JPS5948486A - 固定化補酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化補酵素の製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に熔解
させて、この水溶液中で反応を行なわゼでいる。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。このような問題
を解決するために、既に水不溶性の担体に酵。

素を固定化し、この固定化酵素に基質を反応さＦること
か提案されている。

一方、酵素によっては、その触媒作用を発現するために
補酵素を必要とする場合がある。このような場合には、
固定化酵素にどのよう侵して必要とする補酵素を結合さ
ゼるかが極めて重要な問題である。よく知られているよ
うに、補酵素はアポ・酵素と結合し、ボロ酵素となって
酵素反応を行なうが、酵素と補酵素間の結合は一般に可
逆的であり、且つ、比較的弱いため、？ｉｌｉ酵素が容
易にアポ酵素から分８１ｔするからである。酵素につい
てと同様に、？ｉｌｉ酵素を水不溶性の担体に固定化し
て用いることも既に知られているが、従来、酵素及び補
酵素の固定化に用いられている担体は、通常、セルロー
ス、デキストラン、アガじ！−ス等の多ｔＪｆｆ’　１
１Ｊｉの誘導体、ポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラ
ス等の径ＩＷＩＩｌｌ乃至数關の粒子であり、担体に一
定長さの鎖状構）省、所謂スベーザ基を介して酵素や補
６ゲ素を結合さ一部、その自由度を高めても、固定化酵
素や固定化、補Ｖゲ素自体がいずれも反応系内で固定さ
れておれば、それぞれの自由運動範囲は極めて限られて
いるので、酵素と補酵素とが接触する機会は非常に少な
く、目的とする酵素反応は行なわれ難い。

本発明は上記した問題を解決するためになされたもので
あって、反応系において遊離の補酵素と同様に自由に移
動でき、また、反応系からの分離、回収が容易であり、
更に、遊離の酵素や従来の形態の固定化酵素と゛組合せ
て用いるのに適する固定化補酵素の製造方法を提供する
ことを目的とする。

本発明による固定化補酵素の製造方法は、ｆ、］ｌアク
リロニトリル及び／又はメタクリコニニトリル１〜６０
重量％、（ｂｌｌ多官能性内部架橋用単量体１ク２０ るラジカル重合性単量体２０〜９８重量％とからなる単
量体組成を、末端に補酵素の固定化に利用し得る官能基
を有する水溶性重合開始剤によって水媒体中で乳化共重
合させて水分散性高分子重合体粒子を得、次にこの重合
体粒子がその末端に有する上記重合開始剤からの官能基
に補酵素を共有結合にて固定化することを特徴とする。

本発明において用いる水分１１に性高分子重合体粒子の
１Ｊｌｉｌ製に当たっては、単量体組成としてアクリロ
ニトリル及び／又はメタクリロニニトリル１〜６０重景
％、好ましくは５〜４０重量％を後述する他のラジカル
重合性単量体と乳化共重合させる。

本発明において用いる水分散性高分子重合体粒子の乳化
共重合においては、得られる重合体粒子に乳化剤が混入
していると、補酵素が失活する等の有害な影響が現われ
ることがあるので、乳化剤を用いないのが好ましい。こ
のよ−）に乳化剤を用いずに乳化共重合を行なった場合
、重合は水相中で行なわれる。即ち、水溶性重合開始剤
が水に溶解している少なくとも一部の単量体を重合さ・
已、こうして生じた低分子量の重合体ラジカルが高分子
化し、水不溶化して粒子を形成し、この粒子に単量体が
吸着されて重合の場が形成され、ここで重合が進行して
水分Ｉｔｋ性高分子重合体粒子が生しる。この場合に、
重合初期の水溶性の低分子量重合体が系に残存するとき
は、一部は水不溶性のｉｆｆ＋ｆｆ型合体粒子の表面に
吸着されて残り、これを担体として補酵素を固定化する
と、この水溶性重合体にも？ｉｌｉ酵素が固定化される
。このように水溶性重合体を含む担体に補酵素が固定化
された固定化？ｌｉｉ酵素は、アポ酵素との反応の際に
水不溶性の水分散性高分子重合体粒子から溶出し、固定
化補酵素自体の活性の経時低下が著しいうえに、基質や
反応生成物と混合するので、反応後に童の分ｚ１１を要
する等の不都合を生しる。

