JPS60188062A - 高張培地を用いることにより改善された蛋白質の産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は蛋白質産生、特に動物細胞培養における抗体産
生を改善する方法に関する。要約すると、細ｌｌｘ、を
培養するのに等張培地よりもむしろ高張培地が用いられ
る。これは細胞の生存能力を保ちつつ細胞あたりに産生
される蛋白質量を増加させる作用を有する。この種の高
張培地は、・・、イプリド−マのような抗体産生細胞が
それらの生存能力や生長速度を有意に変更することなく
、より多量の抗体を産生ずるので、この種の細胞を増殖
するのに特に適している。

従来の技術 咄乳動物細胞を培養するための慣用培地は、細胞の生長
周期へのイオン濃度の影響に関するイーグル（Ｅａｇｌ
ｅ）の２つの独創的論文に従って配合され、５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　１２２：５０１〜５０４　（１９５５）および
Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＆　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、
　６１　：３５６〜３６６（１９５６）　を参照された
い。イーグルは８５〜１１５ｍＭのナトリウムおよび１
〜１０ｍＭのカリウムを含む培地がヒーラ細胞（Ｈｅｌ
ａ　ＣｅＩＩ）とマウス線維芽細胞の両細胞の増殖にと
って最適であると決定した。イーグルの基本培地（これ
は今日使用されるほとんど全ての動物細胞の増殖培地の
基礎となる）の配合はこれらの結果に基づいている。

イーグルの研究はその後スタツプルフイールト゛（Ｓｔ
ｕｂｂｌｅｆｉｅｌａ）およびムエラー（Ｍｕｅｌｌｅ
ｒ）によって引き継がれ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、’
　２０：１６４６〜１６５５（１９６０）を参照された
い）、彼らはヒーラ細胞の生長、生化学的組成および代
識への塩化ナトリウム濃度の影響について調べた。スタ
ツブルフイールト９は、増殖培地の塩化ナトリウム濃度
を高めると細胞複製が妨げられて細胞数が減少するが、
生き残っている細胞ではＲＮＡと蛋白質の合成が促進さ
れることを発見した。スタツブルフイールドは、食塩含
有量の変化がＤＮＡ複製を妨げることによって有糸分裂
を抑制し、かつ生き残っている細胞をそうでないときの
細胞より多く増殖させると理論づげた。塩化ナトリウム
の添加は培地の容量オスモル濃度を変化させたが、スタ
ツズルフイールドは浸透作用とイオン作用との間に区別
を生じさせようとはしなかった。

１２年後、シャハトシャーイル（５ｃｈａｃｈｔｅｃｈ
ａ−ｂθ１）およびフォーレイ（Ｆｏｌｅｙ）は塩化ナ
トリウムの添加により高張化した培地中でエールリド（
Ｅｈｒｌｉｃｈ）の腹水腫瘍細胞を培養して、この型の
細胞の生長周期・＼の高張培地の影響について調べた（
　Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ　、’、　７０：３１７〜
３２４．１９７２を参照されたい）。ツヤハト７ヤーベ
ルは、この培養において細胞数が有意に減少した後に実
質的に正常なライフザイクルに従う塩耐性細胞集団が発
生したことを見出した。しかし、これらの塩耐性細胞は
普通の細胞とはやや異なる形態を有しており、すなわち
それらは上皮細胞よりも線維芽細胞によく似ていると思
われた。これらの細胞の世代時間または倍加時間は劇的
に増加し、そして残存する細胞の数は培地の張度が高く
なるにつれて減少した。

抗体産生培養（例えば、膵臓細胞および）・イズリド−
マ）は血清を含むイーグル修飾培地のごとき培地中で普
通に増殖する。これらの培地中での抗体産生細胞の生長
周期および分泌される抗体の量は、これらの培地中で増
殖する他の蛋白質分泌細胞と比較して予期される範囲内
である。しかしながら、生物学的手段としての抗体の使
用量の増加は、とりわけバイブリド９−マおよびモノク
ローナル抗体製造技術の進歩により、特異な細胞培養か
らの増大した抗体産生の必要性へと導いた。

