JPS6024198A - １２−ケト−３α，７α−ジヒドロキシコラン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はコール酸（正しくは３α、７α、１２α−トリ
ヒドロキシ−５β−コラン酸）から胆石溶解剤として或
いは利胆剤ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣ）の合成原
料として有用なケノデオキシコール酸（ＣＤＣ）の製造
中間体である１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−
５β−コラン酸（以下、本明細書においてＩ２−ケトコ
ール酸、又は１２−ケト体と略称することがある）を微
生物を用いて製造する方法に関する。

従来技術 ］−ル酸を原料としてＣＤＣを合成する方法として、従
来、コール酸の１２位のヒドロキシル基を脱ＯＨするた
めに、コール酸を選択的に酸化して１２−ケト体とした
後還元する方法やメシル化した後脱メシルし水添する方
法など種々知られている。しかしながら、これらの方法
は当然の事乍ら各反応段階において反応性や選択性の問
題があり、必ずしも満足出来るものではなかった。かか
る現状から、近年、微生物学的方法を利用してコール酸
から１２−ケト体を製造する方法が提唱されている（例
えば、特開昭５６−２９９９８号公報参照）。

発明の目的 本発明者等もコール酸からその１２−ケト体を微生物を
用いて製造する方法について鋭意研究を進めた結果、コ
リネバクテリウム属に属する徹生物が１２−ケト体生産
能を有することを見出し本発明をするに至った。

発明の構成 即ち、本発明に従えば、コリネバクテリウム属に属する
１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５β−コラン
酸生産能を有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培
養して培養物中に１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキ
シ−５β−フラン酸を生成せしめ、これを採取すること
から成る１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５β
−コラン酸の製造法が提供される。

発明の構成及び効果の具体的説明 本発明者等はｌｌ几県亜圭」の土壌よりコール酸を含む
培地で１２−ケト体を生産する能力を有する文献、特許
等に未載の新規な菌を分離することに成功し、この菌株
をコリネバクテリウム５Ｄ−１０３と命名し、昭和５８
年７月４日工業技術院微生物工業技術研究所に寄託（微
工研菌寄第７１３４号）とした。

土壌中よりの菌の分離は次の方法によった。

土壌懸濁液を１％のコール酸ナトリウムを含む肉汁寒天
平板培地に少量塗布し、３５℃で４８時間集積培養を行
ない、得られたコロニーの１白金耳量をＢ４培地に接種
後、３５℃で集積培養を行なった。この培養液の１白金
耳量を、Ｂ４寒天平板培地に画線培養し、菌株を純粋分
離した。これらの菌株を各々Ｂ４液体培地で８〜７２時
間培養し、その培養液中の１２−ケト体の定量を行ない
、１２−ケト体の変換能の高い菌株を得た。

型頭は以下に述べる菌学的性質を有し、パージエイズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バタテリオロ
ジー第８版によりコリネバクテリウム属に属する細菌で
あると同定された。

コリネバクテリウム属に属する特定の細菌を利用して、
コール酸塩から１２−ケト体を製造する方法として既に
特開昭５７−８７９５号公報に記載されているが、この
方で使用するコリネバクテリウムＣＡ−３５菌株と本発
明によるコリネバクテリウム５Ｄ−１０３菌株では以下
の点で、その性質が著しく異なる。

菌　株　コリネバクテ　コリネバクテ リウム５Ｄ−１０３リウムＣＡ−３５ １、顕微鏡的所見 大きさ　０．４Ｘ　Ｏ，４〜　１．３〜２．４×１．０
μ　１．０〜１．２μ 鞭　毛　単極鞭毛　な　し ２、培養所見 ＢＣＰミルク　中性、ミルクは　アルカリ性変化なし 肉汁ゼラチン　液化する　液化せず ３、生理学的性質 ＭＲテスト　±　− 硫化水素の生成　− カタラーゼ　− クエン酸の利用　− 無機窒素源の利用　− 菌　株　コリネハクテ　コリネバクテ リウム５Ｄ−１０３リウムＣＡ−３５ 酸素に対する態度　好気的・嫌　好気的気性条件で わずかに生育 叶テスト　Ｆ　− 糖類より酸の生成　し−アラビノース　左記の全り−キ
シロース　での糖の Ｄ−リボース　いずれよ り−グリコース　りも酸を ローマンノース　生成せず Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラク１−−ス シュクロース デンプンいずれ も酸を生成する また、他の公知菌株にもその性質の合致するものが見出
せぬため上記コリネバクテリウム５Ｄ−１０３菌株を新
菌株であると断定した。コリネバクテリウム５Ｄ−１０
３菌株の菌学的性質は次表の通りである。