しかしながら、本発明に従って、アクリロニトシル及び
／又はメククリロニトリルを多官能性架橋用単量体と、
これらと共重合性を有するラジカル重合性単量体と共に
、水溶性重合開始剤を用い、乳化剤の不存在下に水媒体
中で乳化共重合させると、重合の安定性が確保されると
共に、望ましくない水溶性低分子量重合体の生成が抑え
られる。

このような結果が得られる理由は必ずしも明確ではない
が、重合初期に生じる水溶性の重合体ラジカルにアクリ
ロニトリル及び／又はメククリロニトリルと、多官能性
内部架橋用単量体とが有効に共重合して水不溶化すると
共に、重合を安定化さセるのであろう。従って、アクリ
ロニトリル及び／又ｔよメタクリロニトリルの量が上記
範囲より少なずぎるとき、又は多すぎるときは、重合の
安定性が損なわれる。

本発明においては、上記したように、乳化共重合に際し
て乳化剤を用いないのが好ましく、また、乳化剤の不存
在下に安定に乳化共重合させることができるが、しかし
、乳化剤が補酵素に対して有害な影響を与えなければ、
乳化剤を必要に応じて用いてもよいのは勿論である。

本発明の方法においては、更に水分散性高分子重合体粒
子を得るに際して、ラジカル重合性多官能性内部架橋用
単量体を単量体組成において１〜２０Ｍｆｉ１％、好ま
しくは２〜１０市景％用いられる。内部架橋用多官能性
単量体としては、多価アルコールのポリ　（メタ）アク
リレ−１−が好ましく、具体的には、エチレングリコー
ルジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリ
レ−１・、トリエチレングリコールジメタクリレ−１−
、シブＩＩＩピレングリコールジメタクリレ−１−１■
、３−ブチレングリコールジメタクリレ−１・、トリエ
チレングリコールジアクリレー１−、トリメチロールプ
ロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリ
アクリレート、テトラメチロールメタンテトラアクリレ
ート等が用いられる。ジビニルヘンゼンも好ましく用い
られる。前記した理由から、内部架橋用単量体が少なず
ぎるときは水溶性重合体の副生が多くなり、一方、多す
ぎるときは重合が安定性に欠けるようになる。

更に、本発明の方法においては、単量体組成として、ア
クリロニトリル、メタクリロニトリル及び内部架橋用単
量体と共重合し得るラジカル共重合性単量体が２０〜９
８重量％、好ましくは３０〜９３重量％用いられる。こ
のラジカル共重合性単量体としては、アクリロニトリル
、メタクリロニトリル及び内部架橋用単量体と共重合性
を有し、且つ、得られる共重合体が酵素反応の行なわれ
る温度よりも高いガラス転移点を有する限りは特に制限
されるものではないが、好ましくは、エチレン、プロピ
レン、塩化ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、
アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレン
、メチルスチレン、ビニルトルエン、ブクジエン、イソ
プレン、アクリルアミド、メタクリルアミド等の１種又
は２種以上が用いられる。特に、アクリル酸及びメタク
リル酸のアルキルエステル及びスチレンが好ましく用い
られる。

本発明において用いる水溶性重合開始剤は、その末端に
それを介して共有結合にて補酵素を固定化しｆＪる官能
基を有することを要する。このような官能基としては、
代表的には、例えば、カルホキシル基やアミノ基等を挙
げることができ、アミノ基を有する水溶性重合開始剤と
して、２，２゛−アゾビスイソブチルアミジウム塩酸塩
、カルホキシル基を有する水溶性重合開始剤として、４
．４’−７ゾビスシアノハレリアン酸を挙げることがで
きる。

