＋アクリル
酸アルキルエステル、メタクリル酸アルキルエステル及
びスチレンから選ばれる少なくとも１種の単量体２０〜
９８重量％とからなることを特徴とする特許請求の範囲
第６項記載の固定化補酵素の製造方法。
（９）第２のエチレン性単量体組成物における官能基が
第１級アミノ基、水酸基、グリシジル基及びカルボキシ
ル基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とす
る特許請求の範囲第６項記載の固定化補酵素の製造方法
。
（１０）水分散性高分子重合体粒子が０．．０５〜２／
７の平均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲
第６項記載の固定化補酵素の製造方法。