骨髄腫細胞もまた等張培地中で普通に増殖する。

これらの細胞は蛋白質を産生じかつ遺伝子的に修飾する
ことかできるので、細胞の生存能力を失わせずに蛋白質
産生量を増加させる培地が有利であるだろう。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は蛋白質産生を改善するための■白質産生
細胞の培養方法を提供することである。

他の目的は生存しうる膨張培養物を発生させつつ抗体産
生細胞から高度の抗体産生をうながすことである。さら
に他の目的は培養へ供給細胞を添加することなくノ・イ
ブリビーマの増殖およびモノクローナル抗体産生を促進
することである。本発明のさらに別の目的は、高密度の
細胞を含む大量培養から高収率で蛋白質を得る方法を提
供することである。本発明のもう１つの目的は、細胞の
生存能力を保持しつつ細胞（例えば骨髄腫細胞）からの
蛋白質産生を促進することである。これらおよび他の目
的ならびに本発明の特徴は以下の要約、記述および図面
から明らかになるだろう。

問題を解決するための手段 本発明は動物細胞培養における蛋白質産生、特に抗体産
生を促進する方法に関する。要約すると、蛋白質産生細
胞を培養するのに用いられる慣用培地は、以前に可能で
あったよりも高い比活性をもつ有意に市い蛋白質収率を
もたらすように修飾され得ることが発見された。本発明
はまた蛋白質産生な高める改善された増殖培地に関する
。

本発明は、蛋白質産生細胞な高張培地、すなわち少なく
とも３４０　ミＩＪオスモルの容量オスモル濃度を有す
る培地、好適には３４０〜４５０ミリオスモルのホ１′
８、囲、最適には約３６０ミリオスモルの容量オスモル
濃度を有する培地中で培養することにより蛋白質産生を
促進する方法を提供する。好適な培地は増加量のアミノ
酸、好ましくは普通のアミノ酸含有風の２倍のアミノ酸
を加えることによって高張化した慣用の増殖培地（例え
ばイーグル培地）である。これらのアミノ酸は一回分ご
とにまたは連続的に加えることができる。慣用培地が普
通の濃度よりも高いアミノ酸濃度を生ずるように過剰の
アミノ酸を周期的に注入されてもよい。

また、別の方法として、予め調製した高張培地を培養中
へ連続的にまたは断続的に通してもよい。

蛋白質産生における改善はまた高張培地を用いるバッチ
培養で達成される。蛋白質産生細胞はどれも本発明から
利益を得ることができるが、遺伝子的に修飾された細胞
が好適である。

本発明方法は一般に通常の蛋白質産生細胞培養からの蛋
白質産生を高めるのに有用であるが、蛋白質産生細胞が
カプセル内容積を定める透過性膜を有する複数のカプセ
ル内に注入される場合に特に有用である。そのカプセル
膜は酸性多糖類へ塩−結合した複数の第１アミン基をも
つ、ｄ　ＩＪママ−含みうる。好適な酸性多糖類はアル
ギン酸塩であり、一方複数の第１アミン基をもつ好適な
ハリマーはホリハプチト９、最適にはポリリシンまたは
ポリオルニチンである。

本発明は蛋白質産生な促進する改善された増殖培地を提
供する。この培地はイーグル修飾培地のような培地がそ
うであるように細胞増殖および有、糸分裂にとって必要
な必須塩類、栄養素ならびにアミノ酸Ｍを含むが、培地
の容量オスモル濃度を少なくとも約３４０ミリオスモル
、好適には約３４０〜４５０ミリオスモル、最適には約
３６０ミリオスモルへ高めるのに十分過剰のアミノ酸を
加えることによって修飾される。本発明を具体的に表わ
す培地は、細胞の生存能力またはそれらの生長速度に悪
影響を及ぼすことなく増大した蛋白質産生をもたらす。

