JPH0314432B2

JPH0314432B2 -

Info

Publication number: JPH0314432B2
Application number: JP12527282A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Moroishi; Yasuo Kihara; Isoji Sakai; Takashi Kawasaki; Isao So
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1982-07-19
Filing date: 1982-07-19
Publication date: 1991-02-26
Also published as: JPS5914790A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は固定化酵素及びその製造方法に関す
る。酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一
部工業的にも実施されているが、従来は酵素を基
質の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を
行なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られてい
る。しかし、従来、この方法において用いられて
いる担体は、通常、セルロース、デキストラン、
アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミドゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒
子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定さ
れて、基質溶液と接触されるので、基質が高分子
量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問
題がある。

特に、酵素を水不溶性担体にイオン結合にて固
定した固定化酵素は、例えば、イオン強度の高い
水溶液中で使用すると、酵素が容易に脱着して、
酵素活性が速やかに低下する欠点を有し、一方、
共有結合法によれば、酵素の脱着のおそれは小さ
いが、固定化する際の反応が繁雑であつて、酵素
が固定化の操作時に失活する場合も少なくなく、
更に費用も高価となる。

本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素及びその製造方法を提供することを目的と
し、特に、イオン結合法によりながら酵素の脱着
が抑えられて安定に担体に固定化され、従つて、
酵素活性が長期にわたつて高く保持される固定化
酵素及びその製造方法を提供することを目的とす
る。

本発明による固定化酵素は、イオン交換基を有
する水分散型高分子重合体粒子に酵素がイオン結
合にて固定化され、この上にポリアミンとジアル
デヒドのシツフ塩基からなる重合体が沈着されて
いることを特徴とし、かかる固定化酵素は、本発
明に従つて、イオン交換基を有する水分散型高分
子重合体粒子に酵素をイオン結合にて固定化した
後、上記重合体粒子の水分散液中でポリアミンと
ジアルデヒドとを反応させて、上記重合体粒子の
表面に上記ポリアミンとジアルデヒドのシツフ塩
基からなる重合体の層を沈着させることによつて
得られる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03〜2μ、好ましくは
0.07μ乃至1μである。粒径が小さすぎると、これ
を担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素
反応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、
粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表面積
が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共
に、水中に分散させるのが困難となるので好まし
くない。

また、本発明において用いられる水分散型高分
子重合体粒子は、イオン交換基を有することを要
し、かかる重合体は、イオン交換基を有する単量
体と、これと共重合性を有する単量体（以下、共
重合性単量体ということがある。）とを、乳化剤
を用いて、又は用いずして、通常の方法に従つて
乳化共重合させることにより得られる。

イオン交換基を有する単量体のイオン交換基と
しては、例えば、スルホン酸基、カルボキシル
基、リン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級
アミノ基等の塩基性基等を挙げることができる。
このような極性基を有する単量体の具体例として
は、スチレンスルホン酸、スルホプロピルメタク
リレートのようなスルホン酸基を有する単量体、
アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸のように
カルボキシル基を有する単量体、アシツドホスホ
キシエチルメタクリレート、３−クロロ−２−ア
シツドホスホキシエチルメタクリレートのような
リン酸基を有する単量体、ジメチルアミノエチル
メタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタク
リルアミドのような第３級アミノ基を有する単量
体、メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモ
ニウムクロライド、メタクリロイルオキシエチル
トリエチルアンモニウムクロライドのような第４
級アミノ基を有する単量体を挙げることができ
る。

上記のようなイオン交換基を有する単量体と共
重合させる単量体は、共重合性を有し、且つ、得
られる共重合体が、酵素反応の行なわれる温度よ
りも高いガラス転移点を有する限りは特に制限さ
れることなく、種々のものを用いることができる
が、好ましくは、エチレン、プロピレン、塩化ビ
ニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリ
ル酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレ
ン、メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタジエ
ン、イソプレン、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等
の１種又は２種以上が用いられる。

更に、本発明においては、イオン交換基を有す
る単量体及びこれと前記共重合性単量体に加え
て、内部架橋用多官能性単量体を乳化共重合させ
るのが好ましい。このような内部架橋用多官能性
単量体の具体例としては、エチレングリコールジ
メタクリレート、ジエチレングリコールジメタク
リレート、トリエチレングリコールジメタクリレ
ート、ジプロピレングリコールジメタクリレー
ト、１，３−ブチレングリコールジメタクリレー
ト、トリエチレングリコールジアクリレート、ト
リメチロールプロパントリメタクリレート、トリ
メチロールプロパントリアクリレート、テトラメ
チロールメタンテトラアクリレート等のような多
価アルコールの（メタ）アクリレートが好ましく
用いられる。ジビニルベンゼンも好ましく用いら
れる。