但し、補酵素をそれにより共有結合にて固定化し得る限
りは、その官能基の種類及び具体的な重合開始剤は上記
励磁したものに限定されるもので、はない。本発明にお
いて、これら重合開始剤の使用量は、通電、乳化共重合
させる全単量体１００市量部当り０．０５〜２市量部、
好ましくは０．１〜１重量部であり１、重合温度は用い
る重合開始剤に応して適宜に選ばれる。

本発明による方法においては、前記単量体組成により好
ましくは乳化剤を用いることなく、上記のような水溶性
重合開始剤を用いて乳化共重合させると、前記したよう
に重合は水相で開始され、生じた重合体末端はその開始
剤に由来する極性の官能基により、主として重合体粒子
の表面に局在化する。本発明の方法は、重合開始剤に由
来するこの官能基がその表面に局在して存在する水分散
性高分子重合体粒子を担体へして、これに？ｄｉ酵素を
共有結合にて固定化する。

本発明において、水分散型高分子重合体粒子は、その平
均粒径が（１，０３μ〜２μ、好ましくは０．０７μ乃
至１μである。粒径が小さすぎると、これを担体とする
固定化補酵素を水中に分散させて、所定の酵素と共に目
的とする酵素反応を行なわせた後の回収が困Ｍｌｔとな
り、一方、粒径が大きすぎると、＜１’＜位体積当りの
粒子表面積が小さくなり、？ｄｉ酵素の固定化量が少な
くなると共に、水中に分散さ一已るのが困ｆｆ１ｌｔと
なるので好ましくない。

」−記のように水溶性重合開始剤に由来する重合体粒子
の有する官能基を介しで補酵素を共有結合にて固定化す
る方法は特に制限されず、従来より知られている方法が
適宜に採用される。

例えば、一つの方法として、水溶性力ルホジイミト′を
用いて、補酵素のアミノ基と水分散性高分子重合体粒子
表面のカルボキシル系とを直接にアミド結合さセること
ができる。水溶性力ルホジイミ］・とじては、（列えば
、１−：に−ｙ−ル−３（３−ジメチルアミノプロピル
）カルホシイミＦ　Ｊｉ　ｆｆ、ｔ　塩、１−シクロへ
キシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド
−メト−ｐ−１−ル〕−ンスルホネ−１・等を挙げるこ
とができる。このような水溶性カルボジイミドを用いて
、補酵素を重合体粒子のカルボキシル基と共有結合さ・
ｌる方法は従来より知られている通電の方法によればよ
く、例えば、水分１１に性高分子重合体粒子の有するカ
ル士キノＪｌ／基の３〜５０倍当量のカルボジイミドを
用い、５〜３０−’Ｃ程度の温度、ｐｌ＋を４．５〜０
．０程度に保持して、補酵素を反応させればよい。

別の方法として、水分ｔＢＦ　’１９−＋ｆｒ＋分−Ｙ
１１１合体１＋＞、子表面のカルボキシル基にＮ−ヒ１
１ドトシスクシン・ｆミドをカルボジイミドのイ）；右
下に反応さ−Ｕｋ後、補酵素のアミノ基を反応させ、共
有結合を形成さ−Ｕることができる。更に別の方法とし
て、水分１１々性高分子重合体粒子表面のカルボキシ／
ｌ／基にンアミンを反応させて、重合体粒子表面にアミ
ノ基を導入し、このアミノ基により補酵素を共有結合に
て固定化することもできる。例えば、グルクルアルデヒ
１のような架橋試薬を用いて、補酵素のアミン基を重合
体粒子に結合させることができる。

即し、重合体粒子の有するアミノ基に対して過剰にジア
ルデヒドを反応させ、重合体粒子に一方のアルデヒド岳
により結合したジアルデヒド′の他方の遊回１アルテヒ
１：基に補酵素のアミン基を反応させるのである。

