JPS6150959B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化補酵素に関する。

酵素反応は、その基質特異性や常温常圧での高
反応性のために、食品、医薬品の製造の過程で利
用されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶
解させて、水溶液中でで反応を行なわせている。
しかし、このような方法によれば、反応条件を一
定に維持しつつ、新鮮な酵素を補給したり、ま
た、反応後に酵素を失活させることなく、生成物
と酵素を分離することが非常に困難であり、酵素
が不経済に消費される。そのうえ、反応が回分式
であるから生産性に劣る。このような問題を解決
するため、既に種々の方法にて酵素を水不溶性の
担体に固定化し、この固定化酵素に基質を反応さ
せることが提案されている。

一方、酵素によつては、その触媒活性を発現す
るために補酵素を必要とする場合がある。このよ
うな場合には、固定化酵素にどのようにして必要
とする補酵素を結合させるかが、酵素反応を円滑
に進行させるために極めて重要な問題である。よ
く知られれているように、補酵素はアポ酵素と結
合し、ホロ酵素となつて酸素反応を行なうが、酵
素と補酵素間の結合は一般には可逆的であり、且
つ、比較的弱いため、補酵素が容易にアポ酵素か
ら分離するからである。酵素についてと同様に、
補酵素を水不溶性の担体に固定化して用いること
も既に知られているが、従来、酵素及び補酵素の
固定化に用いられている担体は、通常、セルロー
ス、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘導
体、ポリアクルアミドゲル、多孔性ガラス等の径
１mm乃至数mmの粒子であり、担体に一定長さの鎖
状構造、所謂スペーサ基を介して酵素や補酵素を
結合させ、その自由度を高めても、固定化酵素や
固定化補酵素自体がいずれも反応系内で固定され
ておれば、それぞれの自由運動範囲は極めて限ら
れているので、酵素と補酵素とが接触する機会は
非常に少なく、目的とする酵素反応は行なわれ難
い。

本発明は上記した種々の問題を解決するために
なされたものであつて、一般的には改善された固
定化補酵素を提供することを目的とし、特に、反
応系内において遊離の補酸素と同様に移動でき、
また、反応系からの分離、回収が容易であり、更
に、遊離の酵素や従来の形態の固定化酵素と組合
せて用いるのに適する固定化補酵素を提供するこ
とを目的とする。

本発明による固定化補酵素は、官能基を有する
水分散型高分子重合体粒子に補酵素が共有結合に
よつて固定されていることを特徴とする。

水分散型高分子粒子は補酵素を共有結合にて結
合するための官能基を有することを要し、このよ
うな重合体粒子は、代表的には官能基を有する単
量体、好ましくは他の単量体と共に乳化共重合す
ることによつて得ることができる。このような官
能基としてはカルボキシル基、水酸基、アミノ
基、ヒドラジド基、グリシジル基等が挙げること
ができる。かかる官能基を有する単量体として、
具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、イタコ
ン酸のようなカルボキシル基を有する単量体、ヒ
ドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチル
メタクリレートのような水酸基を有する単量体、
グリシジルメタクリレートのようなグリシジル基
を有する単量体を挙げることができる。

また、アミノ基やヒドラジド基を有する水分散
型高分子重合体粒子は、アクリルアミドのような
アミド基を有する単量体及びアクリル酸メチル、
メタクリル酸メチルのようなメチルエステル基を
有する単量体をそれぞれ好ましくは他の単量体と
共に乳化共重合し、得られた共重合体中の上記ア
ミドをホフマン分解し、また、メチルエステル基
にヒドラジンを作用させることによつて得ること
ができる。アクリル酸エステルようなエステル基
を有する単量体を乳化共重合させた後、エステル
基を加水分解することによつても、官能基として
カルボキシル基を含む水分散型高分子重合体粒子
を得ることができる。

これらの官能基を有する単量体に共重合させる
単量体は、共重合性を有する限りは特に制限され
ないが、好ましくはエチレン、プロピレン、塩化
ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アク
リル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレ
ンメチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、ア
クリルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニ
トリル等の一種又は二種以上が用いられる。これ
らの共重合性単量体は、得られる共重合体が酵素
反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を有
するように選ばれる。

