JPS5988090A - 不動態化された微生物を含有する生触媒及びこれを使用するステロイドの変換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特許請求の範囲に記載の生触媒、その製法及
びこれを使用するステロイドの変換法に関する。

微生物培養液を、屡々、ステロイド変換のために使用す
ることは公知である。例えば、アルトロノぐフタ−・シ
ンプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅ
ｘ　、　ＡＴ’ＣＣ６９４６，１３２６０汲びＩＦＯ３
５３０）又はノすシルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ７０５４＋７０
５５＋１２４８８及び］３８０５　）の培養液は、３−
ケト−パーステロイドの△１−脱水素のために使用され
る。フラゼノ々クテリウム・デヒＰロゲナンス（Ｆｌａ
ｖｏｂａ　−ｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｎｓ　；　ＡＴＣＣ１３９３０）の培養液ハ、特に、３
β−ヒＰロキシーへ５−ステロイドを３−ケトー△４−
ステロイげに変換するために使用される。ケトステロイ
Ｐの還元のためには、例えばサツカロミセス・ウノζル
ム（Ｓａｃｃ−ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ；　
ＮＣＹＣ９１又はＣＢＳ　１５０８）の培養液が好適で
ある。更に、特にミコ・々クテリウム・５ｐｅｃ、（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｐｅｃ、；　ＮＲＲＬ−
Ｂ　３６８３及びＮＲＲＬ　−Ｂ　３８０５　）の培養
液を用いて実施することのでき仝。ステロイＰの側鎖分
解が挙げられる。最後に、アスペルギルス・オクラセウ
ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｃｃｈｒａｃｅｕｓ　
；　ＣＢ５１３２５２、ＡＴＣＣ１００８、ＡＴＣＣ１
２３３７、ＡＴＣＣ１８５００又はＮＲＲＬ　４０５）
の培養液もしくはクルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌ
ａｒｉａ　１ｕｎａｔａ　；　ＮＲＲＬ２４３４、ＡＴ
ＣＣ１２０１７又はＩＦＯ６２８６）の培養液により作
用されつるステロイＰの１１α−及び１１β−ヒドロキ
シル化が挙げられる。

本発明方法によれば、前記微生物から、不動態化された
が増殖可能な形の微生物を中に有する生触媒を製造する
ことができる。ポリマー中に微生物が固定されている他
の生触媒に比べて、本発明による生触媒は、優れた作用
効果により優れている。

生触媒の製造に必要な微生物は、常法で培養し、この培
養の後に、濾過するが又は遠心分離し、水及び稀緩衝液
で洗浄し　再度Ｐ鍋するか又は遠心分離する。こうして
得た湿ったビオマスは更に後処理することなしに生触媒
の製造のために使用でき、この際アクロレイン−（１−
ビニル−２−ピロリドン）−共重合体（乾燥物質）に対
して約０５〜７倍量の湿ったビオマスを使用する。しか
しながら、他方で、このビオマスは、スプレー乾燥によ
って乾燥させることもでき、共重合体の０．１〜２．０
倍多量の乾燥粉末（乾燥物質）を使用する。

この生触媒の製造に使用されるこのアクロレイン−（１
−ビニル−２−ピロリドン）−４４合体は、特許請求の
範囲第６項に記載の方法で製造できる。この方法では、
開始剤として有利に、被ルオキシＰ例えば過酸化水素、
過酸化にノゾイル、クモールヒドロペルオキシｌ’、　
ｕ−１−ブチルペルオキシＰ又は殊に、カリウムペルオ
キソジスルフェートヲ使用する。この方法は、１０〜４
０℃の温度殊に１５〜３０’Ｃの温度で実施される。こ
の反応は室温で、最も問題なしに実施できる。