また、他の方法として、ジアヅカップリング法によるこ
ともできる。例えば、アミン基を導入した重合体粒子に
ｐ−ニトロヘンズアルデヒトを反応、結合さ−１、次に
二１・四基を通雷の方法、例えば、水素化ホウ素ナトリ
ウムと亜ニチオン酸ナトリウムによってアミノ基に還元
し、このアミノ基を亜硝酸ナトリウムによってシアヅニ
ウム基とし、これを補酵素のアミノ基とジアヅカツプリ
ングさせるのである。

以上のようにして、補酵素を重合体粒子に共有結合さセ
た後、用いた反応試薬や固定化されていない酵素を遠心
分離、成分Ｍｌ１等の適宜の手段に、１、って除去すれ
ば、本発明の固定化補酵素を得る。

本発明による固定化補酵素は水分ｔ）ｋ液とし′ζ用い
られ、アポ酵素及び基質と接触される。アポ酵素は遊離
でも、固定化酵素でもよい。例えは、アポ酵素がセルロ
ース誘導体やポリアクリルアミドゲル粒子に固定化され
ている従来の固定化酵素を用いる場合、固定化酵素をカ
ラムに完膚し、このカラムに基質を含む本発明の固定化
補酵素を通過さ−Ｕる。反応終了後、固定化補酵素は脱
分島１１その他適宜手段により分離される。

本発明において固定化される補酵素は特に制限されない
が、具体例として、ニコチンアミト−アデニンジヌクレ
オヂＩ：’　（ＮＡＤ）　、二：Ｊチンアミド−７デニ
ンジノ、タレオチドリン酸（ＮΔ（〕Ｐ）、フラビンー
アデニンジヌグレオチ１（Ｉ？ＡＩ））、ピリドキサル
リン酸、補酵素Δ、補酵素Ｑ、ソアノコハラミン、ヒオ
チン、アデノシントリポスフエート（Δ”Ｉ’Ｐ）、ア
デノシンジホスフエート（八ＤＰ）、アゾンシンモノホ
スフェート（ＡＭＰ）等を挙げることができる。

本発明においては、水分散性高分子重合体粒子に補酵素
を結合するに当って、その自由度を高めるためにスペー
サ基を介在させるのが有利である。

後に？ｉｌｉ酵素と結合さセてもよ（、或いはスペーサ
基を予め？ｉｌｉ酵素に結合させ、この後に重合体粒子
と結合させてもよい。また、補酵素と重合体粒子にそれ
ぞれ予めスペーサ基を結合させ、これらスペーサ基にて
相互に結合してもよい。

スペーサ基としては、ヘキザメチレンジアミン、ドデカ
メチレンジアミン、キシリレンシアミン等のジアミン、
６−アミノカプロン酸等のアミノアルキルカルボン酸等
が好ましく用いられるが、また、グリシルグリシルグリ
ジン等のようなものも好ましく用いられる。但し、これ
ら例示したものに限定されるものではない。

より具体的には、本発明においては、補酵素に予めスペ
ーサ基を結合さゼ、これを重合体粒子に結合させるのが
よい。このように予めスペーサ基を結合さゼた補酵素の
具体例として、例えば、Ｎ６−〔（６−アミンへキシル
）カルバモイルメチル〕−ＮＡＤ、Ｎ６−スクジニルー
”ＮＡＤ、Ｎ６−［：４−（３−ヒドロキンブチル）〕
−ＮΔＤ、（〈６−〔（６−アミノヘキシル）カルバモ
イルメチル〕−ＮＡＤＰ等を挙げることができる。