形　態　：桿菌 大きさ　：　０．４　Ｘ　０．４〜１．０μ多形性　：
あり 運動性　：あり 鞭　毛　：単極鞭毛 胞　子　：なし 抗酸性　：なし 集合形態二車−又は不規則な集合 ２、培養所見 肉汁寒天平板：４日間の培養で０．１〜０．５　ｎ＋ｍ
径程のコロニー。白色円形、不透 明、湿潤、光沢あり、わずかに 盛り上がる。

肉汁寒天斜面：白色、線状に生育。

肉汁液体　：白濁のち透明。白色粘稠の沈渣。

肉汁ゼラチン穿刺：糸状に生育、液化。

ＢＣＰミルク：中性。ミルクは変化なし。

３、生理学的性質 硝酸塩の還元＊１：＋ 脱窒反応　ニー ＭＲテスト＊２　：＊± ｖｐテスト＊２　ニー インドールの生成ニー 硫化水素の生成＊３；− デンプンの加水分解：＋ クエン酸の利用（コニザー培地）ニー 〃　（クリステンセン培地）ニー 硝酸塩の利用＊４ニー アンモニウム塩＊４ニー 色素ゐ生成ニー ウレアーゼニー オキシダーゼニー カタラーゼ：一 生育の範囲（ｐＨ）＊５：６〜９ （温度）＊５１０℃〜３７℃ 酸素に対する態度＊６：好気的（嫌気性条件でもわずか
に生育） ＯＦテスト＊７：Ｆ グリセリン　−−− Ｌ−アラビノース　十　−＋ Ｄ−キシロース　＋　−＋ Ｄ−リポース　±　＋ Ｄ−グルコース　＋　−＋ Ｄ−マンノース　＋　−＋ Ｄ−フラクトース　＋　−十 り−ガラクトース　＋　−＋ マルトース　−−十 シュクロース　十　−一＋ Ｄ−ラクトース　−−− Ｄ−セロビオース　＋　＋ Ｄ−ソルビトール　−　−＋ Ｄ−マユトール　−−＋ イノシトール　−−− ラフィノース　−−− スターチ　±　−十 コール酸　− ＊１〜＊８：それぞれにおいて使用した培地組成は以下
の通りである。

＊　１　）　ＤＩＦＣＯ製ニュートリエンドブロス０．
４％、硝酸カリウム０．１％、ｐＨ７，４ ＊２）グルコース０．５％、ペプトン０．７％、リン酸
水素２カリウム０．５％、ｐＨ７，５＊３）クリグラ−
寒天培地 ＊４）グルコース１％、リン酸２水素カリウム０．１％
、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、塩化カリウム
０．０２％、硝酸すｌ・リウリム又は塩化アンモニウム
０．１５％ ＊５）肉汁 ＊６）肉汁寒天 ＊７）ビューアンドライフソン培地 ＊８）ペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母エ
キス０．１％、ＢＴＢ８０ｐｐｍ 本発明方法に従えば、コリネバクテリウム属に属する１
２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシコラン酸生産能を
有する微生物をコール酸を含む栄養培地で培養すること
により１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシコラン酸
を生成せしめる。栄養培地中のコール酸濃度には特に限
定はないが、目的１２−ケト体の収量、培養条件及び経
済的観点から一般には５〜５００　ｇ／β、好ましくは
４゜〜３００　ｇ／１．の濃度とする。

本発明方法において使用することのできる培地としては
、前記微生物が培養により増殖し得るものであれば任意
のものでよく、例えば、炭素源とシテハ、コール酸塩、
リボース、グルコース、フラクトース、シュクロース、
酢酸、エチルアルコール、グリセリンなど、窒素源とし
ては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー等の有機窒素、硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素が用いられる。

また、このほかにリン酸２水素カリウム、リン酸水素２
カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの無機塩が添
加される。

