JPH0314433B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関す
る。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られてい
る。しかし、従来、この方法において用いられて
いる担体は、通常、セルロース、デキストラン、
アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミドゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒
子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定さ
れて、基質溶液と接触されるので、基質が高分子
量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問
題がある。

特に、酵素を水不溶性担体にイオン結合にて固
定した固定化酵素は、例えば、イオン強度の高い
水溶液中で使用すると、酵素が容易に脱着して、
酵素活性が速やかに低下する欠点を有し、一方、
共有結合法によれば、酵素の脱着のおそれは小さ
いが、固定化する際の反応が繁雑であつて、酵素
が固定化の操作時に失活する場合も少なくなく、
更に費用も高価となる。

本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素及びその製造方法を提供することを目的と
する。また、本発明は従来の共有結合による酵素
の固定化方法に比べて遥かに簡単でありながら、
酵素が安定に固定化されて、その酵素活性が長期
にわたつて高く保持される固定化酵素及びその製
造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、水分散型高分子重
合体粒子の表面にポリアミンとジアルデヒドのシ
ツフ塩基からなり、且つ、遊離のアルデヒド基を
有する重合体が沈着され、上記アルデヒド基と介
して酵素が共有結合にて固定されていることを特
徴とし、かかる固定化酵素は、本発明に従つて、
水分散型高分子重合体粒子の水分散液中でジアル
デヒドを過剰としてポリアミンとジアルデヒドと
を反応させ、水分散型高分子重合体粒子の表面に
遊離のアルデヒド基を有する上記ポリアミンとジ
アルデヒドのシツフ塩基からなる重合体を沈着さ
せ、次に、上記のアルデヒド基を介して共有結合
にて酵素を固定化することによつて得られる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03μ〜2μ、好ましくは
0.07μ乃至1μである。粒径が小さすぎると、これ
を担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、
粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積
が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共
に、水中に分散させるのが困難となるので好まし
くない。

また、上記水分散型高分子重合体粒子は、酵素
反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を有
する限りは、任意の重合体からなつていてよく、
例えば、エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢
酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸エス
テル、メタクリル酸エステル、スチレン、メチル
スチレン、ビニルトルエン、ブタジエン、イソプ
レン、アクリルアミド、メタクリルアミド、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル等の１種又は
２種以上の単量体を通常の方法に従つて、乳化剤
を用いて、又は用いずして、乳化重合させること
により得られる。

好ましくは、本発明において用いる水分散型高
分子重合体粒子は側鎖に極性基を有する重合体か
らなる。かかる極性基を有する水分散型高分子重
合体粒子は、極性基を有する単量体を上記のよう
な単量体（以下、非重合性単量体ということがあ
る。）と通常の方法に従つて乳化共重合させるこ
とにより得ることができる。

上記極性基としては、例えば、スルホン酸基、
カルボキシル基、リン酸基等の酸基、第３級アミ
ノ基、第４級アミノ基等の塩基性基等を挙げるこ
とができる。このような極性基を有する単量体の
具体例としては、スチレンスルホン酸、スルホプ
ロピルメタクリレートのようなスルホン酸基を有
する単量体、アクリル酸、メタクリル酸、イタコ
ン酸のようにカルボキシル基を有する単量体、ア
シツドホスホキシエチルメタクリレート、３−ク
ロロ−２−アシツドホスホキシエチルメタクリレ
ートのようなリン酸基を有する単量体、ジメチル
アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプ
ロピルメタクリルアミドのような第３級アミノ基
を有する単量体、メタクリルアミドプロピルトリ
メチルアンモニウムクロライド、メタクリロイル
オキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド
のような第４級アミノ基を有する単量体を挙げる
ことができる。

更に、本発明においては、極性基を有する単量
体及びこれと共重合性を有する前記共重合性単量
体に加えて、内部架橋用多官能性単量体を乳化共
重合させるのが好ましい。このような内部架橋用
多官能性単量体の具体例としては、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコール
ジメタクリレート、トリエチレングリコールジメ
タクリレート、ジプロピレングリコールジメタク
リレート、１，３−ブチレングリコールジメタク
リレート、トリエチレングリコールジアクリレー
ト、トリメチロールプロパントリメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリアクリレート、
テトラメチロールメタンテトラアクリレート等の
ような多価アルコールの（メタ）アクリレートが
好ましく用いられる。ジビニルベンゼンも好まし
く用いられる。