１−ビニル−２−ピロリ１ノ１モル当リドの程度モル量
のアクロレインを使用するかには無関係に、はぼ当モル
量の２成分からなる共重合体は、アルデヒド基測定及び
元素分析により立証できるような組成を有する。しかし
ながら、共重合体の良好な収率な得るために、１−ビニ
ル−２−ピロリドン１モル当リアクロレイン約０５〜１
５モルを使用するのが有利である。重合ヲ、アクロレイ
ン−（１〜ビニル−２−ピロリドン）−混合物２〜２０
％を含有する水溶液中で実施するのが有利である。アク
ロレイン−（１−ビニル−２−ピロリＰン）−混合物１
モル当り、開始剤０５〜ｌＯ殊に１〜４モル％を使用す
るのが有利である。重合の後に、モノマー及び開始剤を
有利に透析により除去し、得られる共重合体の溶液を直
接、生触媒の製造のために使用することができる。他方
、共重合体溶液を使用前に稀釈するか又は例えば凍結乾
燥により濃縮することもできる。

アルキレンツオキシ・ジアミンは、公知であるか又は公
知方法で製造することができる。（Ｊ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　］　９４７．９６３頁以降参照）
。アルキレンジオキシジアミンとしては、特に、炭素原
子５〜９個を有するものが有利である。長釦状のアルキ
レンジオキシジアミンは水中に難溶性であるので、生触
媒の製造のためには、その塩（例えばｌ塩酸塩又はｌ硫
酸りを使用するのが有利である。

この生触媒の製造のために、微生物をアクロレイン−（
１−ビニル−２−ピロリｒ〕）−共重合体−溶液中に懸
濁させ、この際、なお付加的に、不活性溶剤例えばジメ
チルホルムアミｒ又はジメチルスルホキシＰ２５％まで
を添加することができる。一様な懸濁液が生じたら、攪
拌下に、網状化剤中のオキシアミノ基と共重合体中のア
ルデヒド基との比が有利に０５〜１．５殊に１：ｌであ
るような量のアルキレン、クオキシジアミンを加える。

その後、混合物を緩衝液又はアルカリによりｐＨ３〜７
に調節し、生触媒を分離し、粉砕する。生触媒を湿った
まま篩別し、００２〜２　ｍｍの篩別フラクショノ有利
に粒径０．０５〜１．５朋のものを、ステロイドの変換
のために使用するのが有利である。

生触媒の水性懸濁液は、微生物そのものの相応する懸濁
液と同様に、ステロイｒ形成のために使用することがで
きる。例えば、まず、慣用の予備実験を用いて、最適な
醗酵条件例えば基質濃度、工業的条件例えば温度、通気
、ｐＨ−値及び最適醗酵時間をみつけることができる。

特に有利な実施形で０よ、生触媒の懸濁液に。

マイクロナイズされたステロイドを添加し、醗酵させ、
反応実施後に粗大粒状生触媒の篩別により、微細分散性
の生成物を分離する。次いで、粗大粒状生触媒は、場合
によっては、これを栄養溶液で処理することにより反応
性にし、改めて、ステロイド形成のために使用すること
ができる。

次の実施例につき、生触媒を製造するための本発明によ
る方法を説明し、かつステロイ口変換のためのその使用
に関して詳述する。

例　　ｌ ａ）　　コーン・ステイープｏ、　５％、酵母工＃　／
（０，１％及びデンプン糖０．０５％を含有し、ｐＨを
７０に調節した滅菌栄養溶液者５００　ｍｌを有する２
１のエーレンマイヤーフラスコ２個に、アルトロノ々ク
ター・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）の凍結乾燥
培養物を接種し、３０’Ｃで回転振動機上で４８時間振
動させる。この予備培養液ヲ、コーン・ステイープ０５
％−酵ｆＨｘキス０１％及びデンプン糖００５％を含有
し。

ｐＨ７，０に調節された滅菌培地３０１を充填した５ａ
ｔガラス醗酵器の接種のために使用する。接種の後に、
２９℃で、通気（１０々−）下、０．７　ａｔｌｌ・圧
で、攪拌（２２０回／ｍｌ７１）下に。

２４時間醗酵させる。この予備醗酵器−培養液を１次い
でコーン・ステイー−１ｏ、　ｓ％、酵母エキス０．１
％、デンプン糖００５％を含有しｐＨ’ｇ７．０に調節
し、１２１℃及び］、、　１　ａｔｕで滅菌した培地５
００ｔを有する鋼製醗酵器に接種し、予備醗酵器の条件
下で、同様に。