本発明においては、イオン交換基を有する単量
体とこれに共重合可能な上記単量体に加えて、更
に内部架橋剤又は多官能性多量体を乳化共重合さ
せて水分散型高分子重合体粒子を得ることもでき
る。内部架橋剤は得られる重合体粒子のガラス転
移点を高めると共に、官能基を有する単量体の官
能基がカルボキル基のようにイオン性である場合
に、乳化共重合に際して望ましくない水溶性重合
体の生成を抑制する。このような内部架橋剤の具
体例としては、エチレングリコールジメタクリレ
ート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、
１・３−ブチレングリコールジメタクリレート、
トリエチレングリコールジアクリレート、トリメ
チロールプロパントリメタクリレート、トリメチ
ロールプロパントリアクリレート等のようなポリ
オールポリ（メタ）アクリレートやジビニルベン
ゼンが挙げられる。

水分散型高分子重合体粒子は、官能基を有する
単量体0.2〜30重量％と共重合性単量体99.8〜70
重量％とを乳化共重合して得る。内部架橋剤を併
用する場合には、全単量体の20重量％までの範囲
で共重合させるのがよい。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、平均粒径が0.03〜２μ、好ましくは0.07〜
１μである。粒径が小さすぎると、固定化補酵素
を水中に分散させて酵素と共に酵素反応を行なわ
せた後の回収が困難となり、一方、粒径が大きす
ぎると、単位体積当りの粒子表面積が小さくな
り、補酵素の固定化量が少なくなると共に、水中
に分散させるのが困難となるので好ましくない。
水分散型高分子重合体粒子の有する官能基の量は
重合体粒子１ｇ当り0.001〜５ミリ当量、好まし
くは0.01〜２ミリ当量である。官能基量が少なす
ぎるときは、補酵素の固定化量が少なく、酵素反
応が十分に行なわれず、一方、多すぎるときは、
補酵素の固定化に際して補酵素の失活が起こる傾
向があるからである。

本発明において担体として用いる水分散型高分
子重合体粒子は、上記のような単量体及び必要に
応じて内部架橋剤を通常の方法で乳化重合させる
ことにより得られるが、重合体粒子に乳化剤が混
在すると、補酵素が失活する等の有害な影響があ
らわれることがあるので、乳化重合に際しては乳
化剤を用いないのが好ましい。しかし、乳化剤が
補酵素に対して有害な影響を与えないときは、安
定に水分散型高分子重合体粒子を得るために用い
てよいのは勿論である。

水分散型高分子重合体粒子に補酵素を結合させ
る方法は特に制限されず、従来より一般に知られ
ている方法が適宜採用される。かかる方法として
は。例えば、ジアゾ法、カルボジイミド法、臭化
シアン法、アジド法等が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。

また、本発明においては、必要ならば、重合体
粒子にヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレン
ジアミン、グリシルグリシルグリシン等のスペー
サを介して補酵素を結合させ、固定化される補酵
素の担体上での自由運動範囲を拡大することがで
きる。

更に、本発明によれば、前記したような官能基
を有する単量体に予め補酵素を固定化し、これを
他の共重合性単量体と共に乳化共重合させること
によつても、補酵素が固定化された水分散型高分
子重合体粒子が得られる。

本発明において固定化される補酵素は特に制限
されないが、具体例としてニコチンアミド−アデ
ニンジヌクレオチド（NDA）、ニコチンアミド−
アデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）、フラ
ビン−アデニンジヌクレオチド（FAD）、ピリド
キサルリン酸、補酵素Ａ等を挙げることができ
る。

本発明の固定化補酵素は分散液として用いら
れ、アポ酵素及び基質と接触される。アポ酵素は
遊離酵素でも固定化酵素でもよい。例えば、アポ
酵素がセルロース誘導体やポリアクリルアミドゲ
ル粒子に固定化されている従来の固定化酵素を用
いる場合、固定化酵素をカラムに充填し、このカ
ラムに基質を含む本発明の固定化補酵素を通過さ
せる。酵素反応終了後、固定化補酵素は膜分離そ
の他適宜手段により分離される。