内部架橋用多官能性単量体の使用は、イオン交
換基を有する単量体と前記共重合性単量体との乳
化共重合において、好ましくない水溶性重合体の
生成を抑えると共に、重合の安定性を高めるのに
役立つ。

本発明においては、イオン交換基を有する単量
体0.2〜30重量％と前記共重合性単量体70〜99.8
重量とを乳化共重合させて水分散型高分子重合体
粒子を得るのが好ましいが、上記した内部架橋用
多官能性単量体をも共重合させる場合には、これ
を全単量体組成の20重量％までの範囲で使用する
のがよい。余りに多量に使用すると、却つて重合
の安定性を損なうおそれがあるからである。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子
重合体誘子に乳化剤が混存すると、酵素の固定化
に際して酵素が失活するおそれがあるので、好ま
しくは、上記のような単量体を乳化重合させると
きに乳化剤を用いないのがよいが、しかし、乳化
剤が用いる酵素に対して有害な影響を与えないと
きは、乳化剤を必要に応じて用いてもよいのは勿
論である。

また、本発明においては、イオン交換基を有す
る水分散型高分子重合体粒子を得るに際して、上
記のように、予めイオン交換基を有する単量体を
前記共重合性単量体とと乳化共重合させてもよい
が、重合後にイオン交換基に変換し得る官能性基
を有する単量体を、必要ならば共重合性単量体と
共に乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子
を得、この後にこの重合体の有する官能性基を化
学反応によりイオン交換基に変換基に変換しても
よい。イオン交換基に変換し得る官能性基を有す
る単量体として、例えば、アクリル酸エステルや
メタクリル酸エステルを挙げることができ、この
ような単量体成分を含む重合体粒子を酸又はアル
カリで処理すれば、イオン交換基としてカルボキ
シル基を有する水分散型高分子重合体粒子を得る
ことができる。また、グリシジル基を有する単量
体成分を含む重合体粒子に第３級アミンを反応さ
せると、第４級アミノ基を有する重合体粒子を得
ることができる。

本発明において、上記したイオン交換基を有す
る水分散型高分子重合体粒子に酵素をイオン結合
するには、酵素の失活が起こらない温度、PH等適
当な条件で重合体粒子の分散液と酵素溶液とを混
合すればよい。例えば、PHは酵素の等電点、イオ
ン交換基の種類に応じて適宜に定められるが、一
般的には５〜８が好ましい。この後、必要に応じ
て、遠心分離、膜分離等の適宜手段により未固定
の酵素を除去し、かくして、イオン結合により酵
素がその表面に固定化された水分散型高分子重合
体粒子を得る。

このようにして酵素を重合体粒子にイオン結合
した後、この重合体粒子を含有する水分散液中で
ポリアミンとジアルデヒドとを反応させることに
より、酵素が固定化されている重合体粒子表面に
ポリアミンとジアルデヒドとからなるシツフ塩基
の重合体が沈着されている固定化酵素を得ること
ができる。

本発明において用いるポリアミンは、アルデヒ
ド基と反応し得るアミノ基を分子内に２個又はそ
れ以上有するアミン化合物又は重合体を意味し、
好ましくは芳香族、脂肪族又は脂環族のジアミン
やトリアミンが好ましく用いられ、具体的にはフ
エニレンジアミン、キシリレンジアミン、フエニ
レントリアミン、トリアミノトルエン、エチレン
ジアミン、ヘキサジメチレンアミン等が用いられ
る。また、ポリエチレンイミンも用いることがで
きる。次に、ジアルデヒドも芳香族や脂肪族のジ
アルデヒドが好ましく用いられるが、具体的には
グルタルアルデヒド、コハク酸ジアルデヒド、グ
リオキザール、マレインジアルデヒド、テレフタ
ルジアルデヒド等が用いられる。