最適細胞濃度になるまで２４時間醗酵させる。

引続き、培養液を実験分離機ＬＧ２０５［Ｗｅｓｔｆａ
ｌｉａ　５ｅｐａｒａｔｏｒ　ＡＧｌｏｅｌｄｅ（ｗｅ
ｓｔｆ、）社製〕中で、　１００００回／　ｍｉｎで分
離する。この遠心分離された細胞物質を、栄養培地の付
着成分の除去のために蒸溜水で洗浄し、改めて遠心分離
する。

こうして製造した湿った細菌ペース）（２，８５ｋｇ　
）をｐＨ７，６の０．０５モルトリス−（ヒドロキシメ
チル）−メチルアミン−緩衝液２８５１中に懸濁させ５
細胞塊の細砕のために金属ガーゼフィルターを押し通し
、ユニ・ぐ−サル実験室用噴霧乾燥機［Ｕｎｉｖｅｒｓ
ａｌ−Ｌａｂｏｒ−Ｚｅｒｓ−１Ｋｕｂｕｎｇｓｔｒｏ
ｃｋｎｅｒ　；　Ｚａｈｎ　＆　Ｃｏ、Ｈａｍｅｌｎ。

Ｄｅｕ　ｔ　ｓｃｈ　Ｉ　ａｎｄ社製］中で、８０℃の
蒸発温度でスプレーし、この際毎時６　Ｑ　Ｑ　Ｍの細
胞懸濁液を供給する。

こうして、アルトロノ々クタ−・シノゾレックス乾燥粉
末５１３ｇが得られる。

ｂ）再蒸留アクロレイン４４９ｇ及び再蒸留１−ビニル
ー２−ピロリ１７１３３４ｇを窒素気下に、水ｌｌ中に
溶かし、カリウム被ルオキソジスルフエート１０．８＃
に加え、塩が溶解するまで攪拌し、次いで室温で２４時
間放置する。

次いで１反応混合物を蒸溜水に対して３日間透析させる
と、溶液１　ｍｌ当り共重合体４３．５■を含有スるア
クロレイン−（１−ビニル−２−ピロリドン）−共重合
体溶液が得られる。

共重合体のアルデヒド基含分は１ｇ当り５３２ｍモルで
ある。

Ｃ）　　アクロレイン−（ｌ−ビニル−２−ピロリドン
）−共重合体−溶液２．２８　ｍｌ　（共重合体１０ｇ
含有）に、ジメチルホルムアミｒ２２ｍｌ　Ｙ加える。

次いで、この溶液に、激しい攪拌下に、アルトロノ々ク
タ−・シンゾレツクス乾燥粉末１０ｇを加え、これが一
様に分配されり後に、１．６−ビス−アミノオキシ−ヘ
キサン・１塩酸塩の０．５モル水溶液５．３２　ｍｌを
加える。ｐＨ値が低下したら直ちに、ＩＮ苛性ソーダの
添加によりこれをｐＨ４，５に調節する。１０分後に、
反応混合物に０．０５モル燐酸塩緩衝液（ｐＨ６，８６
）を充填して２．５１にし、なお１時間攪拌し、得られ
た生成物を粉砕し、燐酸塩−緩衝液で洗浄し、湿ったま
ま篩別する。粒径０．１〜０．５朋の篩別フラクション
を湿ったまま貯蔵し、ステロイド変換の、ために使用す
る。この湿った生触媒は乾燥物質１４％を含有する。

ｄ）湿った生触媒４４ＯＮ９をｐＨ６，８６の０１０５
モル燐酸塩緩衝液中に懸濁させ、マイクロナイズされた
ヒドロコーチシン１８０■を加え、室温で２４時間振動
させろ。次いで、生触媒を分ＭＬ、ディファレンシャル
ーパルスーポーラログラフイを用いて、形成されたプレ
にゾロンの含６分を測定する。収率は理論量の８７％で
ある。