内部架橋用多官能性単量体の使用は、極性基を
有する単量体と前記共重合性単量体との乳化共重
合において、好ましくない水溶性重合体の生成を
抑えると共に、重合の安定性を高めるのに役立
つ。

本発明においては、極性基を有する単量体0.2
〜30重量％と前記共重合性単量体70〜99.8重量％
とを乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子
を得るのが好ましいが、上記した内部架橋用多官
能性単量体をも共重合させる場合には、これを全
単量体組成の20重量％までの範囲で使用するのが
よい。余りに多量に使用すると、却つて重合の安
定性を損なうおそれがあるからである。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子
重合体粒子に乳化剤が混在すると、酵素の固定化
に際して酵素が失活するおそれがあるので、好ま
しくは、上記のような単量体を乳化重合させると
きに乳化剤を用いないのがよいが、しかし、乳化
剤が用いる酵素に対して有害な影響を与えないと
きは、乳化剤を必要に応じて用いてもよいのは勿
論である。

また、本発明においては、極性基を有する水分
散型高分子重合体粒子を得るに際して、上記のよ
うに、予め極性基を有する単量体を前記共重合性
単量体と乳化共重合させてもよいが、重合後に極
性基に変換し得る官能性基を有する単量体を、必
要ならば共重合性単量体と共に乳化共重合させて
水分散型高分子重合体粒子を得、この後にこの重
合体の有する官能性基を化学反応により極性基に
変換してもよい。極性基に変換し得る官能性基を
有する単量体として、例えば、アクリル酸エステ
ルやメタクリル酸エステルを挙げることができ、
このような単量体成分を含む重合体粒子を酸又は
アルカリで処理すれば、極性基としてカルボキシ
ル基を有する水分散型高分子重合体粒子を得るこ
とができる。また、グリシジル基を有する単量体
成分を含む重合体粒子にに第３級アミンを反応さ
せると、第４級アミノ基を有する重合体粒子を得
ることができる。

本発明によれば、先ず、上記した水分散型高分
子重合体粒子を水中に分散させ、ジアルデヒドを
過剰として、上記ポリアミンとジアルデヒドとを
反応させることにより、ポリアミンとジアルデヒ
ドとからなるシツフ塩基の重合体を水分散型高分
子重合体粒子表面に沈着させる。

本発明において用いるポリアミンは、アルデヒ
ド基と反応し得るアミノ基を分子内に２個又はそ
れ以上有するアミン化合物又は重合体を意味し、
好ましくは芳香族、脂肪族又は脂環族のジアミン
やトリアミンが好ましく用いられ、具体的にはフ
エニレンジアミン、キシリレンジアミン、フエニ
レントリアミン、トリアミノトルエン、エチレン
ジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が用いられ
る。また、ポリエチレンイミンも用いることがで
きる。ジアルデヒドも芳香族や脂肪族のジアルデ
ヒドが好ましく用いられるが、具体的にはグルタ
ルアルデヒド、コハク酸ジアルデヒド、グリオキ
ザール、マレインジアルデヒド、テレフタルジア
ルデヒド等が用いられる。

水分散型高分子重合体粒子の表面にシツフ塩基
を沈着させる反応において、用いるポリアミンと
ジアルデヒドとの当量比は１：１〜１：10であ
り、好ましくは１：１〜１：５である。この範囲
を越えてジアルデヒドを過多に用いるときは、形
成されるシツフ塩基重合体量が少なすぎ、従つ
て、少なくなるので好ましくない。

上記の反応は、シツフ塩基を生成させるための
通常の反応条件下で行われる。例えば、水分散型
高分子重合体粒子の水分散液にポリアミンとジア
ルデヒドとのそれぞれの水溶液を加え、撹拌する
ことにより行なうが、ポリアミンとジアルデヒド
とのそれぞれの水溶液を加える順序は特に制限さ
れない。反応は通常、塩酸等による酸性条件下で
行なうことにより円滑に進行する。また、反応は
通常、常温で数時間行なえばよい。反応温度が高
い程、反応速度は大きいが、水分散型高分子重合
体粒子の安定性が一方において悪くなるので、反
応は通常、50℃以下で行なうのが望ましい。この
後、必要に応じて、未反応のポリアミンとジアル
デヒドとを遠心分離、膜分離等の適宜手段により
除去し、かくして、表面に遊離のアルデヒド基を
有するシツフ塩基の重合体が沈着された水分散型
高分子重合体粒子を得る。