作用 本発明の方法および培地は、一般的に信じられているこ
ととは相違して、高張培地が細胞の生存能力をそこなう
ことなく蛋白質、特に抗体の産生を促進しうるという発
見に基づいている。本発明の教示に従って、以前に可能
であったよりも高い比活性または純度をもつ例外的な抗
体収率が、小規模培養または高細胞密度の生産規模培養
のいずれにおいても得られる。

ヒーラ細胞およびマウス線維芽細胞への塩化ナトリウム
の影響に関する初期の実験は２９０〜３３０ミリオスモ
ルが動物細胞培養の増殖にとって最適の張度範囲である
という結論に導いた。しかし、本発明方法を用いるなら
ば、分泌された蛋白質の５０係の抗体収率が得られ、そ
して６２チまでの収率が可能である。分泌された蛋白質
中の抗体濃度が高いために、抗体精製が容易になり、そ
れによって抗体精製にともなう多くの問題が軽減されか
つ精製費用が安くなる。高張培地は・・イブリド一マ、
骨髄腫細胞および他の連続咄乳動物細胞蛋白質産生培養
物を培養するのにとりわけ有用であり、慣用培地のとき
に可能であるよりも高い蛋白質産生または分泌量をもた
らす。骨・髄腫細胞は特異な蛋白質の産生を高めるよう
に遺伝子的に修飾することができる。

本発明で用いる蛋白質産生細胞は、米国特許第４３５２
８８３号、同第４４０９３３１号および本出願と同日付
の係属中の特許出願番号（代理文書番号ＤＢＨ−４５６
）（これらの開示は参照によりここに引用される）に記
載の方法に従って、約１０細胞／　ｒｒｔｌ程度の細胞
密度を有する大規模培養において増殖させることができ
る。要約すると、上記２つの特許は生存しうる健康な細
胞をカプセル封入する方法およびそ゛の細胞によって産
生された物質を収穫する方法を開示している。出願番号
（代理文書番号ＤＢＩ（−４５６）は、カプセル封入さ
れた培養中へ制限された酸素および二酸化炭素を含む気
体を直接通すことによって酸素および二酸化炭素の要求
条件がかなえられる場合、異常に高い細胞密度が慣用培
地を用いるカプセル封入培養において達成され得ること
を開示している。これらの技術を用いて、約３０１の容
量および約１０　細胞／　Ｆｌｌｇの細胞密度を有する
培養が作られた。本発明方法を用いることにより、この
種の培養は約３〜６Ｉのモノクローナル抗体を産生じた
。

第５図は本発明に従って細胞を培養するための装置を略
図的に示す。それは上部プレート１２を備えた３１６Ｌ
ステンレス鋼製の、電解研磨された５０１容量の容器１
０から成る。モーター１４はパドルシャフト されたパドル１８および２０を回転させる。培養２２は
例えば以下に定義するような高張培地、およびその培地
中に含まれるアミノ酸、気体、ビタミン、イオンなどに
対して透過性の膜をもつ多敬の懸濁カプセルを含む。・
一般に好適な高張培地は普通の濃度の２倍のアミノ酸を
含みかつ５容量係の血清（例えばウシ血清）を補充した
イーグル修飾培地である。通常、カプセルは球形または
回転楕円形であり、そして約２ｍＮ未満くらいの直径を
有する。カプセルは平均直径が約０．　８　ｍｍの作業
穴をもつ。細胞の気体要求条件は滅菌フィルター２４、
空気チューブ２６および散布用ヘッド２８を介して酸素
と二酸化炭素を含む気体を通すことにより満たされる。