Ｐ別した生触媒は、ヒドロコーチシンの変換のために繰
り返し使用できる。

例　　２ ａ）１．８−）ブロムオクタン１ｏ６４Ｅｌを無水エタ
ノール４００ｍ１中に溶かし、ヒドロキシカルノ々ミド
酸エチルエステル８２．２．９及び水酸化カリウム４３
８ｇを加え、還流下に６時間加熱する。反応混９合物な
真空中で濃縮し、残分な水で稀釈し、・クエチルエーテ
ルで抽出し、エーテル抽出物を濃縮する。

得られた残分に、水８０ｍ１中の水酸化カリウム４０ｇ
の溶液を加え、還流下に２５時間加熱する。

反応混合物を冷却させ、これをジエチルエーテルで抽出
し、有機相を分別する。こうして、沸点１１５°Ｃ１０
，，４ｍｍＨ・ｇの１８−）アミノオキシ−オクタン１
６．４３９が得られる。

ジアミノオキシオクタン１６．４３ｇに攪拌下に、溶液
のｐＨ値が２４になるまでＩＮ塩酸水１６７．３　ｍｌ
を加える。次いで、溶液を真空中で濃縮し、残分を９３
％エタノールから再結晶させる。こうして、融点１７４
°Ｃのり一アミノオキシーオクタンー１塩酸塩１４．８
３ｙ　カ得られる。

ｂ）例ＩＣの条件下に、但し、相応する量の１゜８−ジ
−アミノオキシ−オクタン・ｌ塩酸塩の使用下にアルト
ロノ々クタ−・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）生
触媒を製造し、これは、同様に、ヒドロコーチシンを水
素化してプレＰニゾロンにする能力を有する。

例　　３ ａ）゛例１ａの条件下であるが、コーン・ステイヒプ・
リカー０５％、酵母エキス０．３％及びデンゾン糖０２
％を含有する栄養培地を用いて、フラボ・Ｓクテリウム
・デヒドロゲナンス（ＡＴＣＣ１３９３０）培養液５０
０ｍ１を作り、フラゼノぐクテリウムーデヒＰロゲナン
ス乾燥粉末７３１ｇを調製する。

ｂ）例ＩＣの条件下であるが、フラボ・々クテリウム・
デヒＰロゲナンス乾燥粉末の使用下に、３β、７α、２
１−）リヒＰロキシー５−プレグネン−２０−オンを１
７α、２１−ジヒドロキシ−４−プレグネン−３，２０
〜）オンに変じる能力のある生触媒を製造する。

例　　４ ａ）　　エタミン２％、デキストロース５％及びコーン
・ステイープ・リカー０３％を含有し、ｐＨ５，，３の
滅菌栄養培地５００Ｍを有する２を工−レンマイヤーフ
ラスコに、サツカロミセス・つ・々ルム（ＮＣＹＣ９１
）の凍結乾燥培養物を接種し、回転振動機上、２６℃で
２４時間振動させる。

この予備培養物を、滅菌培地（エダミン２％、デキスト
ロース５％及びコーン・ステイープ・リカー０８３％、
ｐＨ５，３）１５ｔを有する２０１ガラス醗酵器に接種
し、滅菌空気０．７ａｔｆｌ圧の通気下及び攪拌下に、
２６℃で６０時間醗酵させる。

その後、培養液を実験室用分離機中で遠心分離し、細胞
沈殿物を培地成分の除去のために蒸溜水３ｔで洗浄し、
改めて遠心する。こうして製造した細胞物質をセレンセ
ン（ＳＬｌｒｅｎ−ｓｅｎ　）による００５モル燐酸塩
緩衝液（ｐＨ６，４）中に懸濁させ、実験室用噴霧乾燥
器中で８０℃でスプレーする。受器中にスプレー乾燥終
了後に、酵母−乾燥粉末１９５ｇが集まる。

ｂ〕　例１ｃの条件下であるが、酵母−乾燥粉末の使用
下に、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを還元し
て１７β−ヒドロキシー４−７７ｙロステン−３−オン
にする能力を有する生触媒を製造する。