次いで、本発明によれば、このように処理され
た水分散型高分子重合体粒子の水分散液に、酵素
の失活が起こらない温度、PH等の条件下に酵素の
水溶液を添加し、必要に応じて撹拌することによ
り、酵素が上記遊離のアルデヒド基に共有結合に
より結合する。この後、固定化されなかつた酵素
を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつて除去
すれば、本発明による固定化酵素を得ることがで
きる。

尚、本発明において、酵素をアルデヒド基に共
有結合にて固定化する場合、必要に応じて所謂ス
ペーサー基を用いることができる。即ち、先ず、
シツフ塩基の重合体の有するアルデヒド基にキシ
リレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等ジア
ミンに更にシツフ塩基を形成させ、シツフ塩基を
形成したジアミンの遊離アミノ基を利用して、こ
れに酵素を従来より知られている方法にて酵素を
共有結合にて結合させるのである。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キサロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスキナーゼ、ヒスタミンメチルトラン
スフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルト
ランスフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
のような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチル
コリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラ
ーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナー
ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、
ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシ
ン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダ
ーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミ
ン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、水分
散型高分子重合体粒子に沈着された遊離のアルデ
ヒド基を有するシツフ塩基に、そのアルデヒド基
を介して酵素が固定化されているので、従来のセ
ルロース誘導体粒子等の場合と異なり、固定化酵
素自体が遊離の酵素と同様に反応系内を自由に移
動できるため、基質の拡散が反応に殆ど影響を与
えず、従つて、高分子量の基質の場合にも遊離の
酵素と同様の高い反応速度で酵素反応を行なわせ
ることができる。また、従来の共有結合法その他
による酵素の固定化と異なり、操作が簡単である
うえに、酵素の固定化条件が緩やかであるため、
固定化時の酵素の失活が少なく、活性収率が高い
という利点に加え、長期にわたる使用によつて
も、酵素活性が高く維持される。しかも、本発明
による固定化酵素は水不溶性の担体に固定化され
ているため、酵素反応後には遠心分離、塩析、凝
集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等
によつて容易に回収でき、長期間にわたつて繰返
して使用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。

実施例 １ メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモ
ニウムクロライド３ｇ、メチルメタクリレート80
ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート２
ｇ及びアクリロニトリル15ｇを蒸留水230ｇに加
え、２，2′−アゾビス−２−アミジノプロパン二
塩酸塩0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶
液60℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹
拌しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均粒
径0.3μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％とし
た分散液100mlに、塩酸でPHを６に調整した１％
のｍ−キシリレンジアミン水溶液４mlを加えて撹
拌し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10
mlを加えて、25℃で５時間撹拌して反応させた。
反応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を
蒸留水で洗滌して、未反応のキシリレンジアミン
及びグルタルアルデヒドを除去した後、再び蒸留
水100ml中に分散させた。尚、この重合体粒子に
おけるアルデヒド基は、粒子１ｇ当り0.33ミリモ
ルであつた。

次に、ウレアーゼ１ｇを水10mlに溶解した酵素
水溶液を上記重合体粒子分散液100mlに加え、撹
拌しながら５℃で８時間反応させた。反応終了
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を0.1Mリ
ン酸水素二カリウム及び0.1Mリン酸二水素カリ
ウムから調製した緩衝液（PH７）で洗滌して、未
固定のウレアーゼを除去し、再び緩衝液中に分散
させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合
体粒子１ｇ当り22mgであり、また、固定化された
酵素の活性の理論量に対する実際の活性の割合と
して定義される活性収率は40％であつた。活性収
率は、0.03Mの尿素水溶液を基質とし、35℃で10
分間固定化酵素を反応させ、生成したアンモニア
量（μモル／分）を塩酸滴定で求めて活性を測定
し、これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵
素固定化量で除して求めた。