酵素が固定化された水分散型高分子重合体粒子
の表面にシツフ塩基重合体を沈着させる反応にお
いて、ポリアミンとジアルデヒドとの当量比は
10：１〜１：10であり、好ましくは５：１〜１：
５である。この範囲を越えていずれか一方を過多
に用いるときは、形成されるシツフ塩基重合体量
が少なすぎ、従つて、酵素を安定化し難いので好
ましくない。

上記の反応は、例えば、酵素の失活の起こらな
い温度及びPHにおいて、酵素の固定された水分散
型高分子重合体粒子の分散液にポリアミンとジア
ルデヒドのそれぞれの水溶液を加え、撹拌するこ
とにより行なうが、ポリアミンとジアルデヒドと
のそれぞれの水溶液を加える順序は特に制限され
ない。反応は通常、塩酸等による酸性条件下で行
なうことにより円滑に進行する。また、反応は通
常、常温で行なうが、酵素が失活するおそれがあ
るような場合には、低温で行なう。反応に要する
時間は、常温での反応の場合、通常数時間乃至10
時間程度である。次いで、未反応のポリアミン及
びジアルデヒドを遠心分離、膜分離等の適宜の手
段によつて除去すれば、本発明による固定化酵素
を得ることができる。

本発明において、上記のような方法により酵素
がイオン結合により水分散型高分子重合体粒子に
固定化されていながら、従来のイオン結合による
固定化酵素に比べて遥かに脱着し難い理由は必ず
しも明確ではないが、ポリアミンとジアルデヒド
とが反応してシツフ塩基を生じ、これが分子量が
大きくなるに従つて水不溶性となり、分散してい
る高分子重合体粒子表面に沈着して、その表面に
固定化されている酵素を被覆すると共に、酵素の
一部がそのアミノ基によりジアルデヒドの有する
アルデヒド基とも反応し、酵素が架橋されるから
であろう。但し、本発明は理論により何ら限定さ
れるものではない。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキターゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ
酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、アス
パラギン酸アセチルトランスエラーゼ、アスパラ
ギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシンアミ
ノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オキザロ
酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−
ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトランスフ
エラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクトキナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチルトラン
スフエラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼのよ
うな転移酵素、アスパラギナーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、アミラー
ゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミナー
ゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、
ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリプシ
ン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオチダ
ーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラスミ
ン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グラタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、水分
散型高分子重合体粒子に固定化酵素がイオン結合
により固定化されていながら、従来のイオン結合
法による固定化酵素と異なつて、酵素はイオン強
度の高い水溶液中においても容易には脱着せず、
酵素活性が長期にわたつて保持される。更に、本
発明による固定化酵素は、従来のセルロース誘導
体粒子等を担体とする場合と異なり、固定化酵素
自体が遊離の酵素と同様に反応系内を自由に移動
できるため、基質の拡散が反応に殆ど影響を与え
ず、従つて、高分子量の基質の場合にも遊離の酵
素と同様の高い反応速度で酵素反応を行なわせる
ことができる。

また、操作が極めて簡単であると共に、酵素の
固定化条件が緩やかであるため、固定化時の酵素
の失活が少なく、活性収率の高い固定化酵素を得
ることができる。しかも、本発明による固定化酵
素は水不溶性の担体に固定化されているため、酵
素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用いる凝
集沈澱、多孔性膜による膜分離等によつて容易に
回収でき、長期間にわたつて繰返し使用すること
ができる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。

実施例１メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモ
ニウムクロライド３ｇ、メチルメタクリレート80
ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート２
ｇ及びアクリロニトリル15ｇを蒸留水230ｇに加
え、２，2′−アゾビス−２−アミジノプロパン二
塩酸塩0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶
液を60℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで
撹拌しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均
粒径0.3μの重合体粒子の水分散液を得た。

次に、ウレアーゼ２ｇを0.1Mリン酸水素二カ
リウム及び0.1Mリン酸二水素カリウムから調製
した緩衝液（PH７）100mlに溶解した酵素水溶液
を上記重合体粒子分散液100mlに加え、５℃温度
で24時間放置後に遠心分離し、沈降した重合体粒
子を緩衝液で洗滌して、未固定のウレアーゼを除
去し、再び蒸留水300mlに分散させ、かくして、
イオン結合してウレアーゼを固定した水分散型高
分子重合体粒子を得た。