例　　５ ａ）　　７５０ｄエーレンマイヤーフラス：７に、？５
１ｔエキス１％、燐酸水素二ナトトリウム０．４５％、
燐酸−Ｘオ素ヵヮウェ。３４％及び、カー、（Ｒ１゜２
（’Ｔａｇａｔ””０２　）　０．２％を含有し、　ｐ
Ｈ６，７に調節した滅菌栄養液２’ｏｏｍｉを装入し、
ミコ・ぐクテリウム−５ｐｅｃ、（ＮＲＲＬ−Ｂ−３８
０５）の乾燥粉末の懸濁液を接種し、１９０回／罷、３
０’Ｃで３日間振動させる。

酵母エキス（６５％）１．２３％、燐酸二水素力ＩＪ　
ウＡ　０．０８％　及ヒ＊　カー　）Ｒ’。２　　ｏ２
％’ｉ含有し、ｐＨ０，６に調節された滅菌栄養溶液４
０１を有する５０１醗酵器に、ミコノζクテリウム・５
ｐｅｃ、培養液２００ｍ１を接種し、この予備培養液を
３０℃で通気（毎時２ｍ゛）下に、４８時間インキュベ
ートする。細胞物質を遠心分離し、これを水で粘液にし
、再度遠心させる。

ｂ）例１ｃの条件下であるが、ミコ・ζクテリウム・５
ｐｅｃ、細菌物質２５１１の使用下に、４−コレステノ
ー３−オンを４−アンドロステン−３，１７−ジオンに
変じる能力のある生触媒が製造される。

例　　６ ａ）クルブラリア、／ｌ／ナタ（ＮＲＲＬ　　２３８０
）を有する７〜１４日ビール麦芽汁−傾斜試験管に、生
理学的塩化ナトリウム溶液３　ｍｌを懸濁させ、これを
、グルコ−ス２％及びコーン・ステイープ２％を含有し
、ｐＨ６，５に調節し、オートクレーブ中、１２０℃で
３０分滅菌した栄養溶液５００ｍＡ！を有する２１：ｒ
−レンマイヤーフラスコに接種する。回転振動機上で３
０分間６０時間振動の後に、この培養液２５０ｍ１を予
備醗酵器の接種のために使用する。この培養液と同じ組
成の１２１℃、１・ぐ−ル過圧で滅菌した栄養媒体１５
７を装入した２０／予備醗酵器に、培養液２５０ｍＡ！
を接種する。

抑泡剤としてのシリコンＳＨの添加のもとに、２９℃及
び０．６ノＺ−ル圧までで、通気（１５１１／　ｍｍ　
）下及び攪拌（２２０回／　＋ｎｍ　）下に２４時間醗
酵させる。

菌糸体を吸引濾取し、これを水中で泥状にし、再度吸引
濾過する。

ｂ）例１ｃの条件下であるが、クルブラリア・ルナタ菌
糸体２５．Ｓ／を用いて、１７α、２１−ジヒドロキシ
−４−プレグネノ−３，２０−ジオ／をヒＦロコ−チゾ
ノに変じるのに好適な生触媒を製造する。

例　　７ ａ）コーン・ステイープ・リカー■％、大豆粉ｌ、２５
％及び大豆油０００５％を含有する滅菌栄養溶液５００
１１１１を有する２１エーレンマイヤ−フラスコに、ア
スペルギルス・オクラセウスＡＴＣＣ１００８の１０日
間傾斜培養物を接種し、３０℃１６５回／ｍｖｎで７２
時間振動させる。

この培養液を、同じ組成の滅菌栄養溶液１４．５１を有
する２０１ガラス醗酵器に接種し、攪拌（２２０回／騙
）下にかつ通気（１５１７ｍ１ｎ）下に、３０℃で醗酵
させる。