散布用ヘット８２８は２５ミクロンの多孔質磁製フィル
ターを含むことができる。

気体は空気９５容量係および二酸化炭素５容ｔ％を含み
うる。気泡は散布用ヘッド２８からカプセルの間の培地
を通って上方へ行（。散布速度は培地中の酸素の分圧を
気体中の酸素の分圧に実質的に等しく維持するのに十分
であるべきである。培地中の酸素の圧力はそれによって
細胞が最適増殖のために要求するその水準にあるいはそ
れよりわずかに高い水準に調整されろ。培地中の血清成
分のために、散布は気泡を容器１０の上部空間３０へ集
めさせる。しかしながら、たとえカプセルが一時的に気
泡内に入って運ばれたとしても、カプセルは細胞が脱水
しないように防ぎ、かつまた細胞が機械的損傷を受けな
いように保護する。こうして、カプセル封入された培養
中への気体の散布は次第に増える細胞集団の酸素要求を
満たすことができ、それによって極めて高い細胞密度を
達成することができる。培養を出た気体は排出口３２お
よびフィルター３４を通過する。３０１培養のだめの気
体の一般的流量ば０２標準立方フィート／時間である。

本発明をバッチ供給方式で実施する場合、高張培地は種
培養を含むマイクロカプセルと共に容器１０の中へ単に
制量して加えられ、そして培養が最大密度へと増殖され
る。これとは別に、初めに等張の慣用培地を用いて、追
加の過剰アミノ酸が例えば注入口３６を介して生長周期
の間に１回またはそれ以上注入することによってその培
養へ加えられてもよい。しかし、本発明の最もよい実施
方法は、連続的または断続的な培地流れを入口３８へ導
入し、フィルター要素４０を介して培地を排出させるこ
とによりその培養の中に高張培地を通すことである。フ
ィルター要素４０はカプセルの直径より小さい、例えば
５０〜１００　ミクロンの孔をもつステンレス製の微孔
質メツシュで構成され得る。培地はバルブ４２により抜
き取られる。

培養内の培地水準は透明な外部チューブ４４で観察でき
る。入口３８へ入る培地およびフィルター４０を介して
出る培地の一般的流量は４〜１２ｉｇ７分である。所望
の高張性を維持することが要求されるに従って、富化用
アミノ酸溶液をその培養中へ注入し得ることがまた予期
される。

細胞により産生された蛋白質を収穫する際に用いる方法
は、対象となる蛋白質の有効分子寸法とカプセル膜の透
過性との関係に依存するだろう。

先に引用した特許に開示されるように、カプセル膜の透
過性は適度にコントロールすることができる。カプセル
膜の多孔度をコントロールして均質なカプセルを作るた
めの一般に好適な方法の詳細は係属中の特許出願番号（
代理文書番号ＤＢＨ−４５２）（この開示は参照により
ここに引用される）に開示されている。対象の蛋白質が
太きすぎてその膜を通過しない場合にはその蛋白質はマ
イクロカプセル内に集まり、蛋白質が十分に小さくてそ
の膜を通過する場合にはそれはカプセル外培地中に集ま
るだろう。