次いで、この分散液に塩酸でPHを６に調整した
１％のｍ−キシリレンジアミン水溶液24mlを加え
て撹拌し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶
液30mlを加えて、５℃で５時間撹拌して反応させ
た。反応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒
子をで洗滌して、未反応のキシリレンジアミン及
びグタルアルデヒドを除去し、再び緩衝液中に分
散させて、本発明による固定化酵素を得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合
体粒子１ｇ当り40mgであり、また、固定化された
酵素の活性の理論量に対する実際の活性の割合と
して定義される活性収率は60％であつた。活性収
率は、0.03Mの尿素水溶液を基質とし、35℃で10
分間固定化酵素を反応させ、生成したアンモニア
量（μモル／分）を塩酸滴定で求めて活性を測定
し、これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵
素固定化量で除して求めた。

次に、この固定化酵素と、先に得た水分散型高
分子重合体粒子にイオン結合にて酵素を固定化し
た比較例としての固定化酵素とが、イオン強度の
大きい水溶液中で酵素の脱着性がどのように異な
るかを調べた。

即ち、先に得た水分散型高分子重合体粒子にイ
オン結合にてウレアーゼを固定化して固定化酵素
を得た。この比較例固定化酵素の活性収率は前記
の方法により75％であつた。

本発明による固定化酵素と上記比較例としての
固定化酵素をそれぞれ1Mの塩化ナトリウムで洗
滌した後、その活性を測定したところ、本発明の
固定化酵素は初期の活性の97％を保持していた
が、比較例固定化酵素は初期の活性の50％にまで
低下した。従つて、本発明による固定化酵素はイ
オン強度の大きい水溶液中においても、酵素が脱
着し難いことが明らかである。

また、本発明の固定化酵素について、上記のよ
うにして活性を測定した後、緩衝液にて洗滌し、
再び活性を測定するという操作を５回繰返した
が、当初の活性の96％の活性を保持しており、繰
返し使用によつても、活性が高く保持された。こ
れに対して、比較例固定化酵素の場合は、初期の
活性の25％にまで活性が低下した。

実施例２アクリル酸３ｇ、スチレン50ｇ、メチルメタク
リレート25ｇ、ジビニルベンゼン２ｇ及びアクリ
ロニトリル20ｇを蒸留水230ｇに加え、過硫酸カ
リウム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶
液を70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで
撹拌しつつ８時間重合させ、固形分30％、平均粒
径0.2μの重合体粒子の水分散液を得た。

α−キモトリプシン２ｇを0.05Mリン酸二水素
ナトリウム及び0.05Mリン酸水素二カリウムから
調製した緩衝液（PH７）100mlに溶解した酵素水
溶液を上記重合体粒子分散液に加え、５℃で24時
間放置した後に遠心分離し、沈降した重合体粒子
を緩衝液で洗滌して、未固定のα−キモトリプシ
ンを除去し、再び蒸留水300mlに分散させた。

次いで、塩酸でPHを６に調整した１％のヘキサ
メチレンジアミン水溶液36mlを加えて撹拌し、次
に、１％のグルタルアルデヒド水溶液30mlを加え
て、５℃で５時間撹拌して反応させた。反応終了
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を上記と同
じ緩衝液で洗滌して、未反応のヘキサメチレンジ
アミン及びグルタルアルデヒドを除去し、再び緩
衝液中に分散させて、本発明による固定化酵素を
得た。

この固定化酵素のα−キモトリプシンの固定化
量は重合体粒子１ｇ当り32mgであり、また、活性
収率は40％であつた。活性収率は60％であつた。
活性収率は、0.05mMのＮ−アセチル−Ｌ−チロ
シンエチルエステルを基質として30℃で酵素を反
応させ、アルカリ滴定によりカルボキシル基生成
速度（μモル／分）から求めた。

Claims

【特許請求の範囲】１イオン交換基を有する水分散型高分子重合体
粒子に酵素がイオン結合にて固定化され、この上
にポリアミンとジアルデヒドのシツフ塩基からな
る重合体が沈着されていることを特徴とする固定
化酵素。２水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の固定化酵素。３イオン交換基を有する水分散型高分子重合体
粒子に酵素をイオン結合にて固定化した後、上記
重合体粒子の水分散液中でポリアミンとジアルデ
ヒドとを反応させて、上記重合体粒子の表面に上
記ポリアミンとジアルデヒドのシツフ塩基からな
る重合体を沈着させることを特徴とする固定化酵
素の製造方法。５水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
４項記載の固定化酵素の製造方法。