２４時間の生長相の後に、菌糸体を分離し、水中で泥状
化し、再度吸引１遇する。

ｂ）例１ｃの条件下であるが、アスペルギルス・オクラ
士ウス菌糸体２５ｆ！の使用下１ｃ、１７α。

２１−ジヒｒロキシー４−ゾレグネン−３゜２０−ジオ
７ｔ７　ｌｌα、１７α、２１−　）　ＩＪヒｐロキシ
ー４−プレグネノ−３，２０−）オンに変換するのに好
適である生触媒を製造する。

第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／６４５）　　　　　　　　　６７６０−４
Ｂ０発　明　者　ウド・クルスマン ドイツ連邦共和国ベルリン４１ツ インマーマンシュトラーセ１８ ５０１−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　アルトロノ々クター・シンゾレツクス、アスペル
   ギルス・オクラセウス、ノクシルス・スファエリクス、
   クルブラリア・ルナタ、フラゼノ々クテリウム・デビド
   ロゲナンス、ミコノぐクテリウム・５ｐｅｃ　、又はサ
   ツカロミセス・ウノ々ルムの不動態化された微生物を含
   有する生触媒において、これら微生物は、一般式：％式
   ％ 〔式中ｎは２〜１２の整数である〕のアルキレン、ジオ
   キシジアミンとの反応により網状化された。アクロレイ
   ンと１−ビニル−２−ピロリドンとからの共重合体中で
   不動態化されていることを特徴とする、不動態化された
   微生物を含有する生触媒。 ２　微生物１０〜７５重量％を特徴する特許請求の範囲
   第１項Ｒ己載の生触媒。 ３００５〜ｌ酊の粒径な有する、特許請求の範囲第１項
   又は２項に記載の生触媒・ ４、　アルトロノζクタ−・シンゾレツクス、アスペル
   ギルス・オクラセウス、ノクシルス・スファエリクス、
   クルブラリア・ルナタ、フラゼノ々クテリウム・デヒド
   ロゲナンス、ミコノ々クテリウム・５ｐｅｃ又はサツカ
   ロミセス・ウノぐルムの不動態化された微生物を含有す
   る生触媒を製造するために、アクロレインと１−ビニル
   −２−ピロリドンとからの共重合体の水溶液中の微生物
   懸濁液に、一般式： ％式％ 〔式中ｎは２〜１２の整数である〕のアルキレン・ジオ
   キシジアミンを添加することを特徴とする、不動態化さ
   れた微生物を含有する生触媒の製法。 ５．０〜４０℃の温度で実施する。特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 ６　水溶液中のアクロレインと１−ビニル−２−ピロＩ
   Ｊ　Ｐンとを、開始剤の存在でＯ〜４０’Ｃで重合する
   ことにより、使用共重合体を特徴する特許請求の範囲第
   ４項又は第５項に記載の方法。 ７．１−ビニル−２−ピロリド７１モル当りアクロレイ
   ン０５〜１０モルを特徴する特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 ８　アルキレンジオキシジアミンのオキシアミノ基と共
   重合体のアルデヒド基との比は０．５〜１５である、特
   許請求の範囲第４項〜第７項のいずれか１項に記載の方
   法。 ９、　アルトロノ々クター・シンプレックス、アスペル
   ギルス・オクラセウス、ノクシルス・スファエリクス、
   クルブラリア・ルナタ、フラゼノζクテリウム・デヒド
   ロゲナンス、ミコノ々クテリウム・５ｐｅｃ　、又はサ
   ツカロミセス・つ・々ルムの不動態化された微生物を含
   有する生触媒の水性懸濁液を使用することを特徴とする
   。ステロイ１の生物学的変換法。 １０、微生物１０〜７５重量％を含有する生触媒の水性
   懸濁液を特徴する特許請求の範囲第９項記載の方法。 】１　生触媒の懸濁液に、溶液の形又はマイクロナイズ
   された形のステロイドを添加し、反応混合物を２０〜４
   ０°Ｃの温度で、ステロイドが変換するまでインキュベ
   ートし、その後、生触媒を篩別により生じたステロイド
   の水性懸−濁液から分離する、特許請求の範囲第１０項
   記載の方法。