この固定化酵素を上記のようにして活性を測定
した後、緩衝液にて洗滌し、再び活性を測定する
という操作を５回繰り返したが、活性は初期の活
性の96％を保持していた。

実施例 ２ アクリル酸３ｇ、スチレン50ｇ、メチルメタク
リレート25ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ及びアクリ
ロニトリル20ｇを蒸留水230ｇに加え、過硫酸カ
リウム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶
液を70℃の温度で窒素気流したに加え、120rpm
で撹拌しつつ８時間重合させて、固形分30％、平
均粒径0.2μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％とし
た分散液100mlに、塩酸でPHを６に調整した１％
のヘキサメチレンジアミン水溶液６mlを加えて撹
拌し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10
mlを加えて、25℃で５時間撹拌して反応させた。
反応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を
蒸留水を洗滌して、未反応のヘキサメチレンジア
ミン及びグルタルアルデヒドを除去し、再び蒸留
水中に分散させて、遊離のアルデヒド基を有する
シツフ塩基重合体の沈着した水分散型高分子重合
体粒子を得た。尚、この重合体における遊離アル
デヒド基は、重合体１ｇ当り0.05ミリモルであつ
た。

次に、α−アミラーゼ１ｇを水10mlに溶解した
酵素水溶液を上記重合体粒子分散液100mlに加え、
撹拌しながら５℃で８時間反応させた。反応終了
後、遠心分離し、実施例１と同じ緩衝液にて重合
体粒子を洗滌し、未固定のα−アミラーゼを除去
し、再び緩衝液に分散させて、本発明による固定
化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼの固定化量は
重合体粒子１ｇ当り10mgであり、また、活性収率
は70％であつた。活性収率は、１％デンプン水溶
液を基質として固定化酵素を35℃で10分間反応さ
せ、ヨウ素デンプン反応からデンプンの分解量を
求めることにより、固定化酵素の活性、即ち、デ
ンプン分解速度（mg／分）を得、これと等しい活
性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して
求めた。

実施例 ３ メチルメタクリレート80ｇ、アクリロニトリル
18ｇ及びトリエチレングリコールジメタクリレー
ト２ｇを蒸留水230ｇに加え、過硫酸アンモニウ
ム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶液を
70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹拌
しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均粒径
0.4μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％とし
た分散液100mlに、塩酸でPHを６に調整した１％
のｍ−キシリレンジアミン水溶液４mlを加えて撹
拌し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10
mlを加えて、25℃で５時間撹拌して反応させた。
反応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を
蒸留水で洗滌して、未反応のキシリレンジアミン
及びグルタルアルデヒドを除去した後、再び蒸留
水100ml中に分散させた。尚、この重合体粒子に
おけるアルデヒド基は、粒子１ｇ当り0.05ミリモ
ルであつた。

次に、ウレアーゼ１ｇを水10mlに溶解した酵素
水溶液を上記重合体粒子分散液100mlに加え、撹
拌しながら５℃で８時間反応させた。反応終了
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を0.1Mリ
ン酸水素二カリウム及び0.1Mリン酸二水素カリ
ウムから調製した緩衝液（PH７）で洗滌して、未
固定のウレアーゼを除去し、再び緩衝液中に分散
させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合
体粒子１ｇ当り８mgであり、また、活性収率は60
％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水分散型高分子重合体粒子の表面にポリアミ
   ンとジアルデヒドのシツフ塩基からなり、且つ、
   遊離のアルデヒド基を有する重合体が沈着され、
   上記アルデヒド基を介して酵素が共有結合にて固
   定されていることを特徴とする固定化酵素。 ２ 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化酵素。 ３ 水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又
   は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の固定化酵素。 ４ 水分散型高分子重合体粒子の水分散液中でジ
   アルデヒドを過剰としてポリアミンとジアルデヒ
   ドとを反応させ、水分散型高分子重合体粒子の表
   面に遊離のアルデヒド基を有する上記ポリアミン
   とジアルデヒドのシツフ塩基からなる重合体を沈
   着させ、次に、上記のアルデヒド基を介して共有
   結合にて酵素を固定化することを特徴とする固定
   化酵素の製造方法。 ５ 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
   粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項記載の固定化酵素の製造方法。 ６ 水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又
   は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の
   範囲第４項又は第５項記載の固定化酵素の製造方
   法。