実施例 次の非限定的実施例は本発明をさらに例示するだろう。

実施例１ この実験は、培地の張度を過剰のアミノ酸の添加により
高めることが蛋白質産生細胞の生存能力または有糸分裂
速度を変えずに増大した蛋白質産生なもたらすことを示
す。次の実験に用いた細胞は工ｇＧを分壓するマウス−
マウスハイブリド−マであった。このハイブリド−マは
米国特許第４３５２８８３号記載の方法の変法てよりカ
プセル封入した。より詳細には、標準培地中１係（重量
／容量）アルギン酸ナトリウム（ＮａＧ−Ｋａｌｃｏ　
ＬＶ）１ｒｕｌあたり１０個の細胞を含む懸濁液が、土
部空気取入れノズルおよびストッパー内に摩擦ばめされ
る細長い中空体をもつハウジングから成るジェット−ヘ
ッド装置へ移された。アルギン酸塩−培地懸濁液の細胞
密度は種培養におけるカプセルあたりの平均細胞数を指
定する。ステッピングポンプを備えたシリンジ（Ｉ＋す
えば１０ｃｃシリンダ）はハウジングの長さにわたって
通ずる針（例えば内径が０．０１インチのテフロン被覆
針）でもってそのハウジングの頂部へ取付けられた。ハ
ウジングの内部は針の先端が空気ナイフとして作動する
一定の空気層の流れにさらされるように設計された。使
用に際して、カプセル封入しようとする物質を含む溶液
を満たしたシリンダはそのハウジングの頂部に数句けら
れ、そしてステッピングポンプが作動して溶液のしずく
を針の先端へ漸増的に押しやる。各しず（は空気流によ
って１切り離され”、１２係′（重量／容量）の塩化カ
ルシウム溶液の中へ約２５〜３．５０ｍ落下してゲル化
した塊を形成し、この塊は吸引ＩＬ′Ｃよって集められ
る。このゲル化した塊はゲル膨張のために等張塩水中で
インキュベートし、この等張塩水は３回変える。この塩
水膨張は全体で約１１分かかる。次に、等張塩溶液中の
７５０ｍ？／１１のポリーＬ−リシン（ングマケミカル
社、分子量６５０００ダルトン）と接触させることによ
って、ゲル化した塊のまわりに膜を形成させる。１２分
の反応後、得られたカプセルは塩水中のＯ，？　％　（
重量／容量）塩化カルシウム含有ＣＨＥＳ（２−シクロ
ヘキシルアミンエタンスルホン酸）緩衝液（シグマ）の
１．４ｆｌ／ｌの溶液を用いて１０分間洗う。このカプ
セルは塩水中の０．３　％　（重量／容量）塩化カルシ
ウムを用いて約８分間洗い、そして塩水中の１０５ｍＶ
／ｌのぼリビニルアミン（ホリサイエンス社、分子量５
００００〜１５００００ダルトン）と１０分間反応させ
ることによって第２の膜をカプセルのまわりに形成させ
る。このカプセルは再び等張塩水で２回７分間にわたり
洗浄し、そして塩水中の５Ｘ１．Ｏ％Ｃ重州／容量）　
ＮａＧ溶液に７分間浸漬することによって後被覆した。

このカプセルは塩水中でさらに４分間洗い、そのあと塩
溶液中の５５ｍＭクエン酸ナトリウムに、最初は２０分
間そして２回目は６分間浸漬することによってカプセル
内容積を再び液化した。カプセルは塩水中で２回、培地
中で４分間１回洗浄した。米国Ｉ特許第４４０９３３１
号に一般的に開示されるように、カプセルが増殖培地中
でインキュベートされる場合に■ｇＧはカプセル内に集
まり、はんの微量がカプセル外培地に検出される。この
方法によって作られたカプセルは実質的に■ｇＧに対し
て不透過性であるが必要とされる栄養素を自由に通過さ
せ、それによりカブモル内容積での細胞増殖および抗体
産生を可能にする。

表１は基本的な既知培地の諸成分を示し、表２および３
はこの培地のアミノ酸成分およびビタミン成分を詳細に
記す。表１の丸括弧内の濃度は、本発明の高張培地を形
成すべく鉄およびアミノ酸含有量においてなされた修飾
を表わす。要約すると、鉄はＩＯＱ倍増加し、アミノ酸
は２倍になった。培地を配合した後、５容量係の胎児ウ
シ血清が加えられる。過剰のアミノ酸および硝酸第二鉄
の添加は培地の容量オスモル濃度を約３６−０ミ！、１
オスモルへ高める。培地成分の調査から明らかなように
、普通培地においては約４．７重量係（水を含まない）
がアミノ酸であるか、高張培地は約８９重量％のアミノ
酸を含む。本発明の好適な培地は約７．０　％〜１２％
のアミノ酸を含む。