本発明による固定化補酵素は、以上のように、
官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に補酵
素が共有結合にて固定化されており、従来のセル
ロース誘導体やポリアクリルアミドゲルの粒子状
担体に固定化した場合と異なり、固定化補酵素自
体が遊離の補酵素と同様に反応系内を自由に移動
できるため、酵素との接触機会が非常に高く、円
滑な酵素反応が確保できる。しかも、補酵素は水
不溶性の重合体粒子担体に共有結合にて固定化さ
れているので、担体から容易には脱離しない。更
に、酵素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用
いる凝集沈殿、多孔性膜による膜分離等によつて
容易に回収でき、長期間にわたつて繰返し、安定
に使用することができる。

実施例 １ メチルメタクリレート97ｇと官能基を有する単
量体としてのアクリル酸３ｇを蒸留水230ｇに加
え、過硫酸カリウム0.3ｇを水10ｇに溶解した重
合開始剤水溶液を窒素気流下、70℃の温度で加
え、120rpmで撹拌しつつ８時間反応さて、平均
粒径0.25μの重合体粒子の分散液を得た。この分
散液50ｇを遠心分離し、水溶性重合体及び開始剤
による電解質を含む上澄を除去した後、沈降した
重合体粒子を再び蒸留水50mlに分散させた。

Ｎ−シクロヘキシル−N′−〔β−（Ｎ−メチル
モルフオリノ）エチル〕カルボジイミド−ｐ−ト
ルエンスルホネート1.5ｇを水30ｇに溶解し、塩
酸でPH5.0に調整したカルボジイミド水溶液を上
記分散液に加え、更に、NAD0.2ｇを水10ｇに溶
解し、塩酸でPH5.0に調整した補酵素溶液を加
え、５℃の温度で24時間放置後、未反応のカルボ
ジイミドと未固定のNADを除くため、遠心分離
して上澄を除去した。沈降粒子を水で洗滌し、本
発明の固定化補酵素を得た。

この固定化補酵素をグリセルアルデヒドホスフ
エートデヒドロゲナーゼを用いて測定したとこ
ろ、活性収率は遊離のNAD基準で35％であつ
た。

実施例 ２ メチルメタクリレート95ｇと官能基を有する単
量体としてのヒドロキシエチルメタクリレート５
ｇを蒸留水230ｇに加え、実施例１と同様にして
乳化重合させて、平均粒径0.3μの重合体粒子の
分散液を得た。この分散液50ｇを遠心分離し、沈
降粒子を再び蒸留水50mlに分散させた。

この分散液に10N水酸化ナトリウム水溶液を加
えてPHを11〜12に調整し、更に臭化シアン３ｇを
水50mlに溶解した臭化シアン水溶液を上記分散液
に撹拌しつつ、徐々に添加した。この際、分散液
のPHを11〜12に保つように水酸化ナトリウム水溶
液を加え、また、温度が30℃を越えないように冷
却した。反応終了後、遠心分離して上澄を捨て、
反応生成物を冷水で洗滌、遠心分離し、これを繰
返して精製した反応生成物を0.1M炭酸水素ナト
リウム水溶液50mlで分散して、臭化シアンで活性
化された重合体粒子分散液を得た。

この分散液を水酸化ナトリウム水溶液にてPH
10.0に調整し、６−アミノヘキサン酸２ｇを水10
mlに溶解した水溶液を加え、PH10.0に調整した
後、25〜30℃の温度で20時間反応させた。反応終
了後、遠心分離して上澄を除き、反応生成物を冷
水で洗滌、遠心分離し、この操作を繰返し、次に
沈降粒子を再び水50mlに分散させて、スペーサー
基を導入した水分散型高分子重合体粒子を得た。

この重合体粒子に実施例１と同様にしてNAD
を固定化し、本発明の固定化補酵素を得た。実施
例１と同様にして活性収率は43％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 官能基を有する平均粒径0.03〜２μの水不溶
   性水分散型高分子重合体粒子にその官能基を介し
   て補酵素が共有結合によつて固定化されてなるこ
   とを特徴とする固定化補酵素。 ２ 官能基がカルボキシル基、水酸基、アミノ
   基、ヒドラジド基又はグリシジル基であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化補
   酵素。