本発明方法における培養は好気的条件下に、例えば通気
攪拌や往復振盪方法によって培養することができる。培
養条件は、特に限定はないが、一般的に言えば、温度２
５〜３８°Ｃ，ｐＨ６，５〜８．０及び８〜９６時間程
度の条件で実施する。

培養液又は培養物からの目的の１２−ケト体の採取方法
は慣用方法に従って行うことができる。

例えば、培養液を遠心分離し、上清を希塩酸で酸性にし
た後、酢酸エチルで抽出する。溶媒を留去して生成物を
集め、メヂルアルコールに溶解後、加熱還流してメチル
エステル化し、冷却して結晶化、再結晶化する。得られ
たメチルエステルは常法に従って加水分解して目的物を
得ることができる。

実施例 以下に本発明の詳細な説明するが、本発明の範囲をこれ
らの実施例に限定するものでないことばいうまでもない
。

実施例１ 以下の方法でコリネバクテリウム５Ｄ−１０３株を培養
した。

下記組成のＢ４培地３Ｉ２を５１ジャーファーメンタ−
に入れ１２１℃で６０分間加熱滅菌した。

Ｂ４培地組成 （蒸留水１００ｍ１中重量％） コール酸ナトリウム　ｌ 酵母エキス　０．１ リン酸２カリウム　０．２ リン酸水素２カリウム　０．５ 硫酸マグネシウム７水和物　０．０５ 寒天　− Ｂ４寒天培地組成 （蒸留水１００ｍ１中重量％） コール酸ナトリウム　１ 酵母エキス　ｏ、１゜ リン酸２カリウム　０．２ リン酸水素２カリウム　０．５ 硫酸マグネシウム７水和物　０．０５ 寒天　１．５ 予め５００ｍβ坂ロフラスコに、Ｂ４培地１００ｍ１を
入れ、３０′Ｃで３日間振盪培養して増殖させた培養液
２００ｍＡを無菌的に遠心分離して得た５Ｄ−１０３株
を上記ジャーファーメンタ−に接種し、４００℃ｐｍ、
３０°Ｃ及び通気量０．５ｆｆ／ｍｉｎの培養条件下で
９６時間培養した。

この培養液１βを採取し、希アルカリでｐＨＩＯにｐＨ
調整後、遠心分離して菌体を沈澱除去し、」二澄液を得
た。この上澄液に希塩酸（１：　１）を加えて塩酸々性
とし、コール酸の酸化生成物及びコール酸の固形物を沈
澱させ濾集した。

濾液を酢酸エチル３００ｍｊ＋で３回抽出し、酢酸エチ
ル抽出液を合わせ４０℃以下で減圧濃縮した。得られた
固形物と先に瀘集した固形物との合計量は１０．１４　
ｇであった。

この固形物の一部をとり、１％酢＠溶液とし、Ｋｉｅｓ
ｅｇｅ１６０　Ｆを用いてＴＬＣを行ない生じたスポッ
トを標品１２−ケト３α、７α−ジヒドロキシ−５β−
コラン酸（１２Ｋ）及びコール酸と比較したところ、同
一の位置に同色の発色を示した。

また、標品１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５
β−コラン酸にと同一の位置に同色の発色を示す画分を
分取し、得られた化合物を下記の方法で、１２−ケト−
３α、７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸と同定した
。

（イ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による同定 （Ａ）１％酢酢酸液液３ｐｌＫｉｅｓｅｇｅ１６０　Ｆ
にスポットし、風乾後ベンゼン：ジオキサン：酢酸（７
５：　２０　：　２）の組成の展開溶剤を用いて１０ｃ
ｍ展開した。乾燥後、５％硫酸水溶液を噴霧し、１２０
℃で１０分間加熱したところ、標品１２−ケト−３α、
７α−ジヒドロキジー５β−コラン酸と同一位置に、同
色のスポットがみられた。

（Ｂ）展開溶媒としてイソオクタン：酢酸エチル：酢酸
（１０：　１０　：　２）を用い（Ａ）と同様に展開、
発色させたところ、標品１２−ケト−３α、７α−ジヒ
ドロキシ−５β−フラン酸と同一位置に同色のスポット
がみられた。