表　１ ４０リットル単位で調製 化学成分 使用量 原液 濃度：　５０Ｘ ２ ２０リットル単位で調製 アミノ酸　使用量 Ｌ−アラニア　９０．０＆ Ｌ−フルボ＝：ｙＨｃｌｌ　６０．０＆Ｌ−アスパラギ
ン酸　２４．０．９ Ｌ〜アスパラギンＨ２０２０，Ｏ！ｊ Ｌ　−ン、ｙ、ｆインＨｃｌ−Ｈ２０６０，Ｏ，！ｉ’
Ｌ−グルタミン酸　１１５．０１ グリシン　５０．０＆ Ｌ−ヒスｆジｙ　ＨＣｌ−ＨＯ２０，ＯｇＬ−イノロイ
シン　３０．０．９ Ｌ−ロイノン　７５．０＆ Ｌ　−ＩＪ　ンンＨｃｌ　９０．０．９Ｌ−メチオニン
　２３．０＆ Ｌ−フェニルアラニン　２５．０．９ Ｌ−プロリン　３０．０１ Ｌ−セリン　１０．０＆ Ｌ−トレオニン　４０．０．９ Ｌ−）リプトファン　］、］０．０． ９Ｌ−バリア　５０．０１ 蒸留水で全量２０リツトルとする 表３ ｉｏリットル単位で調・７「ｌ ビタミン　使用叶 アスコルビ／酸　１ｏｇ ｄ−ビオチン　０３９ ｄ−パントテン酸カルシウム　０５ｇ 塩化コリン　０．８＆ 酢酸ｄ−α−トコフェロール　６　μｌエルゴカルンフ
ェロール　０５！９ グルタチオン　０．５５＆ ミオイノ７トール　１．０ｇ メナシオン重亜硫酸す）　ｌ）ラム　０．０４６ｇリノ
ール酸メチル　１７　μｌ ニコチンアミド’　０５！ｊ ピリドゝキサールＨＣ１Ｏ，５，９ リボフラビン　０．０５ｇ ５ｇビルピノトリウム　１２５Ｉ −ＩＦ−７ミ”Ｈ”　０．５２ｇ ビタミンＡ　ｏｏ５ｇ ビタミビタミン成分　０．１ｇ 蒸留水で全量１０１，１ツトルとする。

カプセル封入されたハイブリドーマは３９ｏ。

３９５，３９６および３９７と呼ばれる４つの培養に分
けた。６ノの培地（約３４の沈降カプセルを含む）から
なる培養３９０は３６１スピナーフラスコ内で培養した
。最初の培地は２倍のアミノ酸含量と過剰の鉄とを含む
高張培地であった。この培養は高張性を維持するために
３．、５．７．１０．１１．１２゜１６、１７．１８．
１９．２０および２１日目に６〜８１の高張培地をバッ
チ供給された。

ステンレス鋼製容器中に６１のカプセル封入された培養
を含む培養３９５は、２６日の実験期間中全部で９０１
の普通培地を連続して供給された。

使用したアミノ酸濃度（８００ｎｔｌりは結果的に等張
培地をもたらした。

ステンレス鋼製容器中にそれぞれ６１のカプセル封入さ
れた培養を含む培養３９６および３９７は、２６日間に
わたって１２０７の培地と追加の鉄とを連続して供給さ
れた。培養３９６は２倍のアミノ酸を含む高張培地を受
け取ったが、培養３９７は等張培地を受け取った。酸素
／Ｃｏ□は全てのカプセル封入された培養の中に散布さ
れた。

第１図は４つのｔ＠養についての各種時間における沈降
カプセル１ｒｕｌあたりの細胞数な示す。０は培養３９
０　（’３　ｌのカプセル；バッチ供給（８ノＭ）；２
×アミノ酸；Ｆｓ；３６１スピナーフラスコ）。