特に、本発明においては、重合体粒子としてカルボキシ
ル基を有するものを用い、これに前記したようなジアミ
ン型スペーサ基を結合い、更に、これに脂肪族のカルボ
ン酸残基の炭素数が２〜Ｊ１の直鎖アミノアルキルカル
ボン酸を水溶性カルボジイミドにより反応させて、かく
して、末端にアミノ基をもつ重合体粒子をＩＭ、一方に
おいて、補酵素には予め遊離のカルボキシル基を有する
ようにスペーサ基を結合せしめ、例えば、このようにし
て得られたＡＴＰ、ＮＡＤ、ＮΔＤＰ等を前記重合体粒
子に水溶性カルボジイミドにより結合固定化するのが望
ましい。

本発明による固定化補酵素は以上のように、水溶性重合
開始剤に由来する官能基を粒子表面に有する水分散性高
分子重合体粒子に、その官能基を介して補酵素が共有結
合にて固定化されており、従来のセルロース誘導体粒子
等を担体とする場合と異なり、固定化補酵素自体が遊離
の補酵素と同様に反応系内を自由に移動できるため、酵
素との接触機会が非常゛に高く、円滑に酵素反応を行な
わセることができる。

しかも、本発明による固定化補酵素は、補酵素が水不溶
性の担体に共有結合にて固定化されているために、容易
には脱離せず、更に、酵素反応後には遠心分離、塩析、
凝集剤を用いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によ
って容易に回収でき、かくして、長期間にわたって繰返
して使用することができる。

また、本発明の固定化補酵素をその製造面からみれば、
一般に官能基を有する単量体を含む単量体組成を乳化共
重合により安定な水分散性高分子重合体粒子として得る
ことは必ずしも容易でばないが、本発明に従って、末端
に官能基を有する水溶性重合開始剤を用いて、前記単量
体組成を乳化共重合させれば、乳化剤を特に用いること
なく、望ましくない水溶性重合体の生成を抑えて、安定
に水分Ｉ＆性性分分子重合体粒子得ることができ、しか
も、この重合体粒子表面には重合開始剤に由来する官能
基を有するのである。

以下６ｑ実施例を挙げて本発明を説明するが、Ａ″発明
これら実施例により限定されるものではない。

実施例１ アクリロニトリル ールジメタクリレート２ｇ゛及びメチルメククリレート
８３ｇを蒸留水２　３’Ｏ　ｇに加え、２，２゛−アゾ
ビスイソブチルアミジウム塩酸塩０，２ｇを水１０ｍｌ
に熔解した重合開始剤水溶液を６０°Ｃの温度で窒素気
流下に加え、１　２　０　ｒｐｍでＲ拌しつつ８時間重
合させて、固形分３０％、平均粒（￥０．４μの重合体
粒子の水分散液を得た。この？Ｌ化共重合において、凝
集物は０．１％であり、また、−に澄中ｔこ定量検出さ
れたアミノ基は僅かに０．０７％であった。

この重合体粒子分散液１００ｎ＋１にグルタルアルデヒ
ドの２％水溶液３０ｍ１を加え、室温で２時間反応させ
た後、遠心分離により精製し、アルデヒド基を有する重
合体粒子を得た。この重合体粒子− を水１００ｍ１に再分散させ、Ｎ　　　〔（６−アミノ
へキシル）カルバモイルメチル〕−ＮΔＤ２ｇを緩衝液
２０ｍ１に溶解した水溶液を加え、５℃の温度で２４時
間はさせて、ＮＡＤを重合体粒子に固定化した。反応終
了後、遠心分離して沈降した重合体粒子を蒸留水で洗滌
し、未固定の上記ＮＡＤを除去し、再び蒸留水に分散さ
せて、本発明による固定化？ｉｌｉ酵素を得た。

この固定化補酵素において、固定化量はＮＡＤ基準で重
合体１ｇ当り２２■であり、活性収率は３５％であった
。

尚、活性収率とは、固定化された補酵素の活性の理論量
に対する実際の活性の割合ｒ意味する。

ここでは、活性収率は、０．５Ｍのエタノールと０゜０
５Ｍのピルビン酸の水溶液を基質とし、固定化補酵素、
アルコールデヒドロゲナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ
を加え、３０°Ｃで３０分間反応させた後、固定化補酵
素を遠心分離して除き、反応液中に生した乳酸の量を測
定し、これと等しい活性を有するＮ６−（’（６−アミ
ノ・＼キシル）カルバモイルメチル）−ＮＡＤ量を固定
化補酵素量で除して求めた。