（ロ）液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）による
同定 ショーデックス０ＤＳ−Ｆ４１１カラム（昭和電工■製
）を備えた高速液体クロマトグラフィーに、上記抽出液
を１５μβ注入し、移動相としてメタノール／Ｈ，ｏ／
Ｈ３ｐｏ、（７０／３０１０．０２Ｍ重量比）の混合液
を流速ｌ　ｍ　ＩＩ　／　ｍｉｎで流し、検出をＲＩで
行なった。

得られた結果を標品１２−ケト−３α、７α−ジヒドロ
キシ−５β−コラン酸と比較したところ、同一のリテン
ションタイムを示した。また、１％酢酸溶液に標品１２
−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸を
０．５％となる様に加えて溶解させ、前記と同様にして
高速液体クロマトグラフィーに注入し展開させたところ
、標品１２−ケト−３α、７α−ジヒドロキジー５β−
コラン酸が示すリテンションタイムの位置に一つのピー
クが得られた。

液体クロマトグラム（チャート第１図に示す。）の面積
比から得られた１２ケト体及びコール酸酸化物、及びコ
ール酸の相対比は一原子の通りであった。

面積百分率（％） コール酸酸化物　χ−１３０，７ １２ケト体　２９．１ コール酸酸化物　χ−２３，５ コール酸　３６．２ 害、施例２ 以下の方法でコリネバクテリウム５Ｉ）−１０３株を培
養した。

Ｂ４培地５　ｍ　ｅを１８ｍｍ綿栓付試験管に入れ、１
２１°Ｃで３０分間加熱減菌を行なった。

Ｂ４寒天培地に育成させた５Ｄ−１０，３株１白金耳を
とり、上記試験管に接種し、３０℃で６日間振盪培養を
行なった。

得られた培養液を遠心分離し、菌体を除去後、得られた
上澄液に希塩酸を加えて、塩酸酸性としたところ、白色
沈澱が得られた。これを酢酸エチル５ｍｌで２回抽出し
、この抽出液を合わせ実施例１で述べたＴＬＣ及びＨＰ
ＬＣで分析したところ結果は、以下の通りであった。

ＴＬＣＨＰＬＣ ＡＢ　面積百分率（％） χ−１＋＋　２０．３ １２ケト体　十　＋５０．５ χ−２＋＋　２．６ コール酸　＋　＋　２６．７ 実施例３ 以下の組成の１％、コール酸含有Ｃ５培地５ｍｌを１８
ｍｍ綿栓付試験管に入れ、１２１°Ｃで３０分間加熱減
菌した。Ｂ４寒天培地に育成させた５Ｄ−１０３株１白
金耳をとり、上記試験管に接種し、３５℃及びＰＩＩ７
．４で、２４時間振盪培養を行なった。

得られた培養液を遠心分離し菌体を除去し、得られた上
澄液に希塩酸（１：　１）を加えて、塩酸酸性とすると
白色沈澱を析出せしめた。

Ｃ５培地（蒸留水１００ｍ１中正量％）ニュートリエン
ドブロス　０．３ 酵母エキス　０．３ ペプトン　２．０ グルコース　０．１ 塩化ナトリウム　０．５ クエン酸アンモニウム　０．０２ 硫酸鉄７水和物　０．０１ チオ硫酸ナトリウム　０．０３ コール酸ナトリウム　１．０ これを酢酸エチル５ｍｌで２回抽出し、この抽出液を合
わせて実施例１で述べたＴＬＣ及びＨＰＬＣ条件で分析
したところ結果は以下の通りであった。

Ｔ　Ｌ　ＣＨＰ　Ｌ　Ｃ Ａ　Ｂ　面積百分率（％） χ−１＋＋　１７．６ １２ケト体　＋　＋　４５．９ χ−２＋＋　８．３ コール酸　十　＋２８．１ 前記した特開昭５７−８７９５号公報には、ＨＰＬＣの
チャートが示されているが、これと前記した第１図と比
較すると、５Ｄ−１０３株では３．１２−ジケト−Ｘ−
コレン酸が生成しておらず、両者が異なった菌であるこ
とは明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例↓、で得られた生成物のＨＰＬＣチャー
ト図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、コリネバクテリウム属に属する１２−ケト−３α、
   ７α−ジヒドロレキ−５β−コラン酸生産能を有する微
   生物をコール酸を含む栄養培地で培養して培養物中に１
   ２−ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５β−フラン酸
   を生産せしめ、これを採取することを特徴とする１２−
   ケト−３α、７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の製
   造法。