・は培養３９５（６１のカプセル；連続供給（９０７）
；ＬＸアミノ酸；ステンレス鋼容器）、△は培養３９６
（６１のカプセル；連続供給（１２０１）；２×アミノ
酸；Ｆｅ；ステンレス痢容器）、および■は培養３９７
（６１のカプセル；連続供給（１２Ｍ）；ＬＸアミノ酸
、Ｆｅ、ステンレス鋼要器）をそれぞれ表わす。細胞の
計数はカプセル試料を破壊した後にヘマトサイトメータ
ーを用いて行った。明らかなように、高張培地はハイプ
リド−マの増殖を妨げないばかりでなく、実際にその生
長速度を高め、これは全く予期されない結果であった。

第２図は第１図の培養についての沈降カプセル１罰あた
りの生存しうる細胞総数を示す。高張培地における細胞
の生存能力は等張培地におけるより、優れていないにし
ても、少なくとも同じくらいによい。

第３図は高張培地を用いることにより抗体産生が高めら
れたことを示す。等張培地を連続的に供給された培養３
９７は、１４日目に細胞培養からカプセル１ｍＪあたり
抗体的２００μＩという優れた抗体産生をもたらしてい
た。これに対して、高張培地で増殖させた培養３９０お
よび３９６は、４倍増加のカプセル１ｍｇあたり抗体的
８００μｇを産生じていた。抗体濃度はカプセル膜を破
壊してＥＬ工ＳＡ抗体検定を用いることにより測定した
。

詳細には、アルカリ性ホスファターゼへ結合させたラッ
ト−抗マウス抗体をカプセル内流動体と反応すせた。ｐ
−ニトロフェニルホスフェートカマウス抗体へ免疫学的
に結合させたアルカリ性ホスファターゼの基質として使
用され、そして３４０　ｎｍの吸光度が測定された。

これらの実験は抗体含有量の増加が培地の高張性の影響
であって追加の鉄の影響であって追加の鉄の影響でない
ことを示している。培養３ｑ６および３９７は、培養３
９６が２倍のアミノ酸を受け取ったことを除いて、追加
の鉄を含む同一の培地であった。培養３９７はアミノ酸
を含む等張培地を連続して供給されたので、この培養で
のアミノ酸の不足はなかった、このデータから明らかな
ように、慣用の等張培地よりむしろ高張培地（この場合
には３６０ミリオスモル）を用いることにより、細胞の
生存能力を低下させることなく蛋白質産生７高めること
がでとる。

実施例２ この実施列は、細胞培養のカプセル封入および過剰のア
ミノ酸を添加して培地を高張化することが抗体合成を非
常に高めるが、ナ）　リウムを添加して培地を高張化す
ることはカプセル封入されていない抗体産生細胞に対し
てでさえ抗体産生をわずかに高めることができるという
ことを示している。

この実験においては３つの毀なる培地が用いられ、１つ
は２５０ミリオスモル（低張）の容量オスモル濃度をも
ち、２番目は３２５ミリオスモルｃ等張）の容量オスモ
ル濃度をもち、そして３番目は４００ミリオスモル（高
張）の容量オスモル濃度をもっていた。各溶液の型骨オ
スモル濃度は氷点降下によって測定した。溶液の容量オ
スモル濃度はこれらの濃度での重量オスモル濃度に大体
等しい。培地は塩化ナトリウム濃度が容量オスモル濃度
を変えるべく変更されたことを除いて、表１〜３に示し
た基本培地（過剰の鉄またはアミノ酸を含まない）と同
じであった。

第４図は３つの培養についての細胞増殖を示す。

０は２５０ミリオスモル培地、・は３２５　ミＩＪオス
モル培地、△は４００ミリオスモル培地をそれぞれ表わ
す。図面から明らかなように、塩の添加によって溶液の
容量オスモル濃度を変えることは細胞増殖に何ら有意な
影響を及ぼさなかった。

表４は溶液の容量オスモル濃度を変更することによって
生じた抗体産生の差異について示す。３組の培養＜Ａ−
Ｃ）が表４に示され、各々２通り（ａ、ｂ）ずつ行われ
た。全ての培養は同じ・・イブリドゝ−マ培養であった
がカプセル封入されなかった。