尚、比較のために、上記実施例において、アクリロニト
リルに代えてメチルメタクリレ−ｔ・ヲ用いた以外は全
く同様にして乳化共重合を行なったところ、凝集物は８
．５％生した。また、−に記実施例において、トリエチ
レングリコールジメタクリレートを用いない以外は全く
同様にして重合を１１なったところ、上澄には仕込め量
の５％のアミン基が検出された。

実施例２ アクリロニ１−リル２０ｇ１ジビニルヘンセン２ｇ、メ
チルメタクリレ−１・３５ｇ及びスチレン４３ｇを蒸留
水２３０ｇに加え、４，４゛−アゾビスシアノバレリア
ン酸０．３ｇを水２０’ｍｌにン容解した重合開始剤水
溶液を窒素気流下７０°Ｃの温度で加え、１２　Ｏｒｐ
ｍで攪拌しつつ８時間重合さゼで、固形分３０％、粒子
表面に開始剤に由来するカルボキシル基を有する平均粒
径０．４μの重合体粒子の水分散液を得た。

Ｎ６−’（２−アミノエチル）−ＮＡＤ２ｇを希塩酸で
ｐｌ＋を６．０に調整した水５０ｍ１に熔解した水溶液
を上記重合体粒子分散液１’００ｍ１に加え、更に、ｊ
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩を加え、ｐＨを６．０に調整しながら、
５℃の温度で２４時間放置した後、遠心骨δＩｆした。

沈降した重合体粒子を蒸留水にて洗滌して、未固定の上
記ＮＡＤを除去し、再び蒸留水に分散させて、本発明に
よる固定化補酵素を得た。

この固定化補酵素において、固定化量はＮＡＤ基を表で
重合体１ｇ当り２５＋ｎｇであり、活性収率はＮ６−（
２−アミノエチル）−ＮＡＤ基準で９０％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｉｌ　　（ａ＋アクリロニ１−リル及び／又はメタク
   リコニニトリル１〜６０重量％、（ｂ）多官能性内部架
   橋用単量体１〜２０重撥％、及び（Ｃ）これらＩＩ量体
   と共重合し得るラジカル重合性単量体２０〜９８重量％
   とからなるｌ’ｌｊ　ｌｉ体組成を、末端に補酵素の固
   定化に利用し得る官能基を有する水溶性重合開始剤によ
   って水媒体中で乳化共重合させて水分散性高分子重合体
   粒子を得、次にこの重合体粒子がその末端に有する上記
   重合開始剤からの官能基に補酵素を共有結合にて固定化
   することを特徴とする固定化補酵素の製造方法。 （２）水溶性重合開始剤がその末端に官能基としてアミ
   ノ基を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の固定化補酵素の製造方法。 （３）水溶性重合開始剤がその末端に官能基としてカル
   ボキシル基を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の固定化補酵素の製造方法。 （４）水溶性重合開始剤が２，２゛−アゾピスイソフチ
   ルアミジウム塩酸塩であることを特徴とする特許請求の
   範囲第２項記載の固定化補酵素の製造方法。 （５）水ｌＢ性重合開始剤が２，２゛−アゾヒスシアノ
   ハレリアン酸であることを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項記載の固定化補酵素の製造方法。 （６）水分散型高分子重合体粒子が（１，０３〜２μの
   平均粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の固定化？ｉｌｉ酵素の製造方法。 （７）　　ラジカル重合性単量体がアクリル酸エステル
   、メタクリル酸エステル又はスチレンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の固定化補酵素の製造
   方法。 （８）多官能性内部架橋用単量体が多価アルコールのポ
   リ　（メタ）アクリレ−１−であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の固定化補酵素の製造方法。