表　４ ２５０ａ　７２．９　７３ ２５ｏｂ　７４．．１ ４、ＯＯａ　７９，９　７８．８ ４００ｂ　７７．７ ２８０ａ　６８，２　６７．１ ２５０ｂ　６６．０ ４００ａ　５２，４　７０．６ ４００ｂ　８８．９ ２５０ａ　６９，７　６７．５ ２５０ｂ　６５．３ ４００ａ　７９，９　９０．３ ４００ｂ　１００．８ データに示されるように、塩の添加によって増殖培地の
容量オスモル濃度を筒めることは等張培地からの抗体産
生と同じくらいがまたはそれ以上によい蛋白質産生を、
そして低張培地よりも優れた蛋白質産生欠もたらす。ま
た上記データから明らかなように、その影響は培地がア
ミノ酸の添加によって高張化された場合の第３図に示す
影響はど劇的でない。こうして塩化ナトリウム修飾高張
培地で増殖させた培養は通常の細胞培養より優れた抗体
産生によって特徴づけられる。しかしながら、アミノ酸
の添加によって容量オスモル濃度を高めることの影響は
劇的でしかも目立たない改善をもたらす。

別の実験が工ｇＭを生成するヒト−ヒトハイプリド−マ
および１ｇＧを産生ずる他のマウス−マウスハイブリド
−マのような蛋白質産生細胞を用いて行われた。全ての
場合において、高張培地は等張培地より多量の抗体を産
生させる。約３５０〜３６０ミリオスモルの容量オスモ
ル濃度をもちかつ追加のアミノ酸を含む培地が最適であ
ると思われるが、十分な栄養を供給する他の高張培地も
抗体および他の蛋白質の産生な促進する。

当技術分野で精通した人々はここで述べた方法および産
物の池の修飾または変更を定めることができる。このよ
うな他の修飾および変更は特許請求の範囲に現金される
。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体産生細胞の培養のためにアミノ酸の添加に
よって高張化した培地の細胞集団に対する影響を示す。 第２図は第１図の培地中で増殖させた細胞の生存能力を
示す。 第３図は第１図の培地中で増殖させた培養からの抗体産
生な示す。 第４図は細胞の生存能力を失わせることなく培地を高張
化するのに塩化ナトリウムが使用可能であることを示す
。 第５図は本発明に従って蛋白質を産生ずるのに有用な装
置を示す。 （外５名）−一一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）約３４０ミリオスモル以上の容量オスモル濃度を
   もつ高張培地で哺乳動物由来の抗体産生細胞を培養する
   ことからなる、前記抗体産生細胞からの抗体産生を促進
   する方法。 （２）前記高張培地は過剰のアミノ酸の添加によって高
   張化した培地からなる、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 （３）過剰のアミノ酸を連続して添加して培地の高張性
   を維持する特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）前記高張培地の浸透圧は約３４０〜４５０ミリオ
   スモルである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）前記の抗体産生哺乳動物細胞は遺伝子的に修飾さ
   れた細胞からなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （６）前記の抗体産生哺乳動物細胞はハイブリド−マか
   らなる、特許請求の範囲第５項記載の方法。 （７）前記の抗体産生細胞は高張培地中に配置した透過
   性のカプセル膜内で培養される、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 （８）前記高張培地の浸透圧は約３６０　ミＩＪオスモ
   ルである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 （９）必須の塩類、栄養素、ビタミン類およびアミノ酸
   類を含み、蛋白質産生細胞からの蛋白質産生を促進する
   培地であって、 前記培地にはその容量オスモル濃度を約３４０〜４５０
   ミリオスモルへ扁めるのに十分なアミノ酸類が添加され
   ることを特徴とする培地。 ００）前記培地は普通のアミノ酸濃度の約２倍のアミノ
   酸を含む、響許請求の範囲第９項記載の培地。 （１１）　培地中のアミノ酸は非水性成分の約７〜１２
   チを占める、特許請求の範囲第９